杂环化合物的生物偶联分子
本发明专利申请延续临时美国专利US62/143,790题目为”杂环化合物的生物偶联分子”,提交日期为2015年 4月6日.本专利申请将包括上述临时专利申请的全部内容。
发明领域
本发明涉及生物学领域至关重要的杂环类分子的生物偶联物,尤其是小分子物质与生物素的偶联物,半抗原与生物素的偶联物,以及生物素以外的其它示踪物的偶联物,包括这些偶联物的应用。
本发明还进一步涉及生物偶联物化学。具体地,本发明提出将NHS酯偶联到生物分子的改进方法。本发明产生的偶联物可应用于科学研究、诊断、免疫检测方法的改进和治疗中。
另外,本发明涉及可用于制备生物探针的化合物。这些探针可用于鉴定,检测和从复杂生物混合物中分离特定生物分子。
发明的背景
许多体液和组织中的物质,能够特异性地结合其它分子,但是不能触发免疫反应,因此这些物质称为半抗原,这些物质可作为某些疾病或人体健康状态的指标。半抗原包括代谢产物、激素、神经递质、脂蛋白,肿瘤标志物和病毒蛋白等。此外,大多数药物(测定这些药物的水平往往是监测药物治疗必要)也被划分到半抗原这一类。由于所有这些半抗原含量很少,因此,常常使用免疫分析方法来检测。免疫学测定方法可分为均相法和非均相法。在非均相法中,一般用固相反应以便分离结合到固相支撑物的标记成分和未结合到固相支撑物的部分。在这种类型的方法中,标记物可以很容易地确定。然而,一个缺点是,非均相反应需要很长的时间进行洗涤和分离的操作。
在均相系统中,不需要分离结合和未结合的标记物,因此,区分结合的和未结合的标记物还得用其它方法。这有不同的可能性。例如,可以使用标记到有关物质上的酶,当它被绑定到待测半抗原或被其它待测物激活时,便具有了酶的活性。另一种可能性是使用荧光物质作为标记物,其荧光通过与待测物质结合或改变其偏振而转移到另一波长范围。
由于样品中通常含有干扰测试的成分,因此这些已知方法的一个特殊缺点是需要对样品进行预处理以除去这些物质。此外,对于每一个参数(组分或条件),都需要进行广泛的优化,例如,酶必须以一种依赖于参数的方式进行修改或优化才可以使用。在所有这些测试中有最佳的分辨和最佳灵敏度之间是相互矛盾的,一方面,特定试剂的浓度不应该太高,以允许与样品之间的竞争反应充分地进行,另一方面,特定试剂的浓度还不能过低,以达到单位时间内有足够的信号改变被检测到。权衡这些要求,导致了有限的灵敏度和对干扰的敏感性,通常只有通过特定的样品前处理才能消除这些干扰。
欧洲专利A0349 988提到的均相系统解决了这些问题:样品溶液与3种受体R1,R2和R3一起孵育。其中 R1和R2能够相互结合,R3能够特异性结合到待测物质上。R1是一个待测物或待测物类似衍生物(含有待测物的至少一个抗原决定簇)与有特定结合配基的标记物的共轭偶联物。R2是一种含有至少两个与R1标记物特异性的结合位点的配基。R3具有至少两个结合位点,其中至少有一个专门与带测定物质S特异性地结合。被测物质溶液和三个受体一起孵育,待测物质与R1竞争结合R3,R2与R1结合。只有当R1,R2和R3都聚集在一起,才可以测到光度值。待测定物质与受体R3的结合将阻止各种成分的聚集,因此聚集的多少可以间接地反映测定被检测物质的含量。该方法适用于免疫活性物质如抗原,抗体和半抗原的检测。对于半抗原的检测,一个具有特异结合配基的示踪标记物的半抗原偶联物作为受体R1。在一个特别有利的实施例中,使用生物素和待检测物质S的偶联物作为受体R1,标记有链霉亲和素(SA)的胶乳用作受体R2,待检测物质的抗体作为受体R3。生物素(Bio)-半抗原共轭偶联物通过生物素的结合部分与链霉亲和素胶乳结合。抗体可以通过半抗原决定簇部分与半抗原-生物素偶联物结合。如果链霉亲和素包被乳胶和生物素-半抗原偶联物这两个复合物结合到抗体上,那么这免疫复合物就可以被测定。这个过程中,浊度出现越慢,待测物含量越多,同时偶联物在溶剂的部分就越小。
SA是一个四聚体蛋白,是从avidinii链霉菌中分离出来的,分子量约60kDa。生物素,分子量为244Da 的维生素,与SA具有高度亲和力。它们之间的相互作用是已知的最强的非共价键相互作用生物(亲和常数为10
-15M
-1)。链霉亲和素-生物素复合物形成非常迅速,一旦形成,不受外界因素影响。使用上述方法检测半抗原,必须要有半抗原与生物素的共轭偶联物。半抗原-生物素偶联物早已被人们所熟知。因此,在欧洲专利A35317中描述了所谓的双体共轭是由免疫活性分子和特异性结合的配基通过接头联接在一起。为了明确接头的长度对共轭偶联物性质的影响程度,已经有了很多的研究。结果表明偶联物在2个分子之间间距为
以上时候性能最佳,这大约相当于18个原子的链的长度,但是,另一方面,超过20个原子的链长度会降低灵敏度。另外指出的是,含有5个以上不同的原子是不利的。然而,有关这些偶联物的绝对满意的结果还没有取得。
此外,生物分子偶联结合是一个新兴的研究领域。生物分子通常与其它分子或化合物结合,用于生物分析或生物制药应用。一个生物分子与另一个分子或化合物的共价结合,一般称为“共轭”。已经开发了轻度和位点特异性小分子、蛋白质、DNA、RNA和碳水化合物衍生的新方法,应用于发现配体、疾病诊断和高通量筛选。这些强大的方法的出现归功于化学选择性反应,使生物共轭反应在生理条件下可以进行,这是现代有机化学的巨大成就。
生物分析或生物制药应用经常需要化合物和生物分子与其它化合物或分子形成共轭物。例如,“免疫共轭物”一般是指由抗体或抗体片段和其它一些分子如示踪标记物(例如,荧光素),一种结合配体(如生物素衍生物),或治疗剂(例如,治疗性蛋白或毒素)组成的共轭物。这些特定的共轭物可用于报告抗体的存在、结合或捕获抗体、以及把治疗性药物运送到特定的部位等。根据共轭物的用途,可以通过接头将一个共轭成分耦合到另一个共轭物成分,来制备各种各样的共轭物。实际上,生物分子同标记化合物、结合配体或治疗剂的无数的组合已被连接以得到适合特定用途或需要的共轭偶联物。
偶联物通常是通过共价键把待偶联的组分结合到其它分子上的。例如,上面提到的免疫偶联物的制备可通过偶联标记化合物、结合配体、或治疗性分子到抗体或抗体片段上。一般来说,耦合过程会涉及到把相关组分连接起来的接头化合物或分子。接头的选择要求是保证两个被偶联在一起的组分结合的稳定性,控制其长度和/或几何形状,使得两个待偶联分子之间的交互作用能够按期望地发生。
