FI90695B - Biospesifinen määritysmenetelmä - Google Patents

Description

90695

BIOSPESIFINEN MÄÄRITYSMENETELMÄ - BIOSPESIFIK BESTÄMNINGSMETOD

Immunomääritys on vakiintunut biospesifinen määritysmenetelmä ja sen eri sovellutuksia käytetään laajalti rutiini-diagnostiikassa ja tutkimuslaboratorioissa. Toinen biospesif isten määritysten ryhmä, joskin vielä kehityksen alaise-5 na oleva, on DNA- ja RNA-hybridisaatiomääritys. Biospesifi-sissä määrityksissä käytetään yleensä kahta biospesifistä reagenssia, primäärireagenssia ja sekundäärireagenssia (esim. vasta-ainetta, DNA- tai RNA-koetinta), jotka kumpikin sitoutuvat analyyttimolekyylin spesifisiin determinant-10 teihin muodostaen kolmen molekyylin kompleksin (kerrosra-kenteen) ja normaalisti toinen näistä reagensseista on leimattu. Nykyisin käytettyjä leimoja ovat radioisotoopit, entsyymit, luminoivat leimat ja fluoresoivat leimat.

Rutiinidiagnostiikassa on jatkuvasti kasvava moniparametri-15 sen analytiikan tarve. Valitettavasti nykyiset menetelmät eivät salli useamman kuin kahden tai kolmen samanaikaisesti mitattavan leiman käyttöä, koska näiden eri leimojen antamien signaalien spektrometrinen erottelu ei ole mahdollista riittävällä tarkkuudella. Eri radioisotooppien tai fluo-20 resoivien leimojen emissiospektrit peittävät huomattavasti toisiaan ja sen seurauksena eri analyyttien erottelu samasta näytteestä on huonoa vaaditulla pitoisuusalueella.

Tämän keksinnön tarkoituksena on esittää parempi menetelmä moniparametrisiin biospesifisiin määrityksiin sekä mene-25 telmässä käytettävä reagenssipakkaus.

Keksinnön tunnusmerkit ilmenevät patenttivaatimuksesta 1.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle ovat luonteenomaista seuraavat vaiheet: - Valmistetaan etukäteen mikropartikkeleita, jotka on 30 jaettu eri luokkiin vastaten kysymykseen tulevia eri ana- 2 90695 lyyttejä siten, että nämä eri luokkien mikropartikkelit sisältävät eri määriä fluoresoivaa väriainetta.

- Nämä eri luokkiin kuuluvat mikropartikkelit päällystetään kysymykseen tulevia analyyttejä sitovilla biospesifisillä 5 primäärireagensseilla ja sen jälkeen mikropartikkelit sekoitetaan keskenään suspensioksi.

- Eri analyyttejä sitovat biospesifiset sekundäärireagens-sit leimataan molekyylillä, joka lähettää fosforesenssiva-loa ja nämä reagenssit sekoitetaan keskenään.

10 - Mikropartikkelisuspensioon lisätään määritettävä näyte ja biospesifisten sekundäärireagenssien sekoitus, jonka jälkeen alkaa bioaffiniteetin vaikutuksesta mikropartikke-lien pinnalla oleviin reagenssimolekyyleihin sitoutua eri analyyttimolekyylien ja leimattujen biospesifisten reagens-15 sien muodostamia komplekseja.

- Sitoutumisreaktio lopetetaan lisäämällä laimenninta ja samalla laimennetaan mikropartikkeleihin sitoutumattomien leimattujen biospesifisten reagenssien pitoisuus.

- Mikropartikkeleiden sisältämää fluoresoivaa väriainetta 20 viritetään valonsäteellä ja sitten mitataan fluoresenssi- emission voimakkuus, jonka perusteella voidaan määrittää ko. mikropartikkelin luokka.

- Mikropartikkeleiden pinnalla olevaa fosforoivaa väriainetta viritetään valonsäteellä ja sitten mitataan fosfo- 25 resenssiemission voimakkuus fotoni-ilmaisimella, jonka antama sähköinen signaali on verrannollinen ko. analyytin pitoisuuteen.

