CN113238062A - 一种用于人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白光激化学发光均相免疫检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

一种用于人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白光激化学发光均相免疫检测试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于免疫分析技术领域，具体涉及一种人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白（VASP‑P）光激化学发光均相免疫检测试剂盒及其检测方法，其中，所述试剂盒包括组份SA‑GG、组份Bio‑Ab、组份FG‑Ab、样本前处理缓冲液、含PGE1的样本激活剂和含PGE1+ADP的样本抑制剂。本发明的试剂盒采用均相免疫，利用光激化学发光分析方法与光激化学发光检测仪配合，用于测定人体样本中的人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白含量，与目前VASP检测主流技术流式细胞技术相比，对操作人员要求较为简单及仪器费用较低，与ELISA等非均相免疫分析相比，检测范围宽，操作简单，检测时间短，灵敏度高，重复性好。

Description

一种用于人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白光激化学发光均相免 疫检测试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明涉及用于人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白光激化学发光均相免疫检测试剂盒及其检测方法，属于分子免疫学领域。
背景技术
人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白（VASP）属于Ena/VASP蛋白家族，是一种血小板胞内肌动蛋白调节蛋白。其存在2个重要的磷酸化位点，分别为：丝氨酸157和丝氨酸239，这两个磷酸化位点的磷酸化状态与血小板的活化功能密切相关。丝氨酸157磷酸化位点的磷酸化可以抑制人血小板中纤维蛋白原与糖蛋白IIb/IIIa的结合；丝氨酸239磷酸化位点主要存在于完整的人内皮细胞及血小板上，其磷酸化以应答药理和生理的血管舒张剂和血小板抑制剂。血管舒张刺激磷蛋白是血小板内P2Y12受体特异性活化标志物，抑制其磷酸化；当存在ADP受体拮抗剂时，VASP磷酸化产物增多，进而抑制血小板的活化。
氯吡格雷对血小板的抑制作用主要通过特异性阻断ADP与血小板膜上P2Y12受体结合而起效，P2Y12受体被抑制则血管舒张刺激磷蛋白磷酸化，表现为血小板抑制；去磷酸化则血小板活性恢复。血管舒张刺激磷蛋白磷酸化是P2Y12活化途径的关键环节，对其量化分析是针对P2Y12通路的特异性检测方法，且测量结果具有良好的稳定性，量化检测血管舒张刺激磷蛋白的磷酸化水平可特异性地评价氯吡格雷对血小板的抑制程度。
目前VASP检测主流产品为stago公司的PLT VASP/P2Y12，需要采用流式细胞仪进行检测，流式细胞技术和操作对人员和机器的要求较高导致花费较为昂贵、Stago公司也提供检测VASP的试剂盒，但反应时间较长，操作繁琐。
而文献中也公开了一些VASP的新的检测方法，中国专利CN106370839A公开了一种快速检测的量子点免疫层析试纸条。试纸条将磷酸化VASP单克隆抗体和量子点偶联物喷涂在玻璃纤维素膜上得到探针固定垫，VASP单克隆抗体包被在检测膜检测线上，羊抗鼠多克隆抗体包被在检测膜的质控线上。
CN108982861A公开了一种酶促化学发光血管扩张型刺激磷蛋白检测试剂盒。用包被有VASP单克隆抗体的磁颗粒和辣根过氧化物酶（HRP）标记VASP-P抗体Ⅱ，在与待测标本中相应的抗原发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入底物（发光剂），酶催化和分解底物发光。
以上三种发光免疫分析方法，均属于非均相免疫分析。非均相免疫分析在检测信号前，需要通过反复洗涤固相(微粒)，以分离去除分布于液相中的未参加反应的标记抗体。多次洗涤必然会为免疫分析带来洗涤“误差”，影响分析方法的精密度，从而影响分析方法的准确度和分析敏感度。并且反复洗涤与检测周期、检测成本都有较为直接的关系，因此，设计一种均相的免疫分析法用于VASP的检测，是十分有必要的。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是获得用于人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白光激化学发光均相免疫检测试剂盒及其检测方法，避免了酶联免疫试剂盒存在的线性范围窄、操作繁琐等缺点，且解决了灵敏度低、稳定性差等缺陷。
为实现上述发明目的之一，本发明采用的人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白光激化学发光均相免疫检测试剂盒的技术方案如下：
所述试剂盒包括包括含链霉亲和素与供体结合物的组份SA-GG、含生物素与VASP-P抗体Ⅰ的结合物的组份Bio-Ab、含VASP-P抗体Ⅱ与受体结合物的组份FG-Ab、样本前处理缓冲液、含PGE1(前列腺素E1)的样本激活剂和含PGE1(前列腺素E1)和ADP（二磷酸腺苷）的样本抑制剂。
