CN117946264A - 一种抗Tau蛋白单克隆抗体及其应用 - Google Patents
一种抗Tau蛋白单克隆抗体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种抗Tau蛋白单克隆抗体及其应用，属于抗体技术领域。本发明的抗Tau蛋白单克隆抗体具有亲和力高、特异性强的特点。利用本发明的抗Tau蛋白单克隆抗体或其抗原结合部分与选自抗Tau中段蛋白抗体、抗pTau181抗体、抗pTau217抗体、抗pTau231抗体中的一种抗体组合检测血液及脑脊液中Tau蛋白含量时，具有灵敏度高、特异性强、检测结果可靠的优势，有助于阿尔茨海默病等相关疾病的预测、诊断、动态监测及预后评估，具有非常高的临床应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及抗体技术领域，具体地，涉及一种抗Tau蛋白单克隆抗体及其应用。
背景技术
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种与年龄老化程度相关的神经元退行性疾病，其主要临床症状表现为进行性痴呆，其主要病理特征表现为由β淀粉样肽聚集成的神经炎性斑、由过度磷酸化Tau的聚集形成的神经纤维缠结和神经元丢失死亡等。AD与许多神经退化疾病（如额颞叶型痴呆、进行性核上性麻痹等）同属于Tau蛋白病，即病理特征都存在异常Tau蛋白的聚集和沉淀，由此推测Tau蛋白似乎为相关神经退化性疾病中认知丧失中的主要参与者。
AD患者的早期临床症状几乎无法察觉，而当AD患者出现明显的记忆衰退和执行功能障碍等症状时，大脑已经发生了不可逆的病理损伤。因此，为了帮助患者尽早确诊和开始阿尔茨海默病的治疗，需要对AD进行可靠和灵敏的诊断。目前批准的正电子发射断层扫描（PET）诊断测试是一种高成本的检测手段，不利于患者长期地跟踪诊疗。
Tau蛋白虽然是一种胞内蛋白，但它可以以游离的形式或细胞外囊泡的形式排到细胞外，目前研究结果证实，使用脑脊液总Tau和pTau作为AD生物标志物时能够有效提高正确诊断患者的百分比。相比较PET-CT等影像学手段，该生物标志物组合的检测将有助于AD的早期发现以及治疗效果的动态追踪。
体外检测总Tau和pTau的含量均必须使用到抗Tau蛋白抗体，而现有抗Tau蛋白抗体种类繁多，但大多亲和力不足、特异性差或结合位点不能与pTau抗体配对检测。
发明内容
为了解决上述技术问题，发明人以包含Tau蛋白的2~44位、103～277位和308~441位氨基酸的抗原进行动物免疫，以分别包含Tau蛋白的2~44位、103～277位、308~441位氨基酸抗原包被酶标板进行Elisa筛选，制备出特异性靶向后段Tau蛋白的单克隆抗体，该抗体亲和力高、特异性强，从而完成本发明。
本发明第一方面提供一种抗Tau蛋白单克隆抗体或其抗原结合部分，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的全长氨基酸序列如SEQ ID No. 7所示，所述轻链可变区的全长氨基酸序列如SEQ ID No. 12所示。
微管系统是神经细胞骨架成分，可参与多种细胞功能。微管由微管蛋白及微管相关蛋白组成，Tau蛋白是含量最高的微管相关蛋白。正常脑中Tau蛋白的细胞功能是与微管蛋白结合促进其聚合形成微管；与形成的微管结合，维持微管稳定性，降低微管蛋白分子的解离，并诱导微管成束。Tau蛋白基因位于17染色体长臂。正常人中由于Tau蛋白mRNA剪辑方式不同，可表达出6种剪接体。其中，最短亚型为Tau-352，长度为352个氨基酸，包含总Tau蛋白的第2~44位、第103～277位和第308~441位氨基酸。进一步，在本发明中，第2-44位称为前段Tau蛋白；第103～277位称为中段Tau蛋白；第308~441位称为后段Tau蛋白。
在本发明中，所述抗Tau蛋白单克隆抗体靶向后段Tau蛋白。研究表明，聚合Tau蛋白由于蛋白酶作用，易造成N端截断，因此靶向中后段Tau蛋白的抗体可能具有更大的优势。
在本发明的一些具体实施方案中，所述抗Tau蛋白单克隆抗体重链可变区CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的氨基酸序列分别如SEQ ID No. 8~SEQ ID No. 10所示；轻链可变区CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3的氨基酸序列分别如SEQ ID No. 13~SEQ ID No. 15所示。
在本发明的一些具体实施方案，所述抗Tau蛋白单克隆抗体为基因重组抗体。
在本发明的一些具体实施方案，所述抗原结合部分选自Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段和scFv片段中的一种。
