CN114058595B - 一株分泌抗lag3单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株分泌抗LAG3单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，所述分泌抗LAG3单克隆抗体的杂交瘤细胞株命名为鼠抗人LAG3单克隆抗体杂交瘤细胞系MJ13‑15，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.45003，保藏日期为2021年12月3日。所述杂交瘤细胞株分泌的抗LAG3单克隆抗体与LAG3蛋白具有较高的亲和力，能够特异性地识别真核表达的LAG3蛋白及原核表达的LAG3蛋白。以抗LAG3单克隆抗体构建的LAG3检测试剂盒灵敏度高、特异性好，在多种检测方法中应用效果较好。

Description

一株分泌抗LAG3单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

技术领域

本发明属于免疫化学技术领域，涉及一株分泌抗LAG3单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。

背景技术

癌症是目前世界上危害人类健康的最严重的疾病之一，在全球范围内，癌症的发病率处于逐年高发的态势，且呈现出年轻化趋势。早预防，早发现，早治疗，能够显著减少癌症的发病率，延长患者的生存期。因此对癌症相关抗原检测的诊断试剂开发尤为重要。

淋巴细胞活化基因3（Lymphocyte-activation gene 3 protein，LAG3），又称为CD233。LAG3基因定位于12号染色体（12p13）。LAG3是一个Ⅰ型跨膜蛋白，属于免疫球蛋白（Ig）超家族，由胞外区、跨膜区和胞质区3个部分组成，主要表达在活化T细胞、NK细胞、B细胞和浆细胞样DC中。LAG3的胞质尾由三个部分组成：一个丝氨酸磷酸化位点、一个“KIEELE”模体（motif）和一个谷氨酸脯氨酸二肽重复序列（EP repeat）。其中“KIEELE”模体高度保守，并可能参与了LAG3下游抑制信号的转导，缺乏该结构的LAG3蛋白不能发挥对T细胞的抑制作用（Shan C,Li X,Zhang J.Progress of immune checkpoint LAG-3 inimmunotherapy[J].Oncology letters,2020,20(5):207.）。

LAG3是免疫负调节因子，主要结合MHC Ⅱ类分子，调节树突状细胞的功能。LAG3能选择性地与稳定的抗原肽-MHC II分子复合物（pMHC II）结合，因此，LAG3能优先抑制稳定的pMHC II的CD4⁺T细胞的活化。LAG3的表达与特异性T细胞的免疫调节功能呈负相关，抑制LAG3的功能，能够让T细胞重新获得细胞毒性，增强特异性CD8⁺T细胞的抗肿瘤作用，从而增强对肿瘤的杀伤效果。在人CD4⁺细胞中封闭LAG3能促进细胞增殖，并提高IL2、IL4、IFN-γ和TNF-α的表达水平。

LAG3参与调节性T细胞的抑制性作用。当处于肿瘤环境或慢性感染时，长期的抗原刺激会导致LAG3持续高表达，引起T细胞耗竭。此外，PD-1/PD-L1途径和LAG3阻断剂的联合抑制作用产生了抗肿瘤功效，因此，阻断LAG3信号通路能促进耗竭T细胞恢复功能。

LAG3目前是免疫检查点二代靶点中临床数据较多、成药性相对确定的靶点。目前以LAG3为靶点的临床在研药物较多，其中Bristol Myers Squibb（BMS）公司公布LAG3单抗relatlimab联合抗PD-1单抗Opdivo（nivolumab）的组合疗法，在评估未经治疗的转移性或不可切除性黑色素瘤患者的II/III期临床试验RELATIVITY-047（CA224-047）中，相比于Opdivo单独用药可显著改善患者的无进展生存期，试验达到主要终点。这是全球首个抗LAG3抗体的临床III期数据。以LAG3为靶点的药物主要治疗领域包括癌症和自身免疫性疾病。

免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）是利用抗原-抗体的相互作用来显示组织切片中抗原的分布和定位的原位检测技术。这种方法的原理是通过抗体识别靶标抗原完成的，抗体具有高特异性，只与组织切片中的目标抗原结合，随后利用化学显色或荧光检测使抗原-抗体的相互作用可视化，或在化学显色中，将酶偶联到抗体上，酶会催化底物在抗原位置产生有色沉淀。免疫组化常用的组织切片技术对组织内抗原的构象及抗原表位的暴露有一定影响。为了提高免疫组化的检测效率和一致性，需要筛选出高特异性的单克隆抗体，且要求这些抗体在组化检测工作中的灵敏度、特异性和准确度等指标达到一定的标准，因此筛选出各项指标均较好的抗体对病理诊断具有重要的意义。

目前，市场上能够特异性并高灵敏度地检测LAG3的抗体数量极少，尤其是能够应用于免疫组织化学的抗LAG3单克隆体。所以制备特异性强、灵敏度高、应用范围广的抗LAG3单克隆抗体，具有重要的现实意义和应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一株分泌抗LAG3单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，所述杂交瘤细胞分泌的抗LAG3单克隆抗体与LAG3蛋白具有较高的亲和力，能够特异性地识别真核表达的LAG3蛋白及原核表达的LAG3蛋白，在制备LAG3检测试剂盒中具有重要的应用前景。以抗LAG3单克隆抗体构建的LAG3检测试剂盒灵敏度高、特异性好，在包括酶联免疫吸附、蛋白免疫印迹、免疫组织化学、流式细胞术和免疫荧光等在内的多种检测方法中应用效果较好。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一株分泌抗LAG3单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述分泌抗LAG3单克隆抗体的杂交瘤细胞株命名为鼠抗人LAG3单克隆抗体杂交瘤细胞系MJ13-15，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.45003，保藏日期为2021年12月3日。

第二方面，本发明提供一种抗LAG3单克隆抗体，所述抗LAG3单克隆抗体由第一方面所述的鼠抗人LAG3单克隆抗体杂交瘤细胞系MJ13-15产生。

本发明中，所述抗LAG3单克隆抗体以人LAG3重组蛋白作为免疫原免疫小鼠，取免疫后的小鼠脾细胞与小鼠的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，筛选能产生高灵敏度和高特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞。

本发明中所述抗LAG3单克隆抗体的抗原为人源LAG3蛋白，所述人源LAG3蛋白包括SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，相应的蛋白胞外区位于第23~450位氨基酸。

