FI91449C - Menetelmä biologisen aineen määrittämiseksi in situ - Google Patents
Menetelmä biologisen aineen määrittämiseksi in situ Download PDFInfo
- Publication number
- FI91449C FI91449C FI924905A FI924905A FI91449C FI 91449 C FI91449 C FI 91449C FI 924905 A FI924905 A FI 924905A FI 924905 A FI924905 A FI 924905A FI 91449 C FI91449 C FI 91449C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- phosphorescence
- fluorescence
- reaction
- reagent
- situ
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6841—In situ hybridisation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Description
91449 MENETELMX biologisen aineen m&Xrittåmiseksi in situ -fOrfarande fOr beståmning av biologisk substans in situ Tåmå keksinto kåsittaa menetelmån, jossa kaytetSSn biospesifistå sitomismSSritystei ja jolla voidaan mS&rittaa kvalitatiivisesti tai kvantitatiivisesti biologisen aineen in situ biologisesta tai ei-biologisesta naytteestS 5 kSyttamålla fotoluminoivaa leimaa, jolla on pitka virittyneen tilan elinikå. Tallainen pitka-kestoinen luminesenssi voi olla fosforesenssia tai viivastynyttå fluoresenssia. Biologinen nayte voi olla esimerkiksi solun pinta/ fiksoitu solu tai kudosnåyte. Ei-biologinen nayte 10 voi olla esimerkiksi filtteri, paperi tai jokin muu matriisi, jota voidaan kayttaå pohjana spesifiselle sitomisreaktiolle. Kaytetty fotoluminoiva leima voi olla metalloporfyriinileima, joka on sidottu johonkin spesifisen sitomisreaktion komponenttiin joko kovalenttisesti tai 15 immunologisella sitoutumisella kMyttHen anti-porfyriini vasta-aineita.
Biologisten naytteiden in situ -maarityksilia hankitaan tietoa esimerkiksi antigeenin, reseptorin tai DNA:n esiintymisestå, maarasta ja paikantamisesta mainitussa 20 nMytteessa.
Kvantitatiivisissa fotoluminesenssiin perustuvissa immunomåarityksissa kaytetaån vasta-ainetta, antigeenia, sitojaproteiinia tai jotakin muuta sitomisreaktioon osallistuvaa reagenssia/ joka on kytketty leimaan, joka 25 voidaan mitata yksinkertaisesti analyysin suorittamiseen vaadittavalla herkkyydellS. Vasta-aineiden spesifiseen sitoutumiseen perustuvien immunomaåritysten lisSksi samankaltaisia mSSrityksia tehdaån kayttåmallS muita sitojaproteiineja, reseptoreita tai DNA-koettimia 30 spesifisinH sitoja-reagensseina. Fluoresenssiin perustuvissa kvantitatiivisissa m&&rityksissH fluoresenssin mittauksella on erityisenS ongelmana sillå saavutettu riittåmåton herkkyys, joka johtuu mittausta håiritsevåstå 2 hyvin korkeasta taustakohinasta. Taustakohina johtuu mm. valon sironnasta naytteen sisåltåmåstS liuottimesta ja hiukkasista, instrumentin omasta taustakohinasta, linssien ja måarityskyvettien foto-luminesenssistå seka nåytteiden 5 autofluoresenssista. Esimerkiksi seeruminåyte, mikrobit, viljellyt solut tai kudosleikkeet aiheuttavat erittåin korkean tausta-fluoresenssin, joka aiheuttaa voimakkaan tausta-interferenssin mittausaallonpituudessa useimpien kåytossa olevien merkkiaineiden osalta.
10 Aika-erotteinen fluorometrinen maaritys pystyy tehokkaasti eliminoimaan biologisista aineista johtuvan taustahåirion, kun kaytetaan viiveaikaa valilla 10 mikrosekuntia - yksi millisekunti. Tåmån lahestymistavan on tehnyt mahdolliseksi pitkåkestoista fluoresenssia emittoivien lantanidikelaatti-15 leimojen kehitys (katsauksena ks. esimerkiksi Soini ja Hemmila, Clinical Chemistry 25; 353, 1979 ja Hemmila, Applications of Fluorescence in Immunoassays, Wiley, New York, 1991). On kehitetty lukuisia kelaattiteknologioita (esim. DE 2 628 158, US 4 374 120, US 4 341 975, US 20 4 058 732 ja US 4 352 751). Dissoisioivaan fluoresenssin kehitykseen perustuva teknologia on saavuttanut laajan kaytdn in vitro -diagnostiikassa. Tassa teknologiassa fluoresenssia ei mitata in situ vaan ioni-dissosiaation jSlkeen (US 4 565 790) ja siten thma teknologia ei sovellu 25 analyyseihin, joissa sitomisreaktiota seurataan in situ, koska mittaus ei pysty tuottamaan paikka-informaatiota.