例如,生物素偶联物广泛应用于生物科学。生物素是一种天然存在的维生素,它对亲和素和链霉亲和素具有极高的亲和力。由于生物素与亲和素之间的高度的亲和力,含生物素偶联物已广泛应用于生物分析方法,包括免疫检测、免疫亲和层析、免疫细胞化学、核酸杂交。生物分析检测往往利用生物素与亲和素的高亲和力,通过生物素共价耦合的一个其它检测分子来实现的。生物素可以共价连接到许多不同类型的分子,包括蛋白质,如抗体,抗体片段,酶和激素;核酸,如寡核苷酸和核酸探针;和小分子,如药物或其他类似的化合物。此外,在某些应用中,生物素可以耦合到固相或载体上。生物素与另一分子的共价偶联涉及适当的化学官能团与反应性生物素衍生物之间的化学反应而形成的键。用于偶联的反应性生物素衍生物可来源于生物素,最常见的包括羧酸衍生物、胺、酰肼衍生物。常见的活性生物素衍生物包括活性生物素酯如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯,和生物素酰肼。另外,活性生物素衍生物可以从商业来源获得,包括西格玛(圣路易斯,密苏里州),皮埃尔斯(罗克福德,伊利诺斯州),分子生物科学(百德,科罗拉多州),与分子探针(尤金,俄勒冈)。把生物素衍生物跟蛋白质结合起来的方法已在许多出版物上发表 (Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,NY:Cold Spring Harbor Laboratory,1988,pp.340-341,and Rose et al.,Bioconjug.Chem.2:154,1991)。
除了生物素,在生物分析方法中,通常也有其它化合物连接到生物分子上。这些化合物用于标记生物分子以达到检测目的。常见的标记化合物包括荧光染料,以及可用来结合相应配基的一些配体。用于此目的的常见例子包括荧光素和罗丹明荧光染料,含有结合配基的配体的例子包括药物分子如地高辛基(地高辛原)或地高辛和β-内酰胺类抗生素。在文献中也有描述许多其它化合物也可在特定结合技术中作为标记物。与生物素类似,这些化合物通常也被衍化成很容易与生物分子结合的功能团。例如,异硫氰酸荧光素是一种反应性荧光素衍生物,很容易通过巯基与蛋白质结合。此外,含多个并列巯基的分子或多聚组氨酸的功能基团使得生物分子能够结合到固体表面,如金或镍的表面。
生物素或荧光染料与生物分子的有效结合,通常需要产生的标记偶联物保留生物分子的生物活性。如果偶联后,生物分子的功能活动减少或丢失,则共轭偶联物可能只有有限的或根本缺失的效用。例如,对于抗体结合物,保留抗体的抗原结合活性(免疫反应性)是最重要的。某些抗体在标记其游离氨基时会使其失去免疫反应性,这可能是由于这些基团存在于抗体的抗原结合位点,所以标记物附着在生物分子上的位点是相当重要的。同样,有些酶在其活性位点含有游离氨基,当它们作为标记位点使用时,可能会导致酶活性的丧失。许多酶在其活性部位也含有巯基,使用巯基反应性化合物,如异硫氰酸荧光素标记会使其失去活性。
除了保留生物活性外,共轭偶联物的稳定性也很重要。例如,标记物丢失会导致在生物分析过程中无法跟踪偶联物的去向。为了提供稳定的链接,结合物往往通过酰胺和酰腙键连接。酰胺键是由一个氨基和羧基反应形成的。酰腙键是由羰基(如醛基)和肼基反应形成的。这些连接在中性pH条件下的稳定性相对较高,因而在偶联(共轭) 技术中得到了广泛的应用。然而,这些连接不够灵活,不能控制组件之间的距离和控制结合物的疏水性和亲水性。除了酰胺键链接,可以使用其它功能基团把待研究的生物分子跟接头连接上。例如,醇类和酚可以通过醚或氨基甲酸乙酯基团耦合;胺可以烷基化或者转化为脲;芳基卤化物可以由各种不同的碳碳偶联方法相连接,如Heck或Stille氏偶联。
因此,有必要在现有技术的基础上,改进连接生物小分子与标记物、结合配体、替代分子或治疗性药物分子的偶联方法,以增强稳定性和控制生物分子之间的距离。
发明的目的
本发明的主要目的,是提供最佳的偶联生物分子,使得相关的免疫检测性能得到提高。
本发明的另一个目的,是提供制备上述最佳生物偶联物的方法。
本发明的另一个目的,是提供适合于非均相和均相免疫检测的半抗原生物素偶联物,使得具有更好的灵敏度,提高反应效率和增加检测性能。
本发明的另一个目的,是描述和使用这些偶联物,用于定量样本中S-腺苷蛋氨酸(S-腺苷甲硫氨酸,SAM)和S-腺苷同型半胱氨酸(SAH),并对S-腺苷蛋氨酸和S-腺苷同型半胱氨酸与其它分子之间的相互作用进行研究。
发明的总结
本发明提供了如下分子式的化合物:
其中X和Y是多功能基团的能够共价结合氮的接头;Z是标记物;A是如下结构的稠环
其中E,F,G和H是由含有碳,氮,氧,硫和磷元素的集合中各自独立地选择出来的基团;n在3-100之间;B是具有一个氧且具有一个或多个羟基的5元杂环;C是具有以下结构的功能团:
其中J是硫或氮;L是含1-5个碳的烷基,当J是硫,L是含1-5个碳的烷基时,S是带正电荷的,m=0或1,K是氢或者NH2或者具有以下结构的基团:
其中X和Y是多功能基团的能够共价结合氮的接头;Z是标记物;
本发明进一步涉及分子式I的化合物:
其中A,B,C和D是由含有碳,氮,氧,硫和磷元素的集合中各自独立地选择出来的基团;n在3-100之间;
本发明进一步涉及分子式II的化合物:
其中A,B,C和D是由含有碳,氮,氧,硫和磷元素的集合中各自独立地选择出来的基团;n在3-100之间;
本发明进一步涉及分子式III的化合物:
其中A,B,C和D是由含有碳,氮,氧,硫和磷元素的集合中各自独立地选择出来的基团;n在3-100之间;
本发明进一步涉及分子式IV的化合物:
其中A,B,C和D是由含有碳,氮,氧,硫和磷元素的集合中各自独立地选择出来的基团;n在3-100之间;
本发明还提供了一种发光能量转移法测定S-腺苷蛋氨酸和S-腺苷同型半胱氨酸的方法:包括(1)链霉亲和素标记的能量转移供体,(2)生物素标记的能量转移受体,其中供体是一个长激发态寿命的发光稀土螯合物,受体是一个短激发态寿命的发光标记物或非发光的标记物,能量从供体标记物转移到受体标记物的增加或减少,分别对应于从供体和受体之间距离的缩短或延长。能量转移的多少可以被测定。其特征在于长寿命的激发态发光稀土螯合物具有以下一个或多个特性:发光量高,激发态寿命为1毫秒或以上,以及适合于能量转移的最佳发射光分布。
本发明还提供了一种检测生物样品中S-腺苷甲硫氨酸(SAM)和S-腺苷高半胱氨酸(SAH)含量的方法。该方法包括以下步骤:(一)准备以下成分:(1)S-腺苷甲硫氨酸的偶联物,S-腺苷甲硫氨酸类似物的偶联物或S-腺苷同型半胱氨酸的偶联物;(2)含有(1)中生物素示踪物的特异结合配体的铕、铽穴或其它荧光团的偶联物作为供体;(3)受体荧光染料的激发光谱与供体的发射光谱相重叠,而且受体上标记有抗S-腺苷甲硫氨酸或抗S-腺苷同型半胱氨酸抗体;(二)加入含有S-腺苷蛋氨酸和S-腺苷同型半胱氨酸的样品;和(三)测定供体和受体的荧光光谱值。
附图说明
