JPH07502820A

JPH07502820A - 生体特異的多変数検定法

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Publication number: JPH07502820A
Application number: JP6502993A
Authority: JP
Inventors: ソイニ，エルッキ
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1992-07-02
Filing date: 1993-06-15
Publication date: 1995-03-23
Anticipated expiration: 2017-08-05
Also published as: WO1994001774A1; JP3311752B2; US5518883A; AU4329093A; EP0606422A1; DE69313611T2; DE69313611D1; EP0606422B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】生体特異的多変数検定法本発明は、生体特異的多変数（ｂｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍｕｌｔｉｐａｒａｍｅｔｅｒ）検定法に関する。

免疫検定（ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）は、よく確立されたグループの生体特異的検定であり、そして定例的な診断及び調査実験において目下広範に使用されている。いまだ開発中の他のグループの生体特異的検定は、ＤＮＡハイブリダイゼーション検定である。生体特異的検定は、１又は数個の生体特異的な反応体（例えば、抗体、ＤＮＡブローブ）を使用し、そして正常には、これらの反応体の１つが標識されている。現在使用されている標識は、ラジオアソトーブの、酵素の、発光性の、蛍光性の標識である。

定例的な診断においては、多変数（多分析物）分析についての増大する必要性が在る。不幸なことに、近年の方法論は、異なる標識からそのシグナルの分光光度計による分離が十分に効果的であないために、２又は３より多くの同時標識の使用を許容することができない。異なるラジオアイソトープ標識及び蛍光光度法標識の放射スペクトルは、有意な重複をもち、そしてその結果、それらは、必要な濃度範囲にわたり、異なる分析物の不適切な分離を提供する。

本発明の目的は、生体特異的な多変数検定のための方法論を改良することである。

本発明は、検定されるべき異なる分析物を表す異なるカテゴリーの微小球（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）の使用に基づく生体特異的多変数検定法であって、上記のカテゴリーが、短い減衰時間（ｓｈｏｒｔ　ｄｅｃａｙ　ｔｉｍｅ）をもつ異なる量の内部蛍光染料４を含んで成り、微小球のそれぞれのカテゴリーか、異なる生体特異的反応体により被覆され、以下の段階・一上記の異なるカテゴリーの微小球を一緒に、懸濁液中にプールし、そして検定されるべき分析物を含むサンプルを、その懸濁液に添加し、一標識された生体特異的反応体の混合物を、上記懸濁液に添加し、上記分析物及び上記標識反応体及び微小球会合反応体の間の生体特異的反応を開始させ、一上記の懸濁液を希釈し、上記微小球に結合していない標識反応体の濃度を減少させ、一上記の内部蛍光染料を励起させ、そしてその放射蛍光の強度を測定し、一上記の蛍光放射を電気的シグナルに変換し、上記の短い壊変時間の蛍光染料から生した電気的シグナルの強度に基つきそれぞれの微小球のカテゴリーを同定すること、を含んで成る検定法に関する。

この方法は、以下の（１）Ｌ記の生体特異的反応体の標識か、化学−若しくは生物−発光反応を作り出し又は触媒する化合物であること、そして、−活性剤であって、上記の微小球の表面上の標識反応体から、化学−若しくは生物−発光反応を作り出し又は触媒するものを、上記の懸濁液に添加し、発光放射を作り出し、そして、−上記の発光標識により作り出された光子放射から生じた電気的シグナルの強度に基づき、それぞれの微小球上の分析物の濃度を測定すること、又は、（１１）上記の生体特異的反応体の標識が、リン光性の化合物であること、そして、上記のリン光性標識により作り出された光子放射から生じた電気的シグナルの強度に基づき、それぞれの微小球上の分析物の濃度を測定すること、のいずれかを特徴とする。

用語“染料（ｄｙｅ）”を、以下に、微小球の内部蛍光に対する関連において系統的に使用する。

用語”標識（ｌａｂｅｌ）“を、以下に、生体特異的な反応体の標識付け′に対する関連において系統的に使用する。この標識は、化学−若しくは生物発光反応又はリン光性化合物を作り出す化合物である。