Moniparametrinen määritys suoritetaan keinotekoisesti valmistettujen mikropartikkeleiden suspensiossa, joka on eri 30 luokkiin kuuluvien ja eri analyyttejä sitovien mikropartikkeleiden sekoitus. Jokaiseen eri luokkaan kuuluvat mikro-

II

3 90695 partikkelit päällystetään ensin spesifisellä primäärirea-genssillä (vasta-aine, DNA, RNA) eli mikropartikkelit toimivat näiden reagenssien ja biospesifisen reaktion kiinteänä alustana. Tälle keksinnölle on luonteenomaista erityi-5 sesti se, että siinä käytetään mikrofotometristä tekniikkaa mikropartikkeleiden luokan ja samalla analyytin tunnistamiseksi fluoresoivan väriaineen avulla sekä fosforesenssiin perustuvaa mittausta analyytin pitoisuuden määrittämiseksi mikropartikkeleiden pinnalta biospesifisen reaktion avulla.

10 Tämän keksinnön tarkoituksena on esittää menetelmä monipa-rametrisen biospesifisen määrityksen toteuttamiseksi ja esitetty menetelmä perustuu fluoresoivien mikropartikkeleiden ja fosforoivan leiman käyttöön ja erityisesti siihen, että fluoresenssisignaali ja fosforesenssisignaali voidaan 15 mitata laajalla dynamiikka-alueella ilman, että ne häiritsevät toisiaan, koska emissiot tapahtuvat oleellisesti eri aikoina. Käytännössä tämä tarkoitaa sitä, että mittaus suoritetaan aikaerotteisella mittausmenetelmällä, joka erottaa tehokkaasti lyhytikäisen fluoresenssiemission pitkäikäises-20 tä fosforesenssiemissiosta. Fosforoivien leimojen viritys tapahtuu valopulsseilla. Mikropartikkeleissa olevien fluoresoivien väriaineiden ja taustan emissiolla on lyhyt, yleensä vain nanosekuntien pituinen puoliintumisaika ja tässä käytetyn fosforesenssileiman puoliintumisaika on ' 25 yleensä esim. 1 ms pituinen. Fosforesenssiemissiota mittaa- va ilmaisin aktivoidaan esim. 0.5 ms viiveen jälkeen viri-tyspulssista, jolloin se mittaa vain pitkän puoliintumisajan omaavaa emissiota. Tällöin ei mikropartikkeliluokan ilmaisemiseen käytetyn fluoresoivan väriaineen emissio eikä 30 taustafluoresenssi häiritse biospesifisen leiman mittausta, mikä on tämän keksinnön mukaisen menetelmän oleellisin ominaisuus.

Tasakokoisia mikropartikkeleita läpimitaltaan 1-200 μπι (rajoittumatta kuitenkaan näihin kokoihin) voidaan valmistaa 35 sopivasta polymeeristä, joka on siinä määrin hydrofiilistä, että ne sopivat hyvin vesisuspensioon. Mikropartikkeleiden 4 90695 pintaominaisuudet sallivat makromolekyylien sitomisen niihin fysikaalisen adsorption tai kovalentin sidoksen avulla aktivoimalla pinnan OH-ryhmiä (L. Johansen et ai., J. Immunol. Methods 59, 255 - 264, 1983). Tämän keksinnön mu-5 kaisessa menetelmässä näytettä, jossa ovat siis kaikki kyseeseen tulevat analyytit, inkuboidaan sekundäärireagens-sien seoksen kanssa mikropartikkelisuspensiossa mahdollisimman pienessä (esim. 10 - 100 μΐ) tilavuudessa, jotta saavutettaisiin mahdollisimman täydellinen reaktio lyhyessä 10 ajassa. Koska mikropartikkelisuspensiossa tapahtuvassa reaktiossa analyyttimolekyylien ja leimattujen reagenssien keskimääräinen etäisyys on hyvin pieni, voidaan reaktiotasapaino saavuttaa nopeasti ja sen seurauksena syntyy mikro-partikkeleiden pinnalla olevien reagenssien yhteyteen lei-15 matusta reagenssistä ja analyytistä muodostuvia komplekseja. Tällaista rakennetta kutsutaan kirjallisuudessa yleisesti kerrosrakenteeksi. Jos inkubaatioajät voidaan säätää tarkasti, ei ole tarvetta ajaa reaktiota päätepisteeseen. Inkubaation jälkeen suspensio laimennetaan riittävästi va-20 paan leimatun sekundäärireagenssin pitoisuuden alentamiseksi ja yksittäisten mikropartikkeleiden pinnalla olevien leimattujen kompleksien määrä mitataan fosforometrisesti. Useimmiten riittää yhden kertaluvun suuruinen laimennus riittävän tehokkaaseen sitoutuneen ja vapaan leimatun rea-25 genssifraktion antamien signaalien erottamiseksi toisistaan, koska tässä menetelmässä käytetty mikrofosforometri-nen ilmaisin pystyy optisesti erottamaan mittauskammion fokuspisteessä olevan mikropartikkelin lähettämän fosfo-resenssin sen ympäristössä olevan vapaan leimatun reagens-30 sin antamasta signaalista. Mikropartikkeleita analysoidaan tilastollisesti riittävä määrä ja kunkin partikkelin fosfo-resenssisignaalin voimakkuus rekisteröidään tietokoneelle.

