CN113588942B

CN113588942B - 一种检测抗原肌球蛋白1-IgG抗体的试剂盒

Info

Publication number: CN113588942B
Application number: CN202110743541.3A
Authority: CN
Inventors: 叶青; 毛建华; 韩秀翠
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2021-07-01
Filing date: 2021-07-01
Publication date: 2022-04-19
Anticipated expiration: 2041-07-01
Also published as: CN115060898A; CN113588942A

Abstract

本发明提供一种检测抗原肌球蛋白1‑IgG抗体的试剂盒，由抗原蛋白Tropomyosin 1(原肌球蛋白1)、固相载体、标准品、阳性质控品、阴性质控品、标记抗体、底物显色液、抗体稀释液、抗原稀释液、样品稀释缓冲液、洗涤液、终止液等组成。本发明利用抗Tropomyosin1‑IgG抗体所对应的靶抗原Tropomyosin 1，以人抗标签肽的IgG作为定量检测的标准品，对血清中形成的抗原抗体复合物进行抗Tropomyosin 1‑IgG抗体检测。本发明试剂盒操作简便，试剂稳定性非常好，便于储存，填补了国内外鉴别免疫性肾病综合征患者生物标志物的空白。

Description

一种检测抗原肌球蛋白1-IgG抗体的试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种检测血清中抗原肌球蛋白1-IgG抗体的试剂盒。本发明首次为免疫性肾病综合征提供了一种快速简便且高灵敏地定性或定量分析抗原肌球蛋白1-IgG水平的检测试剂盒。

背景技术

免疫性肾病综合征的诊断和治疗是生物医学科学中的一项持续的挑战。肾病综合征是一类因肾小球滤过膜的通透性增加，导致血浆蛋白的滤出增多，从而引发大量的蛋白尿的一系列特征性的病理变化的临床综合症。在很大程度上所表现出的许多症状可以由多样的原因引发(包括先天遗传原因、肾功能损害与功能不全、泌尿生殖道的感染与疾病、药物滥用、食欲不振及营养不良、糖尿病、高血压、感染、损伤、免疫的缺陷和癌症)。

肾病综合征的早期诊断与预测尤为重要。原发性肾病综合征的年发病率因种族和国籍而异，大约在1.15～16.9/10,0000。微小病变性肾病综合征是最为常见的病理类型，这类病人绝大多数对激素治疗敏感，但是10％～20％左右的患儿会出现激素耐药，此类患儿在诊断后的5年内进展为终末期肾病的概率为8％～35％，在诊断后的15年内进展为终末期肾病的概率为24％～66％。

Ali等学者观察发现难治性微小病变的病人的肾脏被移植到受者体内后，肾脏功能转为正常并未出现蛋白尿，由此发生蛋白尿的可能主要是供者的内环境出现了某些方面的问题。除部分因基因缺陷而发病的患儿，大部分原发性肾病综合征的患儿在接受了激素和免疫抑制剂的治疗后，病情都发生了明显的好转，因此原发性肾病综合征的发生可能与患者的自身免疫状况密切相关。

抗原结合B细胞表面的BCR，而后通过Igα/Igβ转导到B细胞内，这是B细胞活化的第一信号。同时Th细胞上表达的CD154分子与B细胞表面的CD40分子的相互作用为B细胞的有效活化提供第二信号。这是B细胞增殖、生发中心反应以及最终分化为浆细胞的至关重要的信号。此类浆细胞能够合成并分泌针对上述抗原的特异抗体。近年来的研究发现B细胞功能异常在原发性肾病综合征中发挥了重要的作用。激素敏感型肾病综合征患者疾病复发时，其外周血中的B细胞的数量会显著增加，激素依赖型肾病综合征病人体内检测到大量的被活化的B细胞，而处于缓解期的激素敏感型肾病综合征患者体内B细胞的数量则明显下降。同时发现糖皮质激素不能有效的抑制激素敏感型或激素依赖型肾病综合征患者体内B细胞的活化。