Aika-erotteisen fluorometrian ja lantanidikelaattien sovel-taminen in situ teknologiaan vaatii stabiilien ja voimakkaasti fluoresoivien kelaattileimojen kehitthmisen.
30 Huolimatta siita, ettH loytyy suuri joukko patentti-julkaisuja (esim. US 4 772 563, US 4 837 169 ja eurooppalaiset patenttihakemukset 340 675 ja 68 875), nykyisillå kelaateilla ei ole kyetty ratkaisemaan ongelmaa, joka liittyy voimakkaasti aromaattisten rakenteiden, joilla 35 on korkea imeytymiskyky ja energiansiirto-ominaisuudet, yhdistamiseen korkeaan hydrofilisuuteen, korkeaan 91449 3 kvanttitehokkuuteen ja fotostabiliteettiin samassa kelaatissa eika ole ilxnestynyt markkinoille yhtåån hyvåå kelaattisysteemiå in situ -måårityksiå vårten. Toinen lantanidikelaatteihin liittyva ongelma johtuu niiden 5 virityksesta UV-alueen låheisyydesså, koska tålla alueella tehokas viritys vaatii kvartsilinsseja, joilla on korkea UV-låpåisy ja alhainen tausta. Lisåksi UV-valo aiheuttaa korkean taustan, joka tulee kåytetyistå objektilaseista ja peitelasista. Korkeaenerginen UV-valo voi my δs aiheuttaa 10 leimamolekyylien fotokemiallista hajoamista.
Fosforoivat metalloporfyriinit muodostavat toisen aineryhmån, jolla on sopivia fotoluminesenssiominaisuuksia aika-erotteista fluorometriaa vårten. Metalloporfyriineillå leimattuja reagenssejå on syntetisoitu ja detektio-15 jårjestelmå niiden kåyttoå vårten immunomåårityksisså on kuvattu mm. seuraavissa artikkeleissa; Savitsky et al, Dokl Akad Nauk SSSR; 304, 1005, 1989: Uspechii biologisheskoy khimii 31; 209, 1990 ja venålåinen patentti SU 1 659 477, 1989. On havaittu, ettå erååt metalloporfyriinit omaavat 20 voimakkaan fosforesenssin huoneen låmpStilassa, kun ne on suojattu veden vaikutukselta misellejå muodostavilla detergenteillå ja hapen sammuttavalta vaikutukselta lisåå-mållå voimakkaasti pelkiståviå aineita kuten natriumsulfiittia. Sulfiittikonsentraatiosta riippuen 25 stabiili fosforesenssisignaali voidaan mitata vesiliuoksessa aikana, joka vaihtelee muutamista minuuteista useisiin tunteihin. Liuenneen hapen aiheuttama sammutus on myos palautuva ja fosforesenssi voidaan uudelleenkehittåå lisååmållå sulfiittia. Tåmå menetelmå ei 30 kuitenkaan sovellu pinnalla tapahtuvaan mittaukseen, koska leima tai leimattu reagenssi irrotetaan reaktiopinnalta ennen mittausta kåyttåen korkeaa detergenttipitoisuutta.
Korkea detergenttipitoisuus vaaditaan my6s mittausalueen lineariteetin laajentamiseksi ja metalloporfyriinin itse-35 sammutuksen eståmiseksi.
