CN114341621A - 用于检测分析物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于检测样品中的分析物的方法，该方法包括以下步骤：一种用于检测样品中的分析物的方法，该方法包括以下步骤：(i)向一种装置提供包括样品和报告试剂的混合物，该装置包括具有光学组件和连接在基板表面上的结合组件的基板；(ii)通过结合组件，使一部分报告试剂根据分析物的浓度成比例地结合到基板表面；(iii)用电磁辐射辐照所述装置以进行报告试剂的光敏剂的吸收，使得结合的报告试剂部分的光敏剂与光学组件相互作用以使光学组件从第一光学状态变化为第二光学状态，从而在基板上形成具有第二光学状态的光学组件的局部区域集；以及(iv)检测基板上具有第二光学状态的局部区域集。

Description

用于检测分析物的方法

本发明涉及一种用于检测分析物的方法，尤其涉及一种用于检测由于样品中存在分析物而导致的各个结合事件的方法。

有许多技术可用于测量人样品(例如血液、血浆、血清、组织等)中的生物学相关参数。一种常见的方法是使用与目的目标结合的捕获试剂和具有某种标签的报告试剂。捕获试剂可以结合至固相，例如微量滴定板、小珠或膜。当样品与捕获试剂一起孵育时，分析物与捕获试剂结合。报告试剂也与分析物结合。然后可以(通过洗涤)除去过量的报告物(reporter)，并且可以测量报告试剂的量，从而测量样品中存在的分析物的量。关于如何进行这些类型的结合测定有许多不同的变化。例如，分析物可以先与捕获试剂结合，然后可以在单独的步骤中添加报告物，或者分析物可以先与报告物结合，然后再与捕获剂结合。

存在许多种试剂可在这种类型的结合测定中用作捕获物和报告物，包括核酸、碳水化合物、抗原、肽、蛋白质和抗体。还存在许多种目标分析物，包括肽、蛋白质、抗体、核酸、细胞、碳水化合物、小分子、治疗药物、滥用的药物、类固醇、激素、脂质等。

使用抗体的测定通常称为免疫测定。免疫测定可以采用多种格式。例如，当捕获抗体用于捕获分析物并且报告抗体用于产生可测量的信号时，这通常称为夹心免疫测定。替代的格式是已知的，其中结合剂连接至固相并且目标分析物在溶液中与也结合至结合剂的标记试剂竞争。在不存在分析物的情况下，由于结合了高水平的标记试剂，因此获得了高信号。在存在分析物的情况下，一部分结合位点被阻断，因此结合了较少的标记试剂并且信号减弱。这些测定通常称为抑制或竞争测定。几种类型的竞争测定是已知的。例如，抗体可以与固相结合，并且标记的分析物(或分析物的类似物)可以竞争抗体上的结合位点。或者，可以固定分析物的类似物，并且标记的抗体可以结合到该表面。在样品中存在分析物的情况下，这将与溶液中的抗体结合，从而阻止与表面的结合，并且信号会减弱。

测定有许多格式，以及可以使用许多不同类型的标记物。例如，测定可以是非均相的，因为在进行测量之前，例如通过使用洗涤步骤除去过量的标记物。也可以通过使样品和报告物流动经过捕获区域来实现除去过量的标记物。这种方法用在免疫层析或横向流动条带中，其例如用在用于传染病测试和妊娠测试的快速测试中。或者，均相测定是已知的，其中没有将过量的报告物除去。均相测定倾向于依赖捕获物和报告物的紧密接近，从而产生某种形式的信号。均相测定的一个实例是凝集测定，其中颗粒在溶液中结合在一起。凝集的颗粒引起光的散射，这可以通过比浊法或浊度法测量。使用颗粒的均相测定的另一个实例是发光氧通道免疫测定(LOCI)，下文将进一步详细描述。

均相测定的另一个实例是荧光共振能量转移(FRET)，其中捕获试剂和报告试剂分别是供体和受体荧光团，供体的激发导致能量转移到受体，接着是光发射。

一种在全血中起作用而不除去细胞物质的均相测定格式是热光免疫测定(pyro-optical immunoassay)。捕获抗体包被在热电聚偏乙烯PVDF传感器上，碳颗粒用作报告物。通过用光照射样品产生信号，导致颗粒局部加热。与传感器结合的那些将能量转移给热电传感器，导致被检测为电信号的热应力。碳结合的越多，信号越大。

连接至报告结合剂的标记物可以是吸收光的试剂，例如染料、金颗粒或染色的胶乳微球。原则上，较大的颗粒可以吸收更多的光，并且产生更多的信号。然而，如下文更详细地描述的，存在尺寸限制，使得颗粒标记物不能用在测定中。发光标记物也是已知的，例如荧光、化学发光、生物发光和电化学发光标记物。发光标记物也已被包封在颗粒中以用于某些类型的测定。信号的放大也可以通过使用酶促反应或催化反应来进行。可将酶用于使底物从无色染料转化为有色形式，或转化为荧光或发光形式。在添加底物之前，通常使用洗涤步骤除去过量的酶，以使得信号仅是由与分析物特异性结合的酶产生的。

不使用标记物的免疫测定也是已知的，例如使用表面等离子共振作为信号转导方法的测定。然而，无标记物测定倾向于缺乏使用标记物来增强信号的测定的灵敏度。

有关免疫测定领域的更多信息，请参见“The Immunoassay Handbook:4thEdition:Theory and Applications of Ligand Binding,ELISA and RelatedTechniques”,Ed.D.Wild,Elsevier Science,2013。

所有的结合测定(包括免疫测定)，在可以可靠测量的分析物的最小和最大浓度方面都有限制。

信号最大值通常受诸如可用于结合分析物的捕获抗体的总量和产生信号的报告抗体的总量等因素的限制。如果捕获抗体固定在固相上，那么固相的表面积会限制检测的上限。此外，某些信号转导技术可能容易饱和，例如比色法，这取决于光通过样品时需要经过的路径长度。发光方法不易饱和，因为可以衰减检测器上的增益以处理更高水平的光发射。当非均相测定中的所有抗体结合位点都充满分析物时，则达到最大信号并且系统已饱和。通常会在洗涤步骤中除去过量的分析物，然后添加报告物。均相测定也可能受到称为高剂量钩状效应的影响，其中分析物的浓度大于捕获和/或报告抗体的有效浓度。在这种情况下，在非常高的浓度下，捕获物和报告物上的所有结合位点都可能被阻断，检测信号可能会减弱，从而产生错误的结果。

较低的检测水平由许多不同的因素决定。通常，所有测定都会受到属性的影响，例如所用抗体的质量(亲和力和特异性)以及抗体与相关分析物的交叉反应性。检测下限还取决于测定装置和影响系统设计信噪比的因素。例如，在标准的酶联免疫吸附测定(ELISA)中，捕获抗体包被在96孔微量滴定板的表面上，然后样品在孔中孵育，从而捕获分析物。洗涤孔，然后加入过量的报告物，与捕获的分析物结合。然后洗去过量的报告物，并添加可以与酶反应的底物，将其转化为活性形式。例如，在过氧化氢的存在下，通过辣根过氧化物酶可以将没有颜色的无色染料(例如2,2'-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS))转化为氧化的绿色形式。当分析物以非常低的量存在(例如小于1皮摩尔)时，只有非常少量的酶结合到孔的表面。ABTS与酶反应生成绿色形式，然后扩散到大部分流体中，生成一种稀释到无法与背景信号区分开来的溶液。底物的自动转换也会产生干扰测量的颜色。类似地，其他检测方法(例如荧光)可能会受到干扰因素和样品或反应孔中组分的自发荧光的影响。