优选的，所述组份SA-GG含与链霉亲和素结合的能够在激发状态产生单线态氧的供体，所述与链霉亲和素结合的能够在激发状态产生单线态氧的供体包含有光活化的敏化剂，其为非粒子形式，且在含水介质中可溶，所述供体为填充有感光化合物（酞菁分子）的高分子微粒，直径为180-220nm。感光化合物受特殊波长680nm光激发，每秒可产生6万个以上单线态氧分子，放大信号，但单线态氧半衰期仅为4us，在有水介质中衰减快，最远可传输200nm距离，如果受体能通过一定方式，如抗体免疫吸附、亲和素-链霉素识别等，接近供体，则受体中的荧光基团可迅速吸收单线态氧，以上转换方式产生520-620nm光信号，为检测器探测到。其中，链霉亲和素与供体偶联物缓冲液为发光试剂缓冲液。
优选的，所述组份Bio-Ab含生物素与VASP-P抗体Ⅰ的偶联物，其中生物素为活化小分子生物素。VASP-P抗体Ⅰ可以与磷酸化和非磷酸化VASP结合。其中VASP-P抗体Ⅰ为鼠单抗，鼠单抗重链可变区氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2 所示，鼠单抗轻链可变区氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示。抗体制备方法参照《抗体制备与使用实验指南》，所采用的的免疫原为人工合成（VASP的氨基酸276-355）序列如序列表SEQ ID NO.5所示。
其中，生物素与VASP-P抗体Ⅰ的偶联物的缓冲液为20mM～200mM Tris（三羟甲基氨基甲烷）缓冲液，PH为7.5～8.5。作为一种优选的实施方式，微粒包被物缓冲液浓度为100mM，PH为7.0。
优选的，所述组份FG-Ab含VASP-P抗体Ⅱ与受体结合物，其中受体包含烯烃化合物和金属螯合物，其为非粒子形式，且在含水介质中可溶；受体为填充有发光化合物和镧系元素的高分子微粒，直径为180-220nm。其中VASP-P抗体Ⅱ是在239丝氨酸位置磷酸化的VASP，VASP-P抗体Ⅱ可识别并特异性结合239丝氨酸位置磷酸化的VASP。本发明采用的VASP-P抗体Ⅱ为外购抗体。
其中，VASP-P抗体Ⅱ与受体偶联物缓冲液为20mM～200mM Tris（三羟甲基氨基甲烷）缓冲液，PH为7.5～8.5。作为一种优选的实施方式，微粒包被物缓冲液浓度为100mM，PH为7.0。优选的，所述含PGE1的样本激活剂和含PGE1+ADP的样本抑制剂使用时样本前处理缓冲液将分别稀释至2-20μmol/L，最优选的浓度为10μM，PH为7.4。优选的，所述样本前处理缓冲液包含30-100mM Tris-HCL、100-500mM NaCL、0.2-0.3% Tween-20、0.2-0.8％TritonX-100、1-2‰Proclin 300，PH为7.0～8.0。
更优选的，缓冲液浓度为70mM Tris-HCL(PH7.6)、250mM NaCL、0.2% Tween-20、0.5％TritonX-100、1.5‰Proclin 300，优选的PH为7.6。
优选的，所述试剂盒还包括人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白校准品。
更优选的，所述人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白校准品为含20%胎牛血清的校准品缓冲液，将人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白抗原稀释至工作浓度400ng/L。
其中，校准品缓冲液为20mM～200mM Tris缓冲液，PH为6.5～8.0，优选的浓度为20mM，优选的PH为7.4。
试剂盒将上述试剂组份组装成盒，于-16℃以下条件保存。
本发明的另一个目的是公开了一种使用上述试剂盒的VASP光激化学发光均相免疫检测方法。所述方法包括如下步骤：
a) 样本前处理：取样本激活剂干粉和样本抑制剂干粉分别用样本前处理剂溶解后，分别取10μl加入等体积待测样本（全血）或校准品，混匀，室温孵育10min；
b)孵育后加入等体积的组份FG-Ab和组份Bio-Ab，孵育，进行第一步反应；再加入组份SA-GG进行第二步反应；
c) 激光照射反应孔，测量每个反应孔的光信号值。
本发明中采用的发光测量仪为自动光激化学发光检测仪LiCA500。
优选的，所述所述组份SA-GG采用如下步骤制备：感光颗粒和链霉亲和素10:1的比例加入0.1M 2-（N-吗啉）乙磺酸MES缓冲液，37℃反应避光震荡48小时。羧甲氧基胺半盐酸盐（CMO）溶液封闭未结合位点。离心分离得到已连接亲和素的感光颗粒，用发光试剂缓冲液稀释偶联亲和素的感光微粒重悬保存。
其中，发光试剂缓冲液包含3-7% (v/v) HEPES、0.5-2％(wt/v)海藻糖、0.3-0.7％（wt/v）TrionX-100、 0.05-0.2%(wt/v) Dextan，PH为7.0～8.0。优选的，缓冲液浓度为5%(v/v)HEPES、1％(wt/v)海藻糖、0.5％（wt/v）TrionX-100、 (wt/v)0.1%Dextan，优选的PH为7.5。
优选的，所述组份Bio-Ab采用如下步骤制备：将VASP-P抗体Ⅰ加入碳酸钠缓冲液中，加入活化生物素，37℃反应12-18小时后，进行透析，透析结束后加入Tris-Hcl缓冲液进行悬浮和保存。
优选的，所述组份FG-Ab采用如下步骤制备：将受体加入碳酸钠缓冲液中，加入VASP-P抗体Ⅱ，迅速斡旋混匀，37℃避光反应，加入含75mg/ml Gly的碳酸盐缓冲液，去液体，得到VASP-P抗体Ⅱ和受体的结合物，加入Tris缓冲液进行重悬即为组份FG-Ab。