SEQ ID No.1：

LQPGAEVPVVWAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAGVTWQHQPDSGPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRYTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRAAVHLRDRALSCRLRLRLGQASMTASPPGSLRASDWVILNCSFSRPDRPASVHWFRNRGQGRVPVRESPHHHLAESFLFLPQVSPMDSGPWGCILTYRDGFNVSIMYNLTVLGLEPPTPLTVYAGAGSRVGLPCRLPAGVGTRSFLTAKWTPPGGGPDLLVTGDNGDFTLRLEDVSQAQAGTYTCHIHLQEQQLNATVTLAIITVTPKSFGSPGSLGKLLCEVTPVSGQERFVWSSLDTPSQRSFSGPWLEAQEAQLLSQPWQCQLYQGERLLGAAVYFTELSSPGAQRSGRAPGALPAGHLHHHHHH。

优选地，所述抗LAG3单克隆抗体的重链为IgG1型。

在本发明中，鼠抗人LAG3单克隆抗体杂交瘤细胞系MJ13-15产生的单克隆抗体命名为单克隆抗体MJ13-15，在实际应用中，可根据需要采用已知的抗体改造方案对单克隆抗体MJ13-15进行结构和序列上的改造，以获得需要的性质。这些改造包括：

（1）标记抗体

可对抗体进行标记以便于检测，标记方法可以是荧光标记、化学发光标记、放射性标记、酶联标记（如辣根过氧化酶HRP）、生物素/亲和素标记、磁珠标记或纳米颗粒标记等。

（2）结构改造

可对抗体结构进行改造，构建成抗原亲和性类似但结构不同的分子，如Fab、F(ab’)2、Fab’、Fab’-SH、Fv片段、单链抗体（如scFv）、单域抗体、抗体偶联物、双功能抗体或多特异性抗体等。其中Fab’片段是指在重链CH1结构域的羧基端添加少量氨基酸残基（包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸）的Fab，Fab’-SH是指在恒定区的半胱氨酸残基带有自由硫醇基的Fab’。

优选地，所述抗LAG3单克隆抗体还含有修饰缀合物。所述修饰缀合物包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、生物素或荧光基团中的任意一种。

本发明中，所述抗LAG3单克隆抗体应用于构建LAG3检测试剂盒，或者直接应用于检测，所述抗LAG3单克隆抗体可以修饰有缀合物或检测标记，例如荧光标记、酶标记、放射性标记、生物素标记或亲和素标记等。具体的缀合物或检测标记包括但不限于辣根过氧化物酶（HPR），碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）、生物素（Biotin）、异硫氰酸荧光素（FITC）、Cy3或Cy5等，连接方式包括化学键偶联、静电吸附或亲疏水性吸附等。

第三方面，本发明提供一种根据第二方面所述的抗LAG3单克隆抗体的制备方法，所述制备方法包括：

培养第一方面所述的分泌抗LAG3单克隆抗体杂交瘤细胞株MJ13-15，纯化，获得抗LAG3单克隆抗体。

本发明中，所述抗LAG3单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：

（1）应用真核表达平台，构建真核表达质粒，在293T细胞中瞬转表达，ELISA法证实蛋白能够表达，在HEK293F细胞中扩大培养，瞬转表达，并纯化获得人源LAG3蛋白。

（2）应用原核表达平台，构建原核表达质粒，转化BL21（DE3）细胞株；发酵放大并利用IPTG进行诱导，亲和纯化获得用于筛选的人源LAG3蛋白，并验证蛋白活性。

（3）用得到的真核表达的人源LAG3蛋白免疫小鼠，血清效价测定合格后。处理并获得免疫后的小鼠脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，经过培养，亚克隆和筛选后，获得能够产生特异性识别人LAG3蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株MJ13-15。

（4）将杂交瘤细胞株MJ13-15在DMEM完全培养基中培养，所述DMEM完全培养基中胎牛血清（FBS）的体积分数为12%，并含有青霉素-链霉素，培养温度为37℃，CO₂浓度为5%，静置培养，传代，当细胞数量达到一定数值后，更换为不含血清的DMEM培养基，并静置培养，收集培养基上清，并进行亲和纯化，获得抗体，ELISA测定抗体的活性。

第四方面，本发明提供一种第一方面所述的分泌抗LAG3单克隆抗体的杂交瘤细胞株和/或第二方面所述的抗LAG3单克隆抗体在制备LAG3蛋白表达检测产品中的应用。

第五方面，本发明提供一种LAG3免疫组织化学检测试剂盒，所述LAG3免疫组织化学检测试剂盒包括第二方面所述的抗LAG3单克隆抗体。

优选地，所述LAG3免疫组织化学检测试剂盒还包括：免疫组织化学抗原修复缓冲液、封闭液、酶标二抗、显色剂或苏木素复染液中的任意一种或至少两种的组合。

本发明所提供的抗LAG3单克隆抗体在免疫组织化学检测中，与现有的商业化的用于免疫组化的抗LAG3单克隆抗体相比，本发明提供的抗体在相对低的工作浓度下对LAG3阳性组织切片的染色效果信号更加强烈，从而可提高检测的灵敏度、分辨率，并且可减少抗体用量、降低检测成本。

本发明中，术语“抗LAG3单克隆抗体”是指能够检测组织样本中LAG3表达状态的抗体，其能够与LAG3蛋白结合，在免疫组织化学实验中，抗LAG3单克隆抗体作为一抗进行LAG3表达状态的检测。

第六方面，本发明提供一种LAG3免疫印迹检测试剂盒，所述LAG3免疫印迹检测试剂盒包括第二方面所述的抗LAG3单克隆抗体。

优选地，所述LAG3免疫印迹检测试剂盒还包括：SDS-PAGE凝胶、聚偏二氟乙烯（PVDF）膜、封闭液或酶标二抗中的任意一种或至少两种组合。

本发明中，术语“抗LAG3单克隆抗体”能够检测：（1）通过原核表达系统、真核表达系统、昆虫表达系统或酵母表达系统表达纯化获得的LAG3蛋白单体蛋白；（2）与其他融合蛋白（如TF、IgG FC或GST等）融合的蛋白；（3）LAG3蛋白表达的细胞裂解液。LAG3单克隆抗体其能够与LAG3蛋白结合，在蛋白质免疫印迹（Western Blot）中，LAG3抗体作为一抗进行LAG3蛋白的检测。