免疫测定中的另一个混杂因素可能是报告试剂与捕获表面的非特异性结合。例如，在上述ELISA测定中，在微量滴定孔上包被一层蛋白质，其中一些蛋白质在包被过程中会变性。在测定过程中，报告物结合到捕获表面的区域并不少见。如果该报告物转换(turnover)底物以对整体信号做出贡献，则无法区分特异性结合报告物的信号与非特异性结合报告物的信号。非特异性结合也可以被原始样品中存在的许多组分所促进，它们可以在初始孵育过程中与捕获表面结合，从而改变捕获层的表面特性，形成可以结合报告物的表面。减少报告物的非特异性结合，包括仔细优化测定过程中使用的所有试剂和反应条件，包括抗体、洗涤剂、温度和离子强度。

通常，传统免疫测定的检测限约为0.1皮摩尔至1纳摩尔，取决于测定方法。使用传统方法开发检测限极低的检测方法通常需要大量的优化，并采用严格的洗涤步骤来减少非特异性结合并使信噪比最大化。此外，与样品体积相比，捕获表面通常较小，以确保与背景相比，信号足够高。

一种用于克服与信噪比相关的问题并提高检测限的方法是测量单个结合事件，如果测量值高于局部阈值，则将这些结合事件计作“开启”或“关闭”事件。通过这种方式，可以消除大部分背景噪声。可以通过音频或通信信号的数字化来进行类比。这些数字化的测定已被证明达到了以前使用传统模拟方法无法达到的检测限。例如，已经报道了在低的飞摩尔(10^-15mol/L)以及甚至渺摩尔(10^-18mol/L)范围内的检测限。参见例如“Evaluation ofhighly sensitive immunoassay technologies for quantitative measurements ofsub-pg/mL levels of cytokines in human serum”,Yeung et al.,Journal ofImmunological Methods,2016,437,53和“Digital Detection of Biomarkers Assistedby Nanoparticles:Application to Diagnostics”,Cretich et al.,Trends inBiotechnology,2015,33,343。

测定中使用的大多数标记物/报告物(例如荧光团、染料等)使用宽视场显微术无法单独看到，甚至在高放大倍率下也是如此，因为它们的尺寸低于可见光的衍射极限。因此，这些标记物的存在只能作为一种整体现象来测量，而不是通过计数每个标记物。相比之下，如果颗粒标记物(例如胶乳颗粒)高于一定尺寸，理论上可以通过宽视场光学显微术观察到。根据光学设置，当颗粒直径达到数百微米及以上时，可以开始观察到颗粒，具体取决于显微镜的数值孔径和类型。

然而，由于多种原因，使用这种尺寸的颗粒作为标记物来监测捕获表面上的各个结合事件(例如抗体-抗原相互作用)变得不切实际。例如，与其他类型的标记物相比，这种尺寸的颗粒扩散非常缓慢，从而降低了平坦表面的反应速率。它们也开始表现出宏观浮力效应，如果颗粒的密度与包含它们的介质显著不同，它们会沉淀或漂浮，这也可能导致测定格式出现问题。这种尺寸的颗粒特别容易与表面非特异性结合，导致高背景，难以除去。最后，必须除去多余的颗粒，这需要清洗步骤。然而，大颗粒在存在流体流动的情况下开始受到剪切效应的影响，此时颗粒上的剪切力变得大于抗体-抗原相互作用的破裂强度(约60-250pN)，导致颗粒被冲走(参见“Rapid Femtomolar Bioassays in Complex MatricesCombining Microfluidics and Magnetoelectronics”,Mulvaney et al.,Biosensorsand Bioelectronics,2007,23,191)。

数字化测定的实例包括Quanterix单分子阵列(SIMOA)系统和Singulex单分子计数(SMC)系统。

Quanterix SIMOA系统使用抗体包被的顺磁小珠从溶液中捕获分析物。然后洗涤磁珠，并且加入酶标记的报告抗体。小珠的数量需足以使每个小珠具有多于一种分析物和报告物的可能性降至最低。再次洗涤小珠，然后装入每孔只能容纳一个小珠的微孔阵列中。微孔的体积为飞升级别。如果小珠连接有酶，则将孔中的荧光底物会被转换。孔的小尺度防止荧光产物变得过于分散。如果荧光高于阈值，则每个孔都被计为“开启”或“关闭”事件。

SMC系统用于Singlex Clarity仪器以及Merck Millipore的Erenna和SMCxPRO系统。这三个系统的基本测量技术是相同的。包被了捕获抗体的磁珠在夹心测定中用于捕获目标分析物。在分析物存在的情况下，荧光标记的报告抗体也与小珠结合。用磁铁将小珠拉下来，然后洗掉过量的荧光标记的报告物。然后加入洗脱缓冲液，导致夹心复合物解离，然后将其转移到测量容器中。然后使用共聚焦荧光显微镜测量荧光标记的存在，该显微镜依次从少量样品中获取数据(interrogate)以确定荧光标记是否存在。如果每个单独测量的信号高于阈值，则这将被视为该测量的“开启”事件。

几项关于高灵敏度免疫测定的独立学术综述强调，免疫测定的数字化方法可以前所未有地提高检测限(参见上文的参考文献Yeung and Cretich)。

Quanterix和Singlex系统的检测限取决于测定中使用的样品量。对于10微升血清或血浆样品，理论上的限制是检测单个结合事件，对应于1个分子。然而，就摩尔浓度而言，这相当于每升样品100,000个分子，或每升样品的浓度为0.16×10^-18摩尔(0.16渺摩尔)。

然而，上述的Quanterix和Singlex系统既复杂又繁琐，每个都需要许多清洗和转移步骤。此外，只能对不含细胞材料的样品进行测定，并且系统需要昂贵的仪器才能实现它们所提供的性能。因此，仍然需要更简单和更具成本效益的高灵敏度系统。

因此，本发明提供了一种用于检测样品中的分析物的方法，该方法包括以下步骤：

(i)向装置提供包含样品和报告试剂的混合物，该装置包括具有光学组件和连接至基板表面上的结合组件的基板；

(ii)通过结合组件，使一部分报告试剂根据分析物的浓度成比例地结合到基板表面；

(iii)用电磁辐射辐照该装置以进行报告试剂的光敏剂的吸收，使得结合的报告试剂部分的光敏剂与光学组件相互作用以使光学组件从第一光学状态变化为第二光学状态，从而在基板上形成具有第二光学状态的光学组件的局部区域集；以及

(iv)检测基板上具有第二光学状态的局部区域集。

因此，本发明提供了一种用于检测样品中的分析物的方法，其中仅在基板表面的邻近区域内的报告试剂会产生信号(处于第二光学状态的光学组件的局部区域)并且可以检测信号(处于第二光学状态的光学组件的局部区域集)。因此，本发明的方法简化了分析物的数字化检测。本发明的方法有利于对一系列样品进行均相测定，其中样品包括那些含有细胞材料的样品。