上記の発光標識は、活性化試薬を添加することにより活性化される。上記のリン光性標識は、パルス光源により活性化される。

本多変数検定を、人工的に作った微小球の懸濁液であって、本明細書中でカテゴリーという、異なる分析物を表す異なる微小球のプールを含んで成るものの中で、行う。微小球のそれぞれのカテコ゛リーを、最初に特異的反応体（抗体、ＤＮＡ　、　ＲＮＡ）で被覆する、すなわち、この微小球は、この特異的反応体及び生体特異的反応のための固体支持体として機能する。本発明は、実質的に異なる時間において光子放射を作り出すシグナルの２つの源の使用を組み合わせる。

選択の第一の可能性は、蛍光微小球と発光標識との組み合わせである。本発明は、特に、異なる分析物を表す個々の微小球のそれぞれのカテゴリーを識別するための蛍光染料と、生体特異的反応の後にその微小球上の特定の分析物の濃度を検出するために使用される発光又はリン光性標識とを、組み合わせるマイクロ光度計測方法論（ｍｉｃｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ　ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ）に関する。

直径１〜２００μｍ（このサイズに限定されないが）をもつ単一サイズの微小球を、僅かに親水性の特徴をもつ適切なポリマー材料から作ることができ、そしてそれ故に、それらは、水懸濁液に好適である。この微小球の表面の性質は、物理的吸着により並びにその表面における０１１−基の活性化を通しての共有結合により（Ｌ、　Ｊｏｈａｎｓｅｎ　ｅｌ、　ａｌ、、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　５９．２５５−２６４．１９８３）　、微小球の結合をも可能にする。本発明においては、異なる分析物の全てを含むサンプルを、短時間で可能な限りの完全な反応を達成するために、可能な最小容量（例えば、ｌＯ〜１００ μｌ）の中で、微小球のプールと、及び標識反応体のプールと共に、最初にインキュベートする。この微小球の懸濁液中で、分析物の分子と標識反応体との間の平均距離が非常に小さいので、この生体特異的反応の平衡は、このインキュヘーノヨンの間に直ぐに達成され、そして結果として、一般的に文献中で”サンドイッチ”といわれる、標識反応体、分析物及び微小球表面に固定化された反応体からなる結合体が、形成される。このインキュベーションの後、懸濁液を、個々の微小球を発光計測又はリン光計測により分析するために、適当に希釈する。しばしば、１オーダーの希釈は、結合及び遊離の画分の十分に効果的な分離に十分なものであることがてきる。なぜなら、本発明において使用される光度計検出器は、光学的焦点における微小球起源のシグナルと、周囲のバッファー溶液中の遊離標識からのシグナルとの間を、光学的に区別することができるからである。十分な数の微小球を分析し、そしてそれぞれの微小球の標識からのシグナルの強度を、コンピューター内に記録する。

蛍光性微小球を、ポリマー材料を好適な短い減衰時間の蛍光染料と組み合わせて、作ることができる。非常に短い減衰時間をもつ蛍光染料は、例えば、ＰＯＰＯＰ、ビスＭＳＢ　、蛍光ランタニド（ｌａｎｔｈａｎｉｄｅｓ）　、蛍光無機微結晶、フルオレセイン（ｆ　１ｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）又はローダミン（ｒｈｏｄａｍｉ　ｎｅ）等を、いずれかのモノマー（例えば、”Ｔｈｅｏｒｙ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ｏｆ　５ｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ”、　Ｅｄ、　Ｊ、Ｂ、　Ｂｉｒｋｓ、　Ｐｅｒｇａｍｏｎ　Ｐｒｅｓｓ、　１９６７、　ｐｐ、　３２１−３５３中に討議されているようなもの）に添加することができ、そして固体蛍光材料を、重合において形成される。この材料を、上記と同一の段階において微小球に加工する。

この蛍光染料を、あるいは、微小球の表面にしみ込ませ、又は微小球の表面に結合させることができる。この場合における染料は、その粒子内に均一に分散されていないけれとも、用語”内部”は、この場合をもカバーすると理解しなければならない。この蛍光染料を、例えば、２つの要因により互いに異なった実質的に異なる濃度における異なるバッチのモノマーに添加する。選ばれた蛍光染料が、発光又はリン光標識の放射バンドと重複しない吸収バンドをもっということが重要である。