Yleinen ongelma, joka kohdataan fosforesenssin mittauksessa 4 biospesifisesså sitomisreaktiossa on sen herkkyys kosteudelle, liuottimelle seka hapen sammuttavalle vaikutukselle. Perinteisesti fosforesenssi mitataan kiinteiksi tehdyista naytteistå jaadyttMmSllH n&yte neste-5 typen låmpdtilassa (Aaron ja Winefordner, TaXanta 22; 707, 1975). Johtuen niistå teknisistå ongelmista, jotka esiintyvat tåmån teknologian yhteydesså, on kehitetty vaihtoehtoisia tapoja, joiden tavoitteena on loytåå helpompia tapoja mitata fosforesenssi huoneen låmpdtilassa, 10 kuten mittaus misellaarisessa liuoksessa, syklodektriinin sisåltS, tai kåyttSen erityyppisia kiinteitå kantajia, kuten filtteripaperia, silikageelia, natriumasetaattia tai kaliumbromidia (Vo-Dinh, Room Temperature Phosphorimetry for Chemical Analysis, Wiley, New York, 1984: Schulman ja 15 Walling, J Phys Chem 77; 902, 1973: Hurtubise, Anal Chem 61; 889A, 1989). Kuitenkin, jopa kiinteån kantajan pinnalla fosforesenssi on yha erittain herkka seka hapen låsnaololle etta pinnan kosteusjaamille ja usein joudutaan lisååmåån raskasmetalleja (Perry et al, Anal Chem 61; 2328, 1989: Vo-20 Dinh ja Uziel, Anal Chem 59; 1093, 1987: Hurtubise, Anal Chem 61; 889A, 1989).
Erilaisia komplisoituja teknologioita on sovellettu, jotta saavutettaisiin taydellisen vedettomåt olosuhteet ja toistettavat fosforesenssitulokset, kuten kuumennusta 25 uunissa 100°C:ssa, kaasunpoistoa kuivalla typellå ja mittausta kuivan typen lasnaollessa (Bello ja Hurtubise, Anal Chem 60; 1291, 1988), usean tunnin pituista kuivausta eksikkaattorissa (Paynter et al, Anal Chem 46; 736, 1974), kuumennusta IR-valolla ja mittausta kuivatun ilman 30 l&sn&ollessa (Parker et al, Photochem Photobiol 18; 467, 1973). Kirjallisuuden mukaan my6s Pt- ja Pt-coproporfyriinit ovat herkkia hapen lasnaololle jopa silloin, kun ne ovat sitoutuneet kiinteisiin pintoihin (Green et al., Anal Biochem 174; 73, 1988) ja esimerkiksi 35 Langmuir-Blodgett-filmia, johon on sidottu palladium-coproporfyriini (PdCP) voidaan kSyttaå happisensorina (Papkovsky, Appl Fluor Technol 3; 16, 1991). On myds 91449 5 tunnettua, ettfi optimoitaessa olosuhteet åårimmilleen fosforesenssin mittausta vårten huoneen låmpGtilassa, myGs todennåkGisyys saada kohonnut taustahåirio on kasvanut (LueYen-Bower et al, Talanta 27; 380, 1980).
5 Tåmån keksinnGn tavoitteena on poistaa ylla mainitut epakohdat ja rajoitukset ja esittåå uusi ja kåyttGkelpoinen menetelmå biologisten aineiden mittaamiseksi in situ kåyttåen biospesifista sitomisreaktiota.
Keksinto taten koskee in situ menetelmåå biologisen aineen 10 kvantitatiiviseksi tai kvalitatiiviseksi mittaamiseksi kåyttåen hyvaksi biospesifista sitomisreaktiota, jossa reagenssi, joka on leimattu fotoluminoivalla metalloporfyriinilla joko kovalenttisesti tai epasuorasti reagenssiin kytkettyjen sillan muodostavien vasta-aineiden 15 avulla, jolloin mainittu reagenssi saatetaan reagoimaan biologisen reagoivan aineen kanssa. KeksinnGn mukaan fotoluminesenssi-emission mittaus suoritetaan pinnasta olosuhteissa, jotka ovat omiaan våhentåmaan seka a) fotoluminoivan leiman tai fotolximinoivalla leimalla 20 leimatun reagenssin vapauttamista etta b) fotoluminoivan metalloporfyriini-leiman sammutusta, jolloin mittaus suoritetaan joko - kuivatusta naytteestå, tai - vesipitoisen detergenttiliuoksen alta, josta happi on 25 poistettu, tai - polymeroituvassa vedettGmåsså peiteaineessa.
Tassa keksinnossa termi 'fotoluminesenssi' kasittaa seka fosforesenssin etta viivåstyneen fluoresenssin, jotka molemmat ilmiGt ovat kSyttGkelpoisia keksinnGn mukaisessa 30 menetelmassa. Seuraavassa tekstissa sanaa 'fosforesenssi' on toisinaan kaytetty yksin, vaikkakin myGs joidenkin metalloporfyriinien tuottamaa viivastynyttå fluoresenssia saattaa esiintya jossakin måårin. Olennaista on, ettå metalloporfyriinin tuottama emissio on pitkåikaistå.