第七方面，本发明提供一种LAG3酶联免疫吸附检测试剂盒，所述LAG3酶联免疫吸附检测试剂盒包括第二方面所述的抗LAG3单克隆抗体。

优选地，所述LAG3酶联免疫吸附检测试剂盒还包括：封闭液、酶标二抗、显色液或终止液中的任意一种或至少两种组合。

本发明中，术语“抗LAG3单克隆抗体”能够检测：（1）通过原核表达系统、真核表达系统、昆虫表达系统或酵母表达系统表达纯化获得的LAG3蛋白单体蛋白；（2）LAG3过表达细胞的裂解产物；（3）与其他融合蛋白（如TF、IgG FC或GST等）融合的LAG3蛋白。在酶联免疫吸附（ELISA）中，LAG3单克隆抗体为一抗进行LAG3蛋白的检测。

第八方面，本发明提供一种LAG3免疫荧光检测试剂盒，所述LAG3免疫荧光检测试剂盒包括第二方面所述的抗LAG3单克隆抗体。

优选地，所述抗LAG3单克隆抗体修饰有荧光基团，所述荧光基团为FITC、Cy3或Cy5中的任意一种。

第九方面，本发明提供一种LAG3流式细胞术检测试剂盒，所述LAG3流式细胞术检测试剂盒包括权利第二方面所述的抗LAG3单克隆抗体。

发明中，术语“抗LAG3单克隆抗体”是指能够检测表达LAG3蛋白的细胞中LAG3表达状态的抗体，LAG3单克隆抗体能够与细胞膜上的LAG3蛋白结合，在流式细胞术中，LAG3单克隆抗体作为一抗进行表达LAG3蛋白的细胞的检测。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

（1）本发明所述抗LAG3单克隆抗体特异性强、灵敏度高、应用范围广，所述抗LAG3单克隆抗体与LAG3蛋白具有较高结合能力，抗LAG3单克隆抗体MJ13-15能够特异性地识别真核LAG3蛋白，在相同稀释条件下，抗LAG3单克隆抗体MJ13-15抗体对LAG3蛋白的反应的阳性OD值更高，表明其效价高于商品化抗体。

（2）本发明所提供的抗LAG3单克隆抗体在免疫组织化学检测中能在相对低的工作浓度下对LAG3阳性组织切片进行染色，其染色效果较好，具有较高的灵敏度和分辨率，使用所述抗LAG3单克隆抗体进行免疫组织化学检测能够减少抗体用量、降低检测成本。

附图说明

图1为实施例1中ELISA检测真核表达的人LAG3蛋白表达量与细胞活率的关系图。

图2为实施例1中纯化后的人LAG3重组蛋白的SDS-PAGE电泳图，泳道1：蛋白marker；泳道2：BSA，1 µg；泳道3：还原状态下（R）LAG3蛋白，1 µg；泳道4：非还原状态下（N）LAG3蛋白，1 µg。

图3为实施例5中纯化获得的单克隆抗体的SDS-PAGE电泳图，泳道1：蛋白marker；泳道2：BSA，1 µg；泳道3：还原状态下（R）抗LAG3单克隆抗体，1 µg；泳道4：非还原状态下（N）抗LAG3单克隆抗体，1 µg。

图4为实施例6中采用间接ELISA法检测单克隆抗体特异性的结果图。

图5为实施例8中单克隆抗体与对照抗体Western Blot的检测结果。泳道1：真核表达的LAG3蛋白；泳道2：原核表达的TF-LAG3蛋白。泳道1和泳道2的一抗均为抗LAG3单克隆抗体；泳道3为真核表达的LAG3蛋白，泳道4为原核表达的TF-LAG3蛋白，泳道3和泳道4的一抗均为LAG3（D2G4O）Rabbit mAb。

图6为实施例10中所述LAG3免疫组织化学检测试剂盒进行免疫组化实验的结果图，包括阳性对照CAL26抗体、MJ13-13、MJ13-15和MJ13-29的染色结果（比例尺=100×）。

图7为实施例10中所述LAG3免疫组织化学检测试剂盒进行免疫组化实验的结果图。包括阳性对照CAL26抗体、阴性同型对照抗体、MJ13-21和MJ13-22的染色结果（比例尺=100×）。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例中未标明具体技术或条件者，均按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或未标注生产厂商者，均为可通过正规渠道采购获得的常规产品。

实施例1

本实施例提供一种人LAG3免疫原，所述人LAG3免疫原的制备过程如下：

在人LAG3蛋白胞外区的C端添加6个组氨酸，在蛋白的N端添加适合于真核蛋白分泌的信号肽。利用同源重组的方法将目的基因与表达载体pCDNA3.4连接，构建表达克隆pCDNA3.4-LAG3。其中人LAG3蛋白胞外区的（UNIPROT ID：P18627，Leu23-Leu450）的氨基酸序列及添加了6个组氨酸的完整序列如SEQ ID No.1所示。

SEQ ID No.1：

LQPGAEVPVVWAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAGVTWQHQPDSGPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRYTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRAAVHLRDRALSCRLRLRLGQASMTASPPGSLRASDWVILNCSFSRPDRPASVHWFRNRGQGRVPVRESPHHHLAESFLFLPQVSPMDSGPWGCILTYRDGFNVSIMYNLTVLGLEPPTPLTVYAGAGSRVGLPCRLPAGVGTRSFLTAKWTPPGGGPDLLVTGDNGDFTLRLEDVSQAQAGTYTCHIHLQEQQLNATVTLAIITVTPKSFGSPGSLGKLLCEVTPVSGQERFVWSSLDTPSQRSFSGPWLEAQEAQLLSQPWQCQLYQGERLLGAAVYFTELSSPGAQRSGRAPGALPAGHLHHHHHH。