优选的，所述人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白校准品的制备方法为，用校准品缓冲液将人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白抗原稀释至工作浓度400ng/L。采用蛋白校准品检测后绘制标准曲线，标准曲线公式y=75124x–24344，R²= 0.9995。
本发明的第三个目的在于公开一种上述人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白光激化学发光均相免疫检测试剂盒的应用，所述试剂盒用于评估抗血小板药物的用药效果。抗血小板药物如氯吡格雷。
本发明的人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白含量（VASP-P）试剂盒采用均相免疫，利用光激化学发光分析方法与光激化学发光检测仪配合，用于测定人体样本中的人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白含量。与目前VASP检测主流技术流式细胞技术相比，整个检测过程无分离洗涤过程，不仅节省检测时间，且不会产生额外废液，免除洗涤误差，对操作人员要求较为简单及仪器费用较低；与ELISA等非均相免疫分析相比，检测范围宽，操作简单，检测时间短，灵敏度高，重复性好，环境友好人工成本低，适合推广。
附图说明
图1 为VASP-P检测原理图。
图2为本发明的标准品激活标准曲线图。
图3为本发明的标准品抑制标准曲线图。
图4为本发明的孵育时间与RLU强度的测定表。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白光激化学发光均相免疫检测试剂盒及其检测方法作进一步详细、完整地说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。
实施例1、试剂盒的制备
如图1所示，本发明的试剂盒采用均相免疫，利用光激化学发光分析方法与光激化学发光检测仪配合，用于测定人体样本中的人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白含量。反应的技术原理为：通过在均相条件下将样本、生物素标记VASP-P抗体Ⅰ和偶联了VASP-P抗体Ⅱ的发光微球混合。此时生物素标记VASP-P抗体Ⅰ和偶联了VASP-P抗体Ⅱ的发光微球迅速有效地识别检测样本的目标分子而形成免疫夹心复合物。然后加入链霉亲和素标记的感光微球，形成感光微球-链霉亲和素-生物素-VASP-P抗体Ⅰ-VASP-P抗原-VASP-P抗体Ⅱ-发光微球免疫复合物。在激光(波长为680nm)的照射下，感光微球上的光敏剂将周围环境中的氧气转化为更为活跃的单线态氧。单线态氧扩散至发光微球，与其上的化学发光剂反应，进一步激活了同样在发光微球上的荧光基团，使之发出荧光，波长为615nm。单线态氧的半衰期为4μs，在溶液中的扩散距离为200nm左右。如果生物分子不存在相互作用，单线态氧无法扩散到发光微球，则不会有荧光信号产生。在测定范围内，发光强度与样本中的人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白浓度成正比，使用改良的四参数Logistic方程拟合可定量测算出待测样本中人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白浓度。
(1)样本前处理缓冲液制备：
Figure 876633DEST_PATH_IMAGE001
将上述物料加入1000mL去离子水中，充分搅拌溶解，调节PH至7.60±0.10。
(2)组份SA-GG的制备
a.感光微球（供体）混悬液处理：吸取10mg的感光微球于高速冷冻离心机中离心，弃去上清，加入0.2ml MES缓冲液，超声细胞破碎仪上超声至微粒重新悬浮；
b.链霉亲和素溶液配制：称量1mg链霉亲和素，加入0.2ml MES缓冲液溶解；
c.混合：将以上处理好的感光微球(供体)混悬液、链霉亲和素溶液，等体积比进行混合，迅速混匀；
d. 反应：加入10ul MES缓冲液配制的40mg/ml的NaBH3CN溶液，迅速混匀，37℃旋转反应48小时；
e.封闭：加入40ul MES缓冲液配制150mg/ml的Gly溶液以及25ul 40mg/ml的NaBH3CN溶液，混匀，37℃旋转反应2小时。再加入0.3ml 200mg/ml的BSA溶液(MES缓冲液)，37℃旋转反应16小时；
f.清洗：离心，弃上清，加入新鲜MES缓冲液超声法重新悬浮，再次离心，如此清洗3次；
g.发光试剂缓冲液配置：5%(v/v)HEPES、1％(wt/v)海藻糖、0.5％（wt/v）TrionX-100、 (wt/v)0.1%Dextan，PH为7.5±0.10；
h.稀释悬浮：最后用发光试剂缓冲液进行稀释悬浮，供体浓度为100μg/mL。
(3)组份Bio-Ab的制备：
a.抗体处理：将VASP-P抗体Ⅰ透析于0.1M NaHCO3溶液，4h/次，换液1次，测定抗体浓度并调节至0.5mg/ml；
b.标记：取200ul 取处理好的 VASP-P抗体Ⅰ,再加入8ul 5mg/ml生物素溶液，迅速混匀。2-8℃静置反应12-16小时；
c.透析：将反应好的生物素标记抗体透析于生物素标记透析缓冲液(pH＝8.00)，2～8℃进行透析，至少更换透析液1次，每次至少透析4～5小时；