现在将参考附图来描述本发明，其中：

图1示出了可用于本发明方法的各种组件；

图2示出了辐照之前将报告试剂结合到基板表面的装置；

图3示出了辐照图2的装置；

图4示出了辐照之后的图3的装置；

图5示出了辐照之前存在全血样品和报告试剂的装置；

图6示出了辐照之后的图5的装置；

图7示出了在本发明的方法中使用的装置，其中在辐照之前，报告试剂通过结合组件根据分析物的浓度成比例地结合到基板的表面上；

图8示出了辐照之后图7的装置；

图9示出了用于检测的光学装置；

图10示出了创建的用于本发明的方法的基板和孔；

图11示出了使用图10的基板和孔创建的样品室；

图12示出了实施例5的检测结果；

图13示出了实施例6的检测结果；以及

图14示出了实施例7的检测结果。

本发明的方法用于检测样品中的分析物(其可以通过检测分析物的复合物或衍生物)。

图1的组件为：分析物1；光敏剂2；注入光敏剂的链霉亲和素包被的胶乳颗粒3；注入光敏剂的抗体包被的胶乳颗粒4；抗体5；光敏剂标记的抗体6；处于荧光状态的染料7；处于非荧光状态的染料8；聚合的链霉亲和素9；处于荧光状态的聚链霉亲和素染料缀合物10；处于非荧光状态的聚链霉亲和素染料缀合物11；生物素-BSA缀合物12；红细胞13；处于荧光状态的氨基葡聚糖-生物素-染料缀合物14；和处于非荧光状态的氨基葡聚糖-生物素-染料缀合物15。

本发明方法的步骤(i)包含向装置提供包括样品和报告试剂的混合物，该装置包括基板17，基板17具有光学组件和连接至基板17表面上的结合组件。样品和报告试剂可以在将混合物添加到装置之前预先混合，或者样品和报告试剂可以依次添加到装置中以形成混合物。该混合物还可以包含额外的试剂，但优选地，该混合物由样品和报告试剂组成。

通过解释本发明的基本原理，图2示出了一种装置，其中报告试剂在辐照之前结合到基板表面。该装置包括基板17和样品室16，样品室16用于容纳含有溶解或悬浮于其中的分析物的样品。基板可以是允许检测基板上的具有第二光学状态的局部区域集的任何基板。优选地，基板是透明的基板，更优选地，基板是玻璃。

基板17具有通过生物素-BSA缀合物12和聚合的链霉亲和素9连接至基板17表面上的氨基葡聚糖-生物素-染料缀合物14。染料作为光学组件，而生物素作为结合组件。生物素-BSA缀合物12和聚合的链霉亲和素9是惰性大分子，它们有助于将光学和结合组件连接至基板17的表面。当光学组件是水溶性的时可使用这种方法，因为光学组件需要被拴系在基板17的表面以使其被固定。

尽管以这种方式示出了光学和结合组件，但是用于将光学和结合组件保持在基板17的表面附近的任何技术都是适用的。例如，光学组件和结合组件可以是单独的试剂并且结合组件连接至光学组件上。

还可以将光学组件包封在聚合物层内，将该聚合物层涂覆在基板17的表面上，并且结合组件连接至聚合物层上。聚合物可以是硅树脂、聚苯乙烯或聚异丁烯，或可用于包封光学组件的任何其他适合的聚合物塑料。当光学组件不溶于水时，可以使用这种方法。

或者，凝胶/水凝胶层可以用光学组件浸渍，将凝胶/水凝胶层涂覆在基板17的表面上，并且结合组件连接至凝胶/水凝胶层上。

本发明方法的步骤(ii)包括通过结合组件使一部分报告试剂根据分析物的浓度成比例地结合到基板表面。这可以通过让设备静置一段时间来实现，例如10分钟。

在图2中，注入光敏剂的链霉亲和素包被的胶乳颗粒3是通过氨基葡聚糖-生物素-染料缀合物14上的生物素结合到基板17的表面。注入光敏剂的链霉亲和素包被的胶乳颗粒3作为报告试剂。

尽管显示报告试剂以这种方式结合到基板17的表面，但是当存在分析物时，报告试剂根据分析物的浓度成比例地结合到基板表面。例如，如果结合组件和报告试剂是抗体，且分析物是抗原，则报告试剂通过分析物结合至结合组件以形成所谓的“夹心”复合物，如下文中参考图7和图8所讨论的。

到目前为止，所有步骤都是在没有光线的情况下进行的。本发明方法的步骤(iii)包括用电磁辐射辐照装置以进行报告试剂的光敏剂的吸收，使得结合的报告试剂部分的光敏剂与光学组件相互作用以引起光学组件从第一光学状态变化为第二光学状态，从而在基板17上形成具有第二光学状态的光学组件的局部区域集。

图3示出了用电磁辐射(通常称为“光”)辐照图2的装置，优选可见光。光源例如可以是LED 18。光源用具有适当波长的光照射样品室16以激发光敏剂2。波长取决于光敏剂，但优选的波长为680nm。通常将该装置辐照至少30秒。优选地，该装置暴露于电磁辐射源超过1秒，更优选至少2秒，更优选至少5秒，更优选至少20秒，最优选至少30秒。这确保了基板表面上存在不可逆的光学变化，从而可以区分长期存在的和瞬时的结合事件。

图4示出了辐照之后的图3的装置。光敏剂2与氨基葡聚糖-生物素-染料缀合物的染料光学组件14相互作用以使染料从荧光状态变化为非荧光状态。处于荧光状态的氨基葡聚糖-生物素-染料缀合物14变成处于非荧光状态的氨基葡聚糖-生物素-染料缀合物15。只有紧邻光敏剂2的染料从第一光学状态变化为第二光学状态。

尽管显示染料从荧光状态变化为非荧光状态，但其他光学组件可发生替代变化。在一个实施方案中，光学组件在处于第一光学状态时吸收一个或多个波长的光，优选可见光，而光学组件在处于第二光学状态时吸收一个或多个其他波长的光，优选可见光。在本实施方案中，光学组件发生颜色变化。

在替代的实施方案中，当处于第一和第二光学状态中的一种时，光学组件是化学发光的，而当处于第一和第二光学状态中的另一种时，光学组件是非化学发光的。

替代的第一和第二光学状态可以包括光偏振、荧光寿命、折射率、光散射(包括拉曼散射)和其他光学效应的变化。

图5示出了一种装置，所述装置在辐照之前就存在全血样品和报告试剂。全血样品还包含额外的组分，例如红细胞13。优选地，基板17形成样品室16的顶部，其可以使红细胞13从基板17沉淀下来。

一部分报告试剂通过结合组件结合到基板17的表面。因此，样品在溶液中含有结合的报告试剂和游离的未结合报告试剂。样品室16的深度被设计成使报告试剂的扩散路径长度降至最低，并允许快速达到平衡。通常，样品室的深度为50至200μm。

然后如上所述辐照该装置，图6示出了辐照之后的图5的装置。光学组件的邻近区域内的任何光敏剂相互作用，导致光学组件从第一光学状态变化为第二光学状态。通过这种方式，结合的报告试剂部分的光敏剂与光学组件相互作用，以使光学组件从第一光学状态变化为第二光学状态，从而形成在基板17上具有第二光学状态的光学组件的局部区域集。

图7示出了在本发明的方法中使用的装置，其中在辐照之前，报告试剂通过结合组件根据分析物的浓度成比例地结合到基板表面。

在使用本发明方法的典型夹心免疫测定中，基板17具有通过生物素-BSA缀合物12连接至基板17表面上的聚链霉亲和素-染料缀合物11，以及连接至聚链霉亲和素-染料缀合物11上的抗体5。染料作为光学组件，而抗体作为结合组件。尽管以这种方式示出了光学和结合组件，但是用于将光学和结合组件保持在基板17的表面附近的任何技术都是适用的，例如上文所述的那些。

在本发明的方法中，样品室16填充有包含分析物1的样品。报告试剂例如光敏剂标记的抗体6也被添加到样品室16中。如果使用全血样品，则样品还可能包含其他组件，例如红细胞13。