【图1】形式1(A):抗SAM或SAH的特异抗体直接与受体染料偶联。链酶亲和素或抗地高辛或抗地高辛基抗体与供体染料结合。生物素或地高辛以不同接头连接标记的SAM或SAH将供体和受体染料拉近形成受体-特异性抗体---抗原-生物素-链霉亲和素-供体复合物,或者受体-特异性抗体---抗原-地高辛-抗地高辛抗体-供体复合物,紫外激发的供体荧光使受体染料发出荧光信号,通过适当的仪器记录该荧光强度。与抗体-受体染料偶联物结合的样品中的游离SAM或 SAH分子不发射荧光,因此这部分抗原-特异性抗体-受体复合体不会被记录下来。
形式2(B):SAM或SAH分子通过接头结合到受体染料上。抗SAM或抗SAH抗体间接与供体染料结合。当把受体、供体-特异抗体、样品或标准品混合后,达到平衡状态时,供体染料的激发导致受体染料的特定部分(即受体-抗原-抗体-供体复合物)发射荧光。其它部分,如受体-抗原-特异性抗体和抗原-特异性抗体-供体复合物将不发射荧光,因此不会读出结果。
形式3(A):SAM或SAH抗原与荧光素酶Luc偶联,根据供体荧光选择的荧光染料与抗SAM或抗SAH抗体偶联。加入 Luc底物以便生成荧光素,在荧光素酶Luc-SAM或Luc-SAH---抗SAM或SAH抗体-受体染料复合物形成的条件下,荧光素发光会激发受体染料发出荧光。受体染料不受不含有任何供体的抗原-抗体复合物的激发,这些复合物是样品中游离的SAM或SAH或者标准品与相应的抗体形成的复合物,用来竞争上述可以激发受体发出荧光的复合物。
【图2】显示不同量的SA包被在微孔板上,加入梯度稀释的Bio-12CN-aza-SAM(A),Bio-6C-aza-SAM(B),Bio- 12CN-SAH(C)。用辣根过氧化物酶标记的抗SAM或抗SAH特异性抗体检测微孔板子上的通过生物素-链霉亲和素标记系统而捕捉在酶联板上的不同数量的底物显色信号。
【图3】定量SAM的竞争性酶联免疫吸附试验(cELISA)的标准曲线。使用鼠抗SAM单克隆抗体118-6和Bio-12CN-aza- SAM(A,125ng/ml,B,250ng/ml)。
【图4】定量SAM的竞争性酶联免疫吸附试验(cELISA)的标准曲线。使用鼠抗SAM单克隆抗体84-3和Bio-12CN-aza- SAM(A,250ng/ml,B,500ng/ml)。
对于本发明的阐述
因此,本发明的目的是提供半抗原-生物素或其它示踪剂偶联物,以便用于均相免疫分析方法中,使之具有更好灵敏度和更快的反应速率。
这个目标是通过利用半抗原-生物素或其它示踪物连接,其特征在于半抗原与生物素或其它示踪物通过长度为6~100的原子链(接头)连接起来,接头包含至少5个杂原子。
令人惊讶的是,本发明的抗原-生物素或其它示踪物偶联物在应用中产生的信号比已知的有关偶联物大幅改善。非特异性结合可以通过改善溶剂而有所减少;反应的速率可提高;检测性能有所改进。
根据本发明所述的半抗原-生物素或其它示踪物偶联物,其中半抗原与生物素或其它示踪分子是通过长度为 6-100的原子链(间隔)相连接,其中至少含有5个杂原子。
间隔的原子可以是氮、氧、硫、磷等原子,间隔最好含有氮和氧原子。杂原子的个数必须至少5个。高比例的杂原子是有利的。有时候杂原子的比例是如此之大,可以在间隔的每第三个原子就有一个原子是杂原子,例如所述链长度的聚环氧乙烷可以用作间隔。
间隔长度在6到100个原子的范围内,其中只有存在于链中的原子才被计数。具有多于6个原子的间隔物对结果更有利。
根据本发明所述方法制备的半抗原或小分子和生物素或其它示踪分子偶联物可能是通过双功能基团间隔分子来实现的,即存在于半抗原以及生物素或其它示踪分子上的功能基团与间隔分子上的功能基团进行反应。另一种可能性是半抗原或生物素或示踪分子先进行衍生反应,生成各自的衍生物,然后根据情况与间隔分子或者接头进行反应。依据所期望的接头的长度和杂原子的数量,来选择适当的衍生物和接头分子。
半抗原和生物素或其它示踪分子的衍生反应按已知的方法进行。同源或异源双功能接头如二醛,二羧酸,二胺,氨基酸,巯基羧酸和卤代羧酸适合作为间隔物。优选使用由琥珀酸酯,戊二酸酯,辛二酸酯,乙二胺,丙二胺, 1,5-二氨基戊烷,1,8二氨基-3,6-二氧杂辛烷,1,12-二氨基-4,9-二氧十二烷,氨基丁酸酸,氨基己酸,巯基乙酸,硫代丙酸,溴乙酸和/或碘乙酸合成的间隔。这些合成结构单元必须以形成具有期望长度和期望数目的杂原子的间隔物的方式进行组合。
此外,在本申请中,“反应性基团”可以是适用于将如本文所述第一组分耦合到的第二组分的多种种组功能基团中任何一种。例如,反应性基团可以是胺反应性基团,例如异硫氰酸酯,异氰酸酯,酰基叠氮化物,NHS酯,酰氯如磺酰氯,醛和乙二醛,环氧化物和环氧乙烷,碳酸酯,芳基化试剂,亚胺酯,碳二亚胺,酸酐,亚烷基二胺及其各种组合。合适的硫醇反应性官能团包括卤代乙酰基和烷基卤,马来酰亚胺,氮丙啶,丙烯酰基衍生物,芳基化剂,硫醇-二硫化物交换试剂如吡啶基二硫化物,TNB-硫醇和二硫化物还原剂及其各种组合。合适的羧酸酯反应性官能团包括重氮烷烃,重氮乙酰化合物,羰基二咪唑化合物和碳二亚胺。合适的羟基反应性官能团包括环氧化物和环氧乙烷,羰基二咪唑,N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯或N-羟基琥珀酰亚胺基氯甲酸酯,高碘酸盐氧化化合物,酶催化的氧化反应,烷基卤素和异氰酸酯。醛和酮反应性官能团包括肼,席夫(Schiff)碱,还原胺化产物,曼尼期(Mannich)缩合产物及其各种组合。活性氢反应性化合物包括重氮衍生物,曼尼期缩合产物,碘化反应产物及其各种组合。光反应性化学官能团包括芳基叠氮化物,卤化芳基叠氮化物,苯并醌,重氮化合物,二氮嗪衍生物及其各种组合。
当在水性溶剂混合物中的与TSTU(O(N-琥珀酰亚胺基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐偶联时,方法如下:
1.将酸溶解在DMF/二恶烷/水的2:2:1的混合物中。
2.加入3倍量的二异丙基乙胺和1.3倍量的TSTU。
3.当-OSu酯形成后,加入1.5倍量的胺。
4.反应完成后,除去溶剂,分离得到粗产物。
许多其它试剂也可用于引入NHS酯;然而,它们中的大多数需要干性的有机溶剂而并不适用于水性介质。试剂O-(N-琥珀酰亚胺基)N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸盐(TSTU),尽管在有机/水混合的介质中更为稳定,在水中也比较稳定。TSTU已被用于在有机溶剂中形成低分子量分子的NHS酯。此外,TSTU和其它脲盐已被用于在有机 /水性混合的介质中形成低分子量分子的NHS酯。
