KR20220031633A

KR20220031633A - 분석물을 검출하는 방법

Info

Publication number: KR20220031633A
Application number: KR1020227002503A
Authority: KR
Inventors: 스티븐 앤드류 로스; 폴 브렌단 모나간; 줄리 리차드; 에일린 제인 맥게트릭
Original assignee: 싸이로스 다이애그노스틱스 리미티드
Priority date: 2019-06-24
Filing date: 2020-06-23
Publication date: 2022-03-11
Also published as: EP3987287A1; US20220365092A1; WO2020260865A1; JP2022538581A; GB201909027D0; CN114341621A

Abstract

본 발명은 시료에서 분석물을 검출하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기 단계들: (i) 시료 및 리포터 시약을 포함하는 혼합물을 장치에 제공하는 단계로서, 상기 장치는 기재의 표면에 부착된 광학 성분과 결합 성분을 갖는 기재를 포함하는 것인, 단계; (ii) 상기 결합 성분에 의해, 리포터 시약의 일부를 분석물의 농도에 비례하여 상기 기재의 표면에 결합시키는 단계; (iii) 리포터 시약의 감광제에 의한 흡수를 위해 전자기 방사선을 장치에 조사하여, 결합된 리포터 시약 부분의 감광제가 광학 성분과 상호작용하여 상기 광학 성분이 제1 광학 상태에서 제2 광학 상태로 변하도록 하고, 이에 의해 기재 상에 제2 광학 상태를 갖는 광학 성분의 국부 영역의 세트를 형성하는 단계; 및 (iv) 상기 기재 상에서 제2 광학 상태를 갖는 국부 영역의 세트를 검출하는 단계;를 포함한다.

Description

분석물을 검출하는 방법

본 발명은 분석물을 검출하는 방법, 특히 시료 내 분석물의 존재로 인한 개별 결합 이벤트(binding event)를 검출하는 방법에 관한 것이다.

혈액, 혈장, 혈청, 조직 등과 같은 인간 시료에서 생물학적으로 관련된 파라미터를 측정하는데 사용할 수 있는 많은 기술이 있다. 일반적인 방법은 관심 표적에 결합하는 포획 시약(capture reagent)과, 일종의 표지가 있는 리포터 시약(reporter reagent)을 사용하는 것이다. 포획 시약은 마이크로타이터 플레이트(microtitre plate), 비드 또는 멤브레인과 같은 고체상에 결합될 수 있다. 시료가 포획 시약과 함께 배양되면, 분석물이 포획 시약에 결합한다. 리포터 시약은 또한 분석물에 결합한다. 그 후, 과잉 리포터를 (세척으로) 제거하고, 리포터 시약의 양을 측정하여 시료에 존재하는 분석물의 양을 측정할 수 있다. 이러한 유형의 결합 분석이 수행될 수 있는 방법에는 다양한 변형이 있다. 예를 들어, 분석물은 먼저 포획 시약에 결합할 수 있고, 그 후 리포터는 별도의 단계에서 추가될 수 있거나, 분석물은 먼저 리포터에 결합한 후, 포획제에 결합할 수 있다.

핵산, 탄수화물, 항원, 펩티드, 단백질 및 항체를 포함하여 이러한 유형의 결합 분석에서 포획 및 리포터로 사용될 수 있는 광범위한 시약이 있다. 펩티드, 단백질, 항체, 핵산, 세포, 탄수화물, 소분자, 치료제, 남용 약물, 스테로이드, 호르몬, 지질 등을 포함한 광범위한 표적 분석물도 있다.

항체를 사용하는 분석을 일반적으로 면역분석이라고 한다. 면역분석은 다양한 형식을 취할 수 있다. 예를 들어, 포획 항체를 사용하여 분석물을 포획하고, 리포터 항체를 사용하여 측정 가능한 신호를 생성하는 경우, 이를 일반적으로 샌드위치 면역분석(sandwich immunoassay)이라고 한다. 결합제가 고체상에 부착되고 표적 분석물이 결합제에도 결합하는 표지된 시약과 용액에서 경쟁하는 대체 형식이 알려져 있다. 분석물이 없는 경우, 높은 수준의 표지된 시약이 결합하기 때문에, 높은 신호가 얻어진다. 분석물이 있는 경우, 결합 부위의 일부가 차단되어, 표지된 시약이 더 적게 결합하고, 신호가 감소된다. 이러한 분석은 일반적으로 억제 또는 경쟁 분석으로 알려져 있다. 여러 유형의 경쟁 분석이 알려져 있다. 예를 들어, 항체는 고체상에 결합될 수 있고, 표지된 분석물(또는 분석물의 유사체)은 항체의 결합 부위에 대해 경쟁할 수 있다. 대안적으로, 분석물의 유사체가 고정될 수 있고, 표지된 항체가 이 표면에 결합할 수 있다. 시료에 분석물이 있는 경우, 이는 용액의 항체에 결합하여, 표면에 대한 결합을 방지하고, 신호가 감소될 것이다.

다양한 분석 형식과 사용될 수 있는 다양한 유형의 표지가 있다. 예를 들어, 분석은 측정이 수행되기 전에, 예를 들어 세척 단계를 사용하여, 과잉 표지가 제거된다는 점에서 이질적일 수 있다. 과잉 표지 제거는 시료와 리포터가 포획 영역을 지나도록 흐르게 하여 달성될 수도 있다. 이 접근 방식은, 예를 들어 감염성 질병 시험 및 임신 시험을 위한 신속한 시험에 사용되는 면역 크로마토그래피 또는 측면 흐름 스트립(lateral flow strip)에 사용된다. 대안적으로, 과잉 리포터가 제거되지 않는 균질한 분석(homogeneous assay)이 알려져 있다. 균질한 분석은 어떤 형태의 신호를 생성하는 포획 및 리포터의 근접성에 의존하는 경향이 있다. 균질한 분석의 하나의 예는 입자가 용액에서 함께 결합하는 응집 분석(agglutination assay)이다. 응집된 입자는 빛의 산란을 유발하며, 이는 비탁 분석(turbidimetry) 또는 비탁법(nephelometry)에 의해 측정될 수 있다. 입자를 사용하는 균질한 분석의 추가 예는 하기에서 더 자세히 기재되는 발광 산소 채널링 면역분석(LOCI)이다.

균질한 분석의 다른 예는 형광 공명 에너지 전달(FRET)이며, 여기서 포획 및 리포터 시약은 각각 공여자(donor) 및 수용자(acceptor) 형광단(fluorophore)이고, 공여자의 여기(excitation)는 수용자로 에너지를 전달한 후, 빛을 방출한다.

세포 물질을 제거하지 않고 전혈(whole blood)에서 기능하는 하나의 균질한 분석 형식은 파이로-광학 면역분석(pyro-optical immunoassay)이다. 초전성 폴리비닐리덴(pyroelectric polyvinylidene) PVDF 센서에 포획 항체를 코팅하고, 탄소 입자를 리포터로서 사용한다. 시료에 빛을 비추면 신호가 생성되어, 입자가 국부적으로 가열된다. 센서에 결합된 것들은 초전성 센서에 에너지를 전달하여, 전기 신호로서 감지되는 열 스트레스를 유발한다. 탄소 결합이 많을수록, 신호가 커진다.

리포터 결합제에 부착되는 표지는 염료, 금 입자 또는 염색된 라텍스 미소구체와 같이 빛을 흡수하는 제제일 수 있다. 더 큰 입자는 원칙적으로 더 많은 빛을 흡수하고, 더 많은 신호를 생성할 수 있다. 그러나, 하기에 더 자세히 기술되는 바와 같이, 미립자 표지가 분석에 사용하기에 비실용적인 크기 제한이 있다. 형광 표지, 화학발광 표지, 생물발광 표지 및 전기화학발광 표지와 같은 발광 표지도 알려져 있다. 발광 표지는 또한 특정 유형의 분석을 위해 입자에 캡슐화되었다(encapsulated). 신호의 증폭은 효소 또는 촉매 반응을 사용하여 수행될 수도 있다. 효소를 사용하여 기재를 류코 염료(leuco dye)에서 유색 형태로, 또는 형광성 또는 발광성 형태로 전환할 수 있다. 기재를 추가하기 전에 세척 단계를 사용하여 과잉 효소를 제거하는 것이 일반적이므로, 분석물에 특이적으로 결합된 효소에 의해서만 신호가 생성된다.

신호 전달 방법으로서 표면 플라즈몬 공명을 사용하는 분석과 같이 표지를 사용하지 않는 면역분석도 알려져 있다. 그러나, 표지가 없는 분석(label free assay)은 신호를 향상시키기 위해 표지를 사용하는 분석의 감도가 부족한 경향이 있다.

면역분석 분야에 대한 추가 정보는 "The Immunoassay Handbook:4th Edition:Theory and Applications of Ligand Binding, ELISA and Related Techniques", Ed. D. Wild, Elsevier Science, 2013에서 확인할 수 있다.

면역 분석을 포함한 모든 결합 분석은 안정적으로 측정될 수 있는 분석물의 최소 및 최대 농도의 관점에서 한계가 있다.

신호 최대값은 일반적으로 분석물에 결합할 수 있는 포획 항체의 총량 및 신호를 생성하기 위한 리포터 항체의 총량과 같은 요인에 의해 제한된다. 포획 항체가 고체상에 고정되어 있으면, 고체상의 표면적이 검출의 상한선을 제한할 수 있다. 또한, 일부 신호 변환 기술은 빛이 시료를 통과하는데 필요한 경로 길이에 따라 비색 방법(colorimetric method)과 같은 포화 경향이 있을 수 있다. 발광 방법은, 더 높은 수준의 광 방출을 처리하기 위해 검출기의 이득이 감쇠될 수 있기 때문에, 포화에 덜 취약하다. 이종 분석에서 모든 항체 결합 부위가 분석물로 채워지면, 최대 신호에 도달하고 시스템이 포화된다. 과잉 분석물은 일반적으로 리포터를 추가하기 전에 세척 단계에서 제거된다. 균질한 분석은 또한 분석물의 농도가 포획 및/또는 리포터 항체의 유효 농도보다 더 큰 고용량 후크(high-dose hook)로 알려진 효과를 겪을 수 있다. 이 경우, 매우 높은 농도에서, 포획 및 리포터의 모든 결합 부위가 차단될 수 있고, 분석 신호가 감소되어 잘못된 결과를 제공할 수 있다.

