CN117866087A - 一种抗pTau181单克隆抗体及其应用 - Google Patents
一种抗pTau181单克隆抗体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种抗pTau181单克隆抗体及其应用，属于抗体技术领域。本发明的抗pTau181单克隆抗体具有亲和力高、特异性强的特点。利用本发明的抗pTau181单克隆抗体或其抗原结合部分与抗Tau蛋白抗体组合检测脑脊液或血液中的pTau181含量时，具有灵敏度高、特异性强、检测结果可靠的优势，有助于阿尔茨海默病等相关疾病的预测、诊断、动态监测及预后评估，具有非常高的临床应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及抗体技术领域，具体地，涉及一种抗pTau181单克隆抗体及其应用。
背景技术
Tau蛋白是一组由选择性mRNA剪接形成的神经元微管相关蛋白，在阿尔茨海默病（Alzheimer 's disease，AD）大脑中以神经原纤维缠结的形式聚集。Tau蛋白在调节微管动力学、轴突运输和轴突生长中起关键作用，所有这些功能都是通过位点特异性磷酸化来调节的。事实上，神经退行性疾病中发生的异常Tau蛋白磷酸化不仅导致毒性功能丧失（例如微管结合减少），而且很可能还导致毒性功能获得（例如Tau-Tau相互作用增加）。
随着新的改善疾病的AD疗法的潜在发展，需要简单的、广泛可用的筛查试验来识别那些正在经历认知或行为衰退症状的个体，应进一步评估以开始治疗。在AD疾病进展过程中，病理改变与脑脊液Tau相关物包括总Tau和苏氨酸181磷酸化的Tau蛋白（pTau181）浓度升高有关，pTau181水平比正常大脑中的水平高出3~4倍，而血浆中pTau181水平与脑脊液pTau181水平相关，这使得AD与非AD神经退行性疾病的鉴别成为可能。与目前使用的正电子发射断层扫描（PET）诊断测试相比，基于脑脊液或血液的AD检测是一种更易接受、成本更低的筛查工具。
在进行检测时，由于pTau181的低浓度，抗体的亲和力至关重要。另外，抗体特异性（将靶标与其他蛋白质区分开来的能力）与结合的紧密性同样重要。实现pTau181特异性尤其具有挑战性，因为抗体需要区分单个磷酸化残基的存在。目前，市面上只有极少pTau181的单克隆抗体（单抗）和检测方法，但检测存在检测灵敏度不高、特异性不强、检测结果与临床病理不符等问题。
发明内容
为了解决上述技术问题，发明人以包含pTau181的多肽为抗原进行动物免疫，以另一种含pTau181的多肽和未进行磷酸化的总Tau蛋白为抗原包被酶标板进行Elisa筛选，制备出特异性靶向pTau181的单克隆抗体，该抗体和力高、特异性强，从而完成本发明。
本发明第一方面提供一种抗pTau181单克隆抗体或其抗原结合部分，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的全长氨基酸序列如SEQ ID No. 5所示，所述轻链可变区的全长氨基酸序列如SEQ ID No. 10所示。
pTau181为苏氨酸181磷酸化的Tau蛋白，上述抗pTau181单克隆抗体或其抗原结合部分能够特异性靶向pTau181磷酸化位点。在本发明的一些实施方案中，所述抗pTau181单克隆抗体或其抗原结合部分能够特异性靶向包括总Tau蛋白序列第173~190位氨基酸并且181位磷酸化的多肽，具有区分单个磷酸化残基的能力。
在本发明的一些具体实施方案中，所述抗pTau181单克隆抗体重链可变区CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的氨基酸序列分别如SEQ ID No. 6~SEQ ID No. 8所示；轻链可变区CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3的氨基酸序列分别如SEQ ID No. 11~SEQ ID No. 13所示。
在本发明的一些具体实施方案，所述抗pTau181单克隆抗体为基因重组抗体。
在本发明的一些具体实施方案，所述抗原结合部分选自Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段和scFv片段。
其中，自Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段是可以从IgG和IgM的可变区产生的抗原结合部分。F(ab')2片段包含两个抗原结合区，通过二硫键在铰链处连接；Fab'片段可通过还原F(ab')2片段形成，即Fab'片段衍生自F(ab')2片段；Fab片段是由IgG和IgM产生的单价片段，由通过分子内二硫键连接的VH、CH1和VL、CL区组成；Fv片段是由IgG和IgM产生的最小片段，包含完整抗原结合位点。Fv片段具有与Fab相同的结合特性和相似的三维结合特性。
单链抗体（single-chain variable fragment，scFv）是由抗体重链的可变区与轻链的可变区在一段肽链的连接下构成的小分子，是具有抗体活性的最小功能结构单位。