特定の多変数生体特異的検定法は、以前に紹介されていた。しかしながら、殆どの場合には、その多変数の方法論は、異なる生体特異的反応体て被覆された空間的にそして光学的に分離した反応領域をもつ固体支持体の使用に基づくものであった（例えば、ＰＣＴ　ＷＯ８４１０１０３１を参照のこと）。人工的に作られた微小球の使用に基づく多変数検定法も公開されている。これらの方法においては、分析物のカテゴリーの識別は、異なるカテゴリーについての異なるサイズの又は異なる色の微小球の使用に基づいており、そしてその識別は、その直径又はその粒子の吸収を光学的に計測することにより、起こる。米国特許第５．０２８．５４５号は、短い減衰時間をもつ蛍光染料を識別のために使用し、そして長い減衰時間をもつ他の蛍光化合物をその生体特異的反応体を標識付けするときに使用するような方法について記載している。しかしながら、本発明は、後者とな異なっている。なぜなら、本発明における発光標識の検出は、発光標識及び発光計測又はリン光性標識及びリン光計測の使用に基づいているからである。

微小球表面における生体特異的反応体と会合した発光標識は、それらの反応体及び必要な補因子及び付属の酵素の光学的濃度の使用に基づく。化学発光（例えば、ペルオキシダーゼ−ルミノール）又は生物発光（例えば、ルシフェラーゼ−ルシフェリン）の反応のどらの基質（ルシフェリン）、必要な補酵素、及び定常光タイプよりもむしろフラッシュである光放射シグナルを作りだすための追加の酵素と一緒に、滴定することができる。最適量の光蛋白、例えば、エクオリン（ａｅｑｕｏｒｉｎ）、オペリン（ｏｂｅｌｉｎ）、フォラシン（ｐｈｏ　ｌａｓ　ｉｎ）又はオフィオフィリシン（ｏｐｈｉｏｐｈｉｌｉｓｉｎ）を使用することもできる。

ペルオキシダーゼ又はオキシダーゼを、化合物、例えば、ルミノール又はアクリジン（例えば、ルシゲニン（ｌｕｃｉｇｅｎｉｎ））と−緒に使用し、本明細書中に記載する検出系に好適な発光シグナルを作ることができる。光放射のエンハンサ−及びモジュレータ−（波長、放射速度等）と−緒のこれらの系は、Ｃａｍｐｂｅｌｌ、　Ａ、　”Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ：　ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ”、　Ｗｅｉｎｈｅｉｍ＋　Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ　Ｂｅａｃｈ、Ｆｌ、：　ＶＣＨ；　Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ：　ｔ（ｏｒｗｏｏｄ、１９８８中により詳細に記載されている。酵素的に作られた化学発光は、免疫検定において、そしてＤＮＡ／ＲＮＡプローブ検定において、より高い感度及び迅速な検出を提供する。熱的に安定なジオキセタン（ｄｉｏｘｅｔａｎｅｓ）（例えば、ＡＭＰＰＤ及びＬｕｍｉｇｅｎ　ＰＰＤ）を、化学的にそして酵素的に（例えば、アルカリ性ホスファターゼ又はベーターガラクトシダーセ）引き金を引き、化学発光を作り出すことがてきる（Ｓｃｈａａｐｅｔ　ａｌ、、　１９８９．　Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｍ、、　３５．１８６３−６４）　、先に記載したルシフェラーゼ又は光蛋白が、絹換えＤＮＡ技術により、ＩｇＧ−結合プロチインＡ又はＧに（Ｎｉｌｓｓｏｎ、　Ｂ、　＆　Ａｂｒａｈａｍｓｅｎ、　Ｌ、、ｉｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍ。

１１、ｖｏｌ、　１８５．　ｐｐ、　１４４−１６１．１９９０）、特異的組換え抗体蛋白、例えば、一本鎖抗体に直接的に（Ｃｈｉｓｗｅｌｌ　＆　ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ、　ＴｉｂＴｅｃｈ、　１０゜８０−８４．１９９２）融合されることがてき、それ故さらに、拳法の応用性か強化されるということも、強調されるへきである。

