FI89837B - Biospecifik bestaemningsmetod - Google Patents

Description

8 9 8 3 7

BIOSPESIFINEN MÄÄRITYSMENETELMÄ - BIOSPECIFIK BESTÄMNINGS-METOD

Immunomääritys on vakiintunut biospesifinen määritysmenetelmä ja sen eri sovellutuksia käytetään laajalti rutiini-diagnostiikassa ja tutkimuslaboratorioissa. Toinen biospesif isten määritysten ryhmä, joskin vielä kehityksen alaise-5 na oleva, on DNA- ja RNA-hybridisaatiomääritys. Biospesifi-sissä määrityksissä käytetään yleensä kahta biospesifistä reagenssia, primäärireagenssia ja sekundäärireagenssia (esim. vasta-ainetta, DNA- tai RNA-koetinta), jotka kumpikin sitoutuvat analyyttimolekyylin spesifisiin determinantit) teihin muodostaen kolmen molekyylin kompleksin (kerrosra-kenteen) ja normaalisti toinen näistä reagensseista on leimattu. Nykyisin käytettyjä leimoja ovat radioisotoopit, entsyymit, luminoivat leimat ja fluoresoivat leimat.

Rutiinidiagnostiikassa on jatkuvasti kasvava moniparametri-15 sen analytiikan tarve. Valitettavasti nykyiset menetelmät eivät salli useamman kuin kahden tai kolmen samanaikaisesti mitattavan leiman käyttöä, koska näiden eri leimojen antamien signaalien spektrometrinen erottelu ei ole mahdollista riittävällä tarkkuudella. Eri radioisotooppien tai fluore-20 soivien leimojen emissiospektrit peittävät huomattavasti toisiaan ja sen seurauksena eri analyyttien erottelu samasta näytteestä on huonoa vaaditulla pitoisuusalueella.

Tämän keksinnön tarkoituksena on esittää parempi menetelmä moniparametrisiin biospesifisiin määrityksiin sekä menetel-25 mässä käytettävä reagenssipakkaus.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on luonteenomaista seu-raavat vaiheet: - Valmistetaan etukäteen mikropartikkeleita, jotka on jaettu eri luokkiin vastaten kysymykseen tulevia eri ana-30 lyyttejä siten, että nämä eri luokkien mikropartikkelit sisältävät eri määriä fluoresoivaa väriainetta.

2 Ö9S37 - Nämä eri luokkiin kuuluvat mikropartikkelit päällystetään kysymykseen tulevia analyyttejä sitovilla biospesifisillä primäärireagensseilla ja sen jälkeen mikropartikkelit sekoitetaan keskenään suspensioksi.

5 - Eri analyyttejä sitovat biospesifiset sekundäärireagens- sit leimataan molekyylillä, joka synnyttää tai katalysoi kemi- tai bioluminisenssia ja nämä reagenssit sekoitetaan keskenään.

- Mikropartikkelisuspensioon lisätään määritettävä näyte ja 10 biospesifisten sekundäärireagenssien sekoitus, jonka jälkeen alkaa eri analyyttimolekyylien, mikropartikkeleihin sitoutuneiden reagenssien ja leimattujen biospesifisten reagenssien välillä sitoutumisreaktio.

- Sitoutumisreaktio lopetetaan lisäämällä laimenninta ja 15 samalla laimennetaan mikropartikkeleihin sitoutumattomien leimattujen biospesifisten reagenssien pitoisuus.

- Mikropartikkeleiden sisältämää fluoresoivaa väriainetta viritetään valonsäteellä ja sitten mitataan fluoresenssi-emission voimakkuus, jonka perusteella voidaan määrittää 20 ko. mikropartikkelin luokka.

- Fluoresenssiemission sammuttua täydellisesti mikropartikkeleihin sitoutunut luminoiva leima aktivoidaan lisäämällä suspensioon aktivaattori.

- Aktivaattorin lisäyksen seurauksena syntynyt luminesenssi 25 mitataan fotoni-ilmaisimella, jonka antama sähköinen signaali on verrannollinen ko. analyytin pitoisuuteen.