将构建完成的真核表达pCDNA3.4-LAG3质粒，在293T细胞中瞬转表达，48 h后收集细胞表达上清，通过ELISA进行验证，证实蛋白有表达。然后扩大培养，提取质粒，测序正确后，将质粒DNA瞬时转染HEK293F细胞，具体方法参见Thermofisher公司的Expi293™表达系统试剂盒（货号：A14635）操作指南。在HEK293F细胞中进行蛋白表达，分别在18 h、48 h、72h和96 h进行取样计数，观察细胞状态，检测细胞活率，并用ELISA法进行目的蛋白的表达检测，检测结果如图1所示。并在96 h收获细胞培养物，10000 rpm离心20 min，用0.45 μm一次性无菌滤器过滤液体，获得上清液用于纯化获得的人源LAG3蛋白。

由图1的ELISA结果可知，随着时间的延长，ELISA检测的阳性值逐渐升高，并在72h达到一个峰值，96 h出现略微下降，细胞活率随着时间的延长不断降低，实验结果证实目的蛋白成功表达。

利用Ni柱（NI sepharose High performance，GE，货号17-5268-01）进行亲和纯化，纯化后的蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，检验其蛋白大小及纯度，结果如图2所示。该蛋白C端带有6个组氨酸标签，大小约为47 kDa。由图2可知，纯化后的人LAG3蛋白条带位置正确，纯度>95%。

实施例2

本实施例提供一种LAG3抗体的人源筛选抗原，所述LAG3抗体的人源筛选抗原的制备过程如下：

通过同源重组的方法将人LAG3蛋白胞外区（UNIPROT ID:P18627，Leu23-Leu450）序列与表达载体pCold TF（Takara，Code No:3365）连接，构建表达克隆Pcold TF-LAG3，形成完整的TF-LAG3融合蛋白，完整的融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

SEQ ID No.2：

MNHKVHHHHHHMQVSVETTQGLGRRVTITIAADSIETAVKSELVNVAKKVRIDGFRKGKVPMNIVAQRYGASVRQDVLGDLMSRNFIDAIIKEKINPAGAPTYVPGEYKLGEDFTYSVEFEVYPEVELQGLEAIEVEKPIVEVTDADVDGMLDTLRKQQATWKEKDGAVEAEDRVTIDFTGSVDGEEFEGGKASDFVLAMGQGRMIPGFEDGIKGHKAGEEFTIDVTFPEEYHAENLKGKAAKFAINLKKVEERELPELTAEFIKRFGVEDGSVEGLRAEVRKNMERELKSAIRNRVKSQAIEGLVKANDIDVPAALIDSEIDVLRRQAAQRFGGNEKQALELPRELFEEQAKRRVVVGLLLGEVIRTNELKADEERVKGLIEEMASAYEDPKEVIEFYSKNKELMDNMRNVALEEQAVEAVLAKAKVTEKETTFNELMNQQASAGLEVLFQGPSAGLVPRGSGGIEGRHMLQPGAEVPVVWAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAGVTWQHQPDSGPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRYTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRAAVHLRDRALSCRLRLRLGQASMTASPPGSLRASDWVILNCSFSRPDRPASVHWFRNRGQGRVPVRESPHHHLAESFLFLPQVSPMDSGPWGCILTYRDGFNVSIMYNLTVLGLEPPTPLTVYAGAGSRVGLPCRLPAGVGTRSFLTAKWTPPGGGPDLLVTGDNGDFTLRLEDVSQAQAGTYTCHIHLQEQQLNATVTLAIITVTPKSFGSPGSLGKLLCEVTPVSGQERFVWSSLDTPSQRSFSGPWLEAQEAQLLSQPWQCQLYQGERLLGAAVYFTELSSPGAQRSGRAPGALPAGHL。

构建原核表达质粒，测序正确后，转化BL21（DE3）菌株，并涂布氨苄青霉素平板，37℃倒置培养12 h。挑菌并摇菌培养，采用终浓度为0.1 mM的IPTG进行诱导，破碎菌体，进行SDS-PAGE电泳，确定蛋白是否表达以及分子量，经验证蛋白在菌体破碎后上清液中，可溶性表达，分子大小符合预期。

将菌株接种在含有氨苄青霉素的LB培养基中，37℃，200 rpm培养，待菌液OD值升高至0.5，利用0.1 mM的IPTG进行低温诱导表达，诱导表达的温度为16℃，时间为18 h，诱导表达结束后在10000 rpm离心收集菌体。利用超声破碎仪进行破菌处理，10000 rpm，离心30min，用0.45 μm的滤器过滤破菌上清液，获得待纯化样品，利用Ni柱（NI sepharose Highperformance，GE，货号17-5268-01）进行亲和层析纯化获得用于制备LAG3抗体的人源抗原，并通过ELISA验证蛋白有活性。

实施例3

本实施例提供一种杂交瘤细胞系，所述杂交瘤细胞系的制备过程如下：

（1）免疫小鼠

取4周龄的雌性Balb/c小鼠，前眼眶取20 µL血清作为阴性对照。将真核表达获得的人LAG3重组蛋白在小鼠腹部皮下多点注射免疫；首次免疫剂量为每只小鼠50 µg，用生理盐水稀释至体积为200 µL，与等体积的弗氏完全佐剂混合，充分乳化后注射。隔14天皮下加强免疫一次，剂量为每只小鼠注射LAG3重组蛋白25 µg，用生理盐水稀释至体积为200 µL，与等体积的弗氏不完全佐剂混合，充分乳化后注射。第3次加强免疫后7天眼眶取血，用ELISA检测血清抗体效价，对达到要求的小鼠进行冲击免疫，免疫剂量为每只小鼠注射LAG3重组蛋白50 µg，用生理盐水稀释至体积为100 µL，腹腔注射，3天后进行融合。

（2）融合

在融合的前一天，取一只未免疫的小鼠，脱颈处死，在75%乙醇浸泡5 min消毒，然后用DMEM（品牌：Hyclone，货号：SH30243.01B）完全培养基收集腹腔细胞并铺板，作为融合细胞的饲养层。融合当天，脱颈处死免疫后的小鼠，在75%乙醇中浸泡5 min消毒。解剖获得小鼠脾脏，在DMEM完全培养基中用注射器针头将脾脏内细胞吹出，并在细胞筛上过滤获得脾细胞，与SP2/0细胞按3:1的比例混合，1000 rpm室温离心5 min，弃去培养基。将装有离心且混合好的细胞的离心管放入37℃温水浴中，边搅动细胞边缓慢加入1 mL聚乙二醇溶液（Sigma，P7181-5×5mL）。在水浴中静置1 min，缓慢加入10 mL无血清的DMEM培养基，1000rpm离心5 min，弃去上清。加入含20%胎牛血清的DMEM培养基，并将细胞接种到96孔细胞培养板中，每孔150 µL，37℃ 5% CO₂培养箱中静置培养。24 h后加入50 µL含4×HAT的培养基。此后每3~5天进行换液，用含HAT的完全培养基筛选，2周杂交瘤克隆形成。