环磷酰胺和利妥昔单抗能在激素依赖性的疾病患者体内通过清除B细胞而达到停药后诱导病人的长期缓解。利妥昔单抗可以与前B细胞和成熟B细胞表面的跨膜抗原CD20特异性地结合，通过激活补体，抗体依赖的细胞毒性作用，及诱导细胞凋亡的三种途径来清除B细胞，从而发挥免疫抑制作用。此外，记忆B细胞(特别是转换的记忆B细胞数量)可以预测利妥昔单抗治疗后的复发情况。虽然全球多个多中心的临床研究发现利妥昔单抗能成功的用于微小病变肾病综合征的治疗，但有研究发现利妥昔单抗在治疗激素依赖性肾病综合征的过程中，其清除B细胞的作用能维持大约5个月左右，继后在6到7个月左右随着B细胞的数量回升，病情也会复发。由此可知原发性肾病综合征的患者体内有病理性B细胞的克隆，这些病理性B细胞的克隆的鉴别和精准清除显得尤为重要。

迄今为止，原发性肾病综合征的患儿体内的病理性的B细胞所针对的靶抗原仍不是很清楚。从病理特征上说，微小病变或局灶节段性肾小球硬化均被认为是由于足细胞功能丧失或改变而导致出现大量蛋白尿的足细胞病。足细胞为肾小球上皮细胞，其附着在肾小球基底膜外侧，是阻止蛋白质发生丢失的最后屏障，足细胞的损伤通常会表现为大量的蛋白尿。有研究表明，肾小球上皮细胞的足突和相邻的足突间裂孔隔膜在保持肾小球滤过膜的生理屏障功能中发挥重要的作用。上皮细胞特殊结构的维持主要依赖以肌动蛋白为主的细胞骨架系统(actin细胞骨架)和足突中表达的足突分子。人们已经发现了多个在肾小球上皮细胞足突及裂孔隔膜表达的分子，他们在维持肾小球的发育、滤过膜的完整性、足细胞信号分子的传导、防止蛋白的漏出等方面发挥着重要的作用。足细胞通过自身形态的调整，细胞间滤过间隙的改变来适应肾小球的滤过容积改变，这一功能的完成完全依赖于足细胞的强大细胞骨架系统，然而Tropomyosin 1的功能与细胞骨架密切相关。Tropomyosin1肌球蛋白作为细胞骨架的分子马达，是一种多功能蛋白质，其主要功能是为肌肉收缩提供力。Tropomyosin 1是原肌球蛋白家族的成员，它由许多高度保守，这些蛋白与横纹肌和平滑肌的收缩系统以及非肌肉细胞的细胞骨架有关。Tropomyosin-1由2条螺旋线圈排列的α-螺旋链组成。Tropomyosin 1在肌动蛋白丝的两个凹槽旁边首尾相连，并为肌动蛋白丝提供了稳定性。Tropomyosin 1与肌肉和非肌肉细胞中的肌动蛋白丝结合。Tropomyosin 1还与肌钙蛋白复合物结合起作用，以调节肌肉收缩过程中肌动蛋白和肌球蛋白的钙依赖性相互作用。在非肌肉细胞中，Tropomyosin 1与稳定细胞骨架肌动蛋白丝有关。在平滑肌和非肌肉细胞中已经描述了编码一系列同工型的剪接的转录变体。Tropomyosin 1异构体1在成人和胎儿的骨骼肌和心脏组织中表达，在心脏组织中具有较高的表达水平，而异构体10在成人和胎儿的心脏组织中表达，但在骨骼肌中不表达。Tropomyosin 1基因的突变与3型家族性肥厚型心肌病有关。

有研究发现Tropomyosin 1中的分子Myo1e在表达下调时，实验动物斑马鱼会出现水肿，肾小球的局部细胞数量减少，肾小管和前肾导管管腔、上皮细胞的胞体内吞体(此现象类似于人类的肾小球疾病时出现的蛋白尿)等的改变，Myo1e基因被敲除后的小鼠则出现了蛋白尿和慢性肾损害。此现象说明，Tropomyosin 1中的Myo1e分子在足细胞和肾小球滤过膜的功能完整性中是必不可少的。有报道表明，Tropomyosin 1蛋白的低表达可能与非小细胞肺癌的发生有关并有望成为非小细胞肺癌诊断与治疗的新靶点。也有报道表明，Tropomyosin 1的低表达与膀胱癌的肿瘤分期相关。但Tropomyosin 1蛋白的表达情况及抗Tropomyosin 1-IgG抗体的检测研究在肾病综合征的诊断或治疗的应用方面一直是空白的状态。本发明使该疾病的诊断治疗和监控变得更为方便，并能改善现有的检测手段(肾穿刺)给患者带来的身心痛苦及经济负担。