TSTU也被用于在有机溶剂中制备固相羧化珠的活性酯。由于各种副反应(例如O变成N转变或称Lossen 重排)的可能性小,像TSTU这样的试剂优于碳二亚胺/NHS方法。TSTU还用于在水/有机溶剂混合液中活化羧化的糖,并且随后将该活化的物质与蛋白质相偶联。
使用本发明的半抗原-生物素或其它示踪剂偶联反应获得了改善的溶剂体系,使得反应时间缩短,从而反应潜力增加。
1.将Aza-SAM(5'-N-甲基,5'-N-丁酰基-5'-脱氧腺苷或称为5'-[(3-羧基丙基)甲基氨基]-5'-脱氧腺苷)与辣根过氧化物酶(HRP)通过11个碳1个氮的接头进行偶联(HRP-aza-SAM):
上述化合物是使用如下方案1所示的合成方案合成的:
方案1:
2.用10-碳2-氮接头将Aza-SAM与生物素结合(Bio-12CN-aza-SAM)
4-((((2R,3S,4R,5R)-3,4-二羟基-5-(6-((E)-((Z)-7-((5-(5-((3AS,6R,6AR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-6-基)戊酰胺基)戊基)亚氨基)亚庚基)氨基)-9H-嘌呤-9-基)四氢呋喃-2-基)甲基)(甲基)氨基)丁酸
使用方案2所示的合成方案制备上述化合物。
方案2:
3.用10-碳2-氮接头将SAH与生物素结合(Bio-12CN-SAH)
(S)-4-((((2S,3S,4R,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基)硫基)-2- ((E)-((Z)-7-((5-(5-((3AR,6S,6AS)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-6-基)戊酰氨基)戊基) 亚氨基)亚庚基)氨基)丁酸
使用方案3所示的合成方案制备上述化合物。
方案3:
4.用6-碳接头将Aza-SAM与生物素结合(Bio-6C-aza-SAM)
4-((((2R,3S,4R,5R)-3,4-二羟基-5-(6-(6-(5-((3AR,6S,6AS)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-6-基)戊酰氨基)己酰胺)-9H-嘌呤-9-基)四氢呋喃-2-基)甲基)(甲基)氨基)丁酸
使用方案4所示的合成方案制备上述化合物。
方案4:
5.使用6碳接头将SAM与生物素结合(Bio-6C-SAM)
使用上述合成方案制备上述化合物。
6.用6碳接头将SAH与生物素结合(Bio-6C-SAH)
(S)-4-((((2S,3S,4R,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基)硫基)-2- (6-(5-((3aS,6R,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-6-基)戊酰氨基)己酰胺基)丁酸
使用上述合成方案制备上述化合物。
使用类似化学作为上述合成化学制备以下附加分子。
7.不用任何接头将SAM与生物素结合(Bio-SAM)
8.不用任何接头将SAH与生物素结合(Bio-SAH)
9.用6-碳接头将SAH与地高辛基结合(Dign-6C-SAH)
10.用6-碳接头将SAH与地高辛结合-将地高辛通过6-溴己酸与SAH的NH2结合(Dig-6C-SAH)
(2R)-4-((((2R,3R,4S,5S)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基)硫基)-2- (6-(((2R,3S,4S)-6-(((2R,3S,4S)-6-(((2R,3S,4S,6R)-6-((3R,5R,9S,10S,12R,13S, 14S,17R)-12,14二羟基-10,13-二甲基-17-(5-氧代-2,5-二氢呋喃-3-基)十六氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基)- 4-羟基-2-甲基四氢-2H-吡喃-3-基)氧基)-4-羟基-2-甲基四氢-2H-吡喃-3-基)氧基)-4-羟基-2-甲基四氢-2H-吡喃-3-基)氧基)己酰胺基)丁酸
11.用10碳1-氮接头将SAH与地高辛基或/和地高辛共价结合(Dign-12CN-SAH,Dig-12CN-SAH)
12.用6-溴己酸将Aza-SAM与地高辛结合(Dig-6C-aza-SAM)
13.用6-溴己酸将Aza-SAM与地高辛基结合(Dign-6C-aza-SAM)
14.用12-碳1-氮接头将Aza-SAM与地高辛结合(Dig-12CN-aza-SAM)
15.用12碳1-氮接头将Aza-SAM与地高辛基结合(Dign-12CN-aza-SAM)
16.用12碳1-氮接头(Dig-13CN-SAM)将SAM与地高辛结合
17.用12碳1-氮接头将SAM与地高辛基结合(Dign-13CN-SAM)
18.将SAM,SAM类似物和SAH通过接头或者不通过接头与受体荧光染料结合。使用本发明描述的接头原则准备的接头,与受体染料的NH2基团,比如d2功能区相连接。N-羟基琥珀酰亚胺激活的d2染料(约1kDa的有机功能区),在温和的条件下主要与胺反应形成稳定的染料结合物。使用Cisbio生物检测公司的商业性标记试剂盒制备抗原-受体染料共轭偶联物。并按要求正确存储。
19.将SAM,SAM类似物和SAH通过接头或者不通过接头与荧光素酶供体结合。接头的引入方式类似于先前在本发明中描述的策略,然后通过二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺在其羧基上活化,然后在其NH2基团共价偶联生物发光酶荧光素酶。测试不同摩尔比的SAM,aza-SAM或SAH。孵育1小时后,通过G-25离心柱除去没有结合的游离小分子。应注意确保结合后的荧光素酶酶活性不低于75%。
在本说明书中,A647表示Molecular Probe公司的荧光团Alexa 647。XL665是Cisbio Bioassays销售的,用作受体荧光团的一种交联的异藻蓝蛋白,d2是CisbioBioassays的具有与XL665相同的光物理特性的荧光受体化合物。Cy5是蓝绿素5,一种由GEHealthcare公司出售的受体荧光团。
在免疫测定中使用生物偶联物
竞争性ELISA(cELISA)适用于定量液体样品中的物质。然而,“添加和读结果”式的均相免疫测定具有样品量小,灵敏,快速,无样品预处理,一步出结果的优点,适合于扩大规模至高通量检测,更广泛的样品类型(如细胞样本),并能够用在各种临床分析仪上。一些检测在临床实践中可以更广泛地应用于个体化用药比如给药剂量和治疗调整等。利用本发明描述的这些技术和生物共轭偶联物,可以:(i)精确地,灵敏地,方便快速地测量SAH和 SAM;(ii)帮助发现许多类型的生物样品中与SAM或/和SAH相互作用的各种生物分子;(iii)了解占总量的多少百分比的SAM或SAH是自由或结合形式;(iv)从细胞生物学过程和调控(如表观遗传学,炎症,信号转导,生长,衰老,死亡,致癌等)的角度研究SAM和SAH的作用和动态变化规律,等等。