Raportteja, jotka kuvaavat moniparametrisien biospesifisien määrityksien periaatteita on esitetty aikaisemminkin.

35 Useimmissa tapauksissa moniparametrinen menetelmä on kuitenkin perustunut sellaisten kiinteiden reaktioalustojen käyttöön, joissa biospesifiset reagenssit voidaan kiinnit-

II

5 90695 tää toisistaan erillään oleviksi ja optisesti erotettaviksi alueiksi (esim. PCT WO 84/01031). Myös on julkaistu keinotekoisesti valmistettujen mikropartikkeleiden käyttöön perustuva moniparametrinen biospesifinen määritysmenetelmä, 5 jossa analyyttiluokan tunnistus perustuu erikokoisten mikropartikkeleiden käyttöön ja tunnistus tapahtuu mittaamalla optisesti analysoitavana olevan partikkelin halkaisija. US-patentissa no 5,028,545 on esitetty menetelmä, jossa käytetään lyhytikäistä fluoresenssia lähettävää väriainetta mik-10 ropartikkeleiden tunnistamiseen ja pitkäikäistä fluoresenssia lähettävää väriainetta analyyttien pitoisuuksien mittaamiseen. Lyhytikäisen ja pitkäikäisen fluoresenssin erottamiseksi toisistaan käytetään yllä mainitussa menetelmässä aikaerotteista fluorometriä. Lisäksi on kehitetty menetel-15 mä, jossa käytetään lyhytikäistä fluoresenssia lähettävää väriainetta mikropartikkeleiden tunnistamiseen ja kemi- tai bioluminesenssia synnyttävää molekyyliä analyyttien pitoisuuksien mittaamiseen. Näissä kummassakin edellisessä menetelmässä mikropartikkeleiden luokan määritys ja biospesi-20 fisten reagenssien sitoutumisen mittaus tapahtuvat rekisteröimällä niiden oleellisesti eri aikahetkinä lähettämät va-loemissiot eikä luokan tunnistamiseen käytetyn fluoresoivan leiman emissio tai taustafluoresenssi häiritse biospesifi-sen reagenssin leiman mittaamista.

25 Tässä keksinnössä esitetyn mittausmenetelmän herkkyys perustuu siinä käytettävän fosforoivan molekyylin antamaan signaaliin, joka mitataan fosforometrisesti, jolloin mittausmenetelmä ja mittauslaite ovat periaatteellisesti täysin samanlaiset kuin pitkäikäisen fluoresenssin mittaami-30 sessa käytettävä aikaerotteinen menetelmä ja laite. Fosfo-resenssi on ilmiö, jossa fotoniemissio on peräisin molekyylien elektroniorbitaalien viritystiloista, kuten fluoresenssikin, mutta fosforesenssiemissio syntyy tripletti-tilojen purkauksen seurauksena, kun taas fluoresenssi syn-35 tyy singletti-tilojen purkautumisesta. Kirjallisuudessa nämä ilmiöt ja nimitykset erotetaan selvästi toisistaan. Fosforoivia aineita tunnetaan suuri määrä, mutta yleensä 6 90695 fosforoivat aineet ovat kiinteitä aineita tai sellaisia aineita, jotka fosforoivat matalissa lämpötiloissa eikä niitä ole yleisesti käytetty biomolekyylien leimaamiseen. Joidenkin metalloporfyriinien on kuitenkin havaittu fosfo-5 roivan huoneen lämpötilassa orgaanisissa liuottimissa (M.