虽有研究表明Tropomyosin 1的表达情况在泌尿系统疾病中的应用，但Tropomyosin 1的自身抗体的存在情况的研究是没有的，特别是在免疫性肾病综合征中，更不用说它们的价值性。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测抗原肌球蛋白1-IgG抗体的试剂盒，主要由抗原蛋白Tropomyosin 1、固相载体、标准品、阳性质控品、阴性质控品、标记抗体(酶标记或化学发光剂标记或生物素标记的抗人IgG)、底物显色液、抗体稀释液、抗原稀释液、样品稀释缓冲液、洗涤液、终止液等组成。信号检测方法包括化学发光法、光显色法。

所述抗原蛋白Tropomyosin 1的序列如SEQ ID NO.1如下所示：MAGSSSLEAVRRKIRSLQEQADAAEERAGTLQRELDHERKLRETAEADVASLNRRIQLVEEELDRAQERL。

所述抗原蛋白Tropomyosin 1固定于固相载体上，载体包括硅或玻璃表面、纸、聚苯乙烯、膜、金属、微流控通道、珠粒(磁珠)、柱色谱法介质、聚丙烯酰胺凝胶、生物芯片等等，优选的固相载体包括：硝酸纤维素膜(NC膜)、酶标微孔板。

所述阳性质控品或标准品可以为重组人抗标签肽免疫球蛋白G或其片段、或是从病人血清中提取抗Tropomyosin 1-IgG抗体，健康体检者血清为阴性质控品。

所述显色剂可以为吖啶酯、AMPPD、TMB和4-MUP；所述抗原稀释液为1x PBS pH7.4、NaCl 163mM和1％TritonX-100；所述样品稀释缓冲液为0.01M PBS pH 7.4+10％新生牛血清；所述抗体稀释液为取1M D-glucose和2％甘油加入含0.35％Tween2的0.01M PBS定容至100ml；所述洗涤液为：1x PBS pH7.4、NaCl 163mM、1％TritonX-100和甘油10％；所述终止液为：2M盐酸。

所述的抗原蛋白Tropomyosin 1上带有标签肽，所述的标签肽包括：c-Myc标签、GST标签、Flag标签、His标签或生物素标签。

根据本发明，抗原Tropomyosin 1对应的血清自身抗体的相对滴度定量采用统一的标签肽和抗标签肽抗体之间的特异性免疫反应和标准曲线的回归进行计算。

根据本发明，所述抗原蛋白Tropomyosin 1可表达于真核或原核细胞，优选真核细胞，更优选为哺乳动物细胞，更优选人细胞例如HEK293细胞。哺乳动物细胞的实例包括CHO、HEK293或COS-7细胞。

根据本发明，所述抗原蛋白Tropomyosin 1经Ni柱亲和层析、分子筛、离子交换柱、疏水柱纯化。

根据本发明，所用的化学发光法的标记物为吖啶酯。

根据本发明，所述样品为一切包含自身抗体的样品，选自全血、血清、血浆、尿液、淋巴液、胸腹水，优选血清，更优选哺乳动物(人类)血清。

本发明采用基因工程方法成功表达并纯化出蛋白Tropomyosin 1，以此作为试剂盒中抗原蛋白，采用抗原包被固相载体的方法，首次提供了一套适合于检测免疫性肾病综合征患者血清抗Tropomyosin 1-IgG抗体的试剂盒。该试剂盒是一种定性或定量分析人血清中抗Tropomyosin 1-IgG抗体的检测试剂盒。