Keksinnön kohde ilmenee tarkemmin patenttivaatimuksista.

Tämän keksinnön tarkoituksena on esittää menetelmä monipa-rametrisen biospesifisen määrityksen toteuttamiseksi ja li 3 «9^37 esitetty menetelmä perustuu fluoresoivien mikropartikkelei-den ja luminoivan leiman käyttöön ja erityisesti siihen, että fluoresenssisignaali ja luminesenssisignaali voidaan mitata laajalla dynamiikka-alueella ilman, että ne häirit-5 sevät toisiaan, koska emissiot tapahtuvat oleellisesti eri aikoina. Tämä moniparametrinen määritys suoritetaan keinotekoisesti valmistettujen mikropartikkeleiden suspensiossa, joka on eri luokkiin kuuluvien ja eri analyyttejä sitovien mikropartikkeleiden sekoitus. Jokaiseen eri luokkaan kuulu-10 vat mikropartikkelit päällystetään ensin spesifisellä pri-määrireagenssillä (vasta-aine, DNA, RNA) eli mikropartikkelit toimivat näiden reagenssien ja biospesifisen reaktion kiinteänä kantajana. Tälle keksinnölle on luonteenomaista erityisesti se, että siinä käytetään mikrofotometristä 15 tekniikkaa mikropartikkeleiden luokan ja samalla analyytin tunnistamiseksi fluoresoivan väriaineen avulla sekä lu-mini-senssiin perustuvaa mittausta varten analyytin pitoisuuden määrittämiseksi mikropartikkeleiden pinnalta biospesif isen reaktion avulla.

20 Tasakokoisia mikropartikkeleita läpimitaltaan 1-200 μιη (rajoittumatta kuitenkaan näihin kokoihin) voidaan valmistaa sopivasta polymeeristä, joka on siinä määrin hydrofii-listä, että ne sopivat hyvin vesisuspensioon. Mikropartikkeleiden pintaominaisuudet sallivat makromolekyylien sito-25 misen niihin fysikaalisen adsorption tai kovalentin sidoksen avulla aktivoimalla pinnan OH-ryhmiä (L. Johansen et ai., J. Immunol. Methods 59, 255-264, 1983). Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä näytettä, jossa ovat siis kaikki kyseeseen tulevat analyytit, inkuboidaan sekundääri-30 reagenssien seoksen kanssa mikropartikkelisuspensiossa mahdollisimman pienessä (esim. 10-100 μΐ) tilavuudessa, jotta saavutettaisiin mahdollisimman täydellinen reaktio lyhyessä ajassa. Koska mikropartikkelisuspensiossa tapahtuvassa reaktiossa analyyttimolekyylien ja leimattujen rea-35 genssien keskimääräinen etäisyys on hyvin pieni, voidaan reaktiotasapaino saavuttaa nopeasti ja sen seurauksena syntyy mikropartikkeleiden pinnalla olevien reagenssien H 9 n / 7 4 yhteyteen leimatusta reagenssistä ja analyytistä muodostuvia komplekseja. Tällaista rakennetta kutsutaan kirjallisuudessa yleisesti kerrosrakenteeksi. Jos inkubaatioajät voidaan säätää tarkasti, ei ole tarvetta ajaa reaktiota 5 päätepisteeseen. Inkubaation jälkeen suspensio laimennetaan riittävästi vapaan leimatun sekundäärireagenssin pitoisuuden alentamiseksi ja yksittäisten mikropartikkelei-den pinnalla olevien leimattujen kompeksien määrä mitataan luminometrisesti. Useimmiten riittää yhden kertaluvun 10 suuruinen laimennus riittävän tehokkaaseen sitoutuneen ja vapaan leimatun reagenssifraktion antamien signaalien erottamiseksi toisistaan, koska tässä menetelmässä käytetty mikroluminometrinen ilmaisin pystyy optisesti erottamaan mittauskammion fokuspisteessä olevan mikropartikkelin 15 luminesenssiemission sen ympäristössä olevan vapaan leimatun reagenssin antamasta signaalista. Mikropartikkeleita analysoidaan tilastollisesti riittävä määrä ja kunkin partikkelin luminesenssisignaalin voimakkuus rekisteröidään tietokoneelle.