其中，自Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段是可以从IgG和IgM的可变区产生的抗原结合部分。F(ab')2片段包含两个抗原结合区，通过二硫键在铰链处连接；Fab'片段可通过还原F(ab')2片段形成，即Fab'片段衍生自F(ab')2片段；Fab片段是由IgG和IgM产生的单价片段，由通过分子内二硫键连接的VH、CH1和VL、CL区组成；Fv片段是由IgG和IgM产生的最小片段，包含完整抗原结合位点。Fv片段具有与Fab相同的结合特性和相似的三维结合特性。
单链抗体（single-chain variable fragment，scFv）是由抗体重链的可变区与轻链的可变区在一段肽链的连接下构成的小分子，是具有抗体活性的最小功能结构单位。
本发明第二方面提供编码本发明第一方面任一所述的抗Tau蛋白单克隆抗体或其抗原结合部分的基因，编码重链可变区全长的基因包括SEQ ID No. 6所示核苷酸序列，编码轻链可变区全长的基因包括SEQ ID No. 11所示核苷酸序列。
本发明第三方面提供一种重组载体，包括本发明第二方面所述的编码本发明第一方面任一所述的抗Tau蛋白单克隆抗体或其抗原结合部分的基因。
重组载体可以指克隆载体，也可以指表达载体，可以通过将编码核酸与商购的载体（如质粒或病毒载体）连接而获得，本发明中的重组载体不受特别限制，常用的质粒均可使用，如pSeTag2、pEE14、pMH3、pcDNA3.1、pcDNA3.4等。
在本发明的一些实施方案如此，分别将编码重链可变区全长的核酸和编码轻链可变区全长的核酸连接至不同的表达载体上，得到两种重组载体。
在本发明的一些具体实施方案中，将小鼠重链信号肽、重链可变区全长、小鼠IgG1恒定区的编码核苷酸序列，插入真核表达载体pcDNA3.4的多克隆位点，形成表达重链可变区的重组载体；将小鼠Kappa链信号肽、轻链可变区全长、小鼠Kappa链恒定区的编码核苷酸序列，插入真核表达载体pcDNA3.1 Zeo(+)的多克隆位点，形成表达轻链可变区的重组载体。
在本发明的一些优选实施方案中，所述小鼠重链信号肽氨基酸序列如SEQ ID No.16所示，其核苷酸序列如SEQ ID No. 17所示；所述小鼠IgG1恒定区氨基酸序列如SEQ IDNo. 18所示，其核苷酸序列如SEQ ID No. 19所示。
在本发明的一些优选实施方案中，所述小鼠Kappa链信号肽氨基酸序列如SEQ IDNo. 20所示，其核苷酸序列如SEQ ID No. 21所示；所述小鼠Kappa链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No. 22所示，其核苷酸序列如SEQ ID No. 23所示。
本发明第四方面提供一种重组细胞，包括本发明第三方面所述的重组载体。
所述重组细胞携带前面所述的基因、重组载体或转化子、或抗Tau蛋白单克隆抗体或抗原结合片段。所述重组细胞是通过转染或者转化所述重组载体获得的。
在本发明的一些实施方案中，将上述表达重链可变区的重组载体和表达轻链可变区的重组载体按1:1的比例使用脂质体转染试剂进行转染得到重组细胞。
根据本发明的实施例，所述重组细胞在适合条件下可高效表达上述抗Tau蛋白单克隆抗体。
需要注意的是，本发明所述重组细胞不受特别限制，可以为原核细胞、真核细胞或噬菌体。所述原核细胞可以为大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌或奇异变形菌等。所述真核细胞可以为包括巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、裂殖酵母、木霉等真菌，草地粘虫等昆虫细胞、烟草等植物细胞，BHK细胞、CHO细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞等哺乳动物细胞。在一些实施例中，本发明所述重组细胞优选为哺乳动物细胞，包括BHK细胞、CHO细胞、NS0细胞或COS细胞，且不包括动物生殖细胞、受精卵或胚胎干细胞。
需要说明的是，本申请说明书中所述的“适合条件”，是指适合本申请所述抗Tau蛋白单克隆抗体表达的条件。本领域技术人员容易理解的是，适合抗Tau蛋白单克隆抗体表达的条件包括但不限于合适的转化或转染方式、合适的转化或转染条件、健康的宿主细胞状态、合适的宿主细胞密度、适宜的细胞培养环境、适宜的细胞培养时间。“适合条件”不受特别限制，本领域技术人员可根据实验室的具体环境，优化最适的所述抗Tau蛋白单克隆抗体表达的条件。
本发明第五方面提供本发明第一方面任一所述的抗Tau蛋白单克隆抗体或其抗原结合部分在制备用于检测Tau蛋白的试剂盒中的应用。
在本发明的一些实施方案中，检测Tau蛋白的方法选自IHC法、酶联免疫吸附法、免疫印迹法、化学发光法和流式细胞法。
在本发明的一些实施方案中，利用所述抗Tau蛋白单克隆抗体和选自抗Tau中段蛋白抗体或抗磷酸化Tau蛋白抗体的组合检测生物样本中的Tau相关蛋白。其中，所述Tau相关蛋白包括但不限于Tau不同天然剪接体和磷酸化Tau蛋白（如pTau181、pTau217、pTau231等）。
在本发明的一些具体实施方案中，利用双抗体夹心酶联免疫吸附法进行检测。具体地，利用选自抗Tau中段蛋白抗体或抗磷酸化Tau蛋白抗体进行酶标板包被；再加入相应的抗原37℃孵育30min；使用PBST清洗两次后加入所述抗Tau蛋白单克隆抗体，37℃孵育30min；使用PBST清洗两次后加入HRP标记的羊抗鼠IgG抗体，使用PBST清洗两次后加入显色液，37℃孵育10min后终止反应，使用酶标仪在450nm和630nm处测定吸光度值。