然后达到平衡。光敏剂标记的抗体6通过抗体5根据分析物1的浓度成比例地结合到基板17的表面。光敏剂标记的抗体6作为报告试剂。包括过量的光敏剂标记的抗体6，使得所有的分析物1形成夹心复合物。因此，一部分报告试剂通过结合组件根据分析物1的浓度成比例地结合到基板17的表面。因此，样品在溶液中含有结合的报告试剂和游离的未结合报告试剂。

图8示出了辐照之后的图7的装置。光敏剂2与聚链霉亲和素-染料缀合物的染料光学组件11相互作用以使染料从非荧光状态变化为荧光状态。处于非荧光状态的聚链霉亲和素染料缀合物11变为处于荧光状态的聚链霉亲和素染料缀合物10。只有紧邻光敏剂2的染料从第一光学状态变化为第二光学状态。

报告试剂必须在整个辐照期间永久地结合到基板17的表面，以实现第一光学状态到第二光学状态的完全转换。溶液中任何未结合的报告试剂都不会导致光学组件从第一光学状态变化为第二光学状态。

这提供了优于其他数字化测定方法的显著优势，因为它无需洗涤步骤。通过这种方式，本发明的方法是均相测定。在常规测定中，在进行任何测量之前必须将未结合的报告试剂与结合的报告试剂分离，因为未结合的报告试剂会干扰由结合的报告试剂产生的信号。然而，由于本发明提供的局部表面变化，可以区分结合和未结合的报告试剂。实际上，区分接近基板17表面的报告试剂(即结合的)和本体溶液(bulk solution)中的报告试剂(即未结合的)的能力是本发明的一个特别优势。优选地，步骤(i)至(iii)在没有洗涤步骤的情况下进行，即实施该方法而未在步骤(i)、(ii)和(iii)中从基板中移除样品。

结合的报告试剂部分的光敏剂可以直接与光学组件相互作用以引起变化(例如，光敏剂被激发并将此能量直接转移给光学组件)或通过额外的试剂间接与光学组件相互作用以引起变化(例如，光敏剂被激发并将此能量转移给额外的组件，然后该组件将这个能量转移给光学组件)。

在一个优选的实施方案中，光敏剂的吸收是用于与混合物中存在的预活化剂(pre-activator)试剂相互作用从而产生活化剂试剂，并且活化剂试剂是用于与光学组件相互作用以从第一光学状态变化为第二光学状态。

预活化剂试剂可以存在于样品中，或者预活化剂试剂可以作为额外的试剂添加到样品和报告试剂的混合物中。在一个优选的实施方案中，预活化剂试剂是三线态氧。在另一个优选的实施方案中，活化剂试剂是活性氧簇(ROS)。优选地，ROS选自羟基自由基、超氧化物、过氧化物、有机过氧化物、过氧亚硝酸盐、单线态氧及其混合物。更优选地，活化剂试剂是单线态氧。单线态氧是优选的活化剂试剂，因为它的半衰期短且扩散路径长度有限(在水溶液条件下最长达200nm)。

尽管不希望受理论束缚，但认为光敏剂吸收光以产生激发态，该激发态可以与存在于样品中且接近报告试剂的氧发生系统间穿越(ISC)以产生单线态氧。然后单线态氧继续与光学组件相互作用，如下所述。在一个特别优选的实施方案中，预活化剂试剂是三线态氧并且活化剂试剂是单线态氧。

单线态氧以前已用于发光氧通道免疫测定(LOCI)中的免疫测定。LOCI免疫测定是一种使用供体和受体小珠的均相非数字化测定。供体小珠在以680nm照射时产生单线态氧，而受体小珠在被单线态氧激活时产生化学发光信号。抗体-抗原结合促进供体与受体小珠的结合。通常将反应混合物照射0.5至1.0秒，然后测量发光信号0.5至1.0秒。至关重要的是，测量是在所有未结合的供体和受体小珠存在的情况下进行的。小珠的空间分离使背景信号降至最低；然而，由于测量时间短，LOCI测定无法区分长期存在的和瞬时的结合事件。对于最敏感的测定，例如白细胞介素6(IL-6)或促甲状腺激素(TSH)，该测定可以达到约1-5pg/mL的检测限。本发明的方法甚至进一步使背景信号降至最低，因为“供体”颗粒(即报告试剂)需要靠近基板17的表面(而不是溶液中的颗粒)以便检测到信号，并且在照射期间也必须在那里。因此，本发明的方法比LOCI测定更灵敏并且可以检测更低浓度的分析物。

在一个优选实施方案中，光学组件为染料。优选地，所述光学组件选自以下染料及其混合物之一：

染料(1)-(5)是已知的，其可用作细胞探针以监测在氧化应激下细胞中的ROS形成。然而，这些染料不是已知可用于标准或数字化的免疫测定。染料(6)是一种常见的荧光染料。有许多其他的可商购获得并适用于本发明的荧光染料，包括Alexafluor染料、BODIPY染料、罗丹明(rhodamine)染料、德克萨斯红(Texas red)、俄勒冈绿(Oregon green)、喀斯喀特黄(Cascade yellow)、太平洋蓝(Pacific blue)等。更多实例参见The MolecularProbes Handbook,Thermo Fisher Scientific(分子探针手册，赛默飞世尔科技)。

染料单线态氧传感器绿色(singlet oxygen sensor greem，SOSG)(1)与单线态氧反应，将其从弱荧光形式转变为高荧光形式。单线态氧与蒽基反应形成内过氧化物。在一个优选的实施方案中，光学组件为SOSG。

染料硼-二吡咯亚甲基_581/591(BODIPY_581/591)(2)与活性氧簇(例如单线态氧和羟基自由基)反应，导致荧光激发/发射最大值的浅色移动。

染料(3)-(5)具有相同的核心结构，并与包括单线态氧在内的一般氧化剂反应，以将其转化为荧光形式。因此这些染料可以从无色状态转变为荧光状态。

已发现染料(6)与单线态氧反应以将其从荧光形式转变为非荧光形式。使用荧光素时，令人惊讶地发现可以完全消除光敏剂附近的荧光以在荧光基板上创建一个暗组件的、非荧光的区域。因此，在一个优选实施方案中，光学组件是荧光素。更优选地，光学组件是荧光素，第一光学状态是荧光的并且第二光学状态是非荧光的。最优选地，光学组件是荧光素，第一光学状态是荧光的，第二光学状态是非荧光的并且该局部区域集是基板上的暗的、非荧光的区域。

优选地，当处于第一和第二光学状态中的一种时，光学组件是荧光的，而当处于第一和第二光学状态中的另一种时，光学组件是非荧光的。在一个实施方案中，处于第一光学状态时的光学组件是非荧光的，而处于第二光学状态时的光学组件是荧光的。然而，更优选地，处于第一光学状态时的光学组件是荧光的，而处于第二光学状态时的光学组件是非荧光的。

在另一个优选的实施方案中，光学组件在处于第一光学状态时以一个或多个波长发出荧光，而光学组件在处于第二光学状态时以一个或多个其他波长发出荧光。在该实施方案中，光学组件改变其荧光激发/发射最大值。

优选地，从第一光学状态到第二光学状态的变化是不可逆的。这允许对基板进行后续扫描，以识别其中发生光学状态变化的区域。

本发明方法的步骤(iv)包括检测基板上具有第二光学状态的局部区域集。

具有第二光学状态的光学组件在基板上形成局部区域集。有利地，具有第二光学状态的局部区域可以计数作单独的结合事件。本发明的方法因此适用于进行数字化测定。然而，如果存在大量的结合事件使得大部分光学组件处于第二光学状态，则可以检测到整体变化。