20 Raportteja, jotka kuvaavat moniparametrisien biospesifisien määrityksien periaatteita on esitetty aikaisemminkin.

Useimmissa tapauksissa moniparametrinen menetelmä on kuitenkin perustunut sellaisten kiinteiden reaktioalustojen käyttöön, joissa biospesifiset reagenssit voidaan kiinnit-25 tää toisistaan erillään oleviksi, ja optisesti erotettaviksi alueiksi (esim. PCT WO 84/01031). Myös on julkaistu keinotekoisesti valmistettujen mikropartikkelien käyttöön perustuva moniparametrinen biospesifinen määritysmenetelmä, jossa analyyttiluokan tunnistus perustuu erikokoisten 30 mikropartikkeleiden käyttöön ja tunnistus tapahtuu mittaamalla optisesti analysoitavana olevan partikkelin halkaisija. US-patentissa no 5,028,545 on esitetty menetelmä, jossa käytetään lyhytikäistä fluoresenssia lähettävää väriainetta mikropartikkeleiden tunnistamiseen ja pitkäikäistä fluo-35 resenssia lähettävää väriainetta analyyttien pitoisuuksien mittaamiseen.

I; 89837 5 Tässä keksinnössä esitetyn mittausmenetelmän herkkyys perustuu siinä käytettävien luminesenssireagenssien ja niiden yhteydessä tarvittavien kofaktorien ja entsyymien pitoisuuksien optimointiin. Tässä menetelmässä voidaan 5 käyttää joko kerniluminesenssiä (esim. peroksidaasi - lu-minoli) tai bioluminesenssia (esim. lusiferaasi - lusife-riini) (kumpaakin nimitetään tässä tekstissä "luminesens-siksi"). Sekä prokaryoottien lusiferaasit (esim. Vibrio, Photobacterium, Xenorhabdus jne.) sekä eukaryoottien lusi-10 feraasit (esim. Photinus pyralis, Pyrophorus plagiothala-mus, Lampyris noctiluca, Pholas dactylus, Vargula hilgen-dorfii, jne.) voidaan titrata yhteen niiden substraattien (lusiferiinien), tarpeellisten koentsyymien ja lisäentsyy-mien kanssa siten, että näytteestä saatava valoemissio on 15 lyhytaikainen voimakas valopulssi jatkuvan valon tuoton sijasta. Lisäksi voidaan käyttää fotoproteiinien kuten aequoriinin, obeliinin, folasiinin tai ofiofilisiinin optimaalisia pitoisuuksia. Jos luminesenssireaktio tapahtuu entsyymin pinnalla tai läheisyydessä, voidaan myös käyttää 20 peroksidaaseja tai oksidaaseja yhdessä luminolin tai akri-diinien (esim. lusigeniinin) kanssa riittävän voimakkaan luminesenssisignaalin kehittämiseksi tässä patentissa kuvattua mittausmenetelmää varten. Nämä luminoivat leimaus-menetelmät yhdessä valoemission vahvistimien ja modulaatto-25 reiden kanssa, jotka määräävät emission aallonpituuden ja kinetiikan jne., on kuvattu yksityiskohtaisesti kirjassa: Campbell, A. "Chemiluminescence; principles and applications in biology and medicine", Weinheim; Deerfield Beach, FI.; VCH; Chichester: Horwood, 1988. On myös korostettava, 30 että edellä mainitut lusiferaasit ja fotoproteiinit voidaan yhdistää myös yhdistelmä-DNA -tekniikalla IgG:tä sitovaan proteiiniin A tai G (Nilsson, B. & Abrahamsen, L., in Methods Enzymol., voi. 185, pp. 144-161, 1990) tai suoraan spesifiseen yhdistelmä-DNA -tekniikalla valmistettuun 35 vasta-aineeseen kuten yksiketjuisiin vasta-aineisiin (Chis-well & McCafferty, TibTech, Voi 10, pp 80-84, 1992). Edellä mainitulla tavalla voidaan edelleen lisätä yllä mainittujen leimausmenetelmien soveltuvuutta tämän keksinnön mukaiseen 89837 6 määritysmenetelmään.