낮은 수준의 검출은 다양한 요인에 의해 결정된다. 일반적으로, 모든 분석은 사용되는 항체의 품질(친화도 및 특이성) 및 항체와 관련 분석 물질의 교차 반응성과 같은 속성의 영향을 받을 것이다. 검출의 하한은 또한 분석 설정 및 시스템 설계의 신호 대 잡음비(signal-to-noise ratio)에 영향을 미치는 요인에 따라 달라진다. 예를 들어, 표준 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)에서, 포획 항체는 96웰 마이크로타이터 플레이트의 표면 상에 코팅된 후, 시료가 웰에서 배양되어, 분석물이 포획된다. 웰을 세척한 후, 리포터를 과량으로 추가하여, 포획된 분석물에 결합한다. 그 후, 과잉 리포터를 씻어내고, 효소와 반응할 수 있는 기재를 추가하여, 활성 형태로 전환한다. 예를 들어, 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)(ABTS)과 같은 무색 류코 염료는 과산화수소가 있는 상태에서 호스래디시 과산화효소(horseradish peroxidase)에 의해 산화된 녹색 형태(green form)로 전환될 수 있다. 분석물이 매우 적은 양(예를 들면, 1 피코몰 미만)으로 존재할 때, 웰 표면에 결합된 효소는 매우 소량만 있을 것이다. ABTS는 효소와 반응하여 녹색 형태를 생성한 후, 대부분의 유체로 확산되어, 배경 신호와 구별할 수 없을 정도로 묽은 용액을 생성한다. 기재의 자동 전환은 측정을 방해하는 색상을 생성할 수도 있다. 마찬가지로, 형광과 같은 다른 검출 방법은 시료 또는 반응 웰에 있는 성분의 간섭 인자 및 자가 형광으로 인해 어려움을 겪을 수 있다.

면역 분석에서 다른 혼란스러운 요인은 포획 표면에 대한 리포터 시약의 비특이적 결합일 수 있다. 예를 들어, 상기 기재된 ELISA 분석에서, 미세역가(microtitre) 웰은 단백질 층으로 코팅되어 있으며, 그 중 일부는 코팅 공정에서 변성될 수 있다. 리포터가 분석 중에 포획 표면 영역에 결합하는 것은 드문 일이 아니다. 이 리포터가 전체 신호에 기여하기 위해 기재를 뒤집으면, 특이적으로 결합된 리포터로 인한 신호와 비특이적으로 결합된 신호를 구별할 수 없다. 비특이적 결합은 또한 초기 배양 동안 포획 표면에 결합하여 포획 층의 표면 특성을 개질하고 리포터를 결합할 수 있는 표면을 생성할 수 있는 원래 시료에 존재하는 많은 구성 요소에 의해 촉진될 수 있다. 리포터의 비특이적 결합을 최소화하는 것은 항체, 세제, 온도 및 이온 강도를 포함하여 분석 중에 사용되는 모든 시약 및 반응 조건을 신중하게 최적화하는 것을 포함한다.

일반적으로, 기존 면역분석의 검출 한계는 분석 방법에 따라 약 0.1 피코몰 내지 1 나노몰이다. 기존 접근 방식을 사용하여 검출 한계가 매우 낮은 분석을 개발하려면, 비특이적 결합을 줄이고 신호 대 잡음을 최대화하기 위한 엄격한 세척 단계와 함께 많은 최적화가 필요한 경우가 많다. 추가로, 포획 표면은, 신호가 배경에 비해 충분히 높은 것을 보장하기 위해 시료 부피에 비해 작은 경우가 많다.

신호 대 잡음과 관련된 문제를 우회하고 검출 한계를 개선하는데 사용되는 하나의 접근 방식은 개별 결합 이벤트를 측정하고, 측정값이 국부화된 한계점 이상인 경우 이러한 결합 이벤트를 "켜짐(on)" 또는 "꺼짐(off)" 이벤트로 카운팅하는 것이다. 이러한 방식으로, 많은 배경 잡음이 제거될 수 있다. 오디오 또는 통신 신호의 디지털화로 유추될 수 있다. 이러한 디지털 분석은 기존의 아날로그 방법을 사용하여 이전에 달성할 수 없었던 검출 한계에 도달하는 것을 보여주었다. 예를 들어, 낮은 펨토몰(femtomolar)(10^-15mol/L) 및 심지어 아토몰(attomolar)(10^-18 mol/L) 범위의 검출 한계가 보고되었다. 예를 들면, "Evaluation of highly sensitive immunoassay technologies for quantitative measurements of sub-pg/mL levels of cytokines in human serum", Yeung et al, Journal of Immunological Methods, 2016, 437, 53 and "Digital Detection of Biomarkers Assisted by Nanoparticles:Application to Diagnostics", Cretich et al, Trends in Biotechnology, 2015, 33, 343을 참조한다.

분석에 사용되는 대부분의 표지/리포터(예를 들면, 형광단, 염료 등)는 이들의 크기가 가시광선의 회절 한계 미만이기 때문에, 고배율 하에서도 광시야 현미경을 사용하여 개별적으로 볼 수 없다. 따라서, 이러한 표지의 존재는 각 표지를 카운팅하는 것이 아니라 대량 현상으로만 측정될 수 있다. 대조적으로, 라텍스 입자와 같은 미립자 표지는 이론상 특정한 크기 이상인 경우 광시야 광학 현미경으로 시각화할 수 있다. 광학 설정에 따라, 개구수 및 현미경 유형에 따라, 입자의 직경이 수백 미크론 이상일 때, 입자를 시각화하는 것을 시작할 수 있다.

그러나, 이 크기의 입자를 표지로 사용하여 포획 표면 상의 개별 결합 이벤트(예를 들면, 항체-항원 상호작용)를 모니터링하는 것은 여러 가지 이유로 비실용적이 된다. 예를 들어, 이 크기의 입자는 다른 유형의 표지에 비해 매우 느리게 확산되어, 평면 표면에서의 반응 속도를 손상시킨다. 또한, 이들은 거시적 부력 효과(macroscopic buoyancy effect)를 나타내기 시작하고, 입자의 밀도가 이들이 포함된 매질과 크게 다른 경우 침전되거나 뜨게 되며, 이는 분석 형식에 문제를 일으킬 수도 있다. 이 크기의 입자는 특히 표면에 비특이적으로 결합하는 경향이 있어, 제거하기 어려운 높은 배경을 유발한다. 마지막으로, 과도한 입자를 제거해야 하므로, 세척 단계를 필요로 한다. 그러나, 큰 입자는 유체 흐름이 있는 상태에서 전단 효과를 겪기 시작하여, 입자에 가해지는 전단력이 항체-항원 상호 작용의 파열 강도(약 60-250 pN)보다 커져, 입자가 씻겨 나가게 된다 ("Rapid Femtomolar Bioassays in Complex Matrices Combining Microfluidics and Magnetoelectronics", Mulvaney et al, Biosensors and Bioelectronics, 2007, 23, 191 참조).

디지털 분석의 예는 SIMOA(Quanterix Single Molecule Array) 시스템과 SMC(Singulex Single Molecule Counting) 시스템을 포함한다.

Quanterix SIMOA 시스템은 항체-코팅된 상자성 비드(antibody-coated paramagnetic bead)를 사용하여 용액에서 분석물을 포획한다. 그 후, 자기 비드(magnetic bead)를 세척하고, 효소로 표지된 리포터 항체를 첨가한다. 비드의 양은, 비드당 하나 이상의 분석 물질과 리포터를 가질 확률을 최소화하면 충분하다. 비드를 다시 세척한 후, 웰당 하나의 비드만 보유할 수 있는 마이크로웰의 어레이에 로딩한다. 마이크로웰의 부피는 펨토리터(femtolitre) 규모이다. 비드에 효소가 부착되어 있으면, 웰의 형광 기재가 뒤집어진다. 웰의 작은 치수는 형광 제품이 너무 확산되는 것을 방지한다. 그 후, 형광이 임계값 이상인 경우 각 웰은 "켜짐" 또는 "꺼짐" 이벤트로 카운팅된다.

SMC 시스템은 Singulex Clarity 기기와 Merck Millipore의 Erenna 및 SMCxPRO 시스템에 사용된다. 세 가지 시스템 모두의 기본 측정 기술은 동일한다. 포획 항체에 코팅된 자기 비드는 샌드위치 분석에서 표적 분석물을 포획하는데 사용된다. 형광 표지된 리포터 항체는 또한 분석물의 존재 하에 비드에 결합한다. 비드는 자석으로 당겨지고, 과잉 형광 태그가 붙은 리포터는 세척된다. 그 후, 샌드위치 복합체의 해리를 유발하는 용리 완충액이 추가된 후, 측정 용기로 옮겨진다. 그 후, 형광 태그의 존재 여부를 확인하기 위해 소량의 시료를 순차적으로 조사하는 공초점 형광 현미경(confocal fluorescent microscope)을 사용하여 형광 태그의 존재를 측정한다. 각 개별 측정에 대한 신호가 임계값보다 높으면, 해당 측정에 대해 "켜짐" 이벤트로 카운팅된다.

고감도 면역분석법에 대한 여러 독립적인 학술 리뷰에서는 면역분석법에 대한 디지털 접근 방식이 검출 한계를 전례 없이 개선할 수 있다고 강조했다(위의 Yeung 및 Cretich 참조).

Quanterix 및 Singulex 시스템의 검출 한계는 분석에 사용되는 시료의 부피에 따라 달라진다. 10 마이크로리터 혈청 또는 혈장 시료의 경우, 이론적인 한계는 1 분자에 해당하는 단일 결합 이벤트의 검출일 것이다. 그러나, 몰 농도 관점에서, 이것은 시료 리터당 100,000개 분자, 또는 리터당 0.16 × 10^-18 몰(0.16 아토몰)에 해당한다.

그러나, 상기 기술된 Quanterix 및 Singulex 시스템은 복잡하고 번거로우며, 각각 여러 단계의 세척 및 이동 단계가 필요하다. 또한, 분석은 세포 물질을 포함하지 않는 시료에 대해서만 수행될 수 있으며, 시스템은 이들이 제공하는 성능을 달성하기 위해 고가의 기기를 필요로 한다. 따라서, 더 간단하고 더욱 비용 효율적인 고감도 시스템에 대한 요구가 남아 있다.

따라서, 본 발명은 시료 내의 분석물을 검출하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기 단계들:

(i) 시료와 리포터 시약(reporter reagent)을 포함하는 혼합물을 장치에 제공하는 단계로, 상기 장치는 기재(substrate)의 표면에 부착된 광학 성분(optical component)과 결합 성분(binding component)을 갖는 기재를 포함하는 것인, 단계;

(ii) 상기 결합 성분에 의해, 리포터 시약의 일부를 분석물의 농도에 비례하여 상기 기재의 표면에 결합시키는 단계;

(iii) 리포터 시약의 감광제에 의한 흡수를 위해 전자기 방사선을 장치에 조사하여, 결합된 리포터 시약 부분의 감광제가 광학 성분과 상호작용하여 상기 광학 성분이 제1 광학 상태에서 제2 광학 상태로 변하도록 하고, 이에 의해 기재 상에 제2 광학 상태를 갖는 광학 성분의 국부 영역의 세트를 형성하는 단계; 및

(iv) 상기 기재 상에 제2 광학 상태를 갖는 국부 영역의 세트를 검출하는 단계;를 포함한다.