在优选的实施方案中，通过对基板上具有第二光学状态的局部区域集中的局部区域进行计数或通过测量基板上具有第二光学状态的局部区域集(作为一个整体属性)，来检测基板上具有第二光学状态的局部区域集。更优选地，通过对基板上具有第二光学状态的局部区域集中的局部区域进行计数来检测基板上具有第二光学状态的局部区域集。

根据第一和第二光学状态，具有第二光学状态的局部区域可能需要高于对应于背景信号的阈值。例如，样品可能有一些背景自发荧光，但如果这不高于阈值，则由于测定的数字化性质，它不应影响信号。背景自发化学发光倾向于不会发生。

此外，可在辐照光敏剂之前扫描基板表面以给出表面的2D图像，然后在辐照之后扫描，从照射后图像中减去作为背景的照射前图像以减少来自表面上或样品本身中人工制品、污染物和任何自发荧光的干扰。因此，在优选的实施方案中，本发明的方法还包括在步骤(iv)中用电磁辐射辐照装置之前，从检测到的基板上具有第二光学状态的局部区域集中减去检测到的基板上具有第二光学状态的任何组件。用这种方式，减去背景的图像将仅显示基板光学特性的变化(例如荧光强度的变化)。

基板上具有第二光学状态的局部区域集通常是基板上的离散区域。然而，由于它们的形态，一些局部区域可能会被排除在检测之外。对应于单个结合事件的局部区域倾向于是均匀的和圆形的，但对应于人工制品来说，一些局部区域的形状可能是不规则的。此外，一些局部区域可能比其中颗粒聚集在一起的其他区域大。因此，在优选的实施方案中，仅检测基板上具有第二光学状态的均匀、圆形的局部区域。

可以使用简单的光学手段检测基板上的局部区域集。在优选的实施方案中，使用光学显微术检测基板上具有第二光学状态的局部区域集。适合检测的光学装置如图9所示。更优选地，使用宽视场显微术检测基板上具有第二光学状态的局部区域集。宽视场显微术是最简单的显微术形式，整个样品同时被照射和成像，而更复杂的技术如共聚焦显微术一次只照射和记录单独一个焦点。共聚焦显微术的好处是通过消除离焦雾度和通过样品深度拍摄一堆图像的能力来增加对比度。超分辨率显微术技术也是已知的，例如光激活定位显微术(PALM或FPALM)和随机光学重建显微术(STORM)。与简单的宽视场方法相比，这些方法增加了复杂性和成本。

如果使用染料(1)和(3)-(5)，则可以在光学组件已转变为第二光学状态的基板表面上观察到荧光热点(或者，如果存在大量结合事件，则荧光增强)。为了检测这种荧光，可以在染料的激发波长下照射基板，并扫描基板表面的光发射。

如果使用染料(2)，可以测量610nm处荧光发射的减少或515nm处荧光发射的增加，或者可以同时监测两个波长。

如果使用染料(6)，则可以在光学组件已转变为第二光学状态的基板表面上观察到暗点(或者，如果存在大量结合事件，则可以观察到暗图像)。为了检测这些暗点或暗图像，可以使用具有光源(例如LED)和光电检测器(例如光电倍增管或照相机，例如CCD)的宽视场荧光显微镜，使用适用于检测荧光素的激发和发射滤光片(例如490nm处的激发和520nm处的发射)。

当发生结合事件时，光敏剂靠近基板。也就是说，光敏剂足够靠近基板的表面以与光学组件相互作用并在辐照装置时将其从第一光学状态转变为第二光学状态。然而，光敏剂与基板表面之间的实际距离将取决于许多变量，例如光敏剂的大小和性质，结合组件、报告试剂和分析物的大小和性质，以及样品介质的性质。

结合组件具有结合位点，该结合位点能够使报告试剂根据样品中分析物的浓度成比例地结合。该比例对于测定的功能(functioning)很重要，因为对于要确定的分析物浓度的任何有意义的测量来说，结合都必须取决于分析物的浓度。结合可以与分析物的浓度成正比或间接成比例，这取决于所进行的测定类型。在非竞争性测定的情况下，例如在免疫测定法中，结合与分析物的浓度成正比，但对于竞争性测定而言，结合与分析物的浓度间接成比例。

本文提出了一种特定类型的竞争性测定，其中将针对分析物的抗体固定在基板上，并将分析物的标记的类似物引入样品中。然后分析物和分析物的标记的类似物“竞争”表面上的抗体。在没有分析物的情况下，标记的类似物将以最大可能的速率结合。然而，在存在分析物的情况下，基板上的抗体会被分析物占据(populate)，并且类似物的结合率会降低。

结合组件可被改造以适于结合分析物或分析物的复合物或衍生物，在这种情况下，报告试剂将在分析物或分析物的复合物或衍生物存在的情况下与结合组件结合。在这种情况下，结合组件具有能够在分析物或分析物的复合物或衍生物存在的情况下与报告试剂结合的结合位点。然而，结合仍然与分析物的浓度成比例。

或者，结合组件本身可以是分析物的类似物，并且报告试剂直接与结合组件结合(它是类似物，因为它通过共价键合或非共价相互作用结合到基板表面)。在这种情况下，结合组件将与未结合的分析物或未结合的分析物的复合物或衍生物竞争结合报告试剂。因此，结合组件将只能够与报告试剂结合。

确定报告试剂与结合组件的结合程度(直接或由分析物/分析物的复合物或衍生物介导)提供了对样品中分析物浓度的测量。

该测定还需要存在报告试剂。报告试剂包括光敏剂。光敏剂能够吸收电磁辐射以与光学组件相互作用。正是这种相互作用导致光学组件从第一光学状态变化为第二光学状态。

因此，光敏剂可以包括能够以这种方式与电磁辐射相互作用的任何材料。适合的光敏剂为从光动力疗法(PDT)中已知的PDT试剂。PDT试剂用于癌症治疗和皮肤病学，以在照射时破坏细胞(Shafirstein et al.，Cancers,2017,9,12；Wan and Lin,Clinical,Cosmetic and Investigational Dermatology,2014,7,145)。

在用电磁辐射辐照时，PDT试剂被提升到激发的三重态。这种激发的三重态可以在所谓的I型过程中直接与细胞组件相互作用，或者可以在所谓的II型过程中与氧相互作用。I型和II型过程都可以导致ROS的形成。在II型过程中，主要产物是单线态氧，通过系统间的交叉机制。

单线态氧是具有高度反应性的氧的激发态。它在衰变之前可以进行多种反应，包括狄尔斯-阿尔德(Diels-Alder)型反应和烯反应。它还与含硫和含氮的化合物发生一般氧化反应。单线态氧的无差别的反应性是其用于光动力疗法的原因之一。

许多光敏剂化合物是已知的，包括卟啉、二氢卟酚(chlorins)(例如鲍光过敏素(pyropheophorbide)-a)、酞菁和其他多芳族物质(参见，例如，Antibody-DirectedPhototherapy,Pye et al.,Antibodies,2013,2,270)。

在一个实施方案中，光敏剂选自卟啉、二氢卟酚、酞菁和其他多芳族物质。在一个优选的实施方案中，光敏剂是鲍光过敏素-a(PPa)。PPa具有以下结构：

可以使用其他催化反应而不产生ROS的光敏剂。这些包括Ru(II)-三(2,2'-联吡啶)二氯化物，它在还原剂存在下催化二氯二苯基三氯乙烷的还原；二苯甲酮/曙红，催化均二苯乙烯和叶绿素的顺反异构化，催化二氧化碳与水反应生成碳水化合物。还已知可以催化聚合反应的光敏剂，这也可以导致基板的光学性质发生变化。参见，例如，Dyes asPhotoinitiators or Photosensitisers of Polymerisation Reactions,Fouassier etal.,Materials,2010,3,5130。