Tämän keksinnön mukainen menetelmä on kuvattu yksityiskohtaisemmin kuvassa 1 olevan esimerkkiluonteisen kaavion avulla, joka esittää laitteistoa, jolla tämän keksinnön 5 mukainen määritysmenetelmä on mahdollista suorittaa käytännössä. Alla olevat numerot viittaavat kuvan 1 komponentteihin. Nesteen käsittelyyn tarvitaan sopivia pumppuja ja venttiileitä, joita ei kuitenkaan ole merkitty kuvaan 1. Fluoresoivat mikropartikkelit, jotka edustavat eri analyyt-10 tejä, päällystetään eri analyyttejä sitovilla vasta-aineilla ja ne sekoitetaan yhteen samaksi puskuroiduksi suspensioksi säiliöön (1). 10 μΐ osuus seeruminäytteestä (2) ja 10 μΐ osuus biotiinilla leimattujen sekundäärivasta-ainei-den seoksesta (3) ja 10 μΐ osuus mikropartikkelisuspen-15 sios-ta (1) ruiskutetaan reaktiokyvettiin (4) ja inkuboi-daan 37°C lämpötilassa tarkasti säädetyn ajan kestäen useita minuutteja tai kauemmin. Mikropartikkelisuspensio laimennetaan tai pestään säiliössä 5 olevalla fosfaatti-puskuroidulla suolaliuoksella, jossa on lisäksi naudan seeru-20 min albumiinia (100 mM Na-K-phosphate, pH 7.4, 0.9% NaCl, BSA 1 mg/ml). Pesun aikana mikropartikkelit ovat liikkumattomassa tilassa reaktiokyvetissä joko suodattimen, magneettisten voimien tai muun vastaavan menetelmän avulla kiinnitettyinä. Tulikärpäsen lusiferaasilla kovalenttisesti 25 leimatun streptavidinin puskuroitu liuos (6) ruiskutetaan reaktiokyvettiin (4) biotiinin saamiseksi luminesenssimää-ritykselle sopivaan muotoon. Mikropartikkeleiden suspensio johdetaan sitten kapillaariseen fluoresenssi-ilmaisimen kyvettiin (7), jota valaistaan monokromaattisella valoläh-30 teellä (8) mikropartikkeleiden luokan määrittämistä varten fluoresenssi-ilmaisimen (9) antaman signaalin voimakkuuden perusteella. Sen jälkeen sama suspensio johdetaan kapillaariseen luminesenssi-ilmaisimen kyvettiin (10) yhdessä Siihen ruiskutetun aktivointiliuoksen (11) kanssa, joka 35 sisältää 0.1 M TRIS-C1, pH 7.75, 0.1 mM D-Luciferiiniä, 0.1 mM ATP, 1 μΜ pyrofosfaattia, 1 mM MgCl2 ja 1 μΜ koentsyymi A. Tämä liuos aktivoi luminesenssireaktion ja emittoituvat fotonit lasketaan fotoni-ilmaisimella (12), joka on opti-

II

% 9 8 3 7 7 sesti yhdistetty ilmaisinkyvettiin. Eri mikropartikkeleille saadut fotonilaskimen lukemat ovat verrannollisia seeruminäytteessä olevien eri analyyttien pitoisuuksiin.