（3）筛选

细胞融合后约4天，根据融合细胞团的大小，取培养基利用ELISA法筛选分泌抗LAG3抗体的杂交瘤细胞株。对所得阳性克隆株，采用有限稀释法进行杂交瘤细胞株的亚克隆分选。间接ELISA法的操作步骤如下：取PCOLD TF-LAG3蛋白，用PBS7.4稀释至4 µg/mL，每孔加入100 µL包被96孔板，37℃静置1 h，然后用PBST洗涤4次，用5% BSA封闭。再次洗涤4次后取100 µL培养基进行一抗孵育，用免疫后具有抗体效价的小鼠血清作为阳性对照，未免疫的小鼠血清作为阴性对照，37℃孵育1 h，用PBST洗涤4次。然后每孔加辣根过氧化物酶HRP标记亲和纯化山羊抗鼠IgG（H+L）F(ab’)₂片段（品牌：Jackson，货号：115-036-003）100µL，稀释比例为1:5000，最后用TMB显色，终止显色后测定450 nm的OD值。OD₄₅₀数值大于0.5的，判定为可以进行亚克隆的阳性克隆。

（4）杂交瘤细胞系的建立

经过3次亚克隆和ELISA筛选，共得到31株针对人LAG3抗原、稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系，克隆号为MJ13-1至MJ13-31。根据筛选结果挑选出灵敏度和特异性最强的一株，克隆号为MJ13-15的杂交瘤细胞。

实施例4

本实施例对实施例3所述的克隆号为MJ13-15的杂交瘤细胞进行保藏，命名为鼠抗人LAG3单克隆抗体杂交瘤细胞系MJ13-15，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编为100101，保藏编号为CGMCCNo.45003，保藏日期为2021年12月3日。

实施例5

本实施例提供一种抗LAG3单克隆抗体，所述抗LAG3单克隆抗体由实施例4所述的鼠抗人LAG3单克隆抗体杂交瘤细胞系MJ13-15产生。

（1）抗体培养液的制备

复苏克隆号为MJ13-15的杂交瘤细胞，用DMEM完全培养基（88% DMEM+12% FBS+1×青霉素链霉素）培养在15 cm的无菌培养皿中，37℃，5% CO₂，静置培养48 h。待细胞密度达到5×10⁶个/mL时，弃去培养基上清，并用无菌PBS（pH 7.4）溶液，清洗一遍，补加20 mL基础培养基（DMEM+1×青霉素链霉素），37℃，5% CO₂，静置培养72 h，收集培养基上清，并10000rpm离心10 min，用0.45 μm的滤器过滤，进行下一步的纯化。

（2）抗LAG3单克隆抗体的纯化

用Hi Trap rProtein G FF （GE Healthcare，17061802）亲和层析填料及AKTA系统，参照说明书从培养基中纯化单克隆抗体。平衡液为20 mM、pH 7.0的磷酸盐缓冲液，洗脱液为100 mM、pH 2.7的甘氨酸，中和液为1 M、pH 8.5的Tris-HCl。

纯化具体步骤为：首先取1 mL的纯化柱，用10 mL纯化水冲洗柱子，接着用10 mL平衡液冲洗柱子，进行样品上样，再用10 mL平衡液冲洗柱子，最后用10 mL洗脱液进行抗体的洗脱，并立即加入中和液，使其pH达到7.0，所有步骤的液体流速均为1 mL/min。

SDS-PAGE电泳鉴定纯度，并用Nanodrop测定浓度。SDS-PAGE检测结果见图3。由图3可知，纯化后的单克隆抗体MJ13-15的条带大小正确，纯度>95%。泳道1：蛋白marker；泳道2：牛血清白蛋白（BSA），1 μg；泳道3：还原状态下（R）的抗LAG3单克隆抗体，1 μg；泳道4：非还原状态下（N）的抗LAG3单克隆抗体，1 μg。

实施例6

本实施例提供一种ELISA法检测单克隆抗体的特异性及亚型的方法。

（1）单克隆抗体的抗原特异性检测

取实施例1和2中纯化获得的真核表达的人LAG3蛋白和原核表达的人LAG3蛋白，进行ELISA实验，采用间接ELISA法测试抗LAG3单克隆抗体的特异性。

具体的操作步骤如下：用100 µL真核表达的人LAG3重组蛋白和100 µL原核表达的人LAG3重组蛋白的抗原，37℃包被1 h，其中真核表达的人LAG3重组蛋白和原核表达的人LAG3重组蛋白的浓度均为0.5 µg/mL，在洗涤后利用5% BSA进行封闭，再进行一抗孵育，一抗为实施例5中纯化后的抗LAG3单克隆抗体，以抗体稀释液作为阴性对照。其中用于比较的商品化单克隆抗体为Abcam的重组Anti-LAG-3抗体（Rabbit IgG），克隆号CAL26（货号ab237719），Anti-LAG-3抗体作为阳性对照且加入量与抗LAG3单克隆抗体的量一致。最后每孔加入对应的1:5000稀释的辣根过氧化物酶HRP标记亲和纯化山羊抗鼠IgG（H+L）F(ab’)₂片段（品牌：Jackson，货号：115-036-003）和辣根过氧化物酶HRP标记亲和纯化山羊抗兔IgG（H+L）（品牌：Jackson，货号：111-035-003）100 µL，进行二抗孵育，加入TMB显色液显色，终止显色后，测定450 nm的OD值。

结果如图4所示，抗LAG3单克隆抗体能够特异性地识别真核LAG3蛋白及原核LAG3蛋白。在实验条件相同的情况下，抗LAG3单克隆抗体对LAG3蛋白的反应的阳性OD值更高，说明其灵敏度高于商品化抗体。