6
Keksinnon mukaisessa menetelmåsså biospesifinen sitomisreaktio on a) vasta-aineisiin perustuva reaktio, b) reseptori-sitoutumisreaktio tai c) reaktio, joka perustuu DNA- tai RNA-koettimiin.
5 Taman keksinndn mukaan spesifinen sitomisreaktio suoritetaan biologisella tai ei-biologisella pinna11a, esimerkiksi kudosnaytteellå, solujen pinnoilla, kiinnitetyssS solussa, muovin pinnalla, filtterimatriisilla jne. kSyttSen sitomisreagenssia, johon on sidottu 10 metalloporfyriini.
Seuraavassa taulukossa (Taulukko 1) on esimerkkejå joistakin leimoiksi soveltuvista porfyriineista. Metalli voi olla Pd, Pt, Y, Lu, Sn, Zn, Al, Yb tai jokin muu diamagneettinen metalli-ioni. Muodostunut metalloporfyriini 15 voi emittoida fluoresenssia, fosforesenssia tai viiv&stynyttå fluoresenssia.
Taulukko 1.
coproporfyriini I 20 coproporfyriini III uroporfyriini protoporfyriini IX hematoporfyriini IX mesoporfyriini IX 25 deuteroporfyriini IX
meso-tetra(4-sulfofenyyli)porfiini meso-tetra(4-pyridyyli)porfiini meso-tetra(4-karboksifenyyli)porfiini 30 Nåiden yhdisteiden ominaisuudet seka niiden synteesimenetelmat on kuvattu seuravissa artikkeleissas J. P. Falk, Porphyrins and metalloporphyrins, Elsevier, Amsterdam - New York - London, 1964: G. P. Gurinovich, N. N. Sevchenko, K. N. Soloviev, Spectroscopy of 35 chlorophyll and related compounds, Nauka i Technika, Minsk, 91449 7 1968; The Porphyrins, (ed.) D Dolphin, Academic Press, New York, Vol. 1-4; J. Vanderkooi, G. Maniara, T. J. Green, D. F. Wilson, J Biol Chem, 262, 5476, 1987; A. P. Savitsky, Uspechii Biol. Khimii Nauka, Moscow, 1990.
5 Fotoluminoivalla reagenssilla suoritetun spesifisen varjåyksen jalkeen kohteen fotoluminesenssi voidaan mitata eri olosuhteissa.
Suositeltavat emission mittausympåristot kåsittåvåt mittaukset a) kuivatusta naytteestå, b) vesipitoisen 10 detergenttiliuoksen alta, josta happi on poistettu tai c) polymeroituvassa vedettdmSssa peiteaineessa.
Siten, keksinnon eråån suoritusmuodon mukaisesti pinnasta voidaan poistaa vesi-jaåmat esimerkiksi kuivaamalla se ilmassa tai korvaamalla vesi orgaanisella liuottimella, 15 jonka jSlkeen metalloporfyriinin fosforesenssi tai viivastynyt fluoresenssi voidaan mitata jopa hapen lasnåollessa.
Keksinndn toisen suoritusmuodon mukaan vedetdn pinta voidaan edelleen kiinteyttSa polymeeriseen peiteaineeseen.
20 Polymeerisina aineina voidaan kayttåå erilaisia peiteaineita, etenkin sellaisia ei-vesipitoisia peiteaineita, jotka muodostavat polymeroidun matriisin, ovat suositeltavia. Peiteaineita, jotka soveltuvat fosforesenssiin tai aika-erotteiseen fluoresenssianalyysiin 25 on saatavissa eri kaupallisista låhteistå.
Keksinnon vielå toisen suoritusmuodon mukaan fosforesenssi tai viivastynyt fluoresenssi voidaan mitata myos vesipitoisessa ympåristosså kayttåmalla alhaista detergenttipitoisuutta ja alentamalla merkkiaineella 30 leimattujen aineiden liukoisuutta vesifaasiin lisååmållå eri reagensseja kuten polyetyleeniglykolia (PEG), suoloja tai orgaanisia liuottimia. Suuret PEG-pitoisuudet 8 (>5 %) voivat myoskin parantaa fosforesenssin signaalia.
TSmån keksinnon mukaisesti fosforesenssia tai viivHstynyttå fluoresenssia emittoivien leimojen, kuten metalloporfyriinien, kayttd on tehty yksinkertaiseksi.