d. 稀释悬浮：将透析好的生物素化抗体吸出转移至干净离心管中，用0.1M Tris-HCl溶液生物素标记抗体浓度调节至10ug/ml。
免疫原为人工合成（VASP的氨基酸276-355）序列如下：
KATQVGEKTPKDESANQEEPEARVPAQSESVRRPWEKNSTTLPRMKSSSSVTTSETQPCTPSSSDYSDLQRVKQELLEEV
人工合成（VASP的氨基酸276-355）序列如序列表SEQ ID NO.5所示。
鼠单克隆抗体重链可变区DNA序列和氨基酸序列具体如下：
1 ATG CTG TTG GGG CTG TCT CAG CCA CTC CGA TCT ACA GGA TAT CAA 45
1 M L L G L S Q P L R S T G Y Q 15
46 GGT GTG CAT TGT GAG GTG CAG CTT GTT GAG TCT GGT GGA GGA TTG 90
16 G V H C E V Q L V E S G G G L 30
91 GTG CAG CCT TCT GTG GCT CTC GCT TAT CTT CAC GTC AGC AGA GTC 135
31 V Q P S V A L A Y L H V S R V 45
136 TGC TGG AAG ATG AAC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGA AAG GGT TTG 180
46 C W K M N W V R Q A P G K G L 60
181 GAA TGG ATT GCT CGC GCT AAC AGA GTC AGA GGC AGA ATG GTG TAT 225
61 E W I A R A N R V R G R M V Y 75
226 TAT GCC GAT TCA GTG AAA GAC AGG TTC ACC ATC TCC AGA GAT GAT 270
76 Y A D S V K D R F T I S R D D 90
271 TCA CAA AGC ATG CTC TAT CTG CAG TTG TCT TCT CCA CCA CTC TCT 315
91 S Q S M L Y L Q L S S P P L S 105
316 GGA GCA AGG GAT CAT GGG 333
106 G A R D H G
鼠单克隆抗体重链可变区DNA序列如序列表SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。
鼠单克隆抗体轻链可变区DNA序列和氨基酸序列具体如下：
1 ATG GAG ACA GAC ACA CTC CTG TTA TGG GTA CTG CTG CTC TGG GTT 45
1 M E T D T L L L W V L L L W V 15
46 CCA GGT TCC ACT GGT GAC ATT GTG CTG ACA CAG TCT CCT GCT TCC 90
16 P G S T G D I V L T Q S P A S 30
91 TTA GCT GTA TCT CTG GGG CAG AGG GCC ACC ATC TCG TGC AGG GCC 135
31 L A V S L G Q R A T I S C R A 45
136 ACC AAC CTG TGC GAC GAA TAC ACA GCC ATG CAC TGG TAC CAA CAG 180
46 T N L C D E Y T A M H W Y Q Q 60
181 AAA CCA GGA CAG TCA CCC AAA CTC CTC ATC TAT GGC GAC GTC TCC 225
61 K P G Q S P K L L I Y G D V S 75
226 AAC CTA GAA TCT GGG GTC CCT GCC AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT 270
76 N L E S G V P A R F S G S G S 90
271 GGG ACA GAC TTC ACC CTC AAC ATC CAT CCT GTG GAG GAG GAG GAT 315
91 G T D F T L N I H P V E E E D 105
316 GCT GCA ACC TAT TAC TGT 333
106 A A T Y Y C
鼠单克隆抗体轻链可变区DNA序列如序列表SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示。
(4)组份FG-Ab的制备：
a. 抗体处理：将0.3mg VASP-P抗体Ⅱ透析于0.1M NaHCO3溶液，4h/次，换液1次，测定抗体浓度并调节至1mg/ml。所述VASP-P抗体Ⅱ为外购抗体，具体为abcam公司的Anti-VASP (phospho S239)抗体(ab194747)；
b.受体处理：取4mg受体加入离心管，加入0.05M NaHCO3缓冲液，7000rpm离心10min，弃上清，向离心管中加入800ul 0.05M NaHCO3缓冲液，进行超声清洗后，再次离心，弃上清；
c.混匀和反应：加入400ul pH9.6的0.05M CB缓冲液将受体重悬，使受体浓度为10mg/ml，再加入0.2mg透析后的 VASP-P抗体Ⅱ，混匀后将离心管置于37℃，垂直旋转混合器上25～40rpm避光混匀过夜。将离心管放入2～8℃下冷却10min，取8ul的8mg/ml NaBH4溶液，立即加入离心管内并混匀，室温混合器上反应2小时；