따라서, 본 발명은, 기재의 표면 부근에 있는 리포터 시약만이 신호(제2 광학 상태에서 광학 성분의 국부 영역)를 생성하고, 신호(제2 광학 상태에서 광학 성분의 국부 영역의 세트)가 검출되는 시료에서 분석물을 검출하는 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명의 방법은 분석물의 디지털 검출을 단순화한다. 본 발명의 방법은 세포 물질을 함유하는 시료를 포함하는 시료 범위에 대한 균질한 분석을 용이하게 한다.

본 발명은 이제 도면을 참조하여 설명될 것이며, 여기서:
도 1은 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 다양한 성분들을 도시하고;
도 2는 조사 전에 리포터 시약이 기재의 표면에 결합된 장치를 도시하고;
도 3은 조사되는 도 2의 장치를 도시하고;
도 4는 조사 후의 도 3의 장치를 도시하고;
도 5는 조사 전에 전혈 시료 및 리포터 시약이 존재하는 장치를 도시하고;
도 6은 조사 후의 도 5의 장치를 도시하고;
도 7은 조사 전에 결합 성분에 의해 분석물의 농도에 비례하여 리포터 시약이 기재의 표면에 결합되는 본 발명의 방법에 사용되는 장치를 도시하고;
도 8은 조사 후의 도 7의 장치를 도시하고;
도 9는 검출을 위한 광학 설정을 도시하고;
도 10은 본 발명의 방법을 위해 생성된 기재 및 웰을 도시하고;
도 11은 도 10의 기재 및 웰을 사용하여 생성된 시료 챔버를 도시하고;
도 12는 실시예 5의 검출 결과를 도시하고;
도 13은 실시예 6의 검출 결과를 도시하고;
도 14는 실시예 7의 검출 결과를 도시한다.

본 발명의 방법은 시료에서 분석물을 검출하는데 사용된다(이는 분석물의 복합체 또는 유도체의 검출을 통해 이루어질 수 있음).

도 1의 구성 요소는 다음과 같다: 분석물(1); 감광제(2); 감광제가 주입된 스트렙타비딘 코팅된 라텍스 입자(streptavidin-coated latex particle infused with photosensitiser)(3); 감광제가 주입된 항체 코팅된 라텍스 입자(antibody-coated latex particle infused with photosensitiser)(4); 항체(5); 감광제 표지 항체(6); 형광 상태의 염료(7); 비형광 상태의 염료(8); 중합된 스트렙타비딘(polymerised streptavidin)(9); 형광 상태의 폴리스트렙타비딘 염료 접합체(10); 비형광 상태의 폴리스트렙타비딘 염료 접합체(polystreptavidin dye conjugate in non-fluorescent state)(11); 비오틴-BSA 접합체(biotin-BSA conjugate)(12); 적혈구(13); 형광 상태의 아미노덱스트란-비오틴-염료 접합체(aminodextran-biotin-dye conjugate in fluorescent state)(14); 및 비형광 상태의 아미노덱스트란-비오틴-염료 접합체(15).

본 발명의 방법의 단계 (i)는 시료 및 리포터 시약을 포함하는 혼합물을 장치에 제공하는 것을 포함하며, 상기 장치는, 기재(substrate, 17)의 표면에 부착된 광학 성분 및 결합 성분을 갖는 기재(17)를 포함한다. 시료와 리포터 시약은 혼합물을 장치에 추가하기 전에 미리 혼합하거나, 시료와 리포터 시약을 장치에 순차적으로 첨가하여 혼합물을 형성할 수 있다. 혼합물은 또한 추가 시약을 포함할 수 있지만, 바람직하게는 혼합물은 시료와 리포터 시약으로 구성된다.

본 발명의 기초가 되는 원리를 설명하기 위해, 도 2는, 조사 전에 리포터 시약이 기재의 표면에 결합된 장치를 도시한다. 장치는 기재(17) 및 내부에 용해되거나 현탁된 분석물을 함유하는 시료를 유지하기 위한 시료 챔버(sample chamber, 16)를 포함한다. 기재는 기재 상에 제2 광학 상태를 갖는 국부 영역의 세트의 검출을 허용하는 임의의 기재일 수 있다. 바람직하게는, 기재는 투명 기재이고, 더욱 바람직하게는 기재는 유리이다.

기재(17)는 비오틴-BSA 접합체(12) 및 중합된 스트렙타비딘(9)를 통해 기재(17)의 표면에 부착된 아미노덱스트란-비오틴-염료 접합체(14)를 갖는다. 염료는 광학 성분으로서 작용하고, 비오틴은 결합 성분으로서 작용한다. 비오틴-BSA 접합체(12) 및 중합된 스트렙타비딘(9)은 기재(17)의 표면에 광학 및 결합 성분의 부착을 용이하게 하는 불활성 거대분자이다. 이 접근법은, 광학 성분을 고정화하기 위해, 기재(17)의 표면에 고정될 필요가 있기 때문에, 광학 성분이 수용성일 때 사용된다.

광학 및 결합 성분이 이러한 방식으로 도시되어 있지만, 기재(17)의 표면에 근접하여 광학 및 결합 성분을 유지하기 위한 임의의 기술이 적용 가능하다. 예를 들어, 광학 및 결합 성분은 별도의 시약 및 광학 성분에 부착된 결합 성분일 수 있다.

광학 성분은 또한 기재(17)의 표면 및 중합체 층에 부착된 결합 성분의 표면 상에 코팅된 중합체 층 내에 캡슐화될 수 있다. 중합체는 실리콘, 폴리스티렌 또는 폴리이소부틸렌, 또는 광학 성분을 캡슐화하는데 사용할 수 있는 임의의 다른 적합한 중합체 플라스틱일 수 있다. 이 접근 방식은 광학 성분이 수불용성일 때 사용될 수 있다.

대안적으로, 겔/하이드로겔 층은 광학 성분으로 함침될 수 있고, 겔/하이드로겔 층은 겔/하이드로겔 층에 부착된 결합 성분 및 기재(17)의 표면 상에 코팅될 수 있다.

본 발명의 방법의 단계 (ii)는 결합 성분에 의해 분석물의 농도에 비례하여 리포터 시약의 일부가 기재의 표면에 결합하도록 하는 것을 포함한다. 이것은 장치를 일정 시간, 예를 들어 10분 동안 그대로 두어 달성할 수 있다.

도 2에서, 감광제가 주입된 스트렙타비딘 코팅된 라텍스 입자(3)는 아미노덱스트란-비오틴-염료 접합체(14) 상의 비오틴에 의해 기재(17)의 표면에 결합된다. 감광제가 주입된 스트렙타비딘 코팅된 라텍스 입자(3)는 리포터 시약 역할을 한다.

리포터 시약은 이러한 방식으로 기재(17)의 표면에 결합되는 것으로 도시되지만, 분석물이 존재할 때, 리포터 시약은 분석물의 농도에 비례하여 기재의 표면에 결합한다. 예를 들어, 결합 성분 및 리포터 시약이 항체이고, 분석물이 항원인 경우, 리포터 시약은 분석물을 통해 결합 성분에 결합하여, 도 7 및 8을 참조하여 하기에서 논의되는 바와 같이 소위 "샌드위치" 복합체를 형성한다.

이 시점까지의 모든 단계는 빛이 없는 상태에서 이루어졌다. 본 발명의 방법의 단계 (iii)은, 결합된 리포터 시약 부분의 감광제가 광학 성분과 상호작용하여 광학 성분을 제1 광학 상태에서 제2 광학 상태로 변화시키도록 리포터 시약의 감광제에 의한 흡수를 위해 전자기 방사선을 장치에 조사하여, 이에 의해 기재(17) 상에 제2 광학 상태를 갖는 광학 성분의 국부 영역의 세트를 형성하는 것을 포함한다.

도 3은 전자기 방사선(전형적으로 "광"으로 지칭됨), 바람직하게는 가시광선을 조사하는 도 2의 장치를 도시한다. 광원은, 예를 들어 LED(18)일 수 있다. 광원은 적절한 파장의 빛으로 시료 챔버(16)를 조명하여 감광제(2)를 여기시킨다. 파장은 감광제에 따라 다르지만, 바람직한 파장은 680 nm이다. 장치는 일반적으로 적어도 30초 동안 조사된다. 바람직하게는, 상기 장치는 1초 이상, 보다 바람직하게는 적어도 2초, 보다 바람직하게는 적어도 5초, 보다 바람직하게는 적어도 20초, 가장 바람직하게는 적어도 30초 동안 전자기 방사선 공급원에 노출된다. 이는 기재 표면 상에 비가역적인 광학적 변화가 있음을 보장하므로, 수명이 길고 일시적인 바인딩 이벤트를 구별할 수 있다.

도 4는 조사 후의 도 3의 장치를 도시한다. 감광제(2)는 아미노덱스트란-비오틴-염료 접합체(14)의 염료 광학 성분과 상호작용하여, 염료를 형광 상태에서 비형광 상태로 변화시킨다. 형광 상태의 아미노덱스트란-비오틴-염료 접합체(14)는 비형광 상태의 아미노덱스트란-비오틴-염료 접합체(15)가 된다. 감광제(2)에 매우 근접한 염료만이 제1 광학 상태에서 제2 광학 상태로 변경된다.

염료가 형광 상태에서 비형광 상태로 변화하는 것으로 표시되지만, 다른 광학 성분은 대체 변화를 겪는다. 하나의 양태에서, 제1 광학 상태에 있을 때 광학 성분은 하나 이상의 파장에서 광, 바람직하게는 가시광선을 흡수하고, 제2 광학 상태에 있을 때 광학 성분은 하나 이상의 다른 파장에서 광, 바람직하게는 가시광선을 흡수한다. 이 양태에서, 광학 성분은 색상 변화를 겪는다.

대안적인 양태에서, 제1 및 제2 광학 상태 중 하나에 있을 때 광학 성분은 화학발광성이고, 제1 및 제2 광학 상태 중 다른 하나에 있을 때 광학 성분은 비화학발광성이다.

대안적인 제1 및 제2 광학 상태는 편광, 형광 수명, 굴절률, 광산란(라만 산란 포함) 및 기타 광학 효과에 대한 변화를 포함할 수 있다.

도 5는 조사 전에 전혈 시료와 리포터 시약이 존재하는 장치를 나타낸다. 전혈 시료는 또한 적혈구(13)와 같은 추가 구성 요소를 포함한다. 바람직하게는, 기재(17)는 시료 챔버(16)의 상부를 형성하여, 적혈구(13)가 기재(17)로부터 퇴적되도록 한다.

리포터 시약의 일부는 결합 성분에 의해 기재(17)의 표면에 결합한다. 따라서, 시료는 용액에 유리된 결합된 리포터 시약과 결합되지 않은 리포터 시약을 포함한다. 시료 챔버(16)의 깊이는 리포터 시약의 확산 경로 길이를 최소화하고, 평형이 신속하게 달성될 수 있도록 설계된다. 일반적으로, 시료 챔버의 깊이는 50 내지 200 μm이다.