所述的抗原蛋白Tropomyosin 1固定方法可选择直接包被法：(1)抗原通过物理吸附或非共价键方式结合到硝酸纤维素膜或聚苯乙烯微孔板上；(2)羧基磁微粒经过EDC/Sulfo-NHS活化，与抗原(氨基残基)共价结合，形成稳定物。

本发明通过前期大量临床和分子机制研究，首次在肾病综合征患者血清检测到了抗Tropomyosin 1-IgG抗体。本发明的试剂盒可用于该自身抗体的检测，为自身免疫性肾病综合征的研究提供了支持。

本发明创新点可归纳如下：

(1)本发明采用重组人抗His标签的免疫球蛋白作为标准品，可特异性的识别带有His标签的抗原，从而提高了试剂盒检测的准确性和特异性。

(2)本发明首次为免疫性肾病综合征患者检测自身抗体研发了定性或定量的试剂盒。

(3)本发明试剂盒涉及定性和定量分析人血清中抗Tropomyosin 1-IgG抗体，其中固相膜免疫定性法的优点是操作简便，NC膜吸附能力极强，接近100％，微量抗原能够完全吸附，试剂用量也较少，比传统ELISA节约近10倍；吸附抗原或抗体或已有结果的NC膜可长期保存(-20℃可保存半年)，且不影响其活性，有利于健康人群体检筛选。化学发光免疫采用吖啶酯直接标记法。吖啶酯的化学发光量子产率相对较高，且其标记条件相当温和，标记率也很高，标记之后不会影响分离。同时，吖啶酯化学发光过程的反应速度极快，本底低，即使在反应中有氢氧化钠和过氧化氢的存在，也可以照常发光。在氧化还原反应的过程里，分解了结合物，但这不影响游离吖啶酯的发光。此外，吖啶酯类化学发光试剂稳定性非常好，便于储存。

(4)目前国内外关于免疫性肾病综合征患者有关Tropomyosin 1、抗Tropomyosin1-IgG是没有的，而本发明试剂盒填补了国内外鉴别免疫性肾病综合征患者生物标志物的空白。

附图说明

图1显示了Tropomyosin 1蛋白是自身免疫性肾病综合征病人体内自身抗体针对的主要靶抗原。其中图1a为一抗为健康人血清的二维电泳蛋白点；图1b为一抗为原发性肾病综合征患者血清的二维电泳蛋白点；图1c为肾病综合征患者体内Tropomyosin 1在质谱鉴定情况，箭头所示峰为Tropomyosin 1蛋白峰。

图2显示了SDS-PAGE电泳鉴定的重组合成的Tropomyosin 1蛋白。

图3是固相膜免疫试剂盒检测自身免疫性肾病综合征患者血清中抗Tropomyosin1-IgG抗体。

图4是抗原蛋白Tropomyosin 1的包被羧基磁微粒示意图。

图5是用于检测抗Tropomyosin 1-IgG抗体的化学发光试剂盒的检测原理示意图。

图6显示了各组受试样品中抗Tropomyosin 1-IgG的抗体表达情况。

图7显示了抗Tropomyosin 1-IgG抗体用于自身免疫性肾病综合征鉴别诊断的效能。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例，对本发明作进一步说明。以下实施例用于阐述本发明而非限制本发明的范围。

实施例1

1.Tropomyosin 1蛋白抗原的表达：利用生物工程的方法表达相应的抗原蛋白。

1.2抗原蛋白固定方法：本发明抗原包被固相载体方法用直接包被法：(1)抗原通过物理吸附或非共价键方式结合到聚苯乙烯微孔板或硝酸纤维素膜上；(2)抗原通过化学偶联方式结合在含羧基官能团的磁微粒上。

1.3阳性质控品和标准品：本发明所选阳性质控品和标准品为从病人血清中提取并进行定量的IgG或人抗标签肽IgG。

1.4标记抗体和底物显色剂：本发明所选的标记抗体可以是吖啶酯标记抗人IgG、辣根过氧化物酶标记抗人IgG或生物素标记的抗人IgG；显色剂可以为4-MUP、TMB或AMPPD。