5 Leima, joka on sidottu spesifiseen proteiiniin joko kovalenttisesti tai epåsuorasti kåyttåmålla anti-leima vasta-aineita, voidaan mitata nåytepinnalta yksinkertaisesti ilmakuivauksen jålkeen, etanolihuuhtelun jålkeen tai peitettyna sopivalla (ei-vesipitoisella) 10 peitinaineella tai peittåmållå vesiliuoksella, jossa on pieni pitoisuus detergenttiå neutraalisessa pH:ssa ja josta happi on poistettu fysiikaalisesti, kemiallisesti tai biokemiallisesti. On havaittu, ettei vapaa happi eikå myoskaan vesijaånteet aiheuta fosforesenssin sammumista 15 pinnalla.
Fosforoivien metalloporfyriinien kSyttd leimoina valttåa myos UV-valon kayton naytteen virityksessa, josta syysta optinen jMrjestely on yksinkertaisempi ja vahemmån altis lasimateriaalin taustastainterferenssille. Porfyriinien 20 voimakas Soret-absorptio mahdollistaa valon tehokkaan keråyksen ja metalloporfyriinit tuottavat pitkåaallonpi-tuista emissiota alueella 650 - 1100 nm suurella kvanttitehokkuudella.
Keksintd on kuvattu lisaksi seuraavin ei rajoittavin 25 esimerkein.
Esimerkki 1.
Streptavidiinin leimaus 1 mg palladium-coproporfyriinia (PdCP) liuotettiin 0.3 mlsaan 0.1 N KOH liuosta ja siihen lisåttiin 0.3 ml vettå. 30 Liuos neutraloitiin 0.1 N HCl:lla pH 6.0:ksi. Sen jålkeen lisåttiin tuore vesiliuos meto-n-toluolisulfonaatin 1-sykloheksyyli-3-(2-morfoliini-etyyli)karbodiimidi:å.
91449 9 Kåyttåmållå 0.01 N HCl:åå reaktioseos pidettiin pH:ssa 6.0 15 minuutin ajan. Saatu aktivoidun Pd-coproporfyriinin liuos lisåttiin 1 mg:aan streptavidiiniå 1 ml:ssa 0.1 N karbonaattipuskuria pH:ssa 9.0. Reaktioseosta seisotettiin 5 yli yon pimeåsså + 4°C:ssa. Pd-coproporfyriinin proteiinikonjugaatti eristettiin reaktioseoksesta geelisuodattamalla kåyttåen kolonnia, jossa oli kaksi kerrosta, 7 cm Sephadex G 50 yllå ja 25 cm Sepharose 6B alla, eluoimalla 50 mM Tris-puskurilla, jossa oli 150 mM 10 NaCl ja pH 7.4. Toisena eluoidun proteiinipiikin fraktiot kerattiin talteen.
Proteiinikonsentraatio mitattiin UV absorptiolla 280 nm:ssa våhentåmållå saaduista absorptioista PdCP:n absorptio tassa aallonpituudessa kåyttåmållå tunnettuja ekstinktiokertoimia 15 Pd-coproporfyriinille ja proteiineille setyylimetyyli-ammoniumbromidin (CTAB) vesiliuoksessa.
Esimerkki 2.
Biotinyloidun kanin anti-hiiri IgG:n mittaus fosforesenssi-immunomåårityksellå 20 Proteiiniantigeeni (hiiren IgG) sidottiin polystyreenista tehdyn mikrotitrauslevyn kuoppien pintoihin inkuboimalla kuopat 100 μ1:11β proteiiniliuosta (1 μg/ml) 0.1 M karbonaattipuskurissa, pH 9.0. Vapaiden sitomiskohtien saturointi tehtiin 200 μ1:11β kananmunan albumiinia (5 25 mg/ml) 0.1 M karbonaattipuskurissa pH:ssa 9.0, inkuboimalla 2 h 37°C:ssa. Sen jålkeen kuopat pestiin kuudesti pesuliuoksella (puskuroitu vesi-detergentti-liuos) kåyttåmållå pesulaitetta Nunc Immuno-Wash, Nunc.