在本发明的一些实施方案中，所述磷酸化Tau蛋白选自pTau181、pTau217和pTau231中的一种。相应地，所述抗磷酸化Tau蛋白抗体选自抗pTau181抗体、抗pTau217抗体和抗pTau231抗体中的一种。
进一步地，所述抗原选自Tau-352蛋白、磷酸化Tau-352蛋白、pTau181-BSA多肽、pTau217-BSA多肽、pTau231-BSA多肽中的至少一种。
本发明第六方面提供一种用于检测Tau蛋白的试剂盒，包括本发明第一方面任一所述的抗Tau蛋白单克隆抗体或其抗原结合部分以及抗Tau/pTau蛋白抗体。
在本发明中，检测Tau蛋白的存在或水平进一步用于相关疾病的预测、诊断、动态监测及预后评估。所述相关疾病选自阿尔茨海默病、路易体痴呆和额颞叶变性中的一种。
本发明的有益效果
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明的抗Tau蛋白单克隆抗体具有亲和力高、特异性强的特点。利用本发明的使用抗Tau蛋白单克隆抗体或其抗原结合部分与抗Tau/pTau蛋白抗体组合检测脑脊液或血液中的Tau相关蛋白含量时，具有灵敏度高、特异性强、检测结果可靠的优势，有助于阿尔茨海默病等相关疾病的预测、诊断、动态监测及预后评估，具有非常高的临床应用价值。
附图说明
图1示出了本发明实施例1中纯化Tau-352蛋白的电泳检测结果。
图2示出了本发明实施例1中纯化中段Tau蛋白的电泳检测结果。
图3示出了本发明实施例1中纯化后段Tau蛋白的电泳检测结果。
图4示出了本发明实施例1中纯化前段Tau蛋白的电泳检测结果。
图5示出了本发明实施例3中制备重组抗体各步骤的电泳检测结果。
具体实施方式
除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本申请中所有的份数和百分比都基于重量，且所用的测试和表征方法都是与本申请的提交日期同步的。在适用的情况下，本申请中涉及的任何专利、专利申请或公开的内容全部结合于此作为参考，且其等价的同族专利也引入作为参考，特别这些文献所披露的关于本领域中的相关术语的定义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本申请中提供的任何定义不一致，则以本申请中提供的术语定义为准。
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1 免疫抗原及筛选抗原的制备
人Tau编码基因由于mRNA合成加工时外显子的选择性剪接，可以分成六种不同的亚型（氨基酸长度为352~441）。依据人总Tau蛋白序列（GenBank Reference Sequence登录号：NP_005901.2），选取Tau最短亚型Tau-352序列，长度为352氨基酸，包含总Tau蛋白的第2~44位（前段Tau蛋白）、第103～277位（中段Tau蛋白）和第308~441位氨基酸（后段Tau蛋白），序列如下所示：
AEPRQEFEVMEDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLKAEEAGIGDTPSLEDEAAGHVTQARMVSKSKDGTGSDDKKAKGADGKTKIATPRGAAPPGQKGQANATRIPAKTPPAPKTPPSSGEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRSRTPSLPTPPTREPKKVAVVRTPPKSPSSAKSRLQTAPVPMPDLKNVKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIIVYKPVDLSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKIGSLDNITHVPGGGNKKIETHKLTFRENAKAKTDHGAEIVYKSPVVSGDTSPRHLSNVSSTGSIDMVDSPQLATLADEVSASLAKQGL（SEQ ID No. 1）
优化得到其编码基因序列如下：
GCGGAACCGCGCCAGGAATTTGAAGTGATGGAAGATCATGCGGGCACCTATGGCCTGGGCGATCGCAAAGATCAGGGCGGCTATACCATGCATCAGGATCAGGAAGGCGATACCGATGCGGGCCTGAAAGCGGAAGAAGCGGGCATTGGCGATACCCCGAGCCTGGAAGATGAAGCGGCGGGCCATGTGACCCAGGCGCGCATGGTGAGCAAAAGCAAAGATGGCACCGGCAGCGATGATAAAAAAGCGAAAGGCGCGGATGGCAAAACCAAAATTGCGACCCCGCGCGGCGCGGCGCCGCCGGGCCAGAAAGGCCAGGCGAACGCGACCCGCATTCCGGCGAAAACCCCGCCGGCGCCGAAAACCCCGCCGAGCAGCGGCGAACCGCCGAAAAGCGGCGATCGCAGCGGCTATAGCAGCCCGGGCAGCCCGGGCACCCCGGGCAGCCGCAGCCGCACCCCGAGCCTGCCGACCCCGCCGACCCGCGAACCGAAAAAAGTGGCGGTGGTGCGCACCCCGCCGAAAAGCCCGAGCAGCGCGAAAAGCCGCCTGCAGACCGCGCCGGTGCCGATGCCGGATCTGAAAAACGTGAAAAGCAAAATTGGCAGCACCGAAAACCTGAAACATCAGCCGGGCGGCGGCAAAGTGCAGATTATTGTGTATAAACCGGTGGATCTGAGCAAAGTGACCAGCAAATGCGGCAGCCTGGGCAACATTCATCATAAACCGGGCGGCGGCCAGGTGGAAGTGAAAAGCGAAAAACTGGATTTTAAAGATCGCGTGCAGAGCAAAATTGGCAGCCTGGATAACATTACCCATGTGCCGGGCGGCGGCAACAAAAAAATTGAAACCCATAAACTGACCTTTCGCGAAAACGCGAAAGCGAAAACCGATCATGGCGCGGAAATTGTGTATAAAAGCCCGGTGGTGAGCGGCGATACCAGCCCGCGCCATCTGAGCAACGTGAGCAGCACCGGCAGCATTGATATGGTGGATAGCCCGCAGCTGGCGACCCTGGCGGATGAAGTGAGCGCGAGCCTGGCGAAACAGGGCCTG（SEQ ID NO. 2）
将SEQ ID No. 2所示的编码基因序列插入原核表达载体pET21a(+)的多克隆位点，引入酶切位点BamHI和Xho I，C端携带6×His标签，得到表达Tau-352蛋白的重组质粒。
合成前段Tau蛋白的编码基因序列：
GCGGAACCGCGCCAGGAATTTGAAGTGATGGAAGATCATGCGGGCACCTATGGCCTGGGCGATCGCAAAGATCAGGGCGGCTATACCATGCATCAGGATCAGGAAGGCGATACCGATGCGGGCCTGAAA（SEQ ID No. 3）
将SEQ ID No. 3所示的编码基因序列插入原核表达载体pET32a(+)的多克隆位点，引入酶切位点BamHI和Xho I，N端携带6×His 标签，得到表达前段Tau蛋白的重组质粒。
合成中段Tau蛋白的编码基因序列：
GCGGAAGAAGCGGGCATTGGCGATACCCCGAGCCTGGAAGATGAAGCGGCGGGCCATGTGACCCAGGCGCGCATGGTGAGCAAAAGCAAAGATGGCACCGGCAGCGATGATAAAAAAGCGAAAGGCGCGGATGGCAAAACCAAAATTGCGACCCCGCGCGGCGCGGCGCCGCCGGGCCAGAAAGGCCAGGCGAACGCGACCCGCATTCCGGCGAAAACCCCGCCGGCGCCGAAAACCCCGCCGAGCAGCGGCGAACCGCCGAAAAGCGGCGATCGCAGCGGCTATAGCAGCCCGGGCAGCCCGGGCACCCCGGGCAGCCGCAGCCGCACCCCGAGCCTGCCGACCCCGCCGACCCGCGAACCGAAAAAAGTGGCGGTGGTGCGCACCCCGCCGAAAAGCCCGAGCAGCGCGAAAAGCCGCCTGCAGACCGCGCCGGTGCCGATGCCGGATCTGAAAAACGTGAAAAGCAAAATTGGCAGCACCGAAAACCTGAAACATCAGCCGGGCGGCGGCAAAGTGCAGATT（SEQ ID No. 4）
合成后段Tau蛋白的编码基因序列：
ATTGTGTATAAACCGGTGGATCTGAGCAAAGTGACCAGCAAATGCGGCAGCCTGGGCAACATTCATCATAAACCGGGCGGCGGCCAGGTGGAAGTGAAAAGCGAAAAACTGGATTTTAAAGATCGCGTGCAGAGCAAAATTGGCAGCCTGGATAACATTACCCATGTGCCGGGCGGCGGCAACAAAAAAATTGAAACCCATAAACTGACCTTTCGCGAAAACGCGAAAGCGAAAACCGATCATGGCGCGGAAATTGTGTATAAAAGCCCGGTGGTGAGCGGCGATACCAGCCCGCGCCATCTGAGCAACGTGAGCAGCACCGGCAGCATTGATATGGTGGATAGCCCGCAGCTGGCGACCCTGGCGGATGAAGTGAGCGCGAGCCTGGCGAAACAGGGCCTG（SEQ ID No. 5）
将SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5所示的编码基因序列分别插入原核表达载体pET21a(+)的多克隆位点，引入酶切位点BamHI和Xho I，C端携带6×His标签，分别得到中段Tau蛋白和后段Tau蛋白的重组质粒。