1.5信号检测：利用酶标仪、化学发光分析仪等方法来检测光信号，通过绘制的标准曲线来定量分析人血清中抗Tropomyosin 1–IgG抗体。

1.6本发明所用常规试剂及溶液。

1.6.1硝酸纤维素膜、聚苯乙烯微孔板、磁珠。

1.6.2PBS pH7.4配制:NaCl 137mM、KCL 2.7mM、Na₂HPO₄ 8.1mM、KH₂PO₄ 1.5mM；32.20X洗涤液配制：KCl 54mM、NaCl 2.74mM、KH₂PO₄ 30mM、Na₂HPO₄ 162mM，然后用0.22μm滤膜进行负压过滤。

1.6.3 5％BSA封闭液配制：将5g牛血清白蛋白溶解于100mL的0.01M PBS溶液中。

1.6.4抗原稀释液：1×PBS pH7.4、1％TritonX-100、NaCl 163mM。

1.6.5血清/抗体稀释液：取1M D-glucose(19.82g)、2％甘油(2ml)加入含0.35％Tween2的0.01M PBS定容至100ml，然后用0.22μm滤膜负压过滤。

1.6.6洗涤液：1×PBS pH7.4、NaCl 163mM、1％TritonX-100、甘油10％。

1.6.7TMB显色剂：底物显A液：柠檬酸1.6g，醋酸钠13.6g，30％双氧水0.3ml，蒸馏水加至500ml。底物显色B液：柠檬酸0.95g，乙二胺四乙酸二钠0.2g，甘油50ml，0.15g TMB蒸馏水加至500ml。

1.6.8终止液：2M盐酸。

1.6.9 SDS-PAGE(10％)配制。

10％分离胶配制：

实施例说明：本发明将抗原吸附于固相载体，然后加入阳性质控品或标准品或待检血清样本进行孵育，随后加入标记二抗进行抗原抗体反应，最后利用光显色法、化学发光法或荧光发光法来检测光信号，通过光信号的变化情况来实现定性或定量分析人血清中抗Tropomyosin 1-IgG抗体的目的。

实施例2足细胞上的Tropomyosin 1是自身免疫性肾病综合征病人体内自身抗体针对的主要靶抗原之一

培养足细胞株(MPC5)，用PBS洗涤2-3次，然后用聚焦超声仪(Covaris S220,Gene)在含有30mm Tris-HCl、8m尿素、4％CHAPS和蛋白酶抑制剂(#ab65621；Abcam，1：200稀释)的裂解缓冲液中冰上进行充分裂解，然后将样本置于离心机，12000g，4℃，离心30min。收集上清，即为收集到的肾小球足细胞总蛋白。利用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定收集到的肾小球足细胞总蛋白浓度，得到纯化的肾小球足细胞总蛋白。之后进行二维电泳，转膜，然后用健康对照组和患者的血清分别进行孵育，随后加入二抗进行显影，结果见图1a和图1b。上述二维电泳显影后进行阳性点的差异分析，选取二维电泳胶条上原发性肾病综合征患者强阳性而健康对照组阴性或者弱阳性的蛋白点进行质谱分析鉴定。通过纳米高效液相层析技术分开，并使用质谱仪通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间串联质谱法进行鉴定，所得结果使用ProteinPilot软件分析处理。通过鉴定得出Tropomyosin 1是自身抗体针对的靶抗原。结果见图1c。

实施例3 Tropomyosin 1抗原蛋白表达

抗原蛋白Tropomyosin 1表达及纯化利用基因工程的方法以编码Tropomyosin 1蛋白的基因为模板，进行PCR扩增，然后构建表达载体进行蛋白表达。本发明表达的抗原蛋白上含有His标签的标签肽。表达的重组蛋白经镍柱亲和层析、离子亲和层析法、疏水柱、分子筛等进行纯化，最后利用SDS-PAGE鉴定合成蛋白Tropomyosin 1的分子量并进行定量。如图2所示。