d. 封闭：在离心管中加入70ul的75mg/ml Gly的碳酸盐缓冲液，混匀，垂直旋转混合器上25～40rpm反应1小时；
e.清洗：7500rpm离心5min，弃上清，加入pH7.4的0.1M PBST缓冲液，进行超声清洗，重复两次；
f.稀释悬浮：用0.1M Tris-HCl溶液稀释至受体浓度200μg/mL。
(5)人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白校准品的制备方法：
a.校准品缓冲液制备：
Figure 119395DEST_PATH_IMAGE002
将上述物料加入1000mL去离子水中，充分搅拌溶解，调节PH至7.40±0.10；
b.用校准品缓冲液将人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白抗原稀释至工作浓度400ng/L。
(6)组装：将上述试剂组份组装成盒，于-16℃以下条件保存。
(7)Sigma公司的sulfo-Biotin以及链霉亲和素作为偶联标记原料。
实施例2、试剂盒的测试方法
(1)冰箱中取出试剂盒，均应平衡到室温(18-25℃)；
(2)取样本激活剂干粉和样本抑制剂干粉分别加入1ml样本前处理剂进行溶解；
(3)分别取10μl样本激活剂和样本抑制剂于反应孔中；
(4)取10μl待测样本（全血）或校准品分别加入样本激活剂和样本抑制剂反应孔中，混匀，室温孵育10min；
(5)在反应孔中依次加入20ul组份FG-Ab和20ul组份Bio-Ab，充分混匀，37℃温育10min；
(6)再加入175ul组份SA-GG，37℃温育2min；
(7)激光照射微孔并计算每孔的信号值；
(8)计算：血小板反应指数(PRI)＝[(RLU激活-RLU抑制)/（RLU激活-RLU空白）]×100％，RLU（relative light unit）为相对光单位，发光仪的原始数据通常以相对光单位表示。这是一个样品中光产生量的相对测试值，不能预期不同的发光仪对于同样的样品能够得到相同的RLU读数。
实施例3、试剂盒的性能测试结果
试剂盒性能评价包括对采用该方法制备的试剂盒进行线性、精密度、准确度进行测定。
(1)采用蛋白校准品检测后绘制标准曲线，激活标准曲线如图2所示，抑制标准曲线如图3所示，标准曲线公式y（激活） = 117.66x - 926.74，R2 = 0.9995，y（抑制）=114.65x + 101.47，R2 = 0.9997同时对检测结果线性情况进行评价，检测结果如下表1所示：
Figure 781321DEST_PATH_IMAGE003
表1 为校准品检测结果。
(2)检测重复性：
Figure 185758DEST_PATH_IMAGE004
表2为VASP光激化学发光试剂盒样本检测重复性。
由上述检测结果及分析可知，本发明的试剂盒检测结果重复性好，其结果均具有统计学意义。
(3)抗干扰性能：
Figure 300344DEST_PATH_IMAGE005
表3 为VASP化学发光试剂盒样本抗干扰性能。
鉴于均相免疫技术是一种免洗方法，因此它可能更容易受到来自黄疸，溶血和高血脂血液的异常临床样品的干扰。另外，生物素在许多基于链霉亲和素-生物素的免疫测定中引起干扰，从而导致夹心免疫测定中假降低的结果。
通过在血清库中添加已知量的甘油三酸酯，胆红素，血红蛋白和生物素来进行干扰测试。干扰率是根据添加干扰物质之前和之后的百分比差计算得出的，干扰率±10％为可接受范围。此外，甘油三酸酯，胆红素，血红蛋白和生物素的存在分别达到10.0 g / L，0.5 mmol / L，5.0 g / L和250μg/ L的浓度时，未观察到显着差异。
实施例4、试剂盒的临床性能测试
采用本申请试剂盒通过临床样本验证后，PRI(血小板反应性指数)≥53％为阴性，PRI≤53％为阳性。
本申请的试剂盒与已上市试剂盒(CY-QUANTVASP/P2Y12、BIOCYTEX)同时检测105例样本，数据下表所示：
表3.与Stago公司VASP试剂盒检测样本符合率
Figure 81218DEST_PATH_IMAGE006
阴性符合率：56/59=94.92%；
阳性符合率：46/46=100%；
总符合率：102/105=98.1%。
由以上的结果可以看出：本发明涉及的试剂盒与ELISA试剂盒相比，性能测试结果更优，本发明的人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白光激化学发光均相免疫检测试剂盒具有很好的适用性和先进性。
实施例5、抗体孵育时间优化
测试抗原和抗体之间免疫反应步骤的时长，以便评估孵育时间对测定性能的影响。信号值随5至10分钟的孵育时间而增加。但是，在10分钟后仅观察到RLU强度略有增加，表明反应已达到平衡。因此，在后续步骤中使用了10分钟的孵育时间，具体结果见图4。
最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 湖南菲思特精准医疗科技有限公司
<120> 一种用于人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白光激化学发光均相免疫检测试剂盒及其检测方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 315
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(315)