委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行以上重组质粒合成。
将上述4个重组质粒分别转化入大肠杆菌BL21（DE3）中，获得重组基因工程菌，进行诱导表达和镍柱纯化。
培养和诱导表达的条件为：37℃，220rpm培养约2.5h~3h，当OD值达到0.8~0.9时，加入0.5mM IPTG进行诱导，后以37℃，180rpm条件继续培养约4.5h，收集菌体。
重组蛋白纯化步骤为：100mL菌液获得的菌体使用10mL的细菌裂解液（pH 8.050mM Tris、5mM咪唑、1% Triton X-100、1mM PMSF）进行重悬，使用超声破碎仪进行破碎（300W，5s-5s-10min)。破碎后10000rpm离心5min得到上清和沉淀，上清使用0.45μM PVDF滤膜过滤，过滤后进行镍柱纯化。使用1.5mL填料装柱，10倍柱体积结合液（pH 8.0 10mM PBS、5mM咪唑）平衡镍柱，过滤上清过柱，2倍柱体积1×结合液冲洗，用8~10倍柱体积清洗液（pH8.0 10mM PBS、40~80mM咪唑）清洗4次，2倍柱体积洗脱液（pH 8.0 10mM PBS、100~500mM咪唑）洗脱2次。
4种重组蛋白纯化各步骤的电泳检测结果分别如图1~图4所示。从各图中可知，离心后目标大小的条带集中在上清液中；镍柱上样并利用结合液，上样穿透液（柱后）、冲洗液（洗杂）中主要为杂带蛋白；清洗液冲洗后，清洗液前半段含有大量杂带蛋白和小部分目标蛋白，而后半段中杂带减少只含有少量目标蛋白；洗脱液冲洗后，洗脱液中主要为目标蛋白。由此可知，4种重组蛋白均为可溶性表达，不同重组蛋白在进行His柱纯化时使用的清洗液与洗脱液所含咪唑浓度均进行单独优化以达到符合要求的纯度（>90%）。Tau-352蛋白与后段Tau蛋白使用80mM咪唑进行清洗3次、500mM咪唑进行洗脱2次，如图1、图3；中段Tau蛋白使用40mM咪唑进行清洗3次、500mM咪唑进行洗脱2次，如图2；前段Tau蛋白使用40mM咪唑进行清洗3次、100mM咪唑进行洗脱2次，如图4。
实施例2 靶向后段Tau蛋白单克隆抗体的制备
1. 免疫
使用实施例1纯化获得的Tau-352蛋白作为抗原进行小鼠免疫。首次免疫使用弗式完全佐剂与Tau-352蛋白混合乳化，对小鼠进行皮下多点注射，每只小鼠注射100μg抗原；第二、第三次免疫使用弗式不完全佐剂与Tau-352蛋白混合乳化，继续对小鼠进行皮下多点注射，每只小鼠注射100μg抗原。两次免疫之间均间隔14天。
第三次免疫后一周，进行小鼠尾静脉采血，进行间接酶联免疫吸附法效价检测，使用Tau-352蛋白包被酶标板，将血清梯度稀释（100倍、500倍、2500倍、12500倍、62500倍、312500倍、1562500倍）进行测定，0.01M PBS作为空白对照，未免疫小鼠血清作为阴性对照。结果如表1所示。
表1 小鼠尾血清效价检测
从表1可知，血清稀释62500倍的吸光度值/空白值>2.5时且稀释62500倍数的OD值在1.0左右时，认为已经达到可用效价。对达到可用效价的小鼠在一周后进行脾脏加强免疫，将100μg Tau-352抗原直接注射于脾脏内，3天后进行细胞融合实验。
2. 细胞融合
于无菌环境取免疫小鼠的脾细胞与Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞，按4:1~5:1比例（总细胞量约为1×108）混合于50mL离心管中，使用不完全1640培养基清洗两次后，于37℃水浴中进行细胞融合。
向脾细胞与Sp2/0混合物中滴入1mL预热好的PEG溶液，边滴边缓慢摇晃，于1min之内匀速滴尽；立即加入预热好的50mL 1640培养基，由慢渐快，边加入边缓慢摇晃，于5min之内加尽；于37℃水浴中放置约2min后，800rpm离心3min。离心后，使用约200mL含有15% FBS、1%双抗的IMDM培养基进行充分悬浮，同时加入1×105/mL的饲养细胞充分混匀，进行96孔板铺板，于5% CO2的37℃细胞培养箱内培养。
3. 阳性单克隆筛选
阳性筛选：细胞融合后一周，挑取96孔板细胞上清进行阳性检测，对后段Tau蛋白阳性孔进行有限稀释再次克隆，直到挑选到单克隆阳性细胞。
检测方法如下：使用前段Tau蛋白抗原（前段）、中段Tau蛋白抗原（中段）、后段Tau蛋白抗原（后段）分别进行酶标板包被，包被浓度为1μg/mL。挑取细胞上清约50μL分别加入三种包被板，37℃孵育30min；使用PBST（pH7.4，0.01M PBS，1%Tween）清洗两次后加入0.05μg/mL羊抗鼠HRP二抗50μL，37℃孵育30min；使用PBST清洗两次后加入100μL显色液，37℃孵育10min后加入50μL 1M硫酸终止反应，使用酶标仪在450nm和630nm处测定吸光度值，选取仅对后段Tau蛋白产生阳性的细胞继续进行效价测定（分别稀释5倍、25倍、125倍），最终筛选到可产生高抗原结合力的后段Tau蛋白单克隆抗体（冻存编号为37.1），如表2。
表2 杂交瘤细胞上清效价检测
实施例3 杂交瘤细胞测序及重组抗体制备
1. 单克隆抗体亚型检测