Kuoppaan sidotun antigeenin annettiin reagoida 30 biotinyloidun kanin anti-hiiri IgG:n kanssa. Reaktion jålkeen ylimååråinen vasta-aine poistettiin pesemållå kuusi kertaa pesuliuoksella ja lisåttiin esimerkisså 1 tehtyå Pd-coproporfyriinillå leimattua streptavidiinia. Tunnin 10 reaktion jålkeen kuopat pestiin ko line kertaa vedella, kaksi kertaa alkoholilla ja kuivattiin sitten 15 minuuttia ilmassa. Yksi sarja standardeja mitattiin kuivana ja toinen sarja mitattiin ohuen kerroksen Merckoglas-peitinaineen 5 alla. Vertailustandardit mitattiin vesiliuoksesta, johon sitoutunut streptavidiini-konjugaatti irrotettiin kåyttåen liuosta, jossa oli 5 % Triton X-450 ja 8 mg/ml natrium sulfiittia. Fosforesenssin mittaus suoritettiin suoraan polystyreenilevyn kuoppien pohjista kåyttaen modifioitua 10 1232 DELFIA fluorometria (Wallac Oy, Suomi). Emissio mitattiin kåyttåen 656 nm:n emissiofiltteriå. Valittu viiveaika oli 0.2 ms ja mittausikkuna 0.7 ms fosforesenssimittausta vårten. Tyypillinen standardikuvaaja biotinyloidulle kanin anti-hiiri IgG:Ile on esitetty 15 kuvassa 1.
Esimerkki 3.
Hiiren IgG:n immunovårjåys kåyttåmållå kompleksia, joka on muodostettu PdCPsstå ja anti-PdCP vasta-aineista kåyttåen kanin anti-hiiri IgG vasta-ainetta sitovana vasta-aineena 20 Esimerkisså 2 kuvattua antigeenipåållystettyå mååritysjårjestelmåå kåytettiin mallisysteeminå. Tåsså menetelmåsså leima kiinitettiin ilman alustavaa kemiallista modifiointia påinvastoin kuin useimmiten kåytettyjen kovalenttien konjugaattien osalta. Leima muodostaa 25 spesifisen kompleksin sitå vastaan kehitettyjen vasta- aineiden kanssa ja kanin anti-hiiri-vasta-aineet toimivat siltatyyppisenå rakenteena, joka yhdiståå mååritettyå antigeenia vastaan kehitetyt antibodit leimaa vastaan kehitettyihin antibodeihin. PdCP-anti-PdCP kompleksin 30 sitoutuminen hiiren IgG pinnoitettuihin kuoppiin mitattiin kuten on kerrottu esimerkisså 2 joko kuivana (+) tai Merckoglas-peitettynå (Q). Tulokset on kuvattu kuvassa 2.
91449 11
Esimerkki 4.
Pintafosforesenssi ja irtoamisprosentti erilaisissa olosuhteissa
Mikrotitrauslevyn kuopat, jotka oli pinnoitettu hiiri-5 IgGslla vårj&ttiin biotinyloidulla anti-hiiri-IgG:llå PdCP-leimatulla streptavidiinilla kuten on kuvattu esimerkisså 2. Vårjåyksen ja pesujen jalkeen pinnat mitattiin ilmakuivina, polymeroituvan peitinaineen alia (Merckoglas, Merck) tai vesipitoisen detergenttiliuoksen alia, joka 10 sisSlsi 0.1 inM setyylitrimetyylianrnoniumbromidia ja 8 mg/ml natriumsulfiitiia joko liman PEG:tå tai 20 % PEG:n kanssa.
12 tunnin inkubaation jalkeen pinnat pestiin (paitsi Merckoglas) ja pintaan sitoutunut PdCP-leima irrotettiin alkaaliseen vesiliuokseen ja mitattiin. Tulokset on 15 esitetty taulukossa 2 alia.
Taulukko 2. Pintafosforesenssi ja pintaan jåånyt osuus leimasta eri olosuhteissa såilytettyna
Peitinaine Pintafosforesenssi Sfiilyvyys 20 fotonia per sekunti (cps) %
Kuiva 75 916 100
Vesi & detergentti 14 615 33 25 ......+ PEG 36 159 70
Merckoglas 85 615 ei mitattu 12
Esimerkki 5.
Kaupallisten peitinaineiden vaikutus PdCP-leimatun strepta-vidiinin pintafosforesenssiin YUS kuvattua hilren IgG pinnoitettua pohjaa kfiyttåen 5 mallimaarityksenH testattiin polymeroituvien ei-vesipitoisten peitinaineiden vaikutusta pintafosforesenssiin. Kaupalliset ei-vesipitoiset peitinaineet (Merckoglas, Entellan, Eukitt ja Euparal) hankittiin eri kaupallisista lShteistS. Fosforesenssitulokset, verrattuna 10 kuivana mitattuun fosforesenssiin, on esitetty taulukossa 3 alia.