P. Tsvirko & ai., Optica i Spectroskopia 34, 1094 - 1100, 1973). Platinakoproporfyriinin ja palladiumkoproporfyriinin on myöhemmin havaittu fosforoivan myös veden ollessa liuottimena, kun fosforoivat yhdisteet suojataan detergentillä 10 veden ja hapen sammuttavalta vaikutukselta. On myös esitetty ajatus ja menetelmä niiden käyttämiseksi biomolekyylien leimaamiseen (A. P. Savitsky & ai, Dokl. Acad. Nauk. USSR, 304, 1005, 1989). Happi, joka on voimakas tripletti-tilojen sammuttaja voidaan poistaa mittausliuoksesta monilla tunne-15 tuilla happea sitovilla aineilla, joita lisätään mittaus-liuokseen. Yksinkertaisin tällainen aine on esim. natrium-sulfiitti (Savitsy & ai. USSR patentti 4201377). Porfyrii-nien etuna verrattuna esim. lantanidikelaatteihin on niiden voimakas valon absorptio ja virittyminen 380 - 400 nm 20 aallonpituudella, kun lantanidikelaateilla absorptio- ja viritysaallonpituus on UV-alueella 280 - 360 nm, mikä on laiterakentamisen kannalta hankalampi aallonpituusalue, koska se useimmissa tapauksissa edellyttää erikoisoptiik-kaa. Platinakoproporfyriinin ja palladiumkoproporfyriinin : 25 emissioaallonpituudet ovat alueella 640 - 670 nm.

Tämän keksinnön mukainen menetelmä on kuvattu yksityiskohtaisemmin kuvassa 1 olevan esimerkkiluonteisen kaavion avulla, joka esittää laitteistoa, jolla tämän keksinnön mukainen määritysmenetelmä on mahdollista suorittaa käytän-30 nössä. Alla olevat numerot viittaavat kuvan 1 komponentteihin. Nesteen käsittelyyn tarvitaan sopivia pumppuja ja venttiileitä, joita ei kuitenkaan ole merkitty kuvaan 1. Fluoresoivat mikropartikkelit, jotka edustavat eri analyyt-tejä, päällystetään eri analyyttejä sitovilla vasta-aineil-35 la ja ne sekoitetaan yhteen samaksi puskuroiduksi suspensioksi säiliöön 1. 10 μΐ osuus seeruminäytteestä 2 ja 10 μΐ osuus fosforoivalla molekyylillä leimattujen sekundäärivas-

II

7 90695 ta-aineiden seoksesta 3 ja 10 μΐ osuus mikropartikkelisus-pensiosta 1 ruiskutetaan reaktiokyvettiin 4 ja inkuboidaan esim. 37°C lämpötilassa tarkasti säädetyn ajan kestäen useita minuutteja tai kauemmin. Mikropartikkelisuspensio 5 laimennetaan tai pestään säiliössä 5 olevalla fosfaatti-puskuroidulla suolaliuoksella. Pesun aikana mikropartikke-lit ovat liikkumattomassa tilassa reaktiokyvetissä joko suodattimen, magneettisten voimien tai muun vastaavan menetelmän avulla kiinnitettyinä. Pesun viimeinen vaihe 10 tapahtuu mittausliuoksella 6, joka suojaa fosforoivat molekyylit sammutukselta (esim. puskuroitu vesiliuos pH 7,2 - 7,4 sisältäen 4 mg/ml natriumsulfiittia ja 1% Triton X-100). Mittauslioksessa olevat mikropartikkelit siirretään sitten suspensiona yksi kerrallaan kapillaariseen fluore-15 senssi-ilmaisimen kyvettiin 7, jota valaistaan monokromaattisella 380 - 400 nm valolähteellä 8 mikropartikkeleiden luokan määrittämistä varten, joka tapahtuu fluoresenssi-ilmaisimen 9 antaman signaalin voimakkuuden perusteella.