本发明第二方面提供编码本发明第一方面任一所述的抗pTau181单克隆抗体或其抗原结合部分的基因，编码重链可变区全长的基因包括SEQ ID No. 4所示核苷酸序列，编码轻链可变区全长的基因包括SEQ ID No. 9所示核苷酸序列。
本发明第三方面提供一种重组载体，包括本发明第二方面所述的编码本发明第一方面任一所述的抗pTau181单克隆抗体或其抗原结合部分的基因。
重组载体可以指克隆载体，也可以指表达载体，可以通过将编码核酸与商购的载体（如质粒或病毒载体）可操作地连接而获得，本发明中的重组载体不受特别限制，常用的质粒均可使用，如pSeTag2、PEE14、pMH3、pcDNA3.1、pcDNA3.4等。
在本发明的一些实施方案如此，分别将编码重链可变区全长的核酸和编码轻链可变区全长的核酸连接至不同的表达载体上，得到两种重组载体。
在本发明的一些具体实施方案中，将小鼠重链信号肽、重链可变区全长、小鼠IgG1恒定区的编码核苷酸序列，插入真核表达载体pcDNA3.4的多克隆位点，形成表达重链可变区的重组载体；将小鼠Kappa链信号肽、轻链可变区全长、小鼠Kappa链恒定区的编码核苷酸序列，插入真核表达载体pcDNA3.1 Zeo(+)的多克隆位点，形成表达轻链可变区的重组载体。
在本发明的一些优选实施方案中，所述小鼠重链信号肽氨基酸序列如SEQ ID No.14所示，其核苷酸序列如SEQ ID No. 15所示；所述小鼠IgG1恒定区氨基酸序列如SEQ IDNo. 16所示，其核苷酸序列如SEQ ID No. 17所示。
在本发明的一些优选实施方案中，所述小鼠Kappa链信号肽氨基酸序列如SEQ IDNo. 18所示，其核苷酸序列如SEQ ID No. 19所示；所述小鼠Kappa链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No. 20所示，其核苷酸序列如SEQ ID No. 21所示。
本发明第四方面提供一种重组细胞，包括本发明第三方面所述的重组载体。
所述重组细胞携带前面所述的基因、重组载体或转化子、或抗pTau181单克隆抗体或抗原结合片段。所述重组细胞是通过转染或者转化所述重组载体获得的。
在本发明的一些实施方案中，将上述表达重链可变区的重组载体和表达轻链可变区的重组载体按1:1的比例使用脂质体转染试剂进行转染得到重组细胞。
根据本发明的实施例，所述重组细胞在适合条件下可高效表达上述抗pTau181单克隆抗体。
需要注意的是，本发明所述重组细胞不受特别限制，可以为原核细胞、真核细胞或噬菌体。所述原核细胞可以为大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌或奇异变形菌等。所述真核细胞可以为包括巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、裂殖酵母、木霉等真菌，草地粘虫等昆虫细胞，烟草等植物细胞，BHK细胞、CHO细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞等哺乳动物细胞。在一些实施例中，本发明所述重组细胞优选为哺乳动物细胞，包括BHK细胞、CHO细胞、NS0细胞或COS细胞，且不包括动物生殖细胞、受精卵或胚胎干细胞。
需要说明的是，本申请说明书中所述的“适合条件”，是指适合本申请所述抗pTau181单克隆抗体表达的条件。本领域技术人员容易理解的是，适合抗pTau181单克隆抗体表达的条件包括但不限于合适的转化或转染方式、合适的转化或转染条件、健康的宿主细胞状态、合适的宿主细胞密度、适宜的细胞培养环境、适宜的细胞培养时间。“适合条件”不受特别限制，本领域技术人员可根据实验室的具体环境，优化最适的所述抗pTau181单克隆抗体表达的条件。
本发明第五方面提供本发明第一方面任一所述的抗pTau181单克隆抗体或其抗原结合部分在制备用于检测pTau181的试剂盒中的应用。
在本发明的一些实施方案中，检测pTau181的方法包括但不限于IHC法、酶联免疫吸附法、免疫印迹法和流式细胞法。
在本发明的一些实施方案中，利用所述抗pTau181单克隆抗体和抗Tau蛋白抗体组合基于流式细胞法检测生物样本中的pTau181。
在本发明一些具体实施方案中，将所述抗pTau181单克隆抗体和所述抗Tau蛋白抗体中的一种偶联微球，另一种偶联藻红蛋白荧光素。其中：
偶联微球步骤为：取浓度5×107个/mL荧光微球0.1mL，加入PBST缓冲液清洗2次，在清洗后的第一荧光微球中加入100μg的EDC和50μg的NHS放置30分钟以活化微球，加入100μg抗体在室温旋转反应5小时，清洗第一荧光微球去除多余抗体后加入质量分数为5％的脱脂奶粉封闭30分钟，去除脱脂奶粉后加入pH为7.2的Tris缓冲液保存，制得偶联微球的抗体溶液。