Taulukko 3. Peitinaineen vaikutus pintafosforesenssiin
Peitinaine Signaali Tausta 15 fotonia/s fotonia/s
Kuiva 37 938 324
Merckoglas 108 860 1580
Entellan 97 558 448 20 Eukitt 52 894 498
Euparal 3 494 1372
Esimerkki 6.
Aika-erotteinen fluoresenssimikroskopia syopåantigeenista, 25 CA 242, syopasolulinjan pinna11a
Syopasolulinja (colo 205) kasvatettiin kasvumediumissa.
Noin miljoona solua/ml pestiin ja annettiin reagoida 0.5 mlsn MAb 242:ta kanssa, 10 μg/ml, puoli tuntia huoneen lampotilassa. Pesun jalkeen soluja inkuboitiin edelleen 30 puoli tuntia huoneen IMmpotilassa biotinyloidulla kani- anti-hiiri-IgG:lla ja viimeisessa vaiheessa PdCP-leimatul-la streptavidiinilla (10 μg/ml, 0.5 h). Osa pestyista 91449 13 soluista suspendoitiin Tris-puskuriin, 50 mM, pH 7.2, joka sisalsi 0.1 mM setyylitrimetyyliammoniumbromidia, 20 % PEG ja 8 mg/ml natriumsulfiittia ja 2 mg/ml kaliummono-fosfaattia. Solut sentrifugoitlin sytospinnilla 5 mikroskooppilasille ja peitettiin peitinlasilla. Toiset solufraktiot pestlin etanolilla (70 % ja 100 %), siveltiin laseille, kuivattiln ilmassa ja paallystettiin eri peitinaineella. Posforesenssi-intensiteetit mitattiin yksittSisista soluista mikrofluorometrilia, joka oli 10 valmistettu kaanteismikroskoopista, varustettu pulseeratulla xenon-lampulla, jonka viritysvalo fokusoitiin yhden solun kokoiselle alueelle, pyorivalla sulkimella, filttereilia ja valomonistinputkella. Fosforesenssi-intensiteettien keskiarvot on esitetty kuvassa 3.
Claims (6)
1. In situ -menetelmH biologisen aineen kvantitatiiviseksi tai kvalitatiiviseksi mittaamiseksi kHyttHen hyvHksi biospesifistH sitomisreaktiota, jossa reagenssi, joka on leimattu fotoluminoivalla metalloporfyriinillH joko 5 kovalenttisesti tai epHsuorasti reagenssiin kytkettyjen silian muodostavien vasta-aineiden avulla, jolloin mainittu reagenssi saatetaan reagoimaan biologisen reagoivan aineen kanssa tunnettu siitH, ettH fotoluminesenssi-emission mittaus suoritetaan pinnasta olosuhteissa, jotka 10 ovat omiaan vHhentHmHHn sekH a) fotoluminoivan leiman tai fotoluminoivalla leimalla leimatun reagenssin vapauttamista ettH b) fotoluminoivan metalloporfyriini-leiman sammutusta, jolloin mittaus suoritetaan joko - kuivatusta nåytteestå, tai 15. vesipitoisen detergenttiliuoksen alta, josta happi on poistettu, tai - polymeroituvassa vedettdmåssa peiteaineessa.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelma tunnettu siitH, ettH kaytetaån fosforoivaa 20 metalloporfyriiniå.
3. Jonkin patenttivaatimuksista 1-2 mukainen menetelmH tunnettu siitH, etta metalloporfyriinissa oleva kelatoitu metalli on valittu ryhmåstå, johon sisaltyy Pd, Pt, Y, Lu, Sn, Zn, Al tai Yb.
4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmH tunnettu siitH, ettH biospesifinen sitomisreaktio a) perustuu vasta-aineisiin, b) on reseptorisitomismHHritys tai c) on mHHritys perustuen DNA- tai RNA-koettimiin.
5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen menetelmH 30 tunnettu siitH, ettH pinta on immunomHHrityksessH kaytetty muovipinta, immunomåårityksessa tai DNA-koetinmHHrityksessH kHytetty membraani tai filtteri, 91449 kudosleike tai solupinta.