Sen jälkeen mikropartikkelit siirretään yksi kerrallaan 20 kapillaariseen fosforesenssi-ilmaisimen kyvettiin 10. Foto-niemissio mitataan 640 - 670 nm alueella toimivalla fotoni-ilmaisimella 11, joka on optisesti yhdistetty ilmaisinky-vettiin. Eri mikropartikkeleille saadut fotonilaskimen 12 lukemat ovat verrannollisia seeruminäytteessä olevien eri ; : 25 analyyttien pitoisuuksiin.

Tämän keksinnön mukainen menetelmä ja siihen tarvittava laitteisto voidaan toteuttaa käytännössä monella eri tavalla. Keksinnössä on kuitenkin oleellista se, että jokainen erillinen mikropartikkeli, joka edustaa eri analyyttiluok-30 kaa, tunnistetaan ja mitataan erikseen ja näin voidaan suorittaa moniparametrinen biospesifinen määritys samasta näytteestä. Tunnistaminen perustuu fluoresenssimittaukseen ja biospesifisen reagenssin leiman mittaus fosforesenssiin, kuten yllä on esitetty. Aikaerotteisuuteen perustuvalla 35 mittausjärjestelyllä voidaan suhteellisen lyhytikäinen tunnistusväriaineesta ja taustasta syntyvä fluoresenssi-emissio erottaa fosforesenssiemissiosta, koska niiden valo- 8 90695 emissiot tapahtuvat eri aikoina ja fluoresenssiemissio on täydellisesti loppunut, ennen kuin fosforesenssiemissiota aletaan rekisteröidä eikä fluoresenssi aiheuta merkittävää häiriötä analyytin pitoisuuden määrittämiseen fosforesens-5 sin avulla. Keksinnön oleellinen sisältö on juuri tässä.

Fluoresoivia mikropartikkeleita voidaan valmistaa yhdistämällä sopiva fluoresoiva yhdiste polymeerimateriaaliin. Orgaanisia fluoresoivia yhdisteitä, esim. POPOP, bisMSB, fluoreskeiini, rhodamiini jne. voidaan lisätä monomeereihin 10 mikropartikkeleiden valmistuksen yhteydessä ("Theory and Practice of Scintillation Counting", Ed. J. B. Birks, Pergamon Press, 1967, pp. 321 - 353) ja näin polymerisaa-tiossa muodostuu kiinteää fluoresoivaa materiaalia. Materiaali prosessoidaan mikropartikkeleiksi samassa prosessissa. 15 Mikropartikkeleiden tunnistamiseen käytettävää yhdistettä lisätään eri valmistuseriin eri suuruisia määriä siten, että muodostuu mikropartikkeleita, joiden fluoresenssivoi-makkuus eroaa toisistaan oleellisesti ja esim. kertoimella kaksi.

20 Mikropartikkeleiden analysointi voidaan suorittaa kapillaa-risessa mittauskammiossa joko pysäyttämällä virtaus tai virtauksen ollessa käynnissä. Mittausinstrumentissa tapahtuu mikropartikkeleiden mikrofotometrinen havainnointi ohuessa mittauskyvetissä, johon laimennettu mikropartikke-25 lisuspensio johdetaan. Mikropartikkelisuspensiota mitataan ensin fluoresenssi-ilmaisimella ja kunkin mikropartikkelin analyyttiluokan määritys tapahtuu fluoresenssin voimakkuuden perusteella. Seuraavaksi analyytin pitoisuuden määritys tapahtuu fosforesenssivoimakkuuden mittauksen avulla. Mit-30 tauskyvetin apertuuri valitaan optimaalisesti käytetyn mikropartikkelin suuruuden mukaan ja fosforesenssiemissio mitataan valomonistinputkella tai muulla herkällä fotoni-ilmaisimella tai sopivalla kuvailmaisimellä. Ilmaisimena voidaan käyttää myös mikrokanavakuvavahvistinta ja puoli-35 johdekuvailmaisinta (CCD). Riittävä lukumäärä mikropartikkeleita tunnistetaan ja analysoidaan tilastollisesti riitit 9 90695 tävän tarkan tuloksen saamiseksi jokaiselle analyytille. Mittaustulokset suhteutetaan standardinäytteillä suoritettuihin mittauksiin, joiden perusteella lopputulokset lasketaan.