鉴于SAM和SAH分子的高度动态性和不稳定的性质,能够快速测量它们对于准确反映其在细胞中的生物活性特别重要。因此,开发SAM和SAH的“添加和读结果”式的均相免疫测定方法具有重要和实际的意义。
本发明还涉及基于能量转移的均相测定的改进,其在检测中使用时间分辨的荧光测定法。具体的改进涉及:用作能量转移供体的镧系元素螯合物标记的类型,用于特定检测的能量转移受体的优化,使用优化的过滤片和时间窗口测量能量转移的方式,校正来自样品的所有可能的干扰的方法,多组分分析和开发简化的测定方案。
在本说明书中,术语“发光”应包括荧光,磷光,化学发光,生物发光和电致发光,光致发光,放射性发光,声致发光,热发光和摩擦发光。
在测定多种分子聚合物的优选设计是如何使用发光,短衰减期的受体荧光和长衰减期的镧系元素螯合基供体荧光,并且在时间分辨荧光测定中使用延迟时间的方法来跟踪受体分子被供体荧光激发而发射的光,以避免干扰性的受体直接发光(受体直接被紫外激发发出的荧光)。最好以受体分子过量的方式构建测定方法(对于时间分辨模式,干扰可忽略),并且试剂结合后,应该产生使得信号增加。
对于这样的系统,优选的螯合标记必须具有高的发光产率(ExΦ>2000),长的激发态寿命(优选超过1ms) 和为能量转移而优化的发射分布。螯合离子周围的配体场必须满足如下条件:Eu螯合物70%以上的发射光处于D0 -F2(610-620nm波长范围),而不是590nm范围(比较国际专利申请号WO92/01225有关Eu cryptate的发射光谱;美国专利号US5,324,825、US5,202,423和US5,316,909有关三吡啶的双亚氨基乙酸酯衍生物)。在优选的螯合物中,590nm处的无用磁偶极子跃迁和700nm波长附近的发射应该被抑制(Li和Selvin,J AmerChem Soc117; 8132,1995)。本发明中认为特别好的螯合物应该是由具有高摩尔吸光系数(G),非常长的激发态寿命和良好的量子产率(Φ)的多种发色性的多羧酸盐形成的Eu螯合物(Takalo等,Helv Chim Acta 79;789,1996)。除了Eu之外,当使用其高度发光的螯合物时,Tb是特别有希望的能量转移供体。优选的Tb螯合物由在亚氨基二乙酸酯基团 (Mukkala等人,J Alloys Compounds 225;507,1995)上含有结合侧的三联吡啶衍生物或其它从光吸收芳族结构中分离出来的结合臂组成。用于该应用的特别好的螯合物是三吡啶衍生物,其中一个或两个吡啶环被吡唑(US 08/ 548,174)或三唑和噻唑环(PCT/FI91/00373)代替。除了Eu和Tb之外,使用Sm将有可能进行双重或三重标记的均相能量转移测定。Sm具有以下优点:它可以在相当高的波长下提供能量,高度发光的螯合物的主要发射波长为 643nm,将波长范围持续扩大到接近IR(红外)的可能性(可以从不同的来源商业渠道获得一系列良好的近红外发射的荧光试剂)。Sm的优选稳定螯合物由多种形式的1,3-二酮组成,如Savitsky所述(Savitsky等人,SPIE 2388; 429,1995)。另外第三种选择(第三个标记物)是在650-660nm发射长寿命磷光的磷光Pt或Pd卟啉(WO 94/10568)。
确定供体探针标记的配体或结合试剂与受体探针标记的结合试剂之间的小距离的优选方法是使用直接与结合试剂偶联的活化探针(例如受体荧光素标记的受体蛋白,抗体或其它结合蛋白)。另一种方法是使用间接标记,例如使用受体标记的对抗接合分子(如对抗受体)抗体,使用生物素标记的接合分子和受体标记抗生物素蛋白(链霉亲和素)或采用其它生物亲和反应将受体分子带到实际结合位点附近,直接或间接地与供体标记的组分结合在一起。
可以避免在每个具体测定法中对结合组分的分别单独标记的另一替代方案是使用固体载体(聚合物,陶瓷或玻璃等),例如使用含有高浓度受体分子的通用捕获表面。合适的固体载体可以是直径达1500μm的珠粒(微球)或颗粒或任何固体表面。用多种发光探针标记的微球可从不同来源获得。在载体中使用的优选的探针是疏水化合物,对水的溶解度可忽略以避免渗漏。可以在闪烁体和激光染料中找到适用于这种标记用途的各种探针。对于发光度高的珠子,大量的受体分子可以补偿供受体之间的长距离,并且发光微球实际上提供了能量接受的表面。当发光微球可以吸收大部分供体的发射光时,可以采用简单的辐射能传递,其中能量转移是空间角度的函数,并且10μm微球的关键距离是在微米范围内。对于基于FRET(荧光共振能量转移)的检测方法,当塑料首先用结合蛋白(例如凝集素)包被以固定膜受体时,可能由于长距离而导致低效的能量转移。因此,优选的设计是使用表面活化的微球并使用部分反应性基团与受体分子偶联,或使用受体标记的结合表面(例如罗丹明标记的凝集素)或以后用受体标记包被的蛋白质。
测定均相测定中的结合反应(免疫结合,受体-配体结合,杂交反应,酶-底物结合等)之优选方式是跟踪测定受体信号的增加。使用针对所使用的供体来优化选定的滤光片测量受体信号,其在受体波长处具有良好的发射性,但更重要的是绝对良好地阻断供体的每个发射线。过滤片不应允许供体的主发射线通过(例如Tb的545或490nm和 Eu的613-615nm)。此外,能量转移过滤片必须位于波长区域,在那里与使用的供体不存在轻微的发射线。使用适当的延迟避免了由受体的直接激发导致的干扰(最佳延迟取决于使用的激发脉冲的长度,但应至少比激发脉冲时间长 10倍)。
能量转移激发受体的衰变是供体衰变和能量转移效率的函数。因此,在测定期间(例如竞争性结合测定或非竞争性测定),总体衰变不是恒定的,而是分析物的函数。在特异性结合低且能量转移效率小于1%的关联测定中,受体的能量转移发射荧光的衰减时间是相当恒定的,并且等于供体荧光的衰减时间。这种测量条件下,延迟和计数次数并不重要。对于更高效率的测定,结合后衰减时间减少,通过保持短的延迟时间和合理的短计数时间,可以获得更陡(快速)的响应。另一方面,如果跟随供体发射光,则需要较长的延迟时间才能获得更陡的响应,因为当能量转移发生时,总供体发射光会减少,其衰减时间也在缩短。对于任何测定都适用的优化结果,建议根据测定类型,特异性结合百分比和能量转移效率来优化计数窗口,使得在无论任何测定中,结果会最佳。