<400> 1
atgctgttgg ggctgtctca gccactccga tctacaggat atcaaggtgt gcattgtgag 60
gtgcagcttg ttgagtctgg tggaggattg gtgcagcctt ctgtggctct cgcttatctt 120
cacgtcagca gagtctgctg gaagatgaac tgggtccgcc aggctccagg aaagggtttg 180
gaatggattg ctcgcgctaa cagagtcaga ggcagaatgg tgtattatgc cgattcagtg 240
aaagacaggt tcaccatctc cagagatgat tcacaaagca tgctctatct gcagttgtct 300
tctccaccac tctct 315
<210> 2
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(105)
<400> 2
Met Leu Leu Gly Leu Ser Gln Pro Leu Arg Ser Thr Gly Tyr Gln Gly
1 5 10 15
Val His Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Ser Val Ala Leu Ala Tyr Leu His Val Ser Arg Val Cys Trp Lys
35 40 45
Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Ala
50 55 60
Arg Ala Asn Arg Val Arg Gly Arg Met Val Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
65 70 75 80
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met Leu Tyr
85 90 95
Leu Gln Leu Ser Ser Pro Pro Leu Ser
100 105
<210> 3
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(333)
<400> 3
atggagacag acacactcct gttatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60
gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 120
atctcgtgca gggccaccaa cctgtgcgac gaatacacag ccatgcactg gtaccaacag 180
aaaccaggac agtcacccaa actcctcatc tatggcgacg tctccaacct agaatctggg 240
gtccctgcca ggttcagtgg cagtgggtct gggacagact tcaccctcaa catccatcct 300
gtggaggagg aggatgctgc aacctattac tgt 333
<210> 4
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(111)
<400> 4
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala
20 25 30
Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Thr Asn Leu
35 40 45
Cys Asp Glu Tyr Thr Ala Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
50 55 60
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Asp Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly
65 70 75 80
Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
85 90 95
Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
100 105 110
<210> 5
<211> 80
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(80)
<400> 5
Lys Ala Thr Gln Val Gly Glu Lys Thr Pro Lys Asp Glu Ser Ala Asn
1 5 10 15
Gln Glu Glu Pro Glu Ala Arg Val Pro Ala Gln Ser Glu Ser Val Arg
20 25 30
Arg Pro Trp Glu Lys Asn Ser Thr Thr Leu Pro Arg Met Lys Ser Ser
35 40 45
Ser Ser Val Thr Thr Ser Glu Thr Gln Pro Cys Thr Pro Ser Ser Ser
50 55 60
Asp Tyr Ser Asp Leu Gln Arg Val Lys Gln Glu Leu Leu Glu Glu Val