偶联藻红蛋白荧光素步骤为：取抗体与藻红蛋白荧光素以摩尔比1:30的比例在室温下震荡孵育5小时，以50K超滤管添加浓度为0.01mol/L的PBS溶液清洗3次以去除多余未结合藻红蛋白荧光素，得到荧光标记的抗体溶液。
在本发明的一些优选实施方案中，利用抗Tau蛋白抗体微球和藻红蛋白荧光素标记的所述抗pTau181单克隆抗体进行检测。
所述流式细胞法的检测步骤为：分别向流式管中加入偶联微球的抗体溶液、生物样本、荧光标记的抗体溶液，充分混合均匀，室温避光静置2.5h；加入洗涤缓冲液，通过涡旋将微球重悬，充分混合均匀，离心去上清震荡器震荡30s以上，加入300μL的1×洗涤缓冲液在流式细胞仪上检测荧光信号强度。
本发明第六方面提供一种用于检测pTau181的试剂盒，包括本发明第一方面任一所述的抗pTau181单克隆抗体或其抗原结合部分，或包括本发明第一方面任一所述的抗pTau181单克隆抗体或其抗原结合部分以及抗Tau蛋白抗体。
在本发明中，检测pTau181的存在或水平进一步用于相关疾病的预测、诊断、动态监测及预后评估。所述相关疾病选自阿尔茨海默病、路易体痴呆和额颞叶变性中的一种。
本发明的有益效果
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明的抗pTau181单克隆抗体具有亲和力高、特异性强的特点。利用本发明的抗pTau181单克隆抗体或其抗原结合部分与抗Tau蛋白抗体组合检测脑脊液或血液中的pTau181含量时，具有灵敏度高、特异性强、检测结果可靠的优势，有助于阿尔茨海默病等相关疾病的预测、诊断、动态监测及预后评估，具有非常高的临床应用价值。
附图说明
图1示出了本发明实施例1中纯化重组Tau蛋白的电泳检测结果。
图2示出了本发明实施例3中抗生素筛选的药物杀灭曲线。
图3示出了本发明实施例3中制备重组抗体各步骤的电泳检测结果。
具体实施方式
除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本申请中所有的份数和百分比都基于重量，且所用的测试和表征方法都是与本申请的提交日期同步的。在适用的情况下，本申请中涉及的任何专利、专利申请或公开的内容全部结合于此作为参考，且其等价的同族专利也引入作为参考，特别这些文献所披露的关于本领域中的相关术语的定义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本申请中提供的任何定义不一致，则以本申请中提供的术语定义为准。
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1 免疫抗原及筛选抗原的制备
依据人总Tau蛋白序列（GenBank Reference Sequence登录号：NP_005901.2），选取Tau最长亚型Tau-441序列，如下所示：
MAEPRQEFEVMEDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLKESPLQTPTEDGSEEPGSETSDAKSTPTAEDVTAPLVDEGAPGKQAAAQPHTEIPEGTTAEEAGIGDTPSLEDEAAGHVTQARMVSKSKDGTGSDDKKAKGADGKTKIATPRGAAPPGQKGQANATRIPAKTPPAPKTPPSSGEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRSRTPSLPTPPTREPKKVAVVRTPPKSPSSAKSRLQTAPVPMPDLKNVKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKIGSLDNITHVPGGGNKKIETHKLTFRENAKAKTDHGAEIVYKSPVVSGDTSPRHLSNVSSTGSIDMVDSPQLATLADEVSASLAKQGL（SEQ IDNo. 1）
优化得到其编码基因序列如下：
GCTGAACCCAGGCAAGAATTTGAGGTAATGGAGGACCATGCAGGCACCTATGGTTTGGGCGATCGTAAAGACCAGGGCGGCTATACGATGCACCAGGATCAAGAGGGTGATACCGACGCGGGACTGAAAGAAAGCCCGCTGCAGACCCCGACCGAAGACGGCAGCGAGGAGCCAGGCAGCGAGACAAGCGACGCTAAGAGTACTCCGACGGCTGAGGACGTTACCGCGCCTCTGGTTGATGAGGGTGCGCCGGGCAAGCAAGCAGCTGCACAGCCGCATACCGAGATCCCGGAAGGTACTACAGCCGAAGAAGCAGGTATTGGTGACACGCCGTCTCTGGAAGATGAGGCGGCGGGTCATGTCACCCAGGCGCGTATGGTGTCTAAGTCGAAGGACGGCACGGGTTCTGATGATAAAAAGGCTAAAGGGGCGGACGGCAAAACCAAAATCGCCACCCCGCGTGGTGCTGCGCCACCGGGTCAAAAAGGTCAGGCTAATGCAACCCGCATCCCGGCGAAAACGCCGCCGGCTCCGAAGACCCCACCGTCTAGCGGTGAACCGCCGAAGTCCGGTGATCGCAGCGGCTACAGCTCCCCAGGCTCCCCGGGCACGCCAGGTAGCCGCTCTCGTACCCCGTCCTTACCGACCCCTCCGACGCGTGAACCGAAGAAGGTGGCAGTTGTTCGTACGCCGCCGAAGTCACCCTCCTCTGCGAAGAGTCGCCTGCAAACCGCGCCGGTTCCGATGCCGGATCTTAAGAACGTGAAGTCCAAAATCGGTAGCACCGAGAACTTGAAGCACCAACCGGGAGGTGGCAAGGTGCAAATCATCAATAAAAAATTGGATCTGAGCAATGTGCAGAGCAAGTGTGGTAGCAAGGACAACATTAAACACGTGCCGGGCGGTGGTAGCGTCCAGATTGTGTACAAGCCGGTCGACCTGAGCAAAGTTACCAGCAAGTGCGGTAGCCTGGGCAACATCCACCATAAACCGGGTGGTGGTCAGGTAGAAGTGAAATCCGAAAAATTGGACTTCAAAGACAGAGTTCAAAGCAAGATTGGCTCCCTGGATAACATCACCCACGTTCCGGGTGGTGGCAATAAAAAAATTGAAACCCACAAATTGACCTTTCGTGAAAACGCCAAGGCGAAGACTGACCACGGCGCGGAGATTGTTTACAAATCGCCGGTGGTCTCTGGCGACACCTCCCCGCGTCATCTGTCCAACGTGAGCAGCACCGGTTCCATTGATATGGTTGACAGCCCGCAGCTGGCCACCCTGGCGGATGAGGTTAGCGCGAGCCTCGCCAAACAAGGACTG（SEQ ID No. 2）
将上述基因序列插入原核表达载体pET21a(+)的多克隆位点，引入酶切位点BamHI和Xho I，C端携带6×His标签，得到重组质粒。
合成上述总Tau蛋白序列第173~190位氨基酸所示多肽，C端添加一个半胱氨酸，氨基酸序列如下所示：
AKTPPAPKTPPSSGEPPKC（SEQ ID No. 3）
SEQ ID No. 3中第9位氨基酸（T）进行磷酸化修饰，并分别进行OVA和BSA载体蛋白的偶联，获得pTau181-OVA和pTau181-BSA多肽。
将上述重组质粒转化入大肠杆菌BL21（DE3）中，获得重组基因工程菌，进行诱导表达和镍柱纯化。
培养和诱导表达的条件为：37℃，220rpm培养约2.5h~3h，当OD值达到0.8~0.9时，加入0.5mM IPTG进行诱导，后以30℃，180rpm条件继续培养约4.5h，收集菌体。
重组Tau蛋白纯化步骤如下：收集50mL的菌体于50mL的细菌裂解液（pH 8.0，50mMTris，5mM咪唑，1% Triton X-100，1mM PMSF）充分重悬，于冰水混合物中使用超声破碎菌体（300W，5s-5s-10min）。破碎后进行离心得到上清和沉淀，上清使用0.45μM PVDF滤膜过滤后进行镍柱纯化。使用1mL填料装柱，结合液（pH 8.0，10mM PBS，5mM咪唑）平衡镍柱后进行上样，继续使用2倍柱体积结合液冲洗，用8~10倍柱体积清洗液（pH 8.0，10mM PBS，50mM咪唑）清洗杂带6次，2倍柱体积洗脱液（pH 8.0，10mM PBS，500mM咪唑）洗脱目的蛋白2次，各步收集液蛋白电泳如图1，获得重组Tau蛋白。
从图1可知，离心后，目标大小（64kD）的条带集中在上清液中；镍柱上样并利用结合液，上样穿透液（柱后）、冲洗液（洗杂）中主要为杂带蛋白；清洗液冲洗后，清洗液（50mM）前半段含有大量杂带蛋白和小部分目标蛋白，而后半段中杂带减少至含有少量目标蛋白；洗脱液冲洗后，洗脱液（500mM）中主要为目标蛋白。
实施例2 抗pTau181单克隆抗体的制备
1. 免疫
使用实施例1合成的pTau181-OVA多肽进行小鼠免疫。首次免疫使用弗式完全佐剂与pTau181-OVA多肽等量混合乳化，对小鼠四肢及腹部进行皮下注射，注射量为100μg抗原/只小鼠；两周后，进行第二次免疫，使用弗式不完全佐剂与pTau181-OVA多肽等量混合乳化，对小鼠四肢及腹部进行皮下注射，注射量为100μg抗原/只小鼠；两周后，进行第三次免疫，操作与第二次免疫相同。第三次免疫一周后，剪尾采血，离心取血清进行效价检测，使用pTau181-BSA包被酶标板，将血清梯度稀释（100倍、500倍、2500倍、12500倍、62500倍、312500倍、1562500倍）进行测定，0.01M PBS作为空白对照，未免疫小鼠血清作为阴性对照。结果如表1所示。
表1 小鼠尾血清效价检测
从表1可知，当血清稀释62500倍的吸光度值/空白值>2.5时且稀释62500倍数的OD值在1.0左右时，已经达到可用效价。对达到可用效价的小鼠在一周后进行加强免疫，将100μg pTau181-OVA多肽直接注射于脾脏内，加强免疫3天后进行细胞融合实验。