그 후, 장치는 상기 기술된 바와 같이 조사되고, 도 6은 조사 후의 도 5의 장치를 보여준다. 광학 성분 부근에 있는 임의의 감광제는 상호 작용하여, 광학 성분이 제1 광학 상태에서 제2 광학 상태로 변하도록 한다. 이러한 방식으로, 결합된 리포터 시약 부분의 감광제는 광학 성분과 상호작용하여, 광학 성분이 제1 광학 상태에서 제2 광학 상태로 변하도록 하여, 이에 의해 기재(17) 상에 제2 광학 상태를 갖는 광학 성분의 국부 영역의 세트를 형성한다.

도 7은, 조사 전에 결합 성분에 의해 분석물의 농도에 비례하여 리포터 시약이 기재의 표면에 결합되는 본 발명의 방법에 사용되는 장치를 도시한다.

본 발명의 방법을 이용한 전형적인 샌드위치 면역분석법에서, 기재(17)는 비오틴-BSA 접합체(12)를 통해 기재(17)의 표면에 부착되는 폴리스트렙타비딘-염료 접합체(11), 및 폴리스트렙타비딘-염료 접합체(11)에 부착된 항체(5)를 갖는다. 염료는 광학 성분으로서 작용하고, 항체는 결합 성분으로서 작용한다. 광학 및 결합 성분이 이러한 방식으로 도시되어 있지만, 광학 및 결합 성분을 기재(17)의 표면에 근접하게 유지하기 위한 임의의 기술, 예를 들어 상기 기술된 것과 같은 기술이 적용 가능하다.

본 발명의 방법에서, 시료 챔버(16)는 분석물(1)을 함유하는 시료로 채워진다. 감광제 표지 항체(6)와 같은 리포터 시약 또한 시료 챔버(16)에 추가된다. 전혈 시료를 사용하는 경우, 시료는 적혈구(13)와 같은 추가 구성 요소를 포함할 수 있다.

그 후, 평형이 달성된다. 감광제 표지된 항체(6)는 항체(5)에 의해 분석물(1)의 농도에 비례하여 기재(17)의 표면에 결합된다. 감광제로 표지된 항체(6)는 리포터 시약으로서 작용한다. 과잉의 감광제 표지 항체(6)가 포함되어, 모든 분석물(1)이 샌드위치 복합체를 형성한다. 따라서, 리포터 시약의 일부는, 결합 성분에 의해, 분석물(1)의 농도에 비례하여 기재(17)의 표면에 결합한다. 따라서, 시료는 용액에 유리된 결합된 리포터 시약과 결합되지 않은 리포터 시약을 포함한다.

도 8은 조사 후의 도 7의 장치를 도시한다. 감광제(2)는 폴리스트렙타비딘-염료 접합체(11)의 염료 광학 성분과 상호작용하여, 염료를 비형광 상태에서 형광 상태로 변화시킨다. 비형광 상태의 폴리스트렙타비딘-염료 접합체(11)는 형광 상태의 폴리스트렙타비딘-염료 접합체(10)가 된다. 감광제(2)에 매우 근접한 염료만이 제1 광학 상태에서 제2 광학 상태로 변경된다.

리포터 시약은 제1 광학 상태를 제2 광학 상태로 완전히 전환하기 위해 전체 조사 기간 동안 기재(17)의 표면에 영구적으로 결합되어야 한다. 용액에 결합되지 않은 임의의 리포터 시약은 광학 성분이 제1 광학 상태에서 제2 광학 상태로 변경되지 않도록 한다.

이는 세척 단계가 필요 없다는 점에서, 다른 디지털 분석 방법에 비해 상당한 이점을 제공한다. 이러한 방식으로, 본 발명의 방법은 균질한 분석이다. 기존의 분석에서, 결합되지 않은 리포터 시약이 결합된 리포터 시약에 의해 생성된 신호를 방해하기 때문에, 임의의 측정을 수행하기 전에 결합되지 않은 리포터 시약을 결합된 리포터 시약에서 분리해야 한다. 그러나, 본 발명에 의해 제공되는 국부적인 표면 변화로 인해, 결합된 리포터 시약과 결합되지 않은 리포터 시약이 구별될 수 있다. 실제로, 기재(17)의 표면에 근접한 리포터 시약(즉, 결합된)과 벌크 용액(즉, 결합되지 않은) 내의 리포터 시약을 구별하는 능력은 본 발명의 특별한 이점이다. 바람직하게는, 단계 (i) 내지 (iii)은 세척 단계의 부재 하에 수행되며, 즉 방법은 단계 (i), (ii) 및 (iii)에서 기재로부터 시료를 제거하지 않고 수행된다.

결합된 리포터 시약 부분의 감광제는 광학 성분과 직접 상호 작용하여 변화를 일으키거나(예를 들어, 감광제가 여기되어 이 에너지를 광학 성분으로 직접 전달함), 광학 성분과 간접적으로 상호 작용하여 추가 시약을 통해 변화를 일으킨다(예를 들어, 감광제는 여기되어, 이 에너지를 추가 구성요소로 전달한 후, 이 에너지를 광학 성분으로 전달한다).

바람직한 양태에서, 감광제에 의한 흡수는 혼합물에 존재하는 예비-활성화제 시약과 상호작용하여 활성화제 시약을 생성하기 위한 것이고, 상기 활성화제 시약은 광학 성분과 상호작용하여, 제1 광학 상태에서 제2 광학 상태로 변하도록 하기 위한 것이다.

예비-활성화제 시약은 시료에 존재할 수 있거나, 예비-활성화제 시약은 시료와 리포터 시약의 혼합물에 추가 시약으로서 첨가될 수 있다. 바람직한 양태에서, 예비-활성화제 시약은 삼중항 산소(triplet oxygen)이다. 다른 바람직한 양태에서, 활성화제 시약은 반응성 산소 종(ROS)이다. 바람직하게는, ROS는 하이드록실 라디칼, 슈퍼옥사이드, 퍼옥사이드, 유기 퍼옥사이드, 퍼옥시나이트라이트, 일중항 산소(singlet oxygen) 및 이들의 혼합물로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 활성화제 시약은 일중항 산소이다. 일중항 산소는 짧은 반감기와 유한한 확산 경로 길이(수성 조건 하에서 최대 200 nm)를 가지기 때문에 바람직한 활성화제 시약이다.

이론에 구속되는 것은 아니지만, 감광제는 빛을 흡수하여 시료에 존재하고 리포터 시약에 근접하여 일중항 산소를 생성하는 산소와 시스템간 교차(ISC)를 겪을 수 있는 여기 상태를 생성하는 것으로 믿어진다. 그 후, 일중항 산소는 하기에서 논의되는 바와 같이 광학 성분과 계속 상호작용한다. 특히 바람직한 양태에서, 예비-활성화제 시약은 삼중항 산소이고, 활성화제 시약은 일중항 산소이다.

일중항 산소는 이전에 발광 산소 채널링 면역분석(LOCI)의 면역분석에 사용되었다. LOCI 면역분석은 공여자 및 수용자 비드를 사용하는 균질한 비디지털 분석이다. 공여자 비드는 680 nm에서 조명 시 일중항 산소를 생성하고, 수용자 비드는 일중항 산소에 의해 활성화될 때 화학 발광 신호를 생성한다. 수용체 비드에 대한 공여자의 결합은 항체-항원 결합에 의해 촉진된다. 반응 혼합물은 일반적으로 0.5~1.0초 동안 조명된 후, 발광 신호가 0.5~1.0초 동안 측정된다. 결정적으로, 측정은 결합되지 않은 모든 공여자 및 수용자 비드가 있는 상태에서 발생한다. 비드의 공간적 분리는 배경 신호를 최소화하고; 그러나, LOCI 분석은 짧은 측정 시간으로 인해 수명이 긴 결합 이벤트와 일시적인 결합 이벤트를 구별할 수 없다. 이 분석은 가장 민감한 분석, 예를 들어 인터루킨 6(IL-6) 또는 갑상선 자극 호르몬(TSH)에 대해 약 1-5 pg/mL의 검출 한계를 달성할 수 있다. 본 발명의 방법은, 리포터 시약인 "공여자" 입자가 용액 중의 입자가 아니라 기재(17)의 표면에 근접해야 신호가 검출되기 때문에 배경 신호를 더욱 최소화하고, 조명 기간 동안에도 있어야 한다. 따라서, 본 발명의 방법은 LOCI 분석보다 더 민감하고 더 낮은 농도의 분석물을 검출할 수 있다.

바람직한 양태에서, 광학 성분은 염료이다. 바람직하게는, 광학 성분은 하기 염료 및 이들의 혼합물 중 하나로부터 선택된다:

염료 (1)-(5)가 알려져 있으며, 산화 스트레스 하에 세포에서 ROS 형성을 모니터링하기 위한 세포 프로브(cellular probe)로서 사용된다. 그러나, 이러한 염료는 표준 또는 디지털 면역분석에 사용하기 위한 것으로 알려져 있지 않다. 염료(6)는 일반적인 형광 염료이다. 알렉사플루오르(Alexafluor) 염료, 보디피(BODIPY) 염료, 로다민(rhodamine) 염료, 텍사스 레드(Texas red), 오레곤 그린(Oregon green), 캐스케이드 옐로우(Cascade yellow), 퍼시픽 블루(Pacific blue) 등을 포함하여 상업적으로 입수 가능하고 본 발명에 사용하기에 적합한 다양한 다른 형광 염료가 있다. 추가 예는 The Molecular Probes Handbook, Thermo Fisher Scientific을 참조한다.

SOSG(Dye singlet oxygen sensor green)(1)은 일중항 산소와 반응하여, 약한 형광성 형태에서 높은 형광성 형태로 변한다. 일중항 산소는 안트라세닐기와 반응하여 엔도퍼옥사이드를 형성한다. 바람직한 양태에서, 광학 성분은 SOSG이다.

염료 붕소-디피로메텐_581/591(BODIPY_581/591)(2)은 일중항 산소 및 하이드록실 라디칼과 같은 활성 산소 종과 반응하여, 형광 여기/방출 최대값에서 저변색성(hypsochromic) 이동을 유발한다.

염료(3)-(5)는 동일한 코어 구조를 공유하고, 일중항 산소를 포함한 일반 산화제와 반응하여, 형광 형태로 전환된다. 따라서, 이러한 염료는 류코 상태에서 형광 상태로 전환될 수 있다.

염료(6)는 일중항 산소와 반응하여, 형광성 형태에서 비형광성 형태로 전환시키는 것으로 밝혀졌다. 플루오레세인을 사용하여, 놀랍게도 감광제 부근의 형광을 완전히 제거하여 형광 기재에 어둡고 비형광 영역을 생성할 수 있다는 것이 발견되었다. 따라서, 바람직한 양태에서, 광학 성분은 플루오레세인이다. 보다 바람직하게는, 광학 성분은 플루오레세인이고, 제1 광학 상태는 형광성이며, 제2 광학 상태는 비형광성이다. 가장 바람직하게는, 광학 성분은 플루오레세인이고, 제1 광학 상태는 형광성이며, 제2 광학 상태는 비형광성이며, 국부 영역의 세트는 기재 상의 어두운 비형광성 영역이다.