65 70 75 80
序列表
<110> 湖南菲思特精准医疗科技有限公司
<120> 一种用于人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白光激化学发光均相免疫检测试剂盒及其检测方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 315
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(315)
<400> 1
atgctgttgg ggctgtctca gccactccga tctacaggat atcaaggtgt gcattgtgag 60
gtgcagcttg ttgagtctgg tggaggattg gtgcagcctt ctgtggctct cgcttatctt 120
cacgtcagca gagtctgctg gaagatgaac tgggtccgcc aggctccagg aaagggtttg 180
gaatggattg ctcgcgctaa cagagtcaga ggcagaatgg tgtattatgc cgattcagtg 240
aaagacaggt tcaccatctc cagagatgat tcacaaagca tgctctatct gcagttgtct 300
tctccaccac tctct 315
<210> 2
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(105)
<400> 2
Met Leu Leu Gly Leu Ser Gln Pro Leu Arg Ser Thr Gly Tyr Gln Gly
1 5 10 15
Val His Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Ser Val Ala Leu Ala Tyr Leu His Val Ser Arg Val Cys Trp Lys
35 40 45
Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Ala
50 55 60
Arg Ala Asn Arg Val Arg Gly Arg Met Val Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
65 70 75 80
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met Leu Tyr
85 90 95
Leu Gln Leu Ser Ser Pro Pro Leu Ser
100 105
<210> 3
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(333)
<400> 3
atggagacag acacactcct gttatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60
gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 120
atctcgtgca gggccaccaa cctgtgcgac gaatacacag ccatgcactg gtaccaacag 180
aaaccaggac agtcacccaa actcctcatc tatggcgacg tctccaacct agaatctggg 240
gtccctgcca ggttcagtgg cagtgggtct gggacagact tcaccctcaa catccatcct 300
gtggaggagg aggatgctgc aacctattac tgt 333
<210> 4
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(111)
<400> 4
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala
20 25 30
Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Thr Asn Leu
35 40 45
Cys Asp Glu Tyr Thr Ala Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
50 55 60
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Asp Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly
65 70 75 80
Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
85 90 95
Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
100 105 110
<210> 5
<211> 80
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(80)
<400> 5
Lys Ala Thr Gln Val Gly Glu Lys Thr Pro Lys Asp Glu Ser Ala Asn
1 5 10 15
Gln Glu Glu Pro Glu Ala Arg Val Pro Ala Gln Ser Glu Ser Val Arg