实施例4用于检测抗Tropomyosin 1-IgG抗体的固相膜免疫试剂盒的制备

4.1用于检测抗Tropomyosin 1-IgG的固相膜免疫试剂盒的组成：

1、包被Tropomyosin 1抗原的硝酸纤维素膜，

2、阳性质控品(标准品)人抗His标签免疫球蛋白G(购自Tribioscience公司)，

3、阴性质控品(健康体检者血清)，

4、辣根过氧化物酶标记的羊抗人免疫球蛋白G，

5、抗原稀释液，

6、洗涤液，

7、TMB显色剂，

8、终止液。

4.2抗原Tropomyosin 1蛋白包被浓度的优化将阳性质控血清浓度按倍比稀释固定在载体上，继后用未稀释的免疫性肾病综合征患者的血清进行孵育，检测相应的抗原抗体复合物的量。根据Tropomyosin 1蛋白抗原的包被浓度(180ug/mL、90ug/mL和45ug/mL三个包被浓度)、反应时间(30min、35min)和温度(30℃、35℃)、酶标二抗最佳稀释度(1:500、1:1000、1:1200三个稀释度)设计正交表，每个因素按两水平重复测定标准阳性血清和阴性血清。计算阳性血清的最高发光值(P)和阴性血清的最低发光值(N)的比值(P/N)。经统计处理确定最佳优化条件，显著提高了标准阳性血清的阳性检出率。最终我们得到本发明试剂盒的最佳抗原包被浓度为90μg/ml、最佳抗原抗体反应时间30min最合适温度为35℃，且最佳的二抗工作稀释度为1：1200。

4.3抗原包被硝酸纤维素膜制备及血清样本的检测步骤如下：

4.3.1包被、封闭：用0.01M PBS且pH7.4的合适浓度的稀释抗原液5μl点于硝酸纤维素膜上置37℃温箱中干燥30min，将NC膜置于板槽中，加入100μl 5％BSA于37℃温盒中封闭10min，弃去封闭液后洗涤液洗2次。

4.3.2孵育：向反应槽内加入10μl稀释的抗体标准品或待检血清标本，同时做阴性对照和阳性对照，充分混匀置37℃湿盒中反应30min，同时每个样品做3个平行孔。

4.3.3二抗孵育：弃去槽内液体，洗涤液清洗3次×1min，然后加入20μl抗体稀释液稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG，充分混匀后室温反应30min。

4.3.4显色：弃去槽内液体，洗涤液洗3次×1min，加显色A/B液各500μl，室温反应10min后加入500μl 2M HCl终止液，混匀，1min后弃去槽内液体洗涤3次，取出测试条后用吹风机吹干膜条，自然干燥后进行肉眼定性判定，出现明显棕色斑点者为阳性(如图3)，或将NC膜置于“Canon 9000f markii”显影仪扫描，显影仪自带的软件系统以参考标准品浓度作为纵坐标、阅读仪读数值即灰度值作为横坐标，采用双对数进行Logistic拟合曲线的方法绘制标准曲线来定量分析患者血清中抗Tropomyosin 1-IgG水平。

实施例5用于检测抗Tropomyosin 1-IgG的化学发光试剂盒的制备

5.1用于检测抗Tropomyosin 1-IgG的化学发光试剂盒的组成：

1、包被Tropomyosin 1抗原的磁微粒溶液，

2、阳性质控品(标准品)人抗His标签免疫球蛋白G(购自Tribioscience公司)(含靶值范围)，

3、吖啶酯标记抗人IgG溶液，

4、样本稀释液磷酸盐缓冲液，

5、阴性质控品(健康体检者的血清)，

6、预激发液(H₂O₂)，

7、激发液(NaOH)，

8、清洗液。

5.2流程如下：

5.2.1抗原包被原理：基磁珠表面所含的竣基先与现配的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)溶液发生反应而生成不稳定的氨基活性O-酰基脲中间体，该中间体有三步转化途径：第一步是与溶液中的水发生反应，还原成竣基磁珠；第二种是与抗体的氨基发生反应，直接得到免疫磁珠；第三种是不稳定的活性O-酰基脲中间体与NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)发生反应生成半稳定的氨基反应活性NHS酯，该产物再与抗原上的氨基发生反应生成，继而生成免疫磁珠。如图4。