结合组件和报告试剂的性质取决于分析物的性质，但它们优选地是抗体。本发明的方法在免疫测定中具有特殊的适用性。在一个特别优选的实施方案中，结合组件是针对分析物或分析物的复合物或衍生物产生的抗体，并且报告试剂包括针对分析物或分析物的复合物或衍生物产生的抗体。原则上，单个试剂可以使用每种试剂，但实际上，结合组件和报告试剂是一群分子。术语“抗体”在其范围内优选地包括Fab片段、单链可变片段(scFv)和重组结合片段。

作为抗体-抗原反应的替代方案，结合组件、报告试剂和分析物可以是第一和第二核酸，其中第一和第二核酸互补，或者其为含有抗生物素蛋白或其衍生物的试剂和含有生物素或其衍生物的分析物，反之亦然。结合组件和报告试剂也可以是适体。该系统也不限于生物测定并且可以应用于例如水中重金属的检测。该系统也不必限于液体并且可以使用任何流体系统，例如检测空气中的酶、细胞和病毒等。

可观察的最大信号是在监测光敏剂与表面结合时可以实现的最大信号。颗粒与基板的结合受分析物和报告试剂的扩散速率控制，而扩散速率又在很大程度上受这些组件的流体动力学半径和样品的粘度/温度控制。

在本发明的方法中使用的装置可以进一步包括对照，该对照可补偿测量系统的组件的自然变异性、被测样品的变异性以及测量期间环境条件的变异性。这可以通过将样品暴露于基板表面上的试剂来实现。不同的试剂通常位于基板表面的不同区域，这些区域涂覆有不同的试剂。这些对照被定义为“阴性”和“阳性”对照，即在没有分析物的情况下，阴性对照应该接近预期信号，而当分析物使系统饱和时，阳性对照应该接近预期信号。

为了用这些对照进行检测，本发明的装置优选地包括结合组件、阴性对照试剂和阳性对照试剂，它们中的每一个都如上文所述地连接至基板表面上。

结合组件如上文所述。

在测定条件下，阴性对照试剂对报告试剂的亲和力低于结合组件。因此，阴性对照试剂提供阴性对照。在测定条件下考虑亲和力是重要的。其原因是在非竞争性测定的情况下，结合组件对报告试剂的亲和力是由分析物或分析物的复合物或衍生物的存在介导。因此，在不存在分析物或分析物的复合物或衍生物的情况下，结合组件和阴性对照试剂都对报告试剂没有任何亲和力。然而，在存在分析物或分析物的复合物或衍生物的情况下，阴性对照试剂对报告试剂的亲和力低于结合组件。

此外，在结合组件结合至分析物或分析物的复合物或衍生物的实施方案中，阴性对照试剂对分析物或(如果使用的话)分析物的复合物或衍生物的亲和力优选地低于结合组件。阴性对照试剂优选地为蛋白质，更优选地为抗体。阴性对照试剂通常具有与结合组件相似的化学和物理性质，但在测定条件下对报告试剂的亲和力很小或没有。在一个特别优选的实施方案中，阴性对照试剂在测定条件下对报告试剂基本上没有亲和力。优选地，阴性对照试剂对分析物或分析物的复合物或衍生物基本上没有亲和力。即，报告试剂或在适用的情况下分析物或分析物的复合物或衍生物与阴性对照试剂的结合是非特异性的。以这种方式，阴性对照试剂可以补偿报告试剂与结合组件的非特异性结合。

阳性对照试剂与报告试剂结合并具有对报告试剂的亲和力，与结合组件相比，该亲和力受样品中分析物或(如果使用的话)分析物的复合物或衍生物浓度的影响较小，因此提供了阳性对照。优选地，阳性对照试剂对报告试剂的亲和力基本上与分析物或分析物的复合物或衍生物的浓度无关。更优选地，在测定条件下，阳性对照试剂对报告试剂的亲和力高于结合组件。以这种方式，阳性对照试剂测量系统中的最大预期信号。

为了增加根据本发明进行的测定的动态范围，同时也提高精确度，优选地在基板上的多个位置上具有结合组件。通过改变每个位置的结合组件的浓度，可以将这些位置调整到不同的灵敏度。每个位置也可能有自己的阴性对照和阳性对照试剂，以作为不同动态范围的对照。这尤其适用于对构成系统的每个单独组件的浓度特别敏感的竞争性测定。

尽管上述描述可以使测定在激活光敏剂之前达到平衡，但也有可能通过在一个时间过程中的离散时间周期照射光敏剂并在达到平衡之前监测在反应过程中发生的结合事件来监测结合事件的动力学。

分析物可以是大分子或小分子。大分子通常是蛋白质，例如基于蛋白质的激素，也可以是较大颗粒的一部分，例如病毒、细菌、细胞(例如红细胞)或朊病毒。小分子可以是药物。

本文使用的术语“小分子”是本领域的术语，用于将分子与诸如蛋白质和核酸的大分子区分开来。小分子在免疫测定领域中通常被称为“半抗原”，作为一种小分子，当它与诸如蛋白质的大载体分子连接时，可以引发免疫反应，并包括诸如激素和合成药物的分子。这种类型的小分子通常具有2,000或更小的分子量，通常为1,000或更小，甚至500或更小。结合组件可以被改造以适于结合到分析物本身，尽管分析物在结合到结合组件之前可以经历化学反应或初始络合事件。例如，分析物可在测定条件的pH值下被质子化/去质子化。因此，与结合组件结合的分析物可以是分析物本身或分析物的衍生物；两者都包括在本发明的范围内。

在优选的实施方案中，本发明可用于同时检测同一样品中多种分析物的存在。不同的结合组件可用于基板上的不同位置以测量每种分析物。夹心和竞争测定可以并行运行，并且这些测定可以使用与如上文所述相同的阴性和阳性对照，或者可以对每种被测量的分析物使用单独的对照。

被怀疑含有目的分析物的样品通常是流体样品，例如液体样品，通常是生物样品，例如体液，例如血液、血浆、唾液、血清、眼内液、脑脊液或尿液。样品可以含有悬浮颗粒，甚至可以是全血。在一个优选的实施方案中，样品未经处理，更优选为未经处理的流体。未经处理是指样品/流体在与报告试剂和其他测定组件混合之前没有通过过滤、稀释或任何其他预处理步骤进行预处理。本发明方法的一个优点是可以对确实含有悬浮颗粒的样品进行测定，而不会过度影响测定结果。

在一个优选的实施方案中，样品是全血。令人惊讶的是，全血的组分不干扰本发明的检测方法。通常从血液中除去红细胞以测量血液的血浆或血清组分中的荧光，这是由于细胞组件对光的不可预测的散射，这种散射因样品而异。然而，在本发明的方法中，因为将在基板上测量荧光，并且因为可以测量个体结合事件，所以测量可以在全血中进行。

样品通常为微升量级(例如1-100μL，优选1-10μL)。为了保持流体样品，基板优选地位于具有一个或多个侧壁、上表面和下表面的样品室中。因此，在本发明的方法中使用的装置优选地还包括用于容纳含有与基板接触的分析物的样品的室。

背景干扰的一个潜在额外来源是悬浮颗粒在基板表面的沉降，包括报告试剂和样品的细胞组件。这种干扰源可以通过将基板放置在本体溶液上方来减少，例如置于在反应室的上表面。因此，如果发生任何沉降，它不会干扰基板。优选地，基板形成如图所示的上表面。显然，光学和结合组件将位于室的内表面上，以允许与样品接触。这种和其他修改包括在本发明的范围内。