바람직하게는, 제1 및 제2 광학 상태 중 하나에 있을 때 광학 성분은 형광성이고, 제1 및 제2 광학 상태 중 다른 하나에 있을 때 광학 성분은 비형광성이다. 하나의 양태에서, 제1 광학 상태에 있을 때 광학 성분은 비형광성이고, 제2 광학 상태에 있을 때 광학 성분은 형광성이다. 그러나, 보다 바람직하게는, 제1 광학 상태에 있을 때 광학 성분은 형광성이고, 제2 광학 상태에 있을 때 광학 성분은 비형광성이다.

다른 바람직한 양태에서, 제1 광학 상태에 있을 때 광학 성분은 하나 이상의 파장에서 형광을 발하고, 제2 광학 상태에 있을 때 광학 성분은 하나 이상의 다른 파장에서 형광을 발한다. 이 양태에서, 광학 성분은 그것의 형광 여기/방출 최대치를 이동시킨다.

바람직하게는, 제1 광학 상태에서 제2 광학 상태로의 변화는 비가역적이다. 이는 광학 상태의 변화가 일어난 영역을 식별하기 위해 기재의 후속 스캐닝을 허용한다.

본 발명의 방법의 단계 (iv)는 기재 상에서 제2 광학 상태를 갖는 국부 영역의 세트를 검출하는 것을 포함한다.

제2 광학 상태를 갖는 광학 성분은 기재 상에 한 세트의 국부 영역을 형성한다. 유리하게는, 제2 광학 상태를 갖는 국부 영역은 개별 결합 이벤트로서 카운팅될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 디지털 분석을 수행하는데 적합하다. 그러나, 광학 구성 요소의 대부분이 제2 광학 상태에 있도록 결합 이벤트가 많은 경우 대량 변화가 감지될 수 있다.

바람직한 양태에서, 기재 상의 제2 광학 상태를 갖는 국부 영역의 세트는 기재 상의 제2 광학 상태를 갖는 국부 영역의 세트 내의 국부 영역을 카운팅함으로써 또는 벌크 속성으로 기재 상의 제2 광학 상태를 갖는 국부 영역의 세트를 측정함으로써 검출된다. 보다 바람직하게는, 기재 상의 제2 광학 상태를 갖는 국부 영역의 세트는 기재 상의 제2 광학 상태를 갖는 국부 영역의 세트 내의 국부 영역을 카운팅함으로써 검출된다.

제2 광학 상태를 갖는 국부 영역은 제1 및 제2 광학 상태에 따라 배경 신호에 대응하는 임계값 이상이어야 할 수 있다. 예를 들어, 시료는 일부 배경 자동 형광성이 있을 수 있지만, 이것이 임계값을 초과하지 않는 경우, 분석의 디지털 특성으로 인해 신호에 영향을 미치지 않아야 한다. 배경 자동 화학 발광은 발생하지 않는 경향이 있다.

또한, 기재의 표면을 스캐닝하여, 감광제 조사 전에 표면의 2D 이미지를 제공한 후, 조사 후에 스캐닝할 수 있으며, 시료 자체 또는 표면 상에 인공물, 오염 물질 및 임의의 자가형광으로부터의 간섭을 줄이기 위해 사전 조명 이미지는 사후 조명 이미지에서 배경 차감된다. 따라서, 바람직한 양태에서, 본 발명의 방법은 (iv) 단계에서 검출된 기재 상의 제2 광학 상태를 갖는 국부 영역의 세트로부터 전자기 방사선을 장치에 조사하기 전에 검출된 기재 상의 제2 광학 상태를 갖는 임의의 성분을 감산하는 단계를 더 포함한다. 이러한 방식으로, 배경을 뺀 이미지는 기재의 광학적 특성(예를 들면, 형광 강도의 변화)에 대한 변화만 표시할 것이다.

기재 상의 제2 광학 상태를 갖는 국부 영역의 세트는 일반적으로 기재 상의 개별 영역이다. 그러나, 일부 국부 영역은 이들의 형태로 인해 검출에서 제외될 수 있다. 개별 바인딩 이벤트에 해당하는 국부 영역은 균일하고 원형인 경향이 있지만, 일부 로컬 영역은 인공물에 해당하는 불규칙한 모양일 수 있다. 또한, 일부 로컬 영역은 입자가 함께 뭉친 다른 영역보다 더 클 수 있다. 따라서, 바람직한 양태에서, 기재 상의 제2 광학 상태를 갖는 균일한 원형 국부 영역만이 검출된다.

기재 상의 국부 영역의 세트는 간단한 광학 수단을 사용하여 검출될 수 있다. 바람직한 양태에서, 기재 상의 제2 광학 상태를 갖는 국부 영역의 세트는 광학 현미경을 사용하여 검출된다. 검출에 적합한 광학 설정을 도 9에 나타냈다. 보다 바람직하게는, 기재 상의 제2 광학 상태를 갖는 국부 영역의 세트는 광시야 현미경을 사용하여 검출된다. 광시야 현미경은 한 번에 하나의 단일 초점(focal spot)만 조명되고 기록되는 공초점 현미경과 같은 보다 복잡한 기술과 비교하여 전체 시료가 동시에 조명되고 이미지화되는 가장 간단한 형태의 현미경이다. 공초점 현미경의 이점은 초점이 맞지 않는 연무를 제거하고 시료의 깊이를 통해 이미지 스택을 촬영할 수 있어 대비가 증가하는 것이다. 광활성화 국소화 현미경(PALM 또는 FPALM) 및 확률적 광학 재구성 현미경(STORM)과 같은 초해상도 현미경 기술도 알려져 있다. 이러한 방법은 단순한 광시야 방법에 비해 복잡성과 비용이 추가되었다.

염료 (1) 및 (3)-(5)를 사용하는 경우, 광학 성분이 제2 광학 상태로 전환되는 기재 표면 상에서 형광 핫스팟(hotspot)(또는 결합 이벤트가 많은 경우, 형광 증가)이 관측될 수 있다. 이 형광을 검출하기 위해, 기재는 염료의 여기 파장에서 조명될 수 있고, 기재의 표면은 발광을 위해 스캐닝될 수 있다.

염료(2)를 사용하는 경우, 610 nm에서 형광 방출의 감소 또는 515 nm에서 형광 방출의 증가는 측정될 수 있거나, 두 파장은 모두 모니터링될 수 있다.

염료(6)를 사용하면, 광학 성분이 제2 광학 상태로 전환된 기재의 표면 상에 어두운 스팟(dark spot)(또는 결합 이벤트가 많은 경우, 어두운 이미지)이 관측될 수 있다. 이러한 어두운 스팟 또는 이미지를 검출하기 위해, 플루오레세인 검출에 적합한 여기 및 방출 필터(예를 들면, 490 nm에서의 여기 및 520 nm에서의 방출)를 사용하여, 광원(예를 들어, LED)과 광 검출기(예를 들어, 광전자 증배관 또는 CCD와 같은 카메라)가 있는 광시야 형광 현미경이 사용될 수 있다.

감광제는 결합 이벤트가 발생할 때 기재에 근접한다. 즉, 감광제는 광학 성분과 상호작용하고 장치의 조사에 따라 이를 제1 광학 상태에서 제2 광학 상태로 변환하기 위해 기재의 표면에 충분히 가깝다. 그러나, 감광제와 기재 표면 사이의 실제 거리는, 감광제의 크기와 성질, 결합 성분의 크기와 성질, 리포터 시약과 분석 물질, 및 시료 매체의 특성에 따라 달라질 것이다.

결합 성분은 시료 내 분석물의 농도에 비례하여 리포터 시약을 결합할 수 있는 결합 부위가 있다. 결합은 분석물의 농도에 대한 임의의 의미 있는 측정값을 결정하기 위해, 분석물의 농도에 의존해야 하므로, 비례성은 분석의 기능에 중요하다. 결합은 수행되는 분석 유형에 따라 분석물의 농도에 정비례하거나 간접적으로 비례할 수 있다. 면역 측정 분석과 같은 비경쟁적 분석의 경우, 결합은 분석물의 농도에 정비례하지만, 경쟁적 분석의 경우, 결합은 분석물의 농도에 간접적으로 비례한다.

분석물에 대한 항체가 기재에 고정되고, 분석물의 표지된 유사체가 시료에 도입되는 특정 유형의 경쟁 분석이 제공된다. 그 후, 분석물과 분석물의 표지된 유사체는 표면 상의 항체를 놓고 "경쟁"한다. 분석물이 없는 경우, 표지된 유사체는 가능한 최대 속도로 결합할 것이다. 그러나, 분석 물질이 있는 경우, 기재의 항체가 분석 물질로 채워지고, 유사체의 결합 속도가 감소된다.

결합 성분은 분석물, 또는 분석물의 복합체 또는 유도체에 결합하도록 적응될 수 있으며, 이 경우 리포터 시약은 분석물, 또는 분석물의 복합체 또는 유도체의 존재 하에 결합 성분에 결합할 것이다. 이 경우, 결합 성분은 분석물 또는 분석물의 복합체 또는 유도체의 존재 하에 리포터 시약에 결합할 수 있는 결합 부위를 갖는다. 그러나, 결합은 여전히 분석물의 농도에 비례한다.

대안적으로, 결합 성분 자체는 분석물의 유사체일 수 있고, 리포터 시약은 결합 성분에 직접 결합한다(이는 공유 결합 또는 비공유 상호작용을 통해 기재의 표면에 결합되기 때문에 유사체이다). 이 경우, 결합 성분은 리포터 시약의 결합에 대해 결합되지 않은 분석물, 또는 분석물의 결합되지 않은 복합체 또는 유도체와 경쟁할 것이다. 따라서, 결합 성분은 단순히 리포터 시약에 결합할 수 있을 것이다.

결합 성분에 대한 리포터 시약의 결합 정도를 결정하면(직접적으로 또는 분석물/분석물의 복합체 또는 유도체에 의해 매개됨) 시료 내 분석물의 농도를 측정할 수 있다.

분석은 또한 리포터 시약의 존재를 필요로 한다. 리포터 시약은 감광제를 포함한다. 감광제는 전자파를 흡수하여 광학 성분과 상호 작용할 수 있다. 이는, 광학 성분이 제1 광학 상태에서 제2 광학 상태로 변경되도록 하는 상호 작용이다.

따라서, 감광제는 이러한 방식으로 전자기 복사와 상호 작용할 수 있는 임의의 재료로 구성될 수 있다. 적절한 감광제는 광역학 요법(PDT) 시약으로서 광역학 요법(PDT)에서 알려져 있다. PDT 시약은 암 치료 및 피부과에서 조명 시 세포를 파괴하는데 사용된다(Shafirstein et al, Cancers, 2017, 9, 12; Wan and Lin, Clinical, Cosmetic and Investigational Dermatology, 2014, 7, 145).