2. 细胞融合
取加强免疫小鼠后的脾细胞与达到对数生长期的Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞，使用1640培养基分别清洗后计数，按4:1~5:1比例（总细胞量约为1×108）混合于50mL离心管中。混合后使用1640培养基清洗两次，向混合细胞沉淀于37℃水浴中匀速滴入1mL 预热好的PEG溶液，再加入预热好的50mL 1640培养基，由滴至流，整个过程轻轻晃动离心管混合并于5min之内结束。静置约2min，将离心管于800rpm离心3min。弃上清，细胞沉淀使用约200mL含有15%胎牛血清、1%双抗、2% HAT的IMDM培养基进行充分悬浮，同时加入1×105/mL的饲养细胞提供特异性的生长刺激因子有助杂交瘤细胞生长，进行96孔板铺板，于5% CO2的37℃细胞培养箱内培养。
3. 阳性单克隆筛选
细胞融合后一周，取96孔板细胞上清进行阳性检测。使用pTau181-BSA多肽、重组Tau蛋白分别进行酶标板包被，包被浓度为1μg/mL。挑取细胞上清约50μL分别加入两种包被板，0.01M PBS作为空白对照，免疫小鼠眼血清作为阳性对照，37℃孵育30min；使用PBST（pH7.4，0.01M PBS，1%Tween）清洗两次后加入0.05μg/mL羊抗鼠HRP二抗50μL，37℃孵育30min；使用PBST清洗两次后加入100μL显色液，37℃孵育10min后加入50μL 1M硫酸终止反应，使用酶标仪在450nm和630nm处测定吸光度值，选取仅对pTau181-BSA多肽产生阳性的细胞继续进行有限稀释再次分散克隆，直到挑选到单孔单克隆阳性细胞。对单克隆阳性细胞上清进行效价测定（分别稀释5倍、25倍、125倍），最终筛选到可产生高抗原结合力的抗磷酸化pTau181抗体的单克隆细胞（冻存编号为10.5），如表2。
表2 杂交瘤细胞上清效价检测
实施例3 杂交瘤细胞测序及重组抗体制备
1. 单克隆抗体亚型检测
使用即用型小鼠单抗Ig类/亚类/亚型鉴定用酶标二抗套装（产品厂商：Frdbio，产品货号：FRD90100P8）进行单克隆抗体的亚型检测，检测结果为IgG1/Kappa。
2. 抗体可变区测序
委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行杂交瘤测序，H链（重链）可变区全长核苷酸序列如下：
CTGCAGCAGCCTGGCTCTGAGTACGCCAGGCCTGGCGCCTCTGTGAAGCTGTCCTGTAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACAAGCTATTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCACGGCCAGCTGTTGGAGTGGATCGGCAACATCTACCCCGGCTCCGGGTCTTCCAACTACGACGAGAAGTTCAAGAGCAAGGGCACACTGACCGTGGACACAAGTAGCTCCACCGCATACATGCACCTGTCCAGCCTGACCAGCGAAGACAGCGCCGTGTATTACTGCACCAGAAGCGGCTGGCTGCTGCGAGATTACGCTATGGATTACTGGGGACAGGGAACCAGCGTGACCGTGAGCAGC（SEQ ID No. 4）
H链（重链）可变区全长氨基酸序列如下：
LQQPGSEYARPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRHGQLLEWIGNIYPGSGSSNYDEKFKSKGTLTVDTSSSTAYMHLSSLTSEDSAVYYCTRSGWLLRDYAMDYWGQGTSVTVSS（SEQ ID No. 5）
H链（重链）的3个CDRs序列（由https://www.imgt.org/IMGT_vquest/analysis预测）分别如下：
CDR-H1氨基酸序列为：SYWMH（SEQ ID No. 6）；
CDR-H2氨基酸序列为：NIYPGSGSSNYDEKFKS（SEQ ID No. 7）；
CDR-H3氨基酸序列为：SGWLLRDYAMDY（SEQ ID No. 8）。
L链（轻链）可变区全长核苷酸序列如下：
GACGTGCTGATGACCCAGACCCCCCTGAGCCTGCCCGTGTCCCTGGGCGACCAGGCCTCCATTTCTTGTAGATCCTCACAGTCCATCGTGCACTCTAACGGGAACACCTACCTGGAGTGGTACCTGCAGAAGCCCGGACAGTCTCCAAAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCTACAAGATTCAGCGGAGTGCCAGACCGGTTCAGCGGAAGCGGGTCCGGCACCGACTTCACTCTGAAAATCAGCAGGGTGGAGGCTGAAGATCTGGGCGTGTACTACTGTTTCCAGGGCAGCCACGTGCCTTACACATTTGGCGGCGGGACTAAGCTGGAGATCAAG（SEQ ID No. 9）