样品可以简单地通过表面张力保留在例如毛细通道内。

报告试剂和任选的一种或多种额外的试剂优选地储存在纳入到本发明方法中使用的装置中的室中。

本发明的方法在护理点(point-of-care，POC)检测中特别有用。POC检测被定义为在护理点处或附近进行的诊断检测，即床边检测。POC检测可实现方便和快速的检测，从而改进决策和分类，同时更好地分配医院资源，例如事故和急诊护理以及病床。这与传统检测形成鲜明对比，传统检测是在护理点采集样品，然后送到实验室进行检测。采用此类检测，通常需要数小时或数天才能获得结果，在此期间，必须在没有所需信息的情况下继续进行护理。POC检测通常将检测试剂盒与便携式仪器结合使用。

本发明的方法对于监测通常为非常低丰度的分析物的浓度或者存在/不存在特别有用。潜在应用包括测量心脏病(如高敏肌钙蛋白)、传染病(如丙型肝炎核心抗原)、衰老/痴呆(如阿尔茨海默病标志物β和Tau淀粉样蛋白)、细胞因子和肿瘤学(如循环肿瘤标志物)中的生物标志物。

本发明还提供了一种用于检测样品中的分析物的装置，该装置包括：具有光学组件和连接至基板表面上的结合组件的基板，响应于根据样品中分析物浓度成比例结合到基板表面的报告试剂的辐照光敏剂的相互作用，该光学组件能够从第一光学状态变化为第二光学状态，从而在基板上形成具有第二光学状态的光学组件的局部区域集。

该装置的特征与上述用于本发明方法的装置相同。

在一个优选的实施方案中，该装置还包括用于容纳样品和报告试剂的混合物的室。

本发明的装置可以包括经改造适于产生电磁辐射的辐射源和经改造适于检测处于第二光学状态的光学组件的检测器，从而允许精确确定光敏剂相对于基板的位置。

本发明的装置可以采用与单独的读数器一起使用的盒(cartridge)的形式。读数器可以合并辐射源和检测器。读数器优选地是便携式读数器。优选地，该装置包括盒，其中基板在盒内，并且其中该装置还包括用于检测基板上具有第二光学状态的该局部区域集的检测器。本发明还可以提供包括基板以及本文所定义的光学和结合组件的盒。该盒优选地是一次性盒。

本发明还提供了一种用于检测样品中分析物的系统，包括：本发明的装置；以及用于形成包括样品的混合物的报告试剂，报告试剂包括光敏剂，其中光敏剂能够吸收电磁辐射以与光学组件相互作用，使光学组件从第一光学状态变化为第二光学状态。

优选地，光敏剂能够吸收电磁辐射以与存在于混合物中的预活化剂试剂相互作用以产生活化剂试剂，并且活化剂试剂能够与光学组件相互作用以将光学组件从第一光学状态变化为第二光学状态。

在优选的实施方案中，本发明的系统基本上由上述特征组成。“基本上”是指不需要其他特征来执行测定。

现在将参考以下实施例描述本发明，这些实施例并非旨在限制。

实施例

根据本领域已知的技术制备生物素化的BSA。带有经包封的单线态氧光敏剂的Alphascreen供体小珠来自Perkin Elmer。

实施例1

70kD氨基葡聚糖-生物素-荧光素缀合物

称取10mg氨基葡聚糖(70kD)放入玻璃小瓶中，并在100mM磷酸钾缓冲液中配制成2mg/mL。将250μL的该溶液分配到2mL冻存管中。在DMSO中配制4mg/mL生物素-N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯溶液，并将16.2μL的该溶液添加到冻存管中。在20℃下将样品在滚轴混合器(roller)上混合30分钟，同时在DMSO中制备20mg/mL荧光素-NHS酯溶液。

在与生物素-NHS酯反应30分钟后，加入8.5μL的20mg/mL荧光素-NHS酯溶液，并在20℃下于滚轴混合器上再混合60分钟。然后通过添加11.3μL的10mg/mL甘氨酸溶液并在20℃下于滚轴混合器上混合20分钟使反应淬灭。使用Sephadex G-25 PD10柱将样品脱盐到50mM磷酸盐缓冲液中。使用Nanodrop2000分光光度计在280nm和495nm处测量吸光度以确定浓度和荧光素掺入量。然后使用Minisart(Sartorius)过滤器将样品过滤至0.2μm。计算的生物素和荧光素掺入量分别为1.2和4.3。

实施例2

聚合的链霉亲和素(聚链霉亲和素(polystreptavidin))

根据本领域已知的技术制备聚合的链霉亲和素。总之，用9.7摩尔当量的SMCC(N-琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐)将链霉亲和素(1mg/mL)的等分试样活化1小时，然后用甘氨酸和产物在PD10分子筛柱上脱盐。同时，将一份单独的链霉亲和素等分试样与9.7摩尔当量的SATA(N-琥珀酰亚胺基-s-乙酰基-硫代乙酸酯)反应1小时，然后用羟胺脱盐并在PD10分子筛柱上纯化。

SATA-链霉亲和素和SMCC-链霉亲和素以3:2的摩尔比混合30分钟，然后加入NEM(N-乙基马来酰亚胺)以淬灭反应。然后将产物在G25Sephadex柱上纯化，得到聚合的链霉亲和素。通过紫外-可见光谱法测量产物的浓度并调整至1.0mg/mL。没有进行进一步的表征。

实施例3

制备基板表面1

将压敏粘合剂的一片200μm厚的1cm×1cm正方形片19切出6mm直径的孔，粘附至22mm×22mm玻璃盖玻片20(Brand，目录号4700 55)上，以创建一个浅孔21。

然后将30μL生物素化的BSA(10μg/mL，在40mM磷酸盐缓冲液中)放入该孔中并孵育2小时，然后用洗涤缓冲液(40mM磷酸盐、2％蔗糖、0.9％NaCl、0.03％BSA)洗涤。然后将30μL聚链霉亲和素(10μg/mL，在40mM磷酸盐缓冲液中)加入孔中并孵育60分钟，然后用洗涤缓冲液洗涤3次。然后将30μL的70kD氨基葡聚糖-生物素-荧光素缀合物(10μg/mL，在40mM磷酸盐缓冲液中)孵育30分钟，然后用洗涤缓冲液洗涤3次并在室温下于空气中干燥。

实施例4

链霉亲和素小珠与表面的结合

将链霉亲和素包被的Alphascreen供体小珠(Perkin Elmer目录号6760002S，5mg/mL)以1/1000稀释到40mM磷酸盐缓冲液中，将20μL该溶液添加到来自实施例3的基板中并孵育两个小时，然后再用洗涤缓冲液洗涤3次并干燥。这是在灯具上使用绿色滤光片的低光照条件下进行的。链霉亲和素包被的小珠与氨基葡聚糖-生物素-荧光素缀合物上游离的生物素基团结合，如图2所示。

实施例5

在荧光层中产生非荧光点

将20μL的H₂O添加到基板中，并使用红色LED以680nm照射整个表面，总光输出为15mW，对应于表面上大约0.5mW/mm²的光通量，如图3所示。照射五分钟后，除去液体并将表面干燥。然后将基板倒置并粘附至载玻片的顶部，如图11所示，然后在配备CoolLED pE-300照射源和Leica DFC9000GT数码相机(2048×2048像素)的Leica DMR宽视场荧光显微镜上成像，使用100倍浸没镜头和荧光素组。图9说明了光学装置。