（2）单克隆抗体亚型鉴定

用100 mM PBS（pH 7.4）稀释包被用的羊抗鼠IgG（杭州索莱尔博奥生物技术有限公司，SL200101）至1 µg/mL，每孔加入100 µL，在37℃包被1 h。倾空液体，用含0.05%Tween-20的PBST清洗清洗5次。每孔加入300 µL封闭液5% BSA，37℃封闭1 h，倾空液体，用PBST清洗5次。每孔加入100 µL抗LAG3单克隆抗体，37℃孵育1 h。倾空液体，用PBST清洗5次。用封闭液1:5000稀释HRP标记的山羊抗鼠（IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3）抗体，每孔100 µL，37℃孵育1 h。倾空液体，用PBST清洗5次。每孔加入100 µL底物溶液，室温显色5min，在450 nm波长下测OD值。根据阳性对照及样品检测的OD值，确定抗体的亚型，N为阴性对照，一抗为抗体稀释液，P为阳性对照，一抗为相对应亚型的抗体，结果如表1所示，抗LAG3单克隆抗体的亚型为鼠源 IgG1。

表1

实施例7

本实施例提供一种LAG3免疫印迹检测试剂盒，所述LAG3免疫印迹检测试剂盒包括实施例5中所述的抗LAG3单克隆抗体；所述LAG3免疫印迹检测试剂盒还包括：SDS-PAGE凝胶、PVDF膜、封闭液和酶标二抗。

所述SDS-PAGE凝胶的浓度为12%，所述封闭液为5%脱脂奶粉的PBST封闭液，所述酶标二抗为辣根过氧化物酶HRP标记亲和纯化山羊抗鼠IgG（H+L）F(ab’)₂片段（品牌：Jackson，货号：115-036-003）。

实施例8

本实施例使用实施例7中所述的LAG3免疫印迹检测试剂盒，对样本进行检测。

（1）实验步骤

真核表达的LAG3蛋白（分子量：47 kDa）及原核表达的TF-LAG3蛋白（分子量：98.5kDa）各0.1 µg，配制12% SDS-PAGE胶，向蛋白样品中加入还原缓冲液，煮沸10 min，然后上样。100 V下进行电泳，直至结束；配制1×转膜液，剪取PVDF膜用甲醇处理，与凝胶一起在电压100 V条件下转膜60 min；将PVDF膜置于含5%脱脂奶粉的PBST封闭液中4℃封闭过夜；用PBST洗涤后，将纯化后的抗LAG3单克隆抗体用1%脱脂奶粉按0.5 µg/mL的浓度在室温孵育1h，以Cell Signaling Technology公司的LAG3（D2G4O™，XP® Rabbit mAb，货号：#25848）作为阳性对照，稀释比例为1:4000；室温孵育60 min；用PBST清洗后，将对应的辣根过氧化物酶HRP标记亲和纯化山羊抗鼠IgG（H+L）F(ab’)₂片段（品牌：Jackson，货号：115-036-003）和辣根过氧化物酶HRP标记亲和纯化山羊抗兔IgG（H+L）（品牌：Jackson，货号：111-035-003）按1:3000稀释后，室温孵育60 min；用ChemiDoc™ MP成像系统曝光。

（2）实验结果

实验结果如图5所示，对照抗体D2G4O和本发明提供的抗LAG3单克隆抗体在免疫印迹实验中均能够检测不同表达来源的LAG3蛋白，条带大小正确，特异性好，无非特异性背景。泳道1为真核表达的LAG3蛋白，泳道2为原核表达的TF-LAG3蛋白，泳道1和2的一抗均为抗LAG3单克隆抗体MJ13-15；泳道3为真核表达的LAG3蛋白，泳道4为原核表达的TF-LAG3蛋白，泳道3和4的一抗均为LAG3（D2G4O™ XP® Rabbit mAb）。

实施例9

本实施例提供一种LAG3免疫组织化学检测试剂盒，所述LAG3免疫组织化学检测试剂盒包括实施例5所述的抗LAG3单克隆抗体；所述LAG3免疫组织化学检测试剂盒还包括：免疫组织化学抗原修复缓冲液、封闭液、酶标二抗、显色剂和苏木素复染液。

实施例10

本实施例使用实施例9中所述的LAG3免疫组织化学检测试剂盒，对样本进行检测。

（1）材料

本实施例中所用组织为人体扁桃体组织，样本来源于迈杰转化医学研究（苏州）有限公司组织样本库，并经福尔马林固定和石蜡包埋处理。人体扁桃体组织为LAG3蛋白高表达阳性组织，因此选择该组织进行抗体免疫组化功能性研究。本实施例中的抗体为实施例3中所得克隆号为MJ13-13、MJ13-15、MJ13-21、MJ13-22和MJ13-29的杂交瘤细胞产生的抗LAG3单克隆抗体，分别为单克隆抗体MJ13-13、单克隆抗体MJ13-15、单克隆抗体MJ13-21、单克隆抗体MJ13-22和单克隆抗体MJ13-29。阳性对照抗体为Abcam的克隆号CAL26（货号ab237719）的抗体，阴性同型对照抗体为迈杰转化医学研究（苏州）有限公司开发的鼠IgG1抗体，本实施例中一抗浓度均为1 µg/mL。

（2）实验步骤

样品经烤片后，在Leica BOND-MAX（国械备20140277）全自动组化系统上完成，具体程序如表2所示：

表2

（3）结果

判读依据：实验完成后应首先应对阴、阳性组织进行分析，当染色结果符合预期结果时，说明当次实验结果可靠。此外，阴性同型对照抗体不与人体扁桃体组织有特异性结合，应无染色发生。当有非特异性结合发生时，应比照不同抗体处理下对应区域的染色，仅有当样品处理组有染色的区域同型对照抗体组对应处无染色时，才可判断为阳性；否则应为非特异性染色。

免疫组化实验结果见图6和图7，由图6和图7可知，阳性对照CAL26抗体在人体扁桃体组织上具有特异性性染色，阴性同型对照抗体在该组织上无染色。与对照组相比，本发明的中所测试的5种抗体中，单克隆抗体MJ13-13、单克隆抗体MJ13-15和单克隆抗体MJ13-29均表现出明显的强阳性特异性染色，单克隆抗体MJ13-21和单克隆抗体MJ13-22染色强度较弱。其中单克隆抗体MJ13-15的染色强度明显优于其他抗体，且无非特异性背景染色。在相同抗体工作浓度下，阳性对照抗体CAL26的染色强度与本发明的单克隆抗体MJ13-15染色强度相当，单克隆抗体MJ13-15的非特异性染色背景更少。