L链（轻链）可变区全长氨基酸序列如下：
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSTRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIK（SEQ ID No. 10）
L链（轻链）的3个CDRs序列（由https://www.imgt.org/IMGT_vquest/analysis预测）分别如下：
CDR-L1氨基酸序列为：RSSQSIVHSNGNTYLE（SEQ ID No. 11）；
CDR-L2氨基酸序列为：KVSTRFS（SEQ ID No. 12）；
CDR-L3氨基酸序列为：FQGSHVPYT（SEQ ID No. 13）。
3. 抗生素筛选
按照1:15比例接种CHO细胞于24孔板中，第二天细胞汇合度约为25%时，将培养液换成含抗生素（G418/Zeocin）的培养基，抗生素浓度按梯度递增。选定细胞在7-10天内全部死亡的最低药物浓度为筛选浓度，如药物杀灭曲线图2可知：G418抗性致全部细胞死亡的最低浓度为800μg/mL，Zeocin抗性致全部细胞死亡的最低浓度为50μg/mL。
4. 重组抗体制备
委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行重组抗体质粒合成。
将小鼠重链信号肽、重链可变区全长、小鼠IgG1恒定区的编码核苷酸序列，插入真核表达载体pcDNA3.4的多克隆位点，引入酶切位点XbaI/AflII，进行全基因合成。其中，
小鼠重链信号肽氨基酸序列如下：
GWSCIILFLVATATGVHSQVQ（SEQ ID No. 14）
其编码核苷酸序列如下：
GGATGGAGCTGTATCATCCTGTTTCTGGTGGCTACAGCCACAGGCGTGCACAGCCAGGTGCAG（SEQID No. 15）
小鼠IgG1恒定区氨基酸序列如下：
AKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK（SEQ ID No. 16）
其编码核苷酸序列如下：
GCCAAGACAACACCCCCTAGCGTGTACCCTCTGGCCCCAGGCTCTGCCGCCCAGACCAACTCTATGGTGACCCTGGGGTGTCTGGTGAAAGGCTACTTCCCCGAACCTGTGACCGTGACATGGAATAGCGGAAGTCTGTCTAGCGGCGTGCACACTTTTCCTGCCGTGCTGCAGTCCGATCTGTACACACTGTCCTCCTCCGTGACTGTGCCTAGCTCTACCTGGCCTAGCGAGACCGTGACCTGTAACGTGGCTCACCCAGCCTCTAGTACAAAGGTGGATAAGAAAATTGTGCCTAGAGACTGCGGCTGCAAACCATGTATCTGCACAGTGCCAGAGGTGTCCTCTGTGTTTATTTTCCCTCCCAAGCCTAAGGACGTCCTGACCATCACCTTGACACCCAAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACATCTCCAAGGATGACCCTGAGGTGCAGTTTAGCTGGTTCGTGGATGACGTGGAGGTGCACACTGCCCAGACCCAGCCTCGGGAGGAGCAGTTTAACAGCACTTTCCGGTCTGTGAGCGAGCTGCCAATCATGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAATTTAAGTGTAGAGTGAACAGCGCCGCCTTTCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATTTCCAAAACCAAGGGCCGGCCTAAGGCCCCTCAGGTGTACACCATCCCCCCTCCAAAGGAGCAGATGGCTAAGGACAAAGTGTCCCTGACTTGTATGATCACAGACTTCTTCCCTGAAGATATCACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCCGCCGAGAACTACAAGAATACCCAGCCTATCATGGACACAGACGGCAGCTACTTCGTGTACTCAAAGCTGAATGTGCAGAAGTCAAACTGGGAGGCTGGCAATACCTTCACCTGTTCCGTGCTGCACGAGGGCCTGCACAACCACCACACTGAGAAAAGCCTGAGCCATTCCCCTGGCAAG（SEQ IDNo. 17）