图4说明了由于在680nm处照射时小珠3产生了单线态氧的通量，氨基葡聚糖上紧邻结合小珠的染料分子如何从它们的荧光形式14转变为它们的非荧光形式15，如上所述。

图12是显微镜相机拍摄的部分基板表面的图像。可以观察到其中已结合小珠的具有离散暗点的区域。有一些其中小珠已经聚簇的较大的点。然而，由于小珠在五分钟的照射时间内保持在表面附近，因此可以清楚地区分较小、均匀的点作为单独的结合事件。

实施例6

如以上实施例3和4中所述，制备基板表面并将小珠结合到表面上。然后将20μL人血浆添加到表面，并如上述实施例5中所述进行小珠激发和成像。图13示出了部分基板表面的显微镜相机图像。在基板表面上观察到离散的暗区，对应于单独结合的小珠，这表明人血浆的组分在照射阶段不会阻止或淬灭与活性染料的单线态氧反应。

实施例7

如以上实施例3和4中所述，制备基板表面并将小珠结合到表面上。然后将20μL新鲜人血添加到表面，并如上述实施例5中所述进行小珠激发和成像。图14示出了部分基板表面的显微镜相机图像。在基板表面上观察到离散的暗区，对应于单独结合的小珠，这表明人血液的细胞组件在照射阶段不会阻止或淬灭与活性染料的单线态氧反应。

实施例8

聚链霉亲和素-单线态氧传感器绿色(SOSG)缀合物

从冰箱中取出六瓶单线态氧传感器绿色(Thermo Fisher，目录号S36002，每瓶100μg)并在室温下解冻30分钟。然后将它们在甲醇中复溶并合并以产生200μL的总体积。通过以下方式来激活SOSG：添加19.1μL N-羟基琥珀酰亚胺(6mg/mL，在25mM MES缓冲液中)，然后加入31.9μL 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(6mg/mL，在25mM MES缓冲液中)并在20℃下于滚轴混合器上混合溶液15分钟。将1mL的1mg/mL聚链霉亲和素溶液(在100mM磷酸盐缓冲液中)分配到冻存管中。

孵育15分钟后，加入90.7μL活化的SOSG，将样品在20℃下于滚轴混合器上混合约65小时。然后使用Sephadex G-25PD10柱将样品脱盐到50mM磷酸盐缓冲液中。使用Nanodrop2000分光光度计在280nm和520nm处测量吸光度以确定浓度和SOSG掺入量。将25μLProclin 950添加到样品中，然后使用Minisart过滤器将其过滤至0.2μm。计算SOSG掺入量为1.8摩尔/摩尔链霉亲和素单体。

实施例11

制备基板表面2

将压敏粘合剂的一片200μm厚的1cm×1cm正方形片19切出6mm直径的孔，粘附至22mm×22mm玻璃盖玻片20(Brand GMBH，目录号4700 55)上，以创建一个浅孔21，如图10所示。

然后将30μL生物素化的BSA(10μg/mL，在40mM磷酸盐缓冲液中)放入该孔中并孵育2小时，然后用洗涤缓冲液(40mM磷酸盐、2％蔗糖、0.9％NaCl、0.03％BSA)洗涤。将30μL聚合链霉亲和素-SOSG缀合物(10μg/mL，在40mM磷酸盐缓冲液中)加入孔中并孵育60分钟，然后用洗涤缓冲液洗涤3次。然后将30μL生物素化的抗TSH抗体5409(识别TSH的α和β亚基之间的连接，具有50pM的解离常数)(2μg/mL，在40mM磷酸盐缓冲液中)孵育30分钟，然后用洗涤缓冲液洗涤3次并在室温下于空气中干燥。

实施例12

制备鲍光过敏素-a抗-TSH抗体5407的缀合物

抗体5407(识别TSH的β亚基，解离常数为180pM)来自Medix Biochemica，而鲍光过敏素-a(PPa)来自Frontier Scientific(Logan,Utah)。将PPa转变为琥珀酰亚胺酯，并使用“Targeted photodynamic therapy with multiply-loaded recombinant antibodyfragments,Bhatti et al,Int.J.Cancer,2008,122,1155.”中记载的技术与抗体偶联。计算PPa摩尔掺入量为每摩尔抗体3.5。

实施例13

产生离散荧光点

将基板表面17倒置，并移除粘合剂释放衬垫(adhesive release liner)，然后将基板粘附在丙烯酸片材22上，在基板孔的两侧有两个小孔23，如图11中的剖面图所示。

通过连续稀释(1nM、100pM、10pM、1pM、100fM、10fM)，制备一系列浓度的含有添加了5407-PPa抗体缀合物(10ng/mL)的无TSH全血和TSH的反应混合物。通过将混合物(约6μL)移液通过孔23中的一个而将混合物转移到基板中，然后用油脂密封孔23。

将室在黑暗中孵育10分钟，然后使用总光输出为15mW的红色LED在680nm处来照射。在照射两分钟之后，使用图9所示和上述的光学装置对基板表面进行成像。可以观察到其中PPa已与基板表面结合整整两分钟的离散荧光区域。在估计浓度为50飞摩尔(零分析物样品上点计数的标准偏差的三倍)时，TSH可以被定量为上述背景信号。

Claims (15)

1.一种用于检测样品中分析物的方法，该方法包括以下步骤：

(i)向一种装置提供包括样品和报告试剂的混合物，该装置包括具有光学组件和连接至基板表面上的结合组件的基板；

(ii)通过结合组件，使一部分报告试剂根据分析物的浓度成比例地结合到基板表面；

(iii)用电磁辐射辐照所述装置以进行报告试剂的光敏剂的吸收，使得结合的报告试剂部分的光敏剂与光学组件相互作用以使光学组件从第一光学状态变化为第二光学状态，从而在基板上形成具有第二光学状态的光学组件的局部区域集；以及

(iv)检测基板上具有第二光学状态的局部区域集。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述光敏剂的吸收是用于与存在于所述混合物中的预活化剂试剂相互作用从而产生活化剂试剂，并且所述活化剂试剂是用于与所述光学组件相互作用以从第一光学状态变化为第二光学状态。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述活化剂试剂是活性氧簇。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述活性氧簇是单线态氧。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述基板上具有第二光学状态的局部区域集是使用光学显微术来检测。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述光学组件在处于所述第一光学状态时吸收一个或多个波长的光，并且所述光学组件在处于所述第二光学状态时吸收一个或多个其他波长的光。

7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述光学组件在处于所述第一和第二光学状态中的一种时是荧光的，并且所述光学组件在处于所述第一和第二光学状态中的另一种时是非荧光的。

8.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述光学组件在处于所述第一和第二光学状态中的一种时是化学发光的，并且所述光学组件在处于所述第一和第二光学状态中的另一种时是非化学发光的。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中从所述第一光学状态到所述第二光学状态的变化是不可逆的。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(i)至(iii)在没有洗涤步骤的情况下进行。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品是未经处理的。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述装置被电磁辐射辐照超过1秒。

13.一种用于检测样品中分析物的装置，该装置包括：

具有光学组件和连接至所述基板表面上的结合组件的基板，所述光学组件响应于与根据样品中分析物浓度成比例结合到基板表面的报告试剂的辐照光敏剂的相互作用，能够从第一光学状态变化为第二光学状态，从而在基板上形成具有第二光学状态的光学组件的局部区域集。

14.根据权利要求13所述的装置，包括盒，其中所述基板是在所述盒内，并且其中所述装置还包括用于检测所述基板上具有所述第二光学状态的所述局部区域集的检测器。

15.一种用于检测样品中分析物的系统，包括：

根据权利要求13或14所述的装置；以及

用于形成包括样品的混合物的报告试剂，所述报告试剂包括光敏剂，其中所述光敏剂能够吸收电磁辐射以与所述光学组件相互作用，以使所述光学组件从第一光学状态变化为第二光学状态。

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