전자기 방사선 조사 시, PDT 시약은 여기된 삼중항 상태로 촉진된다. 이 여기된 삼중항 상태는 I형 과정이라고 하는 세포 구성요소와 직접 상호작용하거나, II형 과정이라고 하는 산소와 상호작용할 수 있다. I형 및 II형 공정 모두 ROS의 형성으로 이어질 수 있다. II형 공정에서, 주요 생성물은 시스템 간 교차 메커니즘을 통한 일중항 산소이다.

일중항 산소는 반응성이 높은 산소의 여기 상태이다. 디일스-알더(Diels-Alder) 유형 반응 및 ene 반응을 포함하여 붕괴되기 전에 여러 반응을 겪을 수 있다. 또한, 황 및 질소 함유 화합물과 일반적인 산화 반응을 겪는다. 일중항 산소의 무분별한 반응성은 광역학 요법에 사용되는 이유 중 하나이다.

포르피린, 클로린(예를 들면, 피로페오포르바이드-a), 프탈로시아닌 및 기타 다방향족 종을 포함하는 광범위한 감광제 화합물이 알려져 있다(예를 들면, Antibody-Directed Phototherapy, Pye et al, Antibodies, 2013, 2, 270 참조).

하나의 양태에서, 감광제는 포르피린, 클로린, 프탈로시아닌 및 기타 다방향족 종으로부터 선택된다. 바람직한 양태에서, 감광제는 피로페오포르바이드-a (pyropheophorbide-a, PPa)이다. PPa는 하기 구조를 갖는다:

피로페오포르바이드-a (PPa)

ROS를 생성하지 않고 반응을 촉진하는 다른 감광제가 사용될 수 있다. 이들은, 환원제의 존재 하에 디클로로디페닐트리클로로에탄의 환원을 촉매하는 Ru(II)-트리스(2,2'-비피리딜) 디클로라이드; 스틸벤과 클로로필의 시스-트랜스 이성질체화를 촉매하고, 이산화탄소와 물의 반응을 촉매하여 탄수화물을 생성하는 벤조페논/에오신을 포함한다. 감광제는 중합 반응을 촉매할 수 있는 것으로 알려져 있으며, 이는 또한 기재의 광학적 특성을 변화시킬 수 있다. 예를 들면, Dyes as Photoinitiators or Photosensitisers of Polymerisation Reactions, Fouassier et al, Materials, 2010, 3, 5130을 참조한다.

결합 성분 및 리포터 시약의 특성은 분석물의 특성에 따라 다르지만, 바람직하게는 항체이다. 본 발명의 방법은 면역분석에 특히 적용할 수 있다. 특히 바람직한 양태에서, 결합 성분은 분석물 또는 분석물의 복합체 또는 유도체에 대해 생성된 항체이고, 리포터 시약은 분석물 또는 분석물의 복합체 또는 유도체에 대해 생성된 항체를 포함한다. 원칙적으로, 각 시약에는 단일 분자가 사용될 수 있지만, 실제로는 결합 성분과 리포터 시약은 분자 집단이다. 용어 "항체"는 바람직하게는 Fab 단편, 단일쇄 가변 단편(scFv), 및 재조합 결합 단편을 그 범위 내에 포함한다.

항체-항원 반응에 대한 대안으로서, 결합 성분, 리포터 시약 및 분석물은 제1 및 제2 핵산이 상보적인 제1 및 제2 핵산, 또는 아비딘 또는 이의 유도체를 함유하는 시약 및 비오틴 또는 이의 유도체를 함유하는 분석물일 수 있고, 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 결합 성분 및 리포터 시약은 또한 앱타머(aptamer)일 수 있다. 이 시스템은 생물학적 분석에 국한되지 않으며, 예를 들어 수중 중금속 검출에 적용될 수 있다. 시스템은 또한 액체로 제한될 필요는 없으며, 공기 중의 효소, 세포 및 바이러스 등의 검출과 같은 임의의 유체 시스템이 사용될 수 있다.

최대 관찰 가능한 신호는 표면에 결합하는 감광제를 모니터링할 때 달성할 수 있는 최대 신호이다. 기재에 대한 입자의 결합은 분석물 및 리포터 시약의 확산 속도에 의해 좌우되며, 이는 결국 이들 성분의 유체역학적 반경과 시료의 점도/온도에 의해 크게 좌우된다.

본 발명의 방법에 사용되는 장치는 측정 시스템의 구성요소의 자연적 변동성, 측정되는 시료의 변동성, 및 측정 동안의 환경 조건의 변동성을 보상하는 제어 장치를 더 포함할 수 있다. 이는 시료를 기재 표면의 시약에 노출시켜 달성할 수 있다. 상이한 시약은 일반적으로 기재 표면의 상이한 영역에 위치하며, 이러한 영역은 상이한 시약으로 코팅된다. 이러한 대조군은 음성 대조군은 분석물이 없을 때 예상되는 신호에 근접해야 하고, 양성 대조군은 분석물이 시스템을 포화되었을 때 예상되는 신호에 근접해야 한다는 의미에서, "음성(negative)" 및 "양성(positive)" 대조군으로 정의된다.

이들 대조군으로 검출을 달성하기 위해, 본 발명의 장치는 바람직하게는 결합 성분, 음성 대조군 시약 및 양성 대조군 시약을 포함하며, 이들 각각은 상기 기술된 바와 같이 기재의 표면에 부착된다.

결합 성분은 상기 기술된 바와 같다.

음성 대조군 시약은 결합 성분보다 분석 조건 하에서 리포터 시약에 대한 친화도가 더 낮다. 따라서, 음성 대조군 시약은 음성 대조군을 제공한다. 분석 조건 하에서 친화도를 고려하는 것은 중요하다. 그 이유는, 비경쟁 분석의 경우, 리포터 시약에 대한 결합 성분의 친화도가 분석물의 존재 또는 분석물의 복합체 또는 유도체의 존재에 의해 조정되기 때문이다. 따라서, 분석물 또는 분석물의 복합체 또는 유도체가 없는 경우, 결합 성분이나 음성 대조군 시약 모두 리포터 시약에 대한 친화력이 없다. 그러나, 분석물 또는 분석물의 복합체 또는 유도체가 있는 경우, 음성 대조군 시약은 결합 성분보다 리포터 시약에 대한 친화도가 더 낮다.

또한, 결합 성분이 분석물, 또는 분석물의 복합체 또는 유도체에 결합하는 양태에서, 음성 대조군 시약은 바람직하게는 분석물 또는 사용되는 경우 분석물의 복합체 또는 유도체에 대해 결합 성분보다 낮은 친화도를 갖는다. 음성 대조군 시약은 바람직하게는 단백질, 보다 바람직하게는 항체이다. 음성 대조군 시약은 일반적으로 결합 성분과 유사한 화학적 및 물리적 특성을 갖지만, 분석 조건 하에서, 리포터 시약에 대한 친화도가 거의 또는 전혀 제공되지 않는다. 특히 바람직한 양태에서, 음성 대조군 시약은 분석 조건 하에서 리포터 시약에 대해 본질적으로 친화성을 갖지 않는다. 바람직하게는, 음성 대조군 시약은 분석물 또는 분석물의 복합체 또는 유도체에 대해 본질적으로 친화성을 제공하지 않는다. 즉, 음성 대조군 시약에 대한 리포터 시약, 또는 적용 가능한 경우 분석물 또는 분석물의 복합체 또는 유도체의 결합은 비특이적이다. 이러한 방식으로, 음성 대조군 시약은 결합 성분에 대한 리포터 시약의 비특이적 결합을 보상할 수 있다.

양성 대조군 시약은 리포터 시약에 결합하고, 리포터 시약에 대한 친화도를 가지며, 이는 분석물 시료의 농도 또는 사용되는 경우 분석물의 복합체 또는 유도체의 농도가 결합 성분보다 덜 영향을 받으므로, 양성 대조군을 제공한다. 바람직하게는, 양성 대조군 시약은 분석물의 농도 또는 분석물의 복합체 또는 유도체의 농도와 본질적으로 독립적인 리포터 시약에 대한 친화도를 갖는다. 보다 바람직하게는, 양성 대조군 시약은 결합 성분보다 분석 조건 하에서 리포터 시약에 대해 더 높은 친화도를 갖는다. 이러한 방식으로, 양성 대조군 시약은 시스템에서 예상되는 최대 신호를 측정한다.

본 발명에 따라 수행된 분석의 동적 범위를 증가시키면서, 또한 정밀도를 개선하기 위해, 결합 성분을 기재 상의 복수의 위치에 갖는 것이 바람직하다. 이러한 위치는 각 위치에서 결합 성분의 농도를 변화시켜 다른 감도로 조정될 수 있다. 각 위치는 다양한 동적 범위에 대한 대조군 역할을 하는 자체 음성 대조군 및 양성 대조군 시약을 가질 수도 있다. 이는 특히 시스템을 구성하는 개별 구성 요소 각각의 농도에 특히 민감한 경쟁 분석에 적용할 수 있다.

상기 설명은 분석이 감광제를 활성화하기 전에 평형에 도달하게 할 수 있지만, 시간 경과에 따라 별개의 기간 동안 감광제를 조명하고 평형에 도달하기 전에 반응 과정에서 발생하는 결합 이벤트를 모니터링하여 결합 이벤트의 동역학을 모니터링할 수도 있다.

분석물은 거대분자 또는 소분자일 수 있다. 거대분자는 일반적으로 단백질 기반 호르몬과 같은 단백질이고, 바이러스, 박테리아, 세포(예를 들면, 적혈구) 또는 프리온과 같은 더 큰 입자의 일부일 수도 있다. 소분자는 약물일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 "소분자"라는 용어는 당업계의 용어로, 단백질 및 핵산과 같은 거대분자와 구별하기 위해 사용된다. 소분자는 면역분석 분야에서 종종 "합텐(hapten)"이라고 하며, 단백질과 같은 큰 담체 분자에 부착될 때 면역 반응을 유발할 수 있는 소분자이며, 호르몬 및 합성 약물과 같은 분자를 포함한다. 이러한 유형의 소분자는 일반적으로 2,000 이하, 종종 1,000 이하, 심지어 500 이하의 분자량을 가질 것이다. 분석물이 결합 성분에 결합하기 전에 화학 반응 또는 초기 복합체 형성 이벤트를 겪을 수 있지만, 결합 성분은 분석물 자체에 결합하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 분석물은 분석 조건의 pH에서 양성자화/탈양성자화될 수 있다. 따라서, 결합 성분에 결합된 분석물은 분석물 자체 또는 분석물의 유도체일 수 있고; 둘 다 본 발명의 범위 내에 포함된다.

바람직한 양태에서, 본 발명은 동일한 시료에서 동시에 다수의 분석물의 존재를 검출하는 데 사용될 수 있다. 각 분석물의 측정을 위해 기재의 다른 위치에서 다른 결합 성분이 사용될 수 있다. 샌드위치 및 경쟁 분석은 병렬로 실행될 수 있으며, 분석은 상기 기술된 바와 같이 음성 및 양성 대조군을 사용하거나, 측정되는 각 분석물에 대해 별도의 대조군이 있을 수 있다.