选取小鼠Kappa链信号肽、轻链可变区全长、小鼠Kappa链恒定区的编码核苷酸序列，插入真核表达载体pcDNA3.1 Zeo(+)的多克隆位点，引入酶切位点AflII/XbaI，进行全基因合成。其中，
小鼠Kappa链信号肽氨基酸序列如下：
KLPVRLLVLMFWIPASNS（SEQ ID No. 18）
其编码核苷酸序列如下：
AAGCTGCCTGTGAGGCTGCTGGTGCTGATGTTCTGGATCCCTGCCAGCAACAGC（SEQ ID No. 19）
小鼠Kappa链恒定区氨基酸如下：
ADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC（SEQ ID No. 20）
其编码核苷酸序列如下：
GCTGACGCCGCCCCCACCGTGTCCATCTTCCCCCCCTCTTCCGAACAGCTGACTAGCGGCGGCGCCAGCGTGGTGTGCTTCCTGAACAACTTCTATCCCAAGGATATCAACGTCAAGTGGAAGATCGACGGCTCTGAGCGGCAGAACGGCGTGCTGAATTCCTGGACCGACCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACTCAATGAGTAGCACTCTGACCCTGACCAAGGACGAGTACGAGAGGCACAATTCCTACACCTGTGAGGCCACCCACAAGACTTCTACAAGCCCAATCGTGAAGAGCTTCAATAGGAACGAGTGT（SEQ ID No. 21）
将2个重组质粒转入大肠杆菌TOP10中，大量培养后使用质粒大提试剂盒进行质粒提取。
按照重链轻链1:1的比例使用脂质体转染试剂转染CHO细胞，于8% CO2的37℃细胞培养箱内培养。转染72小时后按1:10的比例将转染细胞在12孔板中传代，换为含上述实验中确定的抗生素浓度的选择培养基。继续培养48小时后，在12孔板内可见单个细胞分裂繁殖形成单个集落，将细胞消化下来后做连续的10倍稀释（102-1010），将每一稀释度的细胞滴加到96孔板中培养，一周后，选择单个克隆生长的孔再一次进行克隆，最终挑选到稳定的单克隆细胞株。
将单克隆细胞株进行扩大培养，在培养的第2/3/4天连续加入补充培养基，当细胞密度大于1×107时，转入8% CO2的33℃细胞培养箱内培养。第14天左右停止培养，离心收集细胞上清，使用0.45μM PVDF滤膜过滤后，使用Protein A亲和层析柱进行抗体纯化。具体步骤为：使用1mL ProteinA填料进行装柱，加入20倍柱体积的平衡液（pH7.4，0.01M PBS）进行平衡，将25mL滤后细胞上清缓慢过柱，使用2倍柱体积平衡液（pH7.4，0.01M PBS）进行洗杂，使用2倍柱体积洗脱液（pH 3.0，0.1M 甘氨酸）进行洗脱2次，洗脱后马上加入1/10洗脱液体积中和液（pH 8.0，1M Tris）。中和的洗脱液于pH7.4 0.01M PBS中透析3次，每次时长大于8h，收样后测定浓度冻存于-20℃。各步收集液进行蛋白电泳，如图3。
从图3可知，细胞上清经过亲和纯化，成功富集了抗体蛋白。与原液相比，流穿液中除抗体轻重链之外的杂蛋白条带没有变化，即亲和柱与杂蛋白几乎无结合；平衡液洗杂后，洗涤液中仅有少许杂蛋白条带，即抗体蛋白与亲和柱结合较为牢固；洗脱液冲洗，洗脱液中主要条带为目标抗体轻重链条带，纯度>95%。
实施例4 重组抗体应用于检测脑脊液及血液中pTau181含量的流式体外诊断
将实施例3纯化后的重组抗体分别与抗Tau蛋白抗体（Tau-1：厂家SynapticSystems 货号314 011；Tau-2：厂家QED货号57013；Tau-3：厂家thermofisher货号 13-6400；Tau-4：厂家NOVUS货号NBP2-25162；Tau-5：厂家NOVUS货号NBP2-50051；Tau-6：厂家biolegend货号806701；Tau-7：厂家abcam货号ab254256；Tau-8：厂家abcam货号ab312308；Tau-9：厂家abcam货号ab76128；Tau-10厂家abcam货号ab254150）配对，用于血液及脑脊液中的Tau蛋白生物标志物流式细胞仪检测。
在本实施例中，提供两种偶联方案进行检测：
（1）将10种抗Tau蛋白抗体分别偶联微球，实施例3制备的重组抗体偶联藻红蛋白荧光素；
（2）将10种抗Tau蛋白抗体分别偶联藻红蛋白荧光素，实施例3制备的重组抗体偶联微球。
偶联微球步骤为：取浓度5×107个/mL荧光微球（厂家Biolegend，货号740169）0.1mL，加入PBST缓冲液清洗2次，在清洗后的微球中加入100μg的EDC和50μg的NHS放置30分钟以活化微球，加入100μg抗体在室温旋转反应5小时，清洗荧光微球去除多余抗体后加入质量分数为5％的脱脂奶粉封闭30分钟，去除脱脂奶粉后加入pH为7.2的Tris缓冲液保存，制得偶联微球的抗体溶液。