使用即用型小鼠单抗Ig类/亚类/亚型鉴定用酶标二抗套装（产品厂商：Frdbio，产品货号：FRD90100P8）进行单克隆抗体的亚型检测，检测结果为IgG1/Kappa。
2. 抗体可变区测序
委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行杂交瘤测序，H链（重链）可变区全长核苷酸序列如下：
GAGGTGAGACTGGTGGAATCCGGCGGAGGCCTGGTGCAGCCAGGCGGCAGCCTGAGACTGAGCTGTGCCACCTCTGGATTCACATTTTCCGACTTCTACATGGAGTGGGTGAGGCAGTCTCCCGGGAAGAGACTGGAGTGGATCGCCGCTAGCCGGGACAAGACCAACGACTACACTACAGAGTACAACACTAGCGTGAAGGGAAGATTCATCGTGAGCAGGGACACAAGCCAGAGCATCCTGTACCTTCAGATGAATGCCCTGAGGGCCGAGGACACTGCCATCTACTACTGCGCCCGGGACGCCTGGTTCGCCTATTGGGGACAGGGAACACTGGTGACAGTGTCTGCA（SEQ ID No. 6）
H链（重链）可变区全长氨基酸序列如下：
EVRLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSDFYMEWVRQSPGKRLEWIAASRDKTNDYTTEYNTSVKGRFIVSRDTSQSILYLQMNALRAEDTAIYYCARDAWFAYWGQGTLVTVSA（SEQ ID No. 7）
H链（重链）的3个CDRs序列（由https://www.imgt.org/IMGT_vquest/analysis预测）分别如下：
CDR-H1氨基酸序列为：DFYME（SEQ ID No. 8）；
CDR-H2氨基酸序列为：ASRDKTNDYTTEYNTSVKG（SEQ ID No. 9）；
CDR-H3氨基酸序列为：DAWFAY（SEQ ID No. 10）。
L链（轻链）可变区全长核苷酸序列如下：
GATATCGTGATCACACAGGACGAGCTGAGCAACCCTGTGACCAGCGGCGAAAGTGTGAGCATCAGCTGCCGGTCCTCCAAGTCCCTGCTGTACAAGGACGGCAAGACTTACCTGAATTGGTTCCTGCAGAGGCCAGGCCAGAGCCCCCAGCTGCTGATCTACCTGATGAGCACCAGGGCCAGCGGCGTGAGCGACAGATTCTCTGGGTCCGGAAGCGGCACCGATTTCACCCTGGAGATCTCTCGCGTGAAGGCCGAGGATGTGGGCGTGTACTACTGCCAGCAGCTGCTGGAGTACCCAGTGACGTTCGGCGCAGGCACCAAACTGGAGCTGAAA（SEQ ID No. 11）
L链（轻链）可变区全长氨基酸序列如下：
DIVITQDELSNPVTSGESVSISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFLQRPGQSPQLLIYLMSTRASGVSDRFSGSGSGTDFTLEISRVKAEDVGVYYCQQLLEYPVTFGAGTKLELK（SEQ ID No. 12）
L链（轻链）的3个CDRs序列（由https://www.imgt.org/IMGT_vquest/analysis预测）分别如下：
CDR-L1氨基酸序列为：RSSKSLLYKDGKTYLN（SEQ ID No. 13）；
CDR-L2氨基酸序列为：LMSTRAS（SEQ ID No. 14）；
CDR-L3氨基酸序列为：QQLLEYPVT（SEQ ID No. 15）。
3. 重组抗体制备
委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行重组抗体质粒合成。
将小鼠重链信号肽、重链可变区全长、小鼠IgG1恒定区的编码核苷酸序列，插入真核表达载体pcDNA3.4的多克隆位点，引入酶切位点XbaI/AflII，进行全基因合成。其中，
小鼠重链信号肽氨基酸序列如下：
KLWLNWVFLLTLLHGIQC（SEQ ID No. 16）
其编码核苷酸序列如下：
AAGCTGTGGCTGAACTGGGTGTTCCTGCTGACCCTGCTGCACGGCATCCAGTGT（SEQ ID No. 17）
小鼠IgG1恒定区氨基酸序列如下：
AKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK（SEQ ID No. 18）
其编码核苷酸序列如下：