6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen menetelmå tunnettu siita, etta fotoluminesenssi, joka on joko fosforesenssi tai viivastynyt fluoresenssi, mitataan aika-5 erotteisella fluorimetrillå, fluoresenssimikroskoopilla, kuva-analyysilla tai pyyhkåisyfluorimetrillå.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI924905A FI91449C (fi) | 1992-10-29 | 1992-10-29 | Menetelmä biologisen aineen määrittämiseksi in situ |
| PCT/FI1993/000414 WO1994010568A1 (en) | 1992-10-29 | 1993-10-12 | METHOD FOR THE DETERMINATION OF A BIOLOGICAL SUBSTANCE $i(IN SITU) |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI924905 | 1992-10-29 | ||
| FI924905A FI91449C (fi) | 1992-10-29 | 1992-10-29 | Menetelmä biologisen aineen määrittämiseksi in situ |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI924905A0 FI924905A0 (fi) | 1992-10-29 |
| FI91449B FI91449B (fi) | 1994-03-15 |
| FI91449C true FI91449C (fi) | 1994-06-27 |
Family
ID=8536128
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI924905A FI91449C (fi) | 1992-10-29 | 1992-10-29 | Menetelmä biologisen aineen määrittämiseksi in situ |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| FI (1) | FI91449C (fi) |
| WO (1) | WO1994010568A1 (fi) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10138267B2 (en) | 2015-04-06 | 2018-11-27 | Hunan Skyworld Biotechnologies Co. Ltd. | Bioconjugates of heterocyclic compounds |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0350948B1 (en) * | 1988-07-14 | 1998-03-18 | Toyohakka Kogyo Kabushiki Kaisha | Porphyrin derivatives |
-
1992
- 1992-10-29 FI FI924905A patent/FI91449C/fi active
-
1993
- 1993-10-12 WO PCT/FI1993/000414 patent/WO1994010568A1/en active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1994010568A1 (en) | 1994-05-11 |
| FI91449B (fi) | 1994-03-15 |
| FI924905A0 (fi) | 1992-10-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102072891B (zh) | 金属修饰的光子晶体生物检测薄膜及其制备方法和用途 | |
| US6306589B1 (en) | Biological assays for analyte detection | |
| Fähnrich et al. | Recent applications of electrogenerated chemiluminescence in chemical analysis | |
| Papkovsky et al. | Emerging applications of phosphorescent metalloporphyrins | |
| Mayr et al. | Dual lifetime referenced optical sensor membrane for the determination of copper (II) ions | |
| US7332344B2 (en) | Luminescence assays | |
| US7517701B2 (en) | Luminescent lanthanide complexes | |
| US20090227043A1 (en) | Fluorescence Resonance Energy Transfer Assay Based on Modified Solid Surface | |
| AU686490B2 (en) | Long lifetime anisotropy (polarization) probes for clinical chemistry, immunoassays, affinity assays and biomedical research | |
| Piszczek et al. | Multiphoton ligand-enhanced excitation of lanthanides | |
| JPH07502820A (ja) | 生体特異的多変数検定法 | |
| JPH10307141A (ja) | プラズモン共鳴および蛍光検出を用いた生体分子相互作用の同時検出法 | |
| JP6010110B2 (ja) | 発光重合体の反復増幅 | |
| Turel et al. | Direct UV-LED lifetime pH sensor based on a semi-permeable sol–gel membrane immobilized luminescent Eu3+ chelate complex | |
| WO2008050274A1 (en) | Detecting target molecules in a sample | |
| EP3295174B1 (en) | Method for re-using test probe and reagents in an immunoassay | |
| RU2379691C1 (ru) | Способ многоаналитного иммуноанализа с использованием микрочастиц | |
| FI91449C (fi) | Menetelmä biologisen aineen määrittämiseksi in situ | |
| US7629179B2 (en) | Surfaces coated with target-induced fluorescent compounds for detection of target elements | |
| Soper et al. | Molecular fluorescence, phosphorescence, and chemiluminescence spectrometry | |
| Matsumoto | Recent developments in lanthanide chelates as luminescent labels for biomedical analyses | |
| Crystall et al. | Time resolved evanescent wave induced fluorescence measurements of surface adsorbed bovine serum albumin | |
| Soini et al. | Two-photon fluorescence excitation in detection of biomolecules | |
| US5017475A (en) | Fluorescent detection method based on enzyme activated conversion of a fluorophore precursor substrate | |
| WO1997020213A1 (en) | Luminescent probes for protein detection |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB | Publication of examined application |