在研究化学分子或生物分子之间相互作用引起供体荧光团和受体荧光团之间距离变化时,首选FRET技术。一般原理包括:通过将FRET配体与参与生物过程的分子相结合或者与可识别这些生物的探针而制备荧光共轭物,然后测量FRET信号对应于刺激(例如通过向培养基中加入会影响所研究的生物学过程的化合物)的变化。这些化合物可以参与酶反应的调节,引起对蛋白质的三维构象的修饰,导致分析物的产生和分析物/FRET配体的形成。在所有情况下,被研究的生物学事件的改变导致荧光供体和受体化合物之间FRET信号的改变。
除了易于实施的竞争ELISA的比色终点测定系统之外,TR-FIA(时间分辨荧光免疫测定)和其它类似技术是使用生物共轭偶联物的绝佳领域。TR-FRET(时间分辨荧光共振能量转移)是一种技术,当两个荧光团在物理和空间上足够接近时,能量转移从一个(供体)发生到另一个(受体)。当受体的激发光谱与供体的发射光谱重叠时,它允许供体以高量子产率激发受体染料而发射荧光。测量到的独特的荧光信号仅仅反映供体和受体微球相结合的分子部分。该性质使这种测定方法具有自己的优点,即良好的信号与背景比;不需要将结合的复合物与未结合的成分分开;简单的添加和读取类型的测定。通过时间分辨方法,在供体-受体复合物形成后产生的长寿命受体荧光的延迟读数(50至 100微秒延迟),使得背景荧光(如未结合的受体发射和可能的化合物,缓冲液和其它样品组分的自发荧光)可以容易地消除,因为这些背景非特异性荧光信号的寿命非常短暂。生物分子之间的分子相互作用可以通过将每个配体与荧光标记偶联并通过检测能量转移水平来评估。
图1示出了说明如何使用本发明中描述的生物偶联物来定量测量SAM和SAH的两种格式的TR-FRET技术的示意图。格式1抗SAM或SAH的特异性抗体通过用受体染料标记的兔或山羊抗小鼠IgG间接或直接与受体染料偶联。同时也显示了与供体染料相结合的两种示踪方法,链酶亲和素-生物素和地高辛-抗地高辛抗体特异性结合配体。具有不同接头的生物素偶联(或地高辛)偶联的SAM或SAH使供体和受体染料紧密接近,极有可能小于100埃
这允许供体激发受体染料,使得供体发生能量转移,并测量从受体染料以特定波长发射的独特的荧光信号,其仅反映能供体和受体特异性地连接在一起的复合物部分。来自样品的游离SAM或SAH分子与生物偶联物竞争结合抗SAM或抗SAH 抗体,因此这种竞争会导致荧光信号降低。竞争性测量方法可以基于竞争结合特征来建立。格式2:SAM,SAM类似物或SAH与受体染料共轭(有或没有接头),其将与来自样品的游离SAM或SAH竞争结合与供体直接偶联的抗SAM或 SAH的抗体,或供体连接到兔或山羊抗小鼠IgG后间接连到抗SAM或SAH抗体上。来自受体染料的发射荧光反映了供体-特异性抗体---抗原-受体复合体中的没有被竞争掉的与供体染料结合的SAM或SAH的量。与非结合性的SAM或 SAH分子结合的特异性抗体的不会发出特定的荧光,这是竞争性测定中竞争方之一。不与供体染料结合的游离抗SAM 或SAH抗体(如果有的话)将消耗标记或未标记的抗原。供体和受体荧光信号用TR-FRET酶标仪阅读器读取,并且可以计算受体荧光/供体荧光的比值,用于量化样品中SAM或SAH。
BRET(生物发光共振能量转移)技术类似于TR-FRET或FRET,除了供体染料被生物发光酶替代,例如,萤光素酶(EC1.13.12.7)或Luc。受体染料应选择具有更高的量子产率、其激发光谱与Luc的生物发光光谱相重叠的。例如,SAM或SAH(抗原)与Luc相偶联作为供体,符合上述标准的受体荧光染料与抗SAM或抗SAH抗体偶联。加入萤光萤光素(Luc底物)引起荧光素发光,同时激发受体染料形成Luc-抗原---抗体-受体染料复合物时发出荧光。记录供体发光和受体荧光,并计算BRET指数(受体荧光/供体发光的比值)。存在样品中的SAM或SAH抗原越多,受体荧光越少,BRET指数越小。可以建立竞争性BRET均相免疫测定法,优化每个条件后对SAM或SAH进行定量测定,从而使线性、灵敏度、可回收性和再现性都令人满意。图1A的一部分还说明了该过程的工作原理。基于BRET的方法在检测时不需要激光来激发供体染料。相反,它只需要添加萤光素酶的底物就可以激发供体发光。当足够的底物开始产生可以测量的发光时,它也激发被特定抗原-抗体接近的受体荧光材料。它不激发与荧光素酶供体无关的受体荧光染料。因此,测量的发射信号反映了含有供体(生物共轭物)和受体的抗原-抗体复合物的部分,而不是仅通过抗体与受体相关的样品或标准物的SAM或SAH抗原。
进一步使用
技术还有助于发现其它生物分子(结合配偶体)与SAM或SAH代谢物的分子相互作用。使用d2的生物偶联物(d2受体与SAM和SAH偶联),并且这些代谢物的结合配体可以通过特异性结合或相互作用直接或间接连接至HTRF供体荧光团上。我们所需要做的只是将d2-生物共轭物和预先制备好的结合配体偶联物,加入
测定体系中,然后进行
测量。
实施例简述
以下实施例旨在证明本发明的生物偶联物、制备方法及其在免疫测定中的用途。然而,不应被解释为限制本发明范围的依据。
实施例一
用11-碳和1-氮接头将Aza-SAM与辣根过氧化物酶(HRP)共价结合(HRP-aza-SAM)
在100ml的三口瓶中加入500mg的BOC-氨基己酸,再加入1.5倍当量的TSTU和一滴三乙胺,加入10mlDMF,6h 反应完全,加入乙醚析出产品,再次取50mg所得产品和20mg aza-SAM以3ml干燥无水DMF为溶剂,TLC跟踪监测 aza-SAM反应完全,去掉多余的BOC-氨基己酸,分离出产品,将产品溶于3mlDMF,滴入含有二氯甲烷的三氟乙酸,加入乙醚析出产品,在高真空抽除BOC残片,所的产品溶解于DMF溶解至澄清透明,缓慢滴加戊二醛的DMF溶液体系加上氮气保护下在25℃下搅拌反应后升温度至68℃下反应几小时,TLC显示aza-SAM反应完成,减压蒸馏除去DMF,得到淡黄色油状液体,加入乙醚洗涤3次得到白色固体,用6ml水充分溶解后加入2ml HRP的水溶液,避光在4℃下反应3天,TLC监测反应,显示有少量原料aza-SAM,用MW=2000的透析袋,透析液PH=7.40.01mMPBS除掉有机溶剂和多余的aza-SAM,4℃透析4次(大约2天)以后,冷冻干燥浓缩,剩余1ml溶剂装瓶在0-4℃下保存。
实施例二
用10-碳和2-氮接头将Aza-SAM与生物素共价结合(Bio-12CN-aza-SAM)