관심 분석물을 포함하는 것으로 의심되는 시료는 일반적으로 유체 시료, 예를 들면 액체 시료, 그리고 일반적으로 생물학적 시료, 예를 들어 혈액, 혈장, 타액, 혈청, 안내액, 뇌척수액 또는 오줌과 같은 생물학적 시료일 것이다. 시료는 부유 입자를 함유할 수 있으며, 전혈이 될 수도 있다. 바람직한 양태에서, 시료는 처리되지 않고, 보다 바람직하게는 처리되지 않은 유체이다. 처리되지 않은 것은 시료/유체가 리포터 시약 및 기타 분석 성분과 혼합되기 전에 여과, 희석 또는 임의의 기타 전처리 단계에 의해 사전 처리되지 않음을 의미한다. 본 발명의 방법의 이점은, 분석 결과에 과도하게 영향을 미치지 않으면서 현탁된 입자를 포함하는 시료에 대해 분석이 수행될 수 있다는 것이다.

바람직한 양태에서, 시료는 전혈이다. 전혈의 성분이 본 발명의 검출방법을 방해하지 않는 것은 놀라운 일이다. 시료마다 다른 세포 성분에 의한 예측할 수 없는 빛의 산란으로 인해 혈액의 혈장 또는 혈청 성분의 형광을 측정하기 위해 혈액에서 적혈구를 제거하는 것이 일반적이다. 그러나, 본 발명의 방법에서, 형광은 기재 상에서 측정될 것이기 때문에, 그리고 개별 결합 이벤트가 측정될 수 있기 때문에, 측정은 전혈에서 일어날 수 있다.

시료는 일반적으로 마이크로리터 정도이다(예를 들면, 1-100 μL, 바람직하게는 1-10 μL). 유체 시료를 유지하기 위해, 기재는 바람직하게는 하나 이상의 측벽, 상부 표면 및 하부 표면을 갖는 시료 챔버에 위치된다. 따라서, 본 발명의 방법에 사용되는 장치는 바람직하게는 기재와 접촉하여 분석물을 함유하는 시료를 유지하기 위한 챔버를 추가로 포함한다.

배경 간섭의 잠재적인 추가 소스는 시료의 리포터 시약 및 세포 성분을 포함하여 기재 표면에 부유 입자가 침전되는 것이다. 이러한 간섭 소스는 기재를 벌크 용액 위에, 예를 들어 반응 챔버의 상부 표면에 위치시킴으로써 감소될 수 있다. 따라서, 침전이 발생하더라도, 기재를 간섭하지 않는다. 바람직하게는, 기재는 도면에 도시된 바와 같이 상부 표면을 형성한다. 분명히, 광학 및 결합 성분은 시료와의 접촉을 허용하기 위해 챔버의 내부 표면 상에 있을 것이다. 이러한 변형 및 다른 변형은 본 발명의 범위 내에 포함된다.

시료는, 예를 들어 모세관 채널 내부에 표면 장력에 의해 단순히 유지될 수 있다.

리포터 시약 및 선택적으로 하나 이상의 추가 시약은 바람직하게는 본 발명의 방법에 사용되는 장치에 통합된 챔버에 저장된다.

본 발명의 방법은 현장 진료(point-of-care, POC) 시험에서 특히 유용하다. POC 시험은 치료 지점 또는 그 근처에서 진단 시험, 즉 병상 시험으로 정의된다. POC 시험은 편리하고 신속한 시험을 가능하게 하여, 의사 결정 및 분류를 개선하는 동시에 사고 및 응급 치료 및 병상과 같은 병원 자원을 더 잘 할당할 수 있다. 이는 진료 현장에서 시료를 채취한 후 시험를 위해 실험실로 보내는 기존의 시험과 대조된다. 이러한 시험을 통해, 결과를 얻는데 몇 시간 또는 며칠이 걸리는 경우가 많으며, 그 동안 목적하는 정보 없이 계속 관리해야 한다. POC 시험은 종종 휴대용 기기와 함께 시험 키트를 사용한다.

본 발명의 방법은 일반적으로 매우 낮은 존재비로 존재하는 분석물의 농도 또는 존재/부재를 모니터링하는데 특히 유용하다. 잠재적 적용은 심장 질환(예를 들면, 고감도 트로포닌(troponin)), 감염성 질환(예를 들면, C형 간염 핵심 항원), 노화/치매(예를 들면, 알츠하이머병 마커인 아밀로이드 베타 및 타우), 사이토카인 및 종양학(예를 들면, 순환 종양 마커)의 바이오마커 측정을 포함한다.

본 발명은 또한 시료에서 분석물을 검출하기 위한 장치를 제공하며, 상기 장치는 광학 성분 및 기재의 표면에 부착된 결합 성분을 갖는 기재를 포함하며, 상기 광학 성분은 시료 내 분석물의 농도에 비례하여 기재의 표면에 결합된 리포터 시약의 조사된 감광제와의 상호작용에 응답하여 제1 광학 상태에서 제2 광학 상태로 변할 수 있고, 이에 의해 제2 광학 상태를 갖는 광학 성분의 국부 영역의 세트를 기재 상에 형성한다.

장치의 특징은 본 발명의 방법에 사용되는 장치에 대해 상술한 바와 같다.

바람직한 양태에서, 장치는 시료와 리포터 시약의 혼합물을 유지하기 위한 챔버를 추가로 포함한다.

본 발명의 장치는 전자기 방사선을 생성하도록 구성된 방사선 소스 및 제2 광학 상태에서 광학 성분을 검출하여 기재에 대한 감광제의 위치를 정밀하게 결정할 수 있도록 하는 검출기를 포함할 수 있다.

본 발명의 장치는 별도의 판독기와 함께 사용되는 카트리지의 형태를 취할 수 있다. 판독기는 방사선 소스와 검출기를 통합할 수 있다. 판독기는 바람직하게는 휴대용 판독기이다. 바람직하게는, 장치는 카트리지를 포함하고, 기재는 카트리지 내에 있고, 장치는 기재 상의 제2 광학 상태를 갖는 국부 영역의 세트를 검출하기 위한 검출기를 추가로 포함한다. 본 발명은 또한 본 명세서에 정의된 바와 같은 기재 및 광학 및 결합 성분을 포함하는 카트리지를 제공할 수 있다. 카트리지는 바람직하게는 일회용 카트리지이다.

본 발명은 또한 샘플에서 분석물을 검출하기 위한 시스템을 제공하고, 상기 시스템은, 본 발명의 장치; 및 시료를 포함하는 혼합물을 형성하기 위한 리포터 시약으로, 상기 리포터 시약은 감광제를 포함하고, 상기 감광제는 전자기 방사선을 흡수하여 광학 성분과 상호작용하여 광학 성분을 제1 광학 상태에서 제2 광학 상태로 변경할 수 있는, 리포터 시약을 포함한다.

바람직하게는, 감광제는 전자기 방사선을 흡수하여 혼합물에 존재하는 예비-활성화제 시약과 상호작용하여 활성화제 시약을 생성할 수 있고, 활성화제 시약은 광학 성분과 상호작용하여 제1 광학 상태로부터 제2 광학 상태로 광학 성분을 변경할 수 있다.

바람직한 양태에서, 본 발명의 시스템은 본질적으로 상기 기술된 특징들로 구성된다. "본질적으로"는 분석을 수행하는데 다른 기능이 필요하지 않음을 의미한다.

본 발명은 이제 본 발명을 제한하려는 의도가 아닌 하기 실시예를 참조하여 기술할 것이다.

실시예

비오틴화된 BSA는 당업계에 공지된 기술에 따라 제조하였다. 캡슐화된 일중항 산소 감광제가 있는 Alphascreen 공여자 비드는 Perkin Elmer에서 공급되었다.

실시예 1

70 kD 아미노덱스트란-비오틴-플루오레세인 접합체

10 mg의 아미노덱스트란(70 kD)을 칭량하여 유리 바이알에 넣고, 100 mM 인산칼륨 완충액에서 2 mg/mL로 만들었다. 이 용액 250 μL를 2 mL 동결 튜브(cryotube)에 분배했다. 4 mg/mL 비오틴-N-하이드록시 숙신이미드(NHS) 에스테르 용액을 DMSO에 만들고, 16.2 μL을 동결 튜브에 첨가했다. 시료를 20 ℃에서 30분 동안 롤러 상에서 혼합하는 한편, 20 mg/mL 플루오레세인-NHS 에스테르 용액을 DMSO에서 제조하였다.

비오틴-NHS 에스테르와 30분간 반응시킨 후, 20 mg/mL 플루오레세인-NHS 에스테르 용액 8.5 μL를 첨가하고, 20 ℃에서 추가로 60분 동안 롤러 상에서 혼합하였다. 그 후, 10 mg/mL 글리신 용액 11.3 μL를 첨가하여 반응을 급냉시키고, 20 ℃에서 20분 동안 롤러 상에서 혼합하였다. 시료는 Sephadex G-25 PD10 컬럼을 사용하여 50 mM 인산염 완충액으로 탈염시켰다. 농도 및 플루오레세인 혼입을 결정하기 위해 Nanodrop2000 분광 광도계를 사용하여 280 nm 및 495 nm에서 흡광도를 측정했다. 그 후, 시료를 Minisart(Sartorius) 필터를 사용하여 0.2 μm로 여과했다. 계산된 비오틴 및 플루오레세인 혼입은 각각 1.2 및 4.3이었다.

실시예 2

중합된 스트렙타비딘(폴리스트렙타비딘)

중합된 스트렙타비딘을 당업계에 공지된 기술에 따라 제조하였다. 요약하면, 분취량의 스트렙타비딘(1 mg/mL)을 9.7 몰 당량의 SMCC(N-숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트)로 1시간 동안 활성화한 후, 반응물을 글리신으로 급냉시키고, 생성물을 PD10 크기 배제 컬럼에서 탈염시켰다. 동시에, 별도의 스트렙타비딘 분취량을 9.7 몰 당량의 SATA(N-숙신이미딜-s-아세틸-티오아세테이트)와 1시간 동안 반응시킨 후, 하이드록실아민으로 탈염시키고 PD10 크기-배제 컬럼에서 정제했다.

SATA-스트렙타비딘 및 SMCC-스트렙타비딘을 3:2의 몰비로 30분 동안 합한 후, NEM(N-에틸 말레이미드)를 첨가하여 반응물을 급냉시켰다. 그 후, 생성물을 G25 Sephadex 컬럼에서 정제하여, 중합된 스트렙타비딘을 수득했다. 생성물의 농도를 UV-vis 분광법으로 측정하여 1.0 mg/mL로 조정하였다. 더 이상의 특성화는 수행되지 않았다.

실시예 3

기재 표면의 준비 1

직경 6 mm의 구멍이 뚫린 200 μm 두께의 1cm x 1cm 정사각형 조각을 22mm x 22mm 유리 커버 슬립(20)(브랜드, 카탈로그 번호 4700 55)에 부착하여 얕은 웰(21)을 생성했다.