GCCAAGACAACACCCCCTAGCGTGTACCCTCTGGCCCCAGGCTCTGCCGCCCAGACCAACTCTATGGTGACCCTGGGGTGTCTGGTGAAAGGCTACTTCCCCGAACCTGTGACCGTGACATGGAATAGCGGAAGTCTGTCTAGCGGCGTGCACACTTTTCCTGCCGTGCTGCAGTCCGATCTGTACACACTGTCCTCCTCCGTGACTGTGCCTAGCTCTACCTGGCCTAGCGAGACCGTGACCTGTAACGTGGCTCACCCAGCCTCTAGTACAAAGGTGGATAAGAAAATTGTGCCTAGAGACTGCGGCTGCAAACCATGTATCTGCACAGTGCCAGAGGTGTCCTCTGTGTTTATTTTCCCTCCCAAGCCTAAGGACGTCCTGACCATCACCTTGACACCCAAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACATCTCCAAGGATGACCCTGAGGTGCAGTTTAGCTGGTTCGTGGATGACGTGGAGGTGCACACTGCCCAGACCCAGCCTCGGGAGGAGCAGTTTAACAGCACTTTCCGGTCTGTGAGCGAGCTGCCAATCATGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAATTTAAGTGTAGAGTGAACAGCGCCGCCTTTCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATTTCCAAAACCAAGGGCCGGCCTAAGGCCCCTCAGGTGTACACCATCCCCCCTCCAAAGGAGCAGATGGCTAAGGACAAAGTGTCCCTGACTTGTATGATCACAGACTTCTTCCCTGAAGATATCACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCCGCCGAGAACTACAAGAATACCCAGCCTATCATGGACACAGACGGCAGCTACTTCGTGTACTCAAAGCTGAATGTGCAGAAGTCAAACTGGGAGGCTGGCAATACCTTCACCTGTTCCGTGCTGCACGAGGGCCTGCACAACCACCACACTGAGAAAAGCCTGAGCCATTCCCCTGGCAAG（SEQ IDNo. 19）
选取小鼠Kappa链信号肽、轻链可变区全长、小鼠Kappa链恒定区的编码核苷酸序列，插入真核表达载体pcDNA3.4的多克隆位点，引入酶切位点XbaI/AflII，进行全基因合成。其中，
小鼠Kappa链信号肽氨基酸序列如下：
RCSLQFLGVLMFWISGVSG（SEQ ID No. 20）
其编码核苷酸序列如下：
AGATGTAGCCTGCAGTTCCTGGGCGTGCTGATGTTCTGGATCTCTGGCGTGTCTGGC（SEQ ID No.21）
小鼠Kappa链恒定区氨基酸如下：
ADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC（SEQ ID No. 22）
其编码核苷酸序列如下：
GCTGACGCCGCCCCCACCGTGTCCATCTTCCCCCCCTCTTCCGAACAGCTGACTAGCGGCGGCGCCAGCGTGGTGTGCTTCCTGAACAACTTCTATCCCAAGGATATCAACGTCAAGTGGAAGATCGACGGCTCTGAGCGGCAGAACGGCGTGCTGAATTCCTGGACCGACCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACTCAATGAGTAGCACTCTGACCCTGACCAAGGACGAGTACGAGAGGCACAATTCCTACACCTGTGAGGCCACCCACAAGACTTCTACAAGCCCAATCGTGAAGAGCTTCAATAGGAACGAGTGT（SEQ ID No. 23）
将2个重组质粒转入大肠杆菌TOP10中，大量培养后使用过滤法无内毒素快速质粒大量提取试剂盒（倍沃医学科技，BW-PD1522-01）进行质粒提取，使用脂质体转染试剂转染CHO细胞。转染当天将处于对数生长期的CHO细胞密度调整到2.5×106/mL，使用的培养基为义翘神州CHO基础培养基。转染100mL细胞需使用100μg质粒（其中H链质粒35.5μg，L链质粒64.5μg），加270μL上海翌圣Hieff Trans®悬浮细胞专用脂质体核酸转染试剂，于8% CO2的37℃细胞培养箱内培养，在培养的第2/3/4天连续加入补充培养基，当细胞密度大于1×107时，转入8% CO2的33℃细胞培养箱内培养。第14天左右停止培养，离心收集细胞上清，使用0.45μM PVDF滤膜过滤后，使用Protein A亲和层析柱进行抗体纯化。
纯化具体步骤为：使用1mL ProteinA 填料进行装柱，加入20倍柱体积的平衡液（pH7.4，0.01M PBS）进行平衡，将25mL滤后细胞上清缓慢过柱，使用2倍柱体积平衡液（pH7.4，0.01M PBS）进行洗杂，使用2倍柱体积洗脱液（pH 3.0，0.1M 甘氨酸）进行洗脱，洗脱后马上加入1/10洗脱液体积中和液（pH 8.0，1M Tris）。中和的洗脱液于pH7.4 0.01MPBS中透析3次，每次时长大于8h，收样后测定浓度冻存于-20℃。各步收集液进行蛋白电泳，如图5。