Tämän keksinnön mukainen menetelmä ja siihen tarvittava 5 laitteisto voidaan toteuttaa käytännössä monella eri tavalla. Keksinnössä on kuitenkin oleellista se, että jokainen erillinen mikropartikkeli, joka edustaa eri analyyttiluok-kaa, tunnistetaan ja mitataan erikseen ja näin voidaan suorittaa moniparametrinen biospesifinen määritys samasta 10 näytteestä. Tunnistaminen perustuu fluoresenssimittauk- seen, kuten yllä on esitetty. Sopivalla mittausjärjestelyllä voidaan suhteellisen lyhytikäinen fluoresenssiemissio ja luminesenssi erottaa toisistaan, koska niiden valoemissiot tapahtuvat eri aikoina ja fluoresenssiemissio on täydelli-15 sesti loppunut, ennen kuin luminesenssireaktio aktivoidaan eikä se aiheuta merkittävää häiriötä analyytin pitoisuuden määrittämiseen luminesenssin avulla. Keksinnön oleellinen sisältö on juuri tässä.

Fluoresoivia mikropartikkeleita voidaan valmistaa yhdistä-20 mällä sopiva fluoresoiva yhdiste polymeerimateriaaliin. Orgaanisia fluoresoivia yhdisteitä, esim. POPOP, bisMSB jne., fluoresoivia lantanidikelaatteja ja fluoresoiviaa epäorgaanisia mikrokiteitä voidaan lisätä monomeereihin mikropartikkeleiden valmistuksen yhteydessä ("Theory and 25 Practice of Scintillation Counting", Ed. J.B. Birks, Perga-mon Press, 1967, pp. 321-353) ja näin polymerisaatiossa muodostuu kiinteää fluoresoivaa materiaalia. Tärkeä näkökohta fluoresoivan yhdisteen valinnassa on, ettei sen valon absorptioalue satu samalle alueelle kuin luminesenssin 30 emissio. Materiaali prosessoidaan mikropartikkeleiksi samassa prosessissa. Mikropartikkelien tunnistamiseen käytettävää yhdistettä lisätään eri valmistuseriin eri suuruisia määriä siten, että muodostuu mikropartikkeleita, joiden fluoresenssivoimakkuus eroaa toisistaan oleellisesti 35 ja esim. kertoimella kaksi.

8983? 8

Mikropartikkeleiden analysointi voidaan suorittaa kapillaa-risessa mittauskammiossa joko pysäyttämällä virtaus tai virtauksen ollessa käynnissä. Mittausinstrumentissa tapahtuu mikropartikkeleiden mikrofotometrinen havannointi 5 ohuessa mittauskyvetissä, johon laimennettu mikropartikke-lisuspensio johdetaan. Mikropartikkelisuspensiota mitataan ensin fluoresenssi-ilmaisimella ja kunkin mikropartikkelin analyyttiluokan määritys tapahtuu fluoresenssin voimakkuuden perusteella. Seuraavaksi suspensio aktivoidaan ruiskut-10 tamalla sisään luminesenssiaktivaattori. Analyytin pitoisuuden määritys tapahtuu luminesenssivoimakkuuden mittauksen avulla. Mittauskyvetin apertuuri valitaan optimaalisesti käytetyn mikropartikkelin suuruuden mukaan ja lumine-senssiemissio mitataan valomonistinputkella tai muulla 15 herkällä fotoni-ilmaisime11a tai sopivalla kuvailmaisimellä. Ilmaisimena voidaan käyttää myös mikrokanavakuvavahvistinta ja puolijohdekuvailmaisinta (CCD). Riittävä lukumäärä mikropartikkeleita tunnistetaan ja analysoidaan tilastollisesti riittävän tarkan tuloksen saamiseksi jokaiselle ana-20 lyytille. Mittaustulokset suhteutetaan standardinäytteillä suoritettuihin mittauksiin, joiden perusteella lopputulokset lasketaan.