5.2.2EDC/NHS活化羧基磁珠

将EP管置于磁力架上4min，等待磁珠和溶液固液分离，然后在剩下的装有磁珠的EP管中加入50ul的25mmol/L pH＝5的MES(2-吗琳乙磺酸)溶液，然后充分震荡混合10min，等到发生固液分离后，重复操作一次；在洗涤过的磁珠中加入现配的EDC溶液和NHS溶液各25ul，充分混匀，于25℃下孵育30min,充分混匀，固液分离后重复洗涤磁珠一次。

5.2.3已活化磁珠偶联抗原的基本步骤

将30ul浓度为1mg/mL的抗原加入到30ul 25mmol/L pH＝5的MES溶液中，然后加入已经活化的磁珠中，振荡充分混匀后再加入40ul 5mmol/L pH＝5的MES溶液，置于涡旋振荡器上振荡混匀。混合物在25℃条件下孵育1h，然后将EP管置于磁力架上静置4min。磁珠中加入100ul 50mmol/L pH＝7.4的Tris溶液，将EP管置于25℃条件下孵育15min，期间缓慢旋转振荡，避免磁珠发生沉淀。15min后发生固液分离，移除液体成分，将EP管置于涡旋振荡器上充分混匀，后将EP管置于磁力架上4min，固液分离，移除液体成分，如此重复4-5次。所有操作结束后，将磁珠悬浮于50ul含有0.1％BSA的PBS缓冲液中，即可得到偶联抗原的相应磁珠。

5.2.4标记抗体与激发：实验过程中较为常用的是吖啶酯和吖啶磺酰胺，吖啶酯在碱性条件下(如碳酸盐存在条件下)，与抗IgG(氨基残基)共价结合，通过脱盐去除杂质，得到带有标记的抗体溶液。

5.2.4.1图中R、R'、R″为烷基、烷氧基及芳基等其他取代基；X、X'、X″为偶联基团，用于偶联抗原或抗体，并增加化合物溶解性。

5.2.4.2吖啶酯的标记反应机理：在碱性条件下，过氧化氢与吖啶的9位碳原子发生加成反应，加成产物在碱性条件下形成的过氧负离子再亲核进攻羰基碳，离去基团离去并进一步形成不稳定的四元环中间体，开环后形成激发态的吖啶酮，其返回到基态的过程中释放出光子。

5.2.5信号检测：在碱性条件下，吖啶酯分子受到过氧化氢攻击后生成二氧乙烷，二氧乙烷极不稳定而发生分解，分解为CO₂和电子激发态的N-甲基吖啶酮，当其回到基态时发出波长为430nm的光，通过收集发光信号，来判断人血清中抗Tropomyosin 1-IgG抗体的浓度。如图5。

5.3具体操作步骤如下：

5.3.1将样本按一定比例进行稀释处理；

5.3.2将稀释后的样本，加入磁微粒液样本稀释液，37℃条件下反应15-20min；

5.3.3随后清洗液洗涤3次；

5.3.4加入吖啶酯标记抗体，37℃条件下反应15-20min

5.3.5重复洗涤3次；

5.3.6最后加入预激发液(H₂O₂)和激发液(NaOH)进行反应，吖啶酯在过氧化氢攻击下生成二氧乙烷，二氧乙烷极不稳定而发生分解，产生CO₂和电子激发态的N-甲基吖啶酮，当N-甲基吖啶酮回到基态时发出430nm的光，收集发光信号，通过校准曲线计算抗Tropomyosin1-IgG抗体浓度测值。

实施例6检测血清中抗Tropomyosin 1-IgG抗体的试剂盒的临床应用

6.1受试者2018年6月到2020年6月被诊断为原发性肾病综合征的患者，健康对照组来自同时期就诊的健康体检者。对照组包括195例健康人，患者组包括168例过敏性紫癜患者，137例过敏性紫癜性肾炎患者，133例IgA肾病患者和466例肾病综合征患者。血清样本从患者组和健康对照组获得。所有受试者在没有进行免疫抑制治疗之前进行血清样本采集。