从图5可知，细胞上清经过亲和纯化，成功富集了抗体蛋白。与上清相比，柱后液中除抗体轻重链之外的杂蛋白条带没有变化，即亲和柱与杂蛋白几乎无结合；平衡液洗杂后，洗杂液几乎看不到蛋白条带，即抗体蛋白与亲和柱结合较为牢固；洗脱液冲洗，洗脱液中主要条带为目标抗体轻重链条带，纯度>95%。
实施例4 重组抗体在Elisa检测中的应用
将实施例3纯化后的重组抗体分别与抗Tau中段蛋白抗体（厂家：ThermoScientific；货号：PA5-84817）、pTau181抗体（厂家：USBio；货号：216051）、pTau217抗体（厂家：Tribioscience；货号：TBS10021）、pTau231抗体（厂家：Novus Biologicals；货号：MAB34941-100）配对，使用双抗体夹心酶联免疫吸附法（Elisa）用于Tau蛋白生物标志物检测。
反应步骤为：使用抗Tau中段蛋白抗体、抗pTau181抗体、抗pTau217抗体、抗pTau231抗体进行酶标板包被，包被浓度为0.5μg/mL。使用Tau-352蛋白、磷酸化Tau-352蛋白、pTau181-BSA多肽、pTau217-BSA多肽、pTau231-BSA多肽（Tau-352蛋白由实施例1获得，磷酸化Tau-352蛋白由Tau-352蛋白体外磷酸化获得，pTau181-BSA多肽、pTau217-BSA多肽和pTau231-BSA多肽委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行合成）分别加入4种包被板，37℃孵育30min；使用PBST（pH7.4，0.01M PBS，1%Tween）清洗两次后加入0.5μg/mL纯化后的重组抗体（实施例3制备）50μL，37℃孵育30min；使用PBST（pH7.4，0.01M PBS，1%Tween）清洗两次后加入0.05μg/mL羊抗鼠HRP二抗（义翘神州，SSA006）50μL，使用PBST清洗两次后加入100μL显色液，37℃孵育10min后加入50μL 1M硫酸终止反应，使用酶标仪在450nm和630nm处测定吸光度值，如表3。
表3 双抗体夹心测试数据
结果显示，重组抗体（实施例3制备）可与抗Tau中段蛋白抗体、抗pTau181抗体、抗pTau217抗体、抗pTau231抗体成功配对，对标准抗原的检测具有高特异性、高准确性。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1. 一种抗Tau蛋白单克隆抗体或其抗原结合部分，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的全长氨基酸序列如SEQ ID No. 7所示，所述轻链可变区的全长氨基酸序列如SEQ ID No. 12所示。
2. 根据权利要求1所述的抗Tau蛋白单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述重链可变区的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的氨基酸序列分别如SEQ ID No. 8~SEQ ID No. 10所示；所述轻链可变区的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3的氨基酸序列分别如SEQ ID No. 13~SEQID No. 15所示。
3.根据权利要求1或2所述的抗Tau蛋白单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述抗Tau蛋白单克隆抗体为基因重组抗体。
4.根据权利要求1或2所述的抗Tau蛋白单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述抗原结合部分选自Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段和scFv片段中的一种。
5. 编码权利要求1~4任一所述的抗Tau蛋白单克隆抗体或其抗原结合部分的基因，其特征在于，编码重链可变区全长的基因包括SEQ ID No. 6所示核苷酸序列，编码轻链可变区全长的基因包括SEQ ID No. 11所示核苷酸序列。
6.一种重组载体，其特征在于，包括权利要求5所述的基因。
7.一种重组细胞，其特征在于，包括权利要求6所述的重组载体。
8.权利要求1~4任一所述的抗Tau蛋白单克隆抗体或其抗原结合部分在制备用于检测Tau蛋白的试剂盒中的应用。
9.一种用于检测Tau蛋白的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1~5任一所述的抗Tau蛋白单克隆抗体或其抗原结合部分，还包括抗Tau中段蛋白抗体或抗磷酸化Tau蛋白抗体。
10.根据权利要求9所述的一种用于检测Tau蛋白的试剂盒，其特征在于，所述磷酸化Tau蛋白选自pTau181、pTau217和pTau231中的一种。
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