微小球表面における生体特異的な反応体と会合する別のリン光性標識は、長い減衰時間をもつリン光化合物の使用に基づいている。

パルス光励起及び時間−解析検出法を使用して、リン光性標識により作られたシグナルを、高感度かつ広いダイナミック・レンジで、測定することができ、そして短い減衰時間の蛍光染料により作られたシグナルから効率的に分離することができる。この効率的な分離は、その放射が、実質的に異なる時間において生じているという事実に基ついている。この蛍光染料の減衰時間は、典型的には、ナノ秒のオーダー内にあり、そしてこのリン光染料の減衰時間は、ミリ秒のオーダー内にある。

時間解析の測定原理及びリン光の検出のために必要な装置は、本質的に、長い減衰時間の蛍光の検出のために正常に使用される装置と同様のものである（Ｅ、　５ｏｉｎｉ　＆　ａｌ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｍ、、　２９／ＩＣ１９８３）　６５）。リン光は、蛍光の場合にも同様に蛍光光子放射がその分子の電子軌道の励起状悪に起源をもつが、蛍光放射がそのシングレット状態の減衰により発生するとき、リン光の光子放射はそのトリブレット状態の減衰により発生するような現象である。これらの現象及び過程は、上記の科学的文献中において異なるものであることは明らかであり、そしてこのような放射を提供する化合物は、異なる構造及び物理化学的性質をもっている。多数のリン光化合物が知られているが、正常には、それらは、固体てあり、又は低温においてのみ有用である。この理由のために、これらの化合物は、生体分子の標識付けのために使用されてこなかった。しかしながら、特定のメタロポルフィリン（ｍｅｔａｌｌｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｓ）は、室温において、そして有機溶媒中でリン光性であることが発見されている（Ｍ、　Ｐ、　Ｔｓｖｉｒｋ。

＆　ａｌ、、　０ｐｔｉｃａ　ｉ　５ｐｅｃｔｒｏｓｋｏｐｉａ　３４．１０９４−１１００．１９７３）　ｏプラチナ−コプロボルフイリン（ｐｌａｔｉｎｕｍ−ｃｏｐｒｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）及びパラジウムーコブロボルフィリン（ｐａ　ｌ　ｌａｄ　ｉ　ｕｍ−ｃｏｐｒｏｐｏｒｐｈｙｒ　ｉ　ｎ）は、それらの化合物か水及び酸素のクエンチングのための洗剤で保護される場合には、水溶液中でリン光を放射することが最近発見された。その結果、生体分子を標識付けするためにそれらを使用するための考え及び可能性のある方法が導入された（Ａ、　Ｐ、　５ａｖｉｔｓｋｙ　＆　ａｔ、　Ｄｏｋｌ、　Ａｃａｄ、　Ｎａｕｋ、　ＵＳＳＲ，３０４，１００５，１９８９）。酸素は、トリブレット状態の強力な消光剤であるが、酸素結合剤を使用してその測定溶液から除去されることができる。このような剤の単純な例は、亜硫酸ナトリウムである（ＳａｖｉｔｓｋＹ　＆　ａｌ、　ＵＳＳＲ特許第４２０１３７７号）。ランタニド（Ｉａｎｊｈａｎｉｄｅ）キレートと比較した場合のポルフィリンの利点は、３８０〜４００ｎｍの範囲内の励起光の強い吸収であり、この時、ランタニド・キレートは、２８０と３６０ｎｍとの間のＵＶレンジ上にそれらの吸収及び励起をもっている。後者は、特別な光学装置を必要とし、そしてより高価な装置導入につながる。プラチナーコブロボルフィリン及びバラジウムーコブロボルフィリンの放射波長レンジは、６４０〜６７０ｎｍである。

本発明を、添付の図面を参照して、より詳細に説明する。図１は、本発明に記載の方法を有効にするだめの装置の態様を図示している。

液体処理のために、適切なバルブ及びポンプが必要である。しかしながら、これらを、図１中に示していない。異なる分析物を表す異なるカテゴリー内の蛍光微小球を、主要な生体特異的反応体（抗体、ＤＮＡ等）で被覆し、そして容器内の懸濁液中に一緒にプールする。