Tälle keksinnölle on myös luonteenomaista, että tässä esitetty mikroluminometrinen mittausjärjestelmä pystyy 25 optisesti erottamaan mikropartikkeleiden pinnasta lähtevän valoemission liuoksesta lähtevästä valoemissiosta. Tämä erottelukyky perustuu siihen, että kun suspensiota laimennetaan huomattavasti, sopii mikroluminometrin fokusaluee-seen kerrallaan vain yksi mikropartikkeli ja liuoksessa 30 olevien vapaiden leimattujen reagenssien aiheuttama taus-tasignaali on vähäinen. Tällä menetelmällä saavutetaan riittävä vapaan ja sidotun fraktion erottelukyky, mutta mikäli on välttämätöntä, erottelua voidaan tehostaa millä tahansa tunnetulla erotusmenetelmällä kuten pesulla, suoda-35 tuksella tai sentrifugoinnilla.

li

Claims (4)

9 H 9 o X 7

1. Biospesifinen moniparametrinen määritysmenetelmä, jossa käytetään ennakolta valmistettuja, eri luokkiin jaettuja ja eri analyyttejä edustavia mikropartikkeleita, jossa eri luokkiin kuuluvat mikropartikkelit sisältävät eri määriä 5 fluoresoivaa väriainetta ja jossa eri luokkiin kuuluvat mikropartikkelit on päällystetty eri analyyttejä sitovilla biospesifisillä reagensseillä, jossa - eri luokkiin kuuluvat mikropartikkelit sekoitetaan yhteen suspensioksi ja analysoitava näyte lisätään tähän suspen- 10 sioon, - suspensioon lisätään biospesifisten, leimattujen sekun-däärireagenssien seos, jolloin alkaa biospesifinen sitoutu-misreaktio analyyttimolekyylien, leimattujen sekundääri-reagenssien ja mikropartikkeleihin liittyneiden reagenssi- 15 en välillä, - suspensio laimennetaan vapaiden leimattujen reagenssien pitoisuuden alentamiseksi, - fluoresoiva väriaine viritetään valonsäteilyllä ja fluo-resenssiemissiovoimakkuus mitataan jokaisesta partikkelis- 20 ta erikseen, - fluoresenssisignaali muunnetaan sähköiseksi signaaliksi mikropartikkeliluokan tunnistamista varten fluoresenssi-signaalista saadun sähköisen signaalin voimakkuuden perusteella, 25 tunnettu siitä, että - sekundäärireagenssien seos on leimattu luminesenssia synnyttävällä tai katalysoivalla molekyylillä, ja - fluoresenssiemission mittauksen jälkeen suspensioon 89837 10 lisätään aktivaattori, joka synnyttää tai katalysoi lu-minesenssia mikropartikkeleiden pinnalla ja saa aikaan lu-minesenssiemission ja - luminesenssiemissio mitataan optisesti erottelevan foto-- 5 ni-ilmaisimen avulla ja ilmaisimelta saadun sähköisen signaalin voimakkuuden perusteella analysoidaan jokaiseen mikropartikkeliin liittyneen analyyttimolekyylin määrä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että mikropartikkeleiden fluore- 10 soiva aine on erittäin lyhytikäistä fluoresenssiemissiota aiheuttava yhdiste kuten POPOP tai bisMSB.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että mikropartikkeleiden fluoresoiva aine on pitempi-ikäistä fluoresenssiemissiota aiheut- 15 tava yhdiste kuten lantanidikelaatti tai fluoresoiva epäorgaaninen mikrokide.

4. Reagenssipaketti biospesifistä moniparametristä määritystä varten tunnettu siitä, että se käsittää erillisinä pakkauksina 20. ennakolta valmistettuja, eri luokkiin jaettuja ja eri analyyttejä edustavia mikropartikkeleita, jossa eri luokkiin kuuluvat mikropartikkelit sisältävät eri määriä fluoresoivaa väriainetta ja jossa eri luokkiin kuuluvat mikro-partikkelit on päällystetty eri analyyttejä sitovilla 25 biospesifisillä reagensseillä, - biospesifisten luminesenssia synnyttävällä tai katalysoivalla molekyylillä leimattujen sekundäärireagenssien seoksen ja - aktivaattorin, joka synnyttää tai katalysoi luminesens- 30 siä mikropartikkeleiden pinnalla ja saa aikaan luminesens- siemission. I: 1X 8 9837