本实施例中单克隆抗体MJ13-15能够特异性地检测人体组织中LAG3蛋白的表达，且灵敏度高、特异性强。

实施例11

本实施例利用酶联免疫吸附实验（ELISA法），通过对抗体进行梯度稀释，比较MJ13-15抗体与商品化阳性对照抗体Abcam的克隆号CAL26（货号ab237719）的效价。

（1）实验步骤

取真核表达的人LAG3重组蛋白，用PBS稀释至0.5 µg/mL，每孔包被100 µL，在37℃孵育1 h，用PBST洗涤后，用5% BSA在37℃封闭1 h，再进行一抗孵育，一抗为实施例5中纯化后的抗LAG3单克隆抗体MJ13-15和Abcam的重组Anti-LAG-3抗体CAL26（货号ab237719），调整两种抗体的初始浓度为1 mg/mL，然后分别梯度稀释，稀释比例依次为1:500，1:1500，1:4500，1:13500，1:40500，1:121500，以1:121500抗体稀释液作为阴性对照（N），以抗体稀释浓度为0.3 μg/mL的相对应抗体作为阳性对照（P），37℃孵育1 h。最后每孔加入对应的1:5000稀释的辣根过氧化物酶HRP标记亲和纯化山羊抗鼠IgG（H+L）F(ab’)₂片段（品牌：Jackson，货号：115-036-003）和辣根过氧化物酶HRP标记亲和纯化山羊抗兔IgG（H+L）（品牌：Jackson，货号：111-035-003）100 µL，进行二抗孵育后洗涤，加入TMB显色液显色，终止显色后，测定450 nm的OD值。

结果如表3所示，抗LAG3单克隆抗体MJ13-15能够特异性地识别真核LAG3蛋白。在相同稀释条件下，抗LAG3单克隆抗体MJ13-15抗体对LAG3蛋白的反应的阳性OD值更高，说明其效价高于商品化抗体。

表3

综上，本发明提供抗LAG3单克隆抗体与LAG3蛋白具有较高的亲和力，能够特异性地识别真核表达的LAG3蛋白及原核表达的LAG3蛋白，在制备LAG3检测试剂盒中具有重要的应用前景。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110> 迈杰转化医学研究（苏州）有限公司

<120> 一株分泌抗LAG3单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

<130> 2021

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 434

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val Trp Ala Gln Glu Gly Ala

1 5 10 15

Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile Pro Leu Gln Asp Leu Ser

20 25 30

Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln His Gln Pro Asp Ser Gly

35 40 45

Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Pro

50 55 60

Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Thr Val Leu

65 70 75 80

Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly Arg Leu Pro Leu Gln Pro

85 90 95

Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln Arg Gly Asp Phe Ser Leu

100 105 110

Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala Gly Glu Tyr Arg Ala Ala

115 120 125

Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys Arg Leu Arg Leu Arg Leu

130 135 140

Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro Gly Ser Leu Arg Ala Ser

145 150 155 160

Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser Arg Pro Asp Arg Pro Ala

165 170 175

Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln Gly Arg Val Pro Val Arg

180 185 190

Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser Phe Leu Phe Leu Pro Gln

195 200 205

Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly Cys Ile Leu Thr Tyr Arg

210 215 220

Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn Leu Thr Val Leu Gly Leu

225 230 235 240

Glu Pro Pro Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala Gly Ala Gly Ser Arg Val

245 250 255

Gly Leu Pro Cys Arg Leu Pro Ala Gly Val Gly Thr Arg Ser Phe Leu

260 265 270

Thr Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly Pro Asp Leu Leu Val Thr

275 280 285

Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu Glu Asp Val Ser Gln Ala

290 295 300

Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys His Ile His Leu Gln Glu Gln Gln Leu

305 310 315 320

Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile Thr Val Thr Pro Lys Ser Phe

325 330 335

Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu Cys Glu Val Thr Pro Val

340 345 350

Ser Gly Gln Glu Arg Phe Val Trp Ser Ser Leu Asp Thr Pro Ser Gln

355 360 365

Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu Ala Gln Glu Ala Gln Leu Leu

370 375 380

Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Gln Gly Glu Arg Leu Leu Gly

385 390 395 400

Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser Pro Gly Ala Gln Arg Ser

405 410 415

Gly Arg Ala Pro Gly Ala Leu Pro Ala Gly His Leu His His His His

420 425 430

His His

<210> 2

<211> 899

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Asn His Lys Val His His His His His His Met Gln Val Ser Val

1 5 10 15

Glu Thr Thr Gln Gly Leu Gly Arg Arg Val Thr Ile Thr Ile Ala Ala

20 25 30

Asp Ser Ile Glu Thr Ala Val Lys Ser Glu Leu Val Asn Val Ala Lys

35 40 45

Lys Val Arg Ile Asp Gly Phe Arg Lys Gly Lys Val Pro Met Asn Ile

50 55 60

Val Ala Gln Arg Tyr Gly Ala Ser Val Arg Gln Asp Val Leu Gly Asp

65 70 75 80

Leu Met Ser Arg Asn Phe Ile Asp Ala Ile Ile Lys Glu Lys Ile Asn

85 90 95

Pro Ala Gly Ala Pro Thr Tyr Val Pro Gly Glu Tyr Lys Leu Gly Glu

100 105 110

Asp Phe Thr Tyr Ser Val Glu Phe Glu Val Tyr Pro Glu Val Glu Leu

115 120 125

Gln Gly Leu Glu Ala Ile Glu Val Glu Lys Pro Ile Val Glu Val Thr

130 135 140

Asp Ala Asp Val Asp Gly Met Leu Asp Thr Leu Arg Lys Gln Gln Ala

145 150 155 160

Thr Trp Lys Glu Lys Asp Gly Ala Val Glu Ala Glu Asp Arg Val Thr

165 170 175

Ile Asp Phe Thr Gly Ser Val Asp Gly Glu Glu Phe Glu Gly Gly Lys

180 185 190

Ala Ser Asp Phe Val Leu Ala Met Gly Gln Gly Arg Met Ile Pro Gly

195 200 205

Phe Glu Asp Gly Ile Lys Gly His Lys Ala Gly Glu Glu Phe Thr Ile

210 215 220

Asp Val Thr Phe Pro Glu Glu Tyr His Ala Glu Asn Leu Lys Gly Lys

225 230 235 240

Ala Ala Lys Phe Ala Ile Asn Leu Lys Lys Val Glu Glu Arg Glu Leu

245 250 255

Pro Glu Leu Thr Ala Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Val Glu Asp Gly