100ml的单口瓶中加入200mg的生物素,296mg的TSTU,以50ml的无水DMF溶解,三乙胺5mg换氮气在 30℃下反应3h后TLC碘熏显示生物素反应完成,加入4g尸胺的DMF溶液,反应过夜,第二天TLC显示D-生物素硒反应中反应完成,减压蒸馏出去过量的胺,并快速柱层析得到淡黄色固体,加入50ml的DMF后充分溶解后,加入5g 的戊二醛,体系在60℃下反应,体系颜色加深,茚三酮显示氨基反应完成后,减压出去溶剂,过量的醛用乙醚洗涤,得到棕色固体,取出过量的上述产品,加入DMF和90mg AZA-SAM的DMF溶液反应3天,并不断补加生物素尸胺的醛直至aza-SAM反应完全,反应完成后减压出去大部分溶剂后,加入乙醚析出固体,丙酮洗涤抽干,色谱分离,得50mg 装入瓶中。
实施例三
用10-碳和2-氮接头将SAH与生物素共价结合(Bio-12CN-SAH)
100ml的单口瓶中加入200mg的生物素,296mg的TSTU,以50ml的无水DMF溶解,三乙胺5mg换氮气在 30℃下反应3h后TLC碘熏显示生物素反应完成,加入4g尸胺的DMF溶液,反应过夜,第二天TLC显示D-生物素硒反应中反应完成,减压蒸馏出去过量的胺,并快速柱层析得到淡黄色固体,加入50ml的DMF后充分溶解后加入5g的戊二醛,体系在60℃下反应,体系颜色加深,茚三酮显示氨基反应完成后,减压出去溶剂,过量的醛用乙醚洗涤,得到棕色固体,取出过量的上述产品,加入DMF和75mg SAH的DMF溶液反应3天。不断补加生物素尸胺的醛直至 SAH反应完全,反应完成后减压出去大部分溶剂后加入乙醚析出固体,丙酮洗涤抽干,色谱分离出去原料得得50mg 装入瓶中。
实施例四
用6-碳接头将Aza-SAM与生物素共价结合(Bio-6C-aza-SAM)
在50ml的单口瓶中加入生物素60mg,TSTU 45mg,无水DMF30ml溶解,加上三通换氮气,搅拌并升温到 30℃下反应,3h后TLC碘熏显示生物素反应完成,加入氨基己酸的DMF溶液搅拌过夜,次日监测反应中D-生物素硒的量,反应完成后减压除去溶剂,用少量乙酸乙酯和甲醇洗涤后,再次加入无水DMF25ml,1.5mg的TSTU,搅拌3h 后,加入AZA-SAM 10mg,DMF溶液反应,TLC,显示AZA-SAM反应完成,减压蒸馏除去溶剂,乙醚,丙酮和少量甲醇洗涤,色谱纯化分离,旋蒸,得粘性固体.加入含氯化氢气体的甲醇溶液搅拌再次洗涤,乙醚抽干,白色固体装瓶, 低温0℃保存。
实施例五
使用6-碳接头将SAM与生物素共价结合(Bio-6C-SAM)
使用与实施四相同的方法,制备上述共轭偶联物。
实施例六
用6-碳接头将SAH与生物素共价结合(Bio-6C-SAH)
使用与实施例四相同的方法,制备上述偶联物。
使用如上所述的类似化学,制备以下额外的生物共轭物。
实施例七
没有任何接头的SAM与生物素的偶联物(Bio-SAM)
实施例八
没有任何接头的SAH与生物素的共轭物(Bio-SAH)
实施例九
用6-碳接头将SAH与地高辛基共价结合(Dign-6C-SAH)
实施例十
用6-碳接头将SAH与地高辛结合,地高辛通过6-溴己酸与SAH的NH2结合(Dig-6C-SAH)
实施例十一
用11-碳和1-氮接头将SAH与地高辛基或/和地高辛共价结合(Dign-12CN-SAH,Dig-12CN-SAH)
实施例十二
用6-溴己酸将Aza-SAM与地高辛共价结合(Dig-6C-aza-SAM)
实施例十三
用6-溴己酸将Aza-SAM与地高辛基共价结合(Dign-6C-aza-SAM)
实施例十四
用12-碳和1-氮接头将Aza-SAM与地高辛共价结合(Dig-13CN-aza-SAM)
实施例十五
用12-碳和1-氮接头将Aza-SAM与地高辛基共价结合(Dign-13CN-aza-SAM)
示例十六
用12-碳和1-氮接头将SAM与地高辛共价结合(Dig-13CN-SAM)
示例十七
用12-碳和1-氮接头将SAM与地高辛基共价结合(Dign-13CN-SAM)
示例十八
生物共轭物的特性的鉴定
已经测试了所提及的大多数的上述生物偶联物能够竞争SAM抗原去结合特异性抗SAM抗体(在SAM或SAM类似物生物共轭物的情况下),以及竞争SAH抗原结去合特异性抗SAH抗体(在SAH生物共轭物的情况下),所使用的方法是Arthus Biosystems的产品货号为IK00201,IK00201s,IK00202,IK00202s,IK00301,IK00301s,IK00302和 IK00302s的竞争性ELISA(cELISA)。结果表明,生物偶联物保留与生物素或地高辛(或地高辛基)共轭之前小分子 (SAM,SAM类似物,SAH)的抗原性质。
为了在夹心状免疫测定形式中测试生物偶联物的其它性质,进行了以下的实验:
(1)用链霉抗生物素蛋白(Sigma)(即SA)包被96孔微量滴定板,然后加入不同量的化合物Bio-12CN-aza-SAM并孵育约1小时。加入适当稀释的HRP-anti-SAM抗体并孵育30分钟。洗涤后,加入HRP底物显色约15分钟。停止反应并读取OD45的光密度值。结果如图2A-2C所示,表明OD450的值与所使用的生物共轭物的数量很好地相关。在该非竞争性测定中,生物偶联物与SA的结合不会干扰生物偶联物与其特异性抗体的结合。
(2)96孔微量滴定板用特异性抗SAM或抗SAH抗体直接包板,或者间接地首先用山羊或兔抗小鼠IgG包板,然后加入针对SAM或SAH的小鼠单克隆抗体。将不同量的生物偶联物加入板中并孵育约1小时。洗涤后,加入适当稀释的 SA-HRP并孵育约30分钟。通过HRP比色法检测生物偶联物的量。结果与图2相似。
实施例十九
生物共轭偶联物在竞争性ELISA中的应用
用1ug/ml的山羊抗小鼠IgG预包被96孔微量滴定板。在用BSA(牛血清白蛋白)适当封闭后,将小鼠抗 SAM抗体克隆118-6和84-3(从1mg/ml母液进行1:2000-1:64000稀释)的稀释抗体系列加入到平板中。分别使用125ng/ml,250ng/ml和500ng/ml的Bio-12CN-aza-SAM与SAM抗原竞争。标准曲线中使用的游离抗原剂量范围为0- 2000nM。结果如图3和图4所示。不同用量的生物偶联物和抗体得到的标准曲线略有不同,在标准品的0~2微米内线性良好。需要进行进一步的测试,以确定哪个条件在测量SAM中产生更好的灵敏度、重复性和回收率。
Bio-12CN-SAH,Bio-6C-SAH和Dig-6C-SAH也在cELISA中进行了类似的测试,以定量测量SAH,线性也很好。
实施例二十
在
格式1(图1A)中使用Bio-12CN-aza-SAM