20 25 30
Arg Pro Trp Glu Lys Asn Ser Thr Thr Leu Pro Arg Met Lys Ser Ser
35 40 45
Ser Ser Val Thr Thr Ser Glu Thr Gln Pro Cys Thr Pro Ser Ser Ser
50 55 60
Asp Tyr Ser Asp Leu Gln Arg Val Lys Gln Glu Leu Leu Glu Glu Val
65 70 75 80

Claims (10)

1.一种人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白光激化学发光均相免疫检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括含链霉亲和素与供体结合物的组份SA-GG、含生物素与VASP-P抗体Ⅰ的结合物的组份Bio-Ab、含VASP-P抗体Ⅱ与受体结合物的组份FG-Ab、样本前处理缓冲液、含前列腺素E1的样本激活剂和含前列腺素E1和ADP的样本抑制剂，所述组份Bio-Ab含与生物素结合的VASP-P抗体Ⅰ，所述与生物素结合的VASP-P抗体Ⅰ为自制备鼠单抗，鼠单抗重链可变区氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2 所示，鼠单抗轻链可变区氨基酸序列如序列表SEQID NO.4所示。
2.根据权利要求1所述的人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白光激化学发光均相免疫检测试剂盒，其特征在于，所述组份SA-GG含有与链霉亲和素结合的能够在激发状态产生单线态氧的供体，所述供体为光活化的或化学活化的敏化剂，其为非粒子形式，且在含水介质中可溶；所述供体为填充有感光化合物的高分子微粒，直径为180-220nm。
3.根据权利要求1所述的人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白光激化学发光均相免疫检测试剂盒，其特征在于，所采用的的免疫原为人工合成序列如序列表SEQ ID NO.5所示。
4.根据权利要求1所述的人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白光激化学发光均相免疫检测试剂盒，其特征在于，所述组份FG-Ab含与VASP-P抗体Ⅱ结合的与单线态氧反应生成可检测信号的受体，所述受体包含烯烃化合物和金属螯合物，其为非粒子形式，且在含水介质中可溶；所述受体为填充有发光化合物和镧系元素的高分子微粒，直径为180-220nm。
5.根据权利要求1所述的人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白光激化学发光均相免疫检测试剂盒，其特征在于，所述组份Bio-Ab中VASP-P抗体Ⅰ能够与血管扩张刺激磷蛋白的第一表位特异性结合，组份FG-Ab中VASP-P抗体Ⅱ能够与血管扩张刺激磷蛋白的第二表位特异性结合，且所述第二表位和所述第一表位不相重叠。
6.一种采用权利要求1~5任一项所述的人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白光激化学发光均相免疫检测试剂盒的检测方法，其特征在于，所述使用方法包括如下步骤：
a) 样本前处理：取样本激活剂干粉和样本抑制剂干粉分别用样本前处理剂溶解后，分别取10μl加入等体积待测样本（全血）或校准品，混匀，室温孵育10min；
b) 孵育后加入等体积的组份FG-Ab和组份Bio-Ab，孵育，进行第一步反应；再加入组份SA-GG进行第二步反应；
c) 激光照射反应孔，测量每个反应孔的光信号值。
7.根据权利要求6所述的人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白光激化学发光均相免疫检测方法，其特征在于，所述组份SA-GG采用如下步骤制备：感光颗粒和链霉亲和素10:1的比例加入0.1M 2-（N-吗啉）乙磺酸MES缓冲液，37℃反应避光震荡48小时。
8.根据权利要求6所述的人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白光激化学发光均相免疫检测方法，其特征在于，所述组份Bio-Ab采用如下步骤制备：将VASP-P抗体Ⅰ加入碳酸钠缓冲液中，加入活化生物素，37℃反应12-18小时后，进行透析，透析结束后加入Tris-Hcl缓冲液进行悬浮和保存。
9.根据权利要求6所述的人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白光激化学发光均相免疫检测方法，其特征在于，所述组份FG-Ab采用如下步骤制备：将受体加入碳酸钠缓冲液中，加入VASP-P抗体Ⅱ，迅速斡旋混匀，37℃避光反应，加入含75mg/ml Gly的碳酸盐缓冲液，去液体，得到VASP-P抗体Ⅱ和受体的结合物，加入Tris缓冲液进行重悬即为组份FG-Ab。
10.根据权利要求6所述的人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白光激化学发光均相免疫检测方法，其特征在于，所述含PGE1的样本激活剂和所述含PGE1+ADP的样本抑制剂使用时采用样本前处理缓冲液稀释至2-20μmol/L。
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