260 265 270

Ser Val Glu Gly Leu Arg Ala Glu Val Arg Lys Asn Met Glu Arg Glu

275 280 285

Leu Lys Ser Ala Ile Arg Asn Arg Val Lys Ser Gln Ala Ile Glu Gly

290 295 300

Leu Val Lys Ala Asn Asp Ile Asp Val Pro Ala Ala Leu Ile Asp Ser

305 310 315 320

Glu Ile Asp Val Leu Arg Arg Gln Ala Ala Gln Arg Phe Gly Gly Asn

325 330 335

Glu Lys Gln Ala Leu Glu Leu Pro Arg Glu Leu Phe Glu Glu Gln Ala

340 345 350

Lys Arg Arg Val Val Val Gly Leu Leu Leu Gly Glu Val Ile Arg Thr

355 360 365

Asn Glu Leu Lys Ala Asp Glu Glu Arg Val Lys Gly Leu Ile Glu Glu

370 375 380

Met Ala Ser Ala Tyr Glu Asp Pro Lys Glu Val Ile Glu Phe Tyr Ser

385 390 395 400

Lys Asn Lys Glu Leu Met Asp Asn Met Arg Asn Val Ala Leu Glu Glu

405 410 415

Gln Ala Val Glu Ala Val Leu Ala Lys Ala Lys Val Thr Glu Lys Glu

420 425 430

Thr Thr Phe Asn Glu Leu Met Asn Gln Gln Ala Ser Ala Gly Leu Glu

435 440 445

Val Leu Phe Gln Gly Pro Ser Ala Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly

450 455 460

Gly Ile Glu Gly Arg His Met Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val

465 470 475 480

Val Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr

485 490 495

Ile Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp

500 505 510

Gln His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro

515 520 525

Leu Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg

530 535 540

Pro Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser

545 550 555 560

Gly Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg

565 570 575

Gln Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp

580 585 590

Ala Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser

595 600 605

Cys Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro

610 615 620

Pro Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe

625 630 635 640

Ser Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly

645 650 655

Gln Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu

660 665 670

Ser Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp

675 680 685

Gly Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr

690 695 700

Asn Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Pro Thr Pro Leu Thr Val Tyr

705 710 715 720

Ala Gly Ala Gly Ser Arg Val Gly Leu Pro Cys Arg Leu Pro Ala Gly

725 730 735

Val Gly Thr Arg Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly

740 745 750

Gly Pro Asp Leu Leu Val Thr Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg

755 760 765

Leu Glu Asp Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys His Ile

770 775 780

His Leu Gln Glu Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile

785 790 795 800

Thr Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu

805 810 815

Leu Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gln Glu Arg Phe Val Trp Ser

820 825 830

Ser Leu Asp Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu

835 840 845

Ala Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln Leu Tyr

850 855 860

Gln Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser

865 870 875 880

Ser Pro Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala Leu Pro Ala

885 890 895

Gly His Leu

Claims (11)

1.一株分泌抗LAG3单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述分泌抗LAG3单克隆抗体的杂交瘤细胞株命名为鼠抗人LAG3单克隆抗体杂交瘤细胞系MJ13-15，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.45003，保藏日期为2021年12月3日。

2.一种抗LAG3单克隆抗体，其特征在于，所述抗LAG3单克隆抗体由权利要求1所述的鼠抗人LAG3单克隆抗体杂交瘤细胞系MJ13-15产生。

3.根据权利要求2所述的抗LAG3单克隆抗体，其特征在于，所述抗LAG3单克隆抗体的重链为IgG1型。

4.根据权利要求2或3所述的抗LAG3单克隆抗体，其特征在于，对纯化后的抗LAG3单克隆抗体进行修饰，所述修饰使用的修饰缀合物包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、生物素或荧光基团中的任意一种。

5.一种权利要求2~4任一项所述的抗LAG3单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

培养权利要求1所述的分泌抗LAG3单克隆抗体的杂交瘤细胞株MJ13-15，纯化，获得所述抗LAG3单克隆抗体。

6.权利要求1所述的分泌抗LAG3单克隆抗体的杂交瘤细胞株和/或权利要求2~4任一项所述的抗LAG3单克隆抗体在制备LAG3蛋白表达检测产品中的应用。

7.一种LAG3免疫组织化学检测试剂盒，其特征在于，所述LAG3免疫组织化学检测试剂盒包括权利要求2~4任一项所述的抗LAG3单克隆抗体；

所述LAG3免疫组织化学检测试剂盒还包括：免疫组织化学抗原修复缓冲液、封闭液、酶标二抗、显色剂或苏木素复染液中的任意一种或至少两种的组合。

8.一种LAG3免疫印迹检测试剂盒，其特征在于，所述LAG3免疫印迹检测试剂盒包括权利要求2~4任一项所述的抗LAG3单克隆抗体；

所述LAG3免疫印迹检测试剂盒还包括：SDS-PAGE凝胶、聚偏二氟乙烯膜、封闭液或酶标二抗中的任意一种或至少两种组合。

9.一种LAG3酶联免疫吸附检测试剂盒，其特征在于，所述LAG3酶联免疫吸附检测试剂盒包括权利要求2~4任一项所述的抗LAG3单克隆抗体；

所述LAG3酶联免疫吸附检测试剂盒还包括：封闭液、酶标二抗、显色液或终止液中的任意一种或至少两种组合。

10.一种LAG3免疫荧光检测试剂盒，其特征在于，所述LAG3免疫荧光检测试剂盒包括权利要求2~4任一项所述的抗LAG3单克隆抗体；

所述抗LAG3单克隆抗体修饰有荧光基团，所述荧光基团为FITC、Cy3或Cy5中的任意一种。

11.一种LAG3流式细胞术检测试剂盒，其特征在于，所述LAG3流式细胞术检测试剂盒包括权利要求2~4任一项所述的抗LAG3单克隆抗体。

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