5 Tälle keksinnölle on myös luonteenomaista, että tässä esitetty mikrofotometrinen mittausjärjestelmä pystyy optisesti erottamaan mikropartikkeleiden pinnasta lähtevän valoemis-sion mikropartikkelien ympäristössä olevasta liuoksesta lähtevästä valoemissiosta. Tämä erottelukyky perustuu siilo hen, että kun suspensiota laimennetaan huomattavasti, sopii mikrofosforometrin fokusalueeseen kerrallaan vain yksi mik-ropartikkeli ja liuoksessa olevien vapaiden leimattujen reagenssien aiheuttama taustasignaali on vähäinen. Tällä menetelmällä saavutetaan riittävä vapaan ja sidotun frak-15 tion erottelukyky, mutta mikäli on välttämätöntä, erottelua voidaan tehostaa millä tahansa tunnetulla erotusmenetelmällä kuten pesulla, suodatuksella tai sentrifugoinnilla.

Alan ammattimiehelle on selvää, että keksinnön erilaiset sovellutusmuodot voivat vaihdella jäljempänä esitettävien 20 patenttivaatimusten puitteissa.

Claims (5)

10 90695

1. Biospesifinen moniparametrinen määritysmenetelmä, jossa käytetään ennakolta valmistettuja, eri luokkiin jaettuja ja eri analyyttejä edustavia mikropartikkeleita, jossa eri luokkiin kuuluvat mikropartikkelit sisältävät eri määriä 5 fluoresoivaa väriainetta ja jossa eri luokkiin kuuluvat mikropartikkelit on päällystetty eri analyyttejä sitovilla biospesifisillä reagensseillä, jossa - eri luokkiin kuuluvat mikropartikkelit sekoitetaan yhteen suspensioksi ja analysoitava näyte lisätään tähän suspen- 10 sioon, - suspensioon lisätään biospesifisten leimattujen sekun-däärireagenssien seos, jolloin alkaa bioaffiniteetin johdosta sitoutumisreaktio analyyttimolekyylien, leimattujen sekundäärireagenssien ja mikropartikkeleihin liitettyjen 15 reagenssien välillä, - suspensio laimennetaan vapaiden leimattujen reagenssien pitoisuuden alentamiseksi, - fluoresoiva väriaine viritetään valonsäteilyllä ja fluo-resenssiemission voimakkuus mitataan jokaisesta partikke- 20 lista erikseen, - fluoresenssisignaali muunnetaan sähköiseksi signaaliksi mikropartikkeliluokan tunnistamista varten fluoresenssisig-naalista saadun sähköisen signaalin voimakkuuden perusteella, 25 tunnettu siitä, että sekundäärireagenssien seos on leimattu fosforoivalla molekyylillä ja kunkin mikropartikkelin fosforesenssiemissio mitataan aikaerotteisen fotoni-ilmaisimen avulla ja ilmaisimelta saadun sähköisen signaalin voimakkuuden perus- n 90695 teella analysoidaan jokaiseen mikropartikkeliin liittyneen analyyttimolekyylin määrä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että mikropartikkeleiden sisältämä 5 fluoresoiva aine on erittäin lyhytikäistä fluoresenssiemis-siota aiheuttava yhdiste.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sekundäärireagenssin leimana käytetään platinakoproporfyriinin tai palladiumkoproporfy- 10 riinin johdannaista.

4. Reagenssipakkaus biospesifistä moniparametristä määritystä varten, jossa on ennakolta valmistettuja, eri luokkiin jaettuja ja eri analyyttejä edustavia mikropartikke-leita, jossa eri luokkiin kuuluvat mikropartikkelit sisäl- 15 tävät eri määriä fluoresoivaa väriainetta ja jossa eri luokkiin kuuluvat mikropartikkelit on päällystetty eri analyyttejä sitovilla biospesifisillä reagensseillä ja jossa on eri analyyttejä vastaavia biospesifisiä sekundää-rireagensseja, tunnettu siitä, että biospesifiset 20 sekundäärireagenssit on leimattu fosforoivalla molekyylillä.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen reagenssipakkaus, tunnettu siitä, että biospesifiset sekundäärireagenssit on leimattu platinakoproporfyriinin tai palladium- 25 koproporfyriinin johdannaisella. 12 90695