兔抗小鼠IgG-XL665和SA-铕(Eu3+)cryptate购自Cisbio Bioassays。仔细优化下列组分的剂量:Bio- 12CN-aza-SAM,SA-Eu3+螯合物,小鼠抗SAM抗体118-6和兔抗小鼠IgG-XL665(溶解在含有100mM PB,pH 7.0的缓冲液,0.1%无蛋白酶BSA,100mM KF,0.1%吐温20的缓冲液中)。在竞争性HTRF测定中,SAM标准品的使用范围为 0-2000nM。用Optiplates-96微孔板进行测试,最终体积为100μl/孔。将所有测定组分合并,并在室温下孵育1小时。用BMG LABTECH CLARIOstar微孔板读数器读取结果。在每个激发脉冲之后以50μs延迟测量时间分辨荧光信号。在665nm波长测定FRET受体发光信号(A计数)和在620nm检测Eu(K)供体信号(B计数)。所有测定孔的B计数应相同,作为内部对照和背景吸光度的指标。同时测量荧光信号,报告比率((A计数-10,000)/B计数)。因为 665nm信号和620nm信号同样受到影响,因此该比例最小程度地受背景吸光度的影响。使用该比率和SAM标准品浓度做绘制标准曲线。样本中SAM越多,A计数越小,因此该比率越小。
实施例二十一
在
的格式2(图1B)中使用d2-6C-aza-SAM
在含有100mM PB,pH 7.0,100mM KF,0.1%吐温-20,0.1%不含蛋白酶的BSA的缓冲液中优化以下每一种成分的剂量:d2-6C-aza-SAM,山羊抗小鼠IgG-Eu3+螯合物,小鼠抗SAM抗体84-3。.在竞争性HTRF测定中,SAM标准品的使用范围为0-2000nM。用Optiplates-96微孔板进行测试,最终体积为100μl/孔。将所有测定组分合并,并在室温下孵育1小时。用BMG LABTECH CLARIOstar微孔板读数器读取结果。在每个激光脉冲之后以50μs的延迟测量时间分辨的荧光信号。在665nm波长测定FRET受体发光信号(A计数)和在620nm检测Eu(K)供体信号(B计数)。所有测定孔的B计数应相同,作为内部对照和背景吸光度的指标。同时测量荧光信号,报告比率((A计数- 10,000)/B计数)。因为665nm信号和620nm信号同样受到影响,因此该比例最小程度地受背景吸光度的影响。使用该比率和SAM标准品浓度做绘制标准曲线。样本中SAM越多,A计数越小,因此该比率越小。
实施例二十二
兔抗小鼠IgG-XL665和铕(Eu3+)螯合物穴状标记试剂盒购自Cisbio Bioassays。将小鼠抗地高辛或抗地高辛基抗体(PerkinElmer)标记为Eu3+螯合物。优化下列每一种成分中的剂量:在含有100mM PB,pH的缓冲液中的 Dig-6C-SAH,抗地高辛-抗体-Eu3+螯合物,小鼠抗SAH抗体301-3和兔抗小鼠IgG-XL665(溶解在含有100mM PB,pH 7.0的缓冲液,0.1%无蛋白酶BSA,100mM KF,0.1%吐温20的缓冲液中)。在竞争性HTRF测定中,SAM标准品的使用范围为0-2000nM。用Optiplates-96微孔板进行测试,最终体积为100μl/孔。将所有测定组分合并,并在室温下孵育1小时。用BMG LABTECH CLARIOstar微孔板读数器读取结果。在每个激发脉冲之后以50μs延迟测量时间分辨荧光信号。在665nm波长测定FRET受体发光信号(A计数)和在620nm检测Eu(K)供体信号(B计数)。所有测定孔的B计数应相同,作为内部对照和背景吸光度的指标。同时测量荧光信号,报告比率((A计数-10,000)/B计数)。因为665nm信号和620nm信号同样受到影响,因此该比例最小程度地受背景吸光度的影响。使用该比率和SAM 标准品浓度做绘制标准曲线。样本中SAM越多,A计数越小,因此该比率越小。
实施例二十三
使用与实施例二十一类似的方法,除了生物偶联物是d2-12CN-SAH代替d2-6C-aza-SAM。
实施例二十四
在BRET格式3中使用萤光素酶-6C-aza-SAM
使用荧光抗体标记试剂盒(Thermo-Fisher)将小鼠抗SAM抗体118-6与AlexaFluor 610-x偶联。优化生物偶联物与荧光素酶的摩尔比,小鼠抗SAM抗体与Alexa Fluor610-x的摩尔比,荧光素酶-6C-aza-SAM(供体Luc- SAM)的工作浓度,小鼠抗SAM抗体118-6(受体荧光素-抗体,FL-Ab)和作为竞争物的样品或标准品,缓冲体系含有100mM PB,pH7.0,0.1%无蛋白酶BSA,100mM KF,0.1%吐温-20。在竞争性BRET测定中,SAM标准测试范围为0-2000nM。用Optiplates-96微孔板进行测试,最终体积为100μl/孔。将上述三种测定组分和底物荧光素酶组合,并在室温下孵育15-30分钟。用BMG LABTECH CLARIOstar结果。在每个激光脉冲之后以50μs延迟测量时间分辨荧光信号。在630nm处测量BRET受体荧光信号,在550nm处检测荧光素信号。计算BRET指数(FL-Ab/Luc-SAM)的适当摩尔比。使用正确的Luc-SAM(摩尔比Luc:SAM为1:20)偶联物和FL-Ab(摩尔比FL:Ab为4-8:1)偶联物,结合的抗体量与BRET指数呈线性关系,以BRET指数和SAM标准浓度绘制标准曲线。样本中SAM越多,BRET指数越低。
实施例二十五
在BRET中使用荧光素酶-13CN-aza-SAM
使用与实施例二十四相似的方法,除了生物偶联物是荧光素酶-13CN-aza-SAM,来代替荧光素酶-6C-aza-SAM。
实施例二十六
在BRET中使用萤光素酶-aza-SAM
使用与实施例二十四相似的方法,除了生物偶联物是荧光素酶-aza-SAM,而不是萤光素酶-6C-aza-SAM
实施例二十七
在BRET中使用荧光素酶-13CN-SAH
使用与实施例二十四相似的方法,除了生物偶联物是荧光素酶-13CN-SAH,来代替荧光素酶-6C-aza-SAM,以抗SAH抗体替代抗SAM抗体,SAH标准取代SAM标准。
实施例二十八
在BRET中使用萤光素酶-6C-SAH
使用与实施例二十四相似的方法,除了生物偶联物是荧光素酶-6C-SAH,来代替荧光素酶-6C-aza-SAM,以抗SAH抗体替代抗SAM抗体,SAH标准取代SAM标准。
实施例二十九
在BRET中使用萤光素酶-SAH
使用与实施例二十四相似的方法,除了生物偶联物是荧光素酶-SAH,来代替荧光素酶-6C-aza-SAM,以抗SAH抗体替代抗SAM抗体,SAH标准取代SAM标准。
本申请中引用的所有专利,专利申请和出版物,包括这些专利,申请和出版物中的所有引用的参考文献,在此通过引用的方式全部并入本发明。
虽然本发明的许多实施方案包括目前优选的实施方案被简单描述如上,许多其它稍有变化的类似的实施方案实属在本公开的阐述和以下权利要求之范围内。因此,该所提供的优选实施方案和实施例的细节不被解释为限制性的。应当理解的是,这里使用的术语仅仅是描述而不是限制性的,且各种类似的变体和许多等效物或概念将不脱离其宗旨或离开所要求保护的发明的范围。