偶联藻红蛋白荧光素步骤为：取抗体与藻红蛋白荧光素以摩尔比1:30的比例在室温下震荡孵育5小时，以50K超滤管添加浓度为0.01mol/L的PBS溶液清洗3次以去除多余未结合藻红蛋白荧光素，得到荧光标记的抗体溶液。
检测步骤为：分别向流式管中加入25μL 100倍稀释的偶联微球的抗体溶液，25μL样本（脑脊液样品或是血清样品或是校准品），25μL 200倍稀释的荧光标记的抗体溶液，充分混合均匀，室温避光静置2.5h；加入1000μL的洗涤缓冲液（pH7.4，2.5mM Tris，2mM NaCl，0.08% ProClin300，0.06% Tween20，0.01%道康宁-1520），通过涡旋将微球重悬，充分混合均匀，离心去上清震荡器震荡30s以上，加入300μL的1×洗涤缓冲液在迈瑞公司生产的BriCyteE6流式细胞仪上检测荧光信号强度。
选取5μg/mL pTau181标准品对上述两种偶联方案的抗体对进行筛选，结果如表3和表4，结果显示，使用抗Tau蛋白抗体Tau-2/Tau-3偶联的微球与藻红蛋白荧光素标记的抗pTau181组成的抗体对，对pTau181标准品的检测荧光信号较强，其中偶联微球的Tau-2抗体与荧光标记的pTau181单抗组成的抗体对检测pTau181标准品的荧光信号强度达到343000，偶联微球的Tau-3抗体与荧光标记的pTau181单抗组成的抗体对检测pTau181标准品的荧光信号强度更是高达420000。
表3 第一种偶联方案的抗体对检测pTau181标准品的数据（荧光信号强度）
表4 第二种偶联方案的抗体对检测pTau181标准品的数据（荧光信号强度）
选取40个临床样本，其中患有早期阿尔茨海默病的病例25例，正常人15例，使用流式细胞法进行检测，血浆检测浓度大于1.04pg/mL，脑脊液检测浓度69.8pg/mL，即计为阳性，结果如表5。
表5 临床样本检测结果
从表5可以看出，利用重组抗体检测与病理检测结果具有96%的符合性，其中脑脊液样品符合性为100%。说明重组抗体应用于检测脑脊液及血液中pTau181含量的流式体外诊断时，具有灵敏度高、特异性强、检测结果可靠的优势。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1. 一种抗pTau181单克隆抗体或其抗原结合部分，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的全长氨基酸序列如SEQ ID No. 5所示，所述轻链可变区的全长氨基酸序列如SEQ ID No. 10所示。
2. 根据权利要求1所述的抗pTau181单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述抗pTau181单克隆抗体重链可变区CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的氨基酸序列分别如SEQ ID No.6~SEQ ID No. 8所示；轻链可变区CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3的氨基酸序列分别如SEQ ID No.11~SEQ ID No. 13所示。
3.根据权利要求1或2所述的抗pTau181单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述抗pTau181单克隆抗体为基因重组抗体。
4.根据权利要求1或2所述的抗pTau181单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述抗原结合部分选自Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段和scFv片段中的一种。
5. 编码权利要求1~4任一所述的抗pTau181单克隆抗体或其抗原结合部分的基因，其特征在于，编码重链可变区全长的基因包括SEQ ID No. 4所示核苷酸序列，编码轻链可变区全长的基因包括SEQ ID No. 9所示核苷酸序列。
6.一种重组载体，其特征在于，包括权利要求5所述的基因。
7.一种重组细胞，其特征在于，包括权利要求6所述的重组载体。
8.权利要求1~4任一所述的抗pTau181单克隆抗体或其抗原结合部分在制备用于检测pTau181的试剂盒中的应用。
9.一种用于检测pTau181的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1~5任一所述的抗pTau181单克隆抗体或其抗原结合部分以及抗Tau蛋白抗体。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述抗pTau181单克隆抗体或其抗原结合部分和所述抗Tau蛋白抗体中的一种偶联微球，另一种偶联藻红蛋白荧光素。
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