サンプル（２）のｌθμｍ部分（例えば、血清）及び発光標識又はリン光標識（３）により標識されたちの第二生体特異的反応体の１０μｍ部分を、反応室（４）にインジェクトし、そして正確に制御された時間にわたり（例えば、数分間以上）適切な温度（例えば、３７°Ｃ）でインキュベートする。次に、この微小球の懸濁液を、容器（５）から取り出したバッファー溶液（例えば、１００ｍＭ　Ｎａ−に−リン酸塩、ｐＨ７，４，０，９％ＮａＣ１、ＢＳＡ　１　ｍｇ／ｍｌ）で、希釈及び洗浄する。この洗浄段階の間に、この微小球を、フィルター膜、磁気力又は他の手段により反応室内に固定化する。この微小球の懸濁液を、蛍光検出器（９）から得られた短い減衰時間の蛍光染料のシグナル強度に基づき、その微小球のカテゴリーの決定するために、単色光源（８）により投光されたキャピラリー蛍光検出室（７）に移す。次に、この懸濁液を、この発光反応の活性化剤として又はこのリン光標識の増強剤として作用する活性他剤溶液（Ｉ＋）の一部と共にキャピラリー検出室（ｌＯ）に移す。この微小球と会合した分析物の濃度を、上記の発光標識から又は上記のリン光標識からのシグナル強度の決定により測定する。放射された光子を、上記の検出室（ｌＯ）に光学的に接続されている光子カウンタ（１２）により検出する。この光子を、電子計数装ｆｉｔ（１３）により記録する。

発光標識の場合には、第二試薬をビオチンにより標識することができ、そしてその結果として、その標識試薬を発光反応に適切な形態に変換するために、例えば、ホタルのルシフェラーゼにより共有結合により標識されたストレプトアビジンを、反応室（４）内に添加する必要がある。検出のために使用される他の多くの発光反応が、類似の追加の段階を必要とするかもしれない。この発光は、発光活性化剤のインジェクションによる活性化を必要とし、そして本発明の場合には、その活性他剤溶液（１１）は１、ルソフェリン、すなわち、ホタルのルシフェラーゼの基質（例えば、０．Ｉ　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＣＩ　、　ｐＨ７，７５，０，１ｍＭ　Ｄ−Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ、０．１　ｍＭ　ＡＴＰ、　Ｉ　μＭピロホスフェー１−１踊Ｍ　ＭｇＣｌ２及びＩ　μＭコエンザイムＡ）を含む。

リン光標識の場合には、上記の第二試薬は、最大シグナル強度及びリン光放射の最小消光の条件を最適化するために使用される容器（６）又は（１１）から取り出された増強剤（例えば、４ｍｇ／ｍｌの亜硫酸すｌ・リウム及びＩ％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を含むｐＨ７，２〜７．４のバッファー溶液）を必要とすることができる。上記の検出室を、パルス光源（１４）により投光し、そして放射された光子を、６４０〜６７０ｎｍレンジ上で検出し、そして時間解析計数機能を取り込んだ電子計数装置（１３）により記録する。検出室（７）及び（１０）を、あるいは、単一の物理的ユニットに結合することができる。

両方の場合において、微小球内の分析物濃度の検出を、光電子増倍管又は池の適切な光子検出又は画像検出器（ＣＣＤ）を使用してその光子放射のシグナル強度を測定しながら、行う。上記のキャピラリー検出装置（７）及び（ｌＯ）を、１つのユニットに結合することもてきる。さらに、微小球の分析を、静止状態において、又は断続−流れ系で行うことができる。それぞれの分析物についての必要な統計的な精度のために十分な量の情報を得るために、十分な数のランダムに流れる微小球を、同定し、そして分析する。

上記のマイクロ光度計測検出は、微小球関連放射と溶液関連放射どの間を区別することができる。なぜなら、そのマイクロ光度計測の焦点における濃度とその希釈された懸濁液中における濃度のそれぞれか、大きなオーダーの大きさで異なっているからである。この検出の概念は、遊離及び結合画分の適切な分離を提供するが、必要により、それは、正常な分離方法（洗浄、濾過、遠心分離等）を使用して、より効率的にされることができる。