6.2利用本试剂盒对受试者(包括195例健康人，患者组包括168例过敏性紫癜患者，137例过敏性紫癜性肾炎患者，133例IgA肾病患者和466例肾病综合征患者)进行抗Tropomyosin 1-IgG抗体的检测，结果显示原发性肾病综合征病人中抗Tropomyosin 1-IgG抗体阳性，而紫癜性肾炎、过敏性紫癜、IgA肾病病人以及健康儿童中抗Tropomyosin 1-IgG抗体皆为阴性，见图6。从图在可以明显的看出，只有自身免疫性肾病综合征的抗Tropomyosin1-IgG抗体阳性。

6.3 ROC曲线评估抗Tropomyosin 1-IgG抗体作为一种血清学标志物用于免疫性肾病综合征患者诊断的价值对肾病综合征患者中抗Tropomyosin 1-IgG抗体的检测结果采用ROC曲线进行分析，以判断该抗体在诊断肾病综合征中的价值。结果显示抗Tropomyosin1-IgG抗体是用于自身免疫性肾病综合征诊断的一种很好的血清学标志物，用抗Tropomyosin 1-IgG抗体大于9.2作为诊断界值用于自身免疫性肾病综合征诊断的敏感性为61.11％，特异性为81.36％，曲线下面积为0.735，见图7。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种检测抗原肌球蛋白1-IgG抗体的试剂盒

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 70

<212> PRT

<213> Tropomyosin 1蛋白功能相似的多肽(Tpm1)

<400> 1

Met Ala Gly Ser Ser Ser Leu Glu Ala Val Arg Arg Lys Ile Arg Ser

1 5 10 15

Leu Gln Glu Gln Ala Asp Ala Ala Glu Glu Arg Ala Gly Thr Leu Gln

20 25 30

Arg Glu Leu Asp His Glu Arg Lys Leu Arg Glu Thr Ala Glu Ala Asp

35 40 45

Val Ala Ser Leu Asn Arg Arg Ile Gln Leu Val Glu Glu Glu Leu Asp

50 55 60

Arg Ala Gln Glu Arg Leu

65 70

Claims

1.一种抗原蛋白原肌球蛋白 1在制备自身免疫性肾病综合征检测的试剂盒中的应用，其特征在于，试剂盒由抗原蛋白原肌球蛋白1、固相载体、标准品、阳性质控品、阴性质控品、标记抗体、底物显色液、抗体稀释液、抗原稀释液、样品稀释缓冲液、洗涤液和终止液组成；所述的抗原蛋白原肌球蛋白1的序列如SEQ ID NO.1所示；所述的标记抗体为酶标记或化学发光剂标记或生物素标记的抗人IgG；所述标准品和阳性质控品为重组的人抗标签肽免疫球蛋白G或其片段，或是血清中提取的抗原肌球蛋白1-IgG抗体；阴性质控品选择健康体检者的血清；所述的抗原蛋白原肌球蛋白1上带有标签肽；通过检测患者血清样本中的抗原肌球蛋白 1-IgG抗体来诊断自身免疫性肾病综合征。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述固相载体为硅或玻璃表面、纸、聚苯乙烯、膜、金属、微流控通道、珠粒、柱色谱法介质、聚丙烯酰胺凝胶或生物芯片。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述固相载体选用硝酸纤维素膜或酶标微孔板。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，显色剂为吖啶酯、AMPPD、TMB或4-MUP；所述抗原稀释液为1x PBS pH7.4、NaCl 163mM和1％TritonX-100；所述样品稀释缓冲液为0.01MPBS pH7.4+10％新生牛血清；所述抗体稀释液为取1M D-glucose和2％甘油加入含0.35％Tween2的0 .01M PBS定容至100ml；所述洗涤液为：1x PBS pH7.4、NaCl 163mM、1％TritonX-100和甘油10％；所述终止液为：2M盐酸。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的标签肽选用：c-Myc标签、GST标签、Flag标签、His标签或生物素标签。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗原蛋白原肌球蛋白1需固定于固相载体上，固定方法为直接包被法，通过物理吸附或非共价键结合或化学结合将抗原蛋白直接固定于固相载体上。