本発明関連の方法は、先に述べた特徴を組み合わせており、そしてその機能を実施する装置を、多くの異なった方法で具現化することができる。本発明の目的は、同一サンプル中の多変数検定を行うという目的のために、異なる分析物のカテゴリーを表す個々の微小球のそれぞれを同定することである。この同定は、先に記載したような蛍光の検出に基づいている。適切な測定系において、内部蛍光染料の短い減衰時間の蛍光及び標識由来シグナルを、別々に検出することができる。なぜなら、それらが、異なる時間に生じるからである。特に、短い減衰時間の蛍光の減衰時間がナノ秒のオーダー内にあるときは、その放射シグナルは、発光反応が活性化された時、又はリン光シグナルが測定される時、完全に減衰される。このことか、本発明のきわめて重大な点であり、そして、上記の速い減衰蛍光物質を、発光計測又はリン光計測による分析物の濃度の測定に対するいかなる有意な妨害を伴わずに、微小球のカテゴリーを同定するために、使用することができる。

Claims

【特許請求の範囲】

１．検定されるべき異なる分析物を表す異なるカテゴリーの微小球の使用に基づく生体特異的多変数検定法であって、上記のカテゴリーが、短い減衰時間をもつ異なる量の内部蛍光染料を含んで成り、微小球のそれぞれのカテゴリーが、異なる生体特異的反応体により被覆され、以下の段階； −上記の異なるカテゴリーの微小球を、一緒に、懸濁液中にプールし、そして検定されるべき分析物を含むサンプルを、その懸濁液に添加し、 −標識された生体特異的反応体の混合物を、上記懸濁液に添加し、上記分析物及び上記標識反応体及び微小球会合反応体の間の生体特異的反応を開始させ、 −上記の懸濁液を希釈し、上記微小球に結合していない標識反応体の濃度を減少させ、 −上記の内部蛍光染料を励起させ、そしてその放射蛍光の強度を測定し、 −上記の蛍光放射を電気的シグナルに変換し、上記の短い減衰時間の蛍光染料から生じた電気的シグナルの強度に基づきそれぞれの微小球のカテゴリーを同定すること、を含んで成り、以下の（ｉ）上記の生体特異的反応体の標識が、化学−若しくは生物−発光反応を作り出し又は触媒する化合物であること、そして、−活性剤であって、上記の微小球の表面上の標識反応体から、化学−若しくは生物−発光を作り出し又は触媒するものを、上記の懸濁液に添加し、発光放射を作り出し、そして、−上記の発光標識により作り出された光子放射から生じた電気的シグナルの強度に基づき、それぞれの微小球上の分析物の濃度を測定すること；又は、（ｉｉ）上記の生体特異的反応体の標識が、リン光性の化合物であること、そして、上記のリン光性標識により作り出された光子放射から生じた電気的シグナルの強度に基づき、それぞれの微小球上の分析物の濃度を測定すること、のいずれかを特徴とする検定法。
２．前記の内部蛍光染料が、短い減衰時間を時間をもつ蛍光化合物、例えば、ＰＯＰＯＰ又はビス−ＭＳＢであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
３．前記の生体特異的反応体の標識が、化学−若しくは生物発光を作り出し又は触媒する化合物、例えば、ペルオキシダーゼ、ルミノール、ルシフェラーゼ、ルシフェリン又はそれらの誘導体であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
４．前記の生体特異的反応体の標識が、前記の内部蛍光染料のものよりも実質的に長い減衰時間をもつリン光性化合物であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
５．前記のリン光性化合物が、白金−コプロポルフィリン又はパラジウム−コプロポルフィリンの誘導体であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
６．生体特異的な多変数検定法の検定試薬キットであって、−検定されるべき異なる分析物を表す微小球の異なるカテゴリーであって、異なる量の内部蛍光染料を含んで成り、微小球のそれぞれのカテゴリーが生体特異的な反応体で被覆されているもの、の調製懸濁液、及び、 −リン光性化合物により又は化学−若しくは生物発光を作り出し又は触媒する化合物により、標識された生体特異的な化合物の混合物を含んで成るキット。