그 후, 30 μL의 비오틴화된 BSA(40 mM 인산 완충액 중 10 μg/mL)를 이 웰에 넣고, 2시간 동안 배양한 후, 세척 완충액(40 mM 인산, 2% 슈크로오스, 0.9% NaCl, 0.03% BSA)으로 세척했다. 그 후, 30 μL의 폴리스트렙타비딘(40 mM 인산 완충액 중 10 μg/mL)을 웰에 첨가하고, 60분 동안 배양한 후, 세척 완충액으로 3회 세척했다. 그 후, 30 μL의 70 kD 아미노덱스트란-비오틴-플루오레세인 접합체(40 mM 인산염 완충액 중 10 μg/mL)를 30분 동안 배양한 후, 세척 완충액으로 3회 세척하고 실온에서 공기 중에서 건조시켰다.

실시예 4

표면에 스트렙타비딘 비드의 결합

스트렙타비딘으로 코팅된 알파스크린(Alphascreen) 공여자 비드(Perkin Elmer 카탈로그 번호 6760002S, 5 mg/mL)를 40 mM 인산염 완충액으로 1/1000 희석한 후, 이 용액 20 μL를 실시예 3의 기재에 첨가하고, 2시간 동안 배양한 후, 세척 완충액으로 3회 세척하고 건조시켰다. 이는 조명기구 위에 녹색 필터(green filter)를 사용하여 낮은 조명 조건에서 수행했다. 스트렙타비딘으로 코팅된 비드는 도 2에 나타낸 바와 같이 아미노덱스트란-비오틴-플루오레세인 접합체의 유리된 비오틴 그룹에 결합한다.

실시예 5

형광층에 비형광 스팟 생성

20 μL의 H₂O를 기재에 추가하고, 전체 표면을 680 nm에서 적색 LED를 사용하여 조명하여 15 mW의 총 광 출력을 제공했고, 이는 도 3에 나타낸 바와 같은 표면에서 대략 0.5 mW/mm²의 광속에 대응한다. 5분간의 조명 후, 액체를 제거하고, 표면을 건조시켰다. 그 후, 기재를 뒤집고, 도 11과 같은 유리 슬라이드 상단에 부착한 후, CoolLED pE-300 조명 소스와 Leica DFC9000GT 디지털 카메라(2048 x 2048 픽셀)를 사용하여 100x 오일 침지 렌즈와 플루오레세인 세트를 사용하여 Leica DMR 광시야 형광 현미경으로 이미지화했다. 도 9는 광학 설정을 보여준다.

도 4는 결합된 비드에 매우 근접한 아미노덱스트란의 염료 분자가 상기 기재된 바와 같이 680 nm에서 조명할 때 비드 3에 의해 생성된 일중항 산소의 플럭스로 인해 형광 형태(14)에서 비형광 형태(15)로 전환되는 방법을 보여준다.

도 12는 현미경 카메라로 촬영한 기재 표면의 일부 이미지이다. 비드가 결합된 별개의 어두운 스팟이 있는 영역을 관찰할 수 있다. 비드가 모여 있는 더 큰 스팟이 있다. 그러나, 더 작고 균일한 스팟은 5분의 조명 기간 동안 표면 근처에 비드가 유지되기 때문에 개별 결합 이벤트로 명확하게 구별될 수 있다.

실시예 6

상기 실시예 3 및 4에 기재된 바와 같이 기재 표면을 제조하고 비드를 표면에 결합시켰다. 그 후, 20 μL의 인간 혈장을 표면에 첨가하고, 상기 실시예 5에 기재된 바와 같이 비드 여기 및 영상화를 수행하였다. 기재 표면의 일부에 대한 현미경 카메라 이미지를 도 13에 나타냈다. 개별적으로 결합된 비드에 해당하는 기재 표면 상에서 불연속적인 어두운 영역이 관찰되며, 이는 인간 혈장의 구성 요소가 조명 단계 동안 활성 염료와의 일중항 산소 반응을 방지하거나 소멸시키지 않음을 보여준다.

실시예 7

상기 실시예 3 및 4에 기재된 바와 같이 기재 표면을 제조하고 비드를 표면에 결합시켰다. 그 후, 20 μL의 신선한 인간 혈액을 표면에 첨가하고, 상기 실시예 5에 기재된 바와 같이 비드 여기 및 영상화를 수행하였다. 기재 표면의 일부에 대한 현미경 카메라 이미지를 도 14에 나타냈다. 개별적으로 결합된 비드에 해당하는 기재 표면에서 불연속적인 어두운 영역이 관측되었으며, 이는 인간 혈액의 세포 구성 요소가 조명 단계 동안 활성 염료와의 일중항 산소 반응을 방지하거나 소멸시키지 않음을 보여준다.

실시예 8

폴리스트렙타비딘 - SOSG (singlet oxygen sensor green) 접합체

SOSG (singlet oxygen sensor green)의 바이알 6개(Thermo Fisher, 카탈로그 번호 S36002, 바이알당 100 μg)를 냉동고에서 꺼내고, 실온에서 30분 동안 해동했다. 그 후, 이들은 메탄올에서 재구성하고, 풀링하여 200 μL의 총 부피를 제공했다. SOSG는 19.1 μL의 N-하이드록시석신이미드(25 mM MES 완충액 중 6 mg/mL)를 추가한 후, 31.9 μL의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드(25 mM MES 완충액 중 6 mg/mL)를 추가하고, 롤러 상에서 20 ℃에서 15분 동안 용액을 혼합함으로써 활성화시켰다. 1 mg/mL 폴리스트렙타비딘 용액(100 mM 인산염 완충액 중) 1 mL을 동결튜브에 분배했다.

15분 배양 후, 활성화된 SOSG 90.7 μL를 첨가하고, 시료를 20 ℃에서 약 65시간 동안 롤러에서 혼합했다. 그 후, 시료를 Sephadex G-25 PD10 컬럼을 사용하여 50 mM 인산염 완충액으로 탈염시켰다. 농도 및 SOSG 혼입을 결정하기 위해 Nanodrop2000 분광광도계를 사용하여 280 nm 및 520 nm에서 흡광도를 측정했다. 25 μL의 Proclin 950을 시료에 첨가한 후, Minisart 필터를 사용하여 0.2 μm까지 여과했다. SOSG 혼입은 스트렙타비딘 단량체 1몰당 1.8몰로 계산했다.

실시예 11

기재 표면의 준비 2

직경 6 mm의 구멍이 뚫린 200 ㎛ 두께의 감압성 접착제(19)의 1cm x 1cm 정사각형 조각을, 22mm x 22mm 유리 커버 슬립(20)(브랜드 GMBH, 카탈로그 번호 4700 55)에 부착하여, 도 10에 도시된 바와 같은 얕은 웰(21)을 생성했다.

그 후, 30 μL의 비오틴화된 BSA(40 mM 인산 완충액 중 10 μg/mL)를 이 웰에 넣고, 2시간 동안 배양한 후, 세척 완충액(40 mM 인산, 2% 슈크로오스, 0.9% NaCl, 0.03% BSA)으로 세척했다. 그 후, 30 μL의 폴리스트렙타비딘-SOSG 접합체(40 mM 인산염 완충액 중 10 μg/mL)를 웰에 첨가하고, 60분 동안 배양한 후, 세척 완충액으로 3회 세척했다. 그 후, 30 μL의 비오티닐화된 항-TSH 항체 5409(해리 상수가 50 pM인 TSH의 알파 및 베타 서브유닛 사이의 접합을 인식함)(40 mM 인산 완충액에서 2 μg/mL)를 30분 동안 배양한 후, 세척 완충액으로 3회 세척하고, 실온에서 공기 중에서 건조시켰다.

실시예 12

항-TSH 항체 5407의 피로페오포비드-a 접합체의 제조

항체 5407(해리 상수가 180 pM인 TSH의 베타 서브유닛을 인식함)은 Medix Biochemica에서 제공되었고, 피로페오포르바이드-a(PPa)는 Frontier Scientific(Logan, Utah)에서 제공되었다. PPa는 숙신이미딜 에스테르로 전환되고, "Targeted photodynamic therapy with multiply-loaded recombinant antibody fragments, Bhatti et al, Int. J. Cancer, 2008, 122, 1155."에 기술된 기술을 사용하여 항체에 결합했다. PPa 몰 혼입은 항체 1몰당 3.5로 계산했다.

실시예 13

불연속 형광 스팟의 생성

기재 표면(17)을 반전시키고, 접착제 이형 라이너를 제거한 후, 기재를 도 11의 프로파일에 도시된 바와 같이 기재 웰의 양쪽에 2개의 작은 구멍(23)이 있는 아크릴 시트(22)에 부착시켰다.

5407-PPa 항체 접합체(10 ng/mL) 및 일련의 희석에 의한 농도 범위(1 nM, 100 pM, 10 pM, 1 pM, 100 fM, 10 fM)에서 TSH로 스파이킹된 TSH 없는 전혈을 함유하는 반응 혼합물을 제조했다. 혼합물(약 6 μL)은 구멍(23) 중 하나를 통해 피펫으로 기재에 전달시킨 후, 구멍(23)을 그리스로 밀봉했다.

챔버를 어둠 속에서 10분 동안 배양한 후, 총 광 출력이 15 mW인 적색 LED를 사용하여 680 nm에서 조명했다. 2분의 조명 후, 기재 표면은 도 9와 상기 기술된 바와 같은 광학 설정을 사용하여 이미지화했다. PPa가 전체 2분 동안 기재 표면에 결합된 곳에서 이산된 형광 영역이 관측될 수 있다. TSH는 50펨토몰의 추정 농도에서 위의 배경 신호와 같이 정량화될 수 있다(0개의 분석물 시료에 대한 스팟 카운트의 표준 편차의 3배).

Claims

시료에서 분석물을 검출하는 방법으로서, 상기 방법은,
(i) 시료와 리포터 시약(reporter reagent)을 포함하는 혼합물을 장치에 제공하는 단계로, 상기 장치는 기재(substrate)의 표면에 부착된 광학 성분(optical component)과 결합 성분(binding component)을 갖는 기재를 포함하는 것인, 단계;
(ii) 상기 결합 성분에 의해, 리포터 시약의 일부를 분석물의 농도에 비례하여 상기 기재의 표면에 결합시키는 단계;
(iii) 리포터 시약의 감광제에 의한 흡수를 위해 전자기 방사선을 장치에 조사하여, 결합된 리포터 시약 부분의 감광제가 광학 성분과 상호작용하여 상기 광학 성분이 제1 광학 상태에서 제2 광학 상태로 변하도록 하고, 이에 의해 기재 상에 제2 광학 상태를 갖는 광학 성분의 국부 영역의 세트를 형성하는 단계; 및
(iv) 상기 기재 상에 제2 광학 상태를 갖는 국부 영역의 세트를 검출하는 단계;를 포함하는 것인, 검출 방법.
제1항에 있어서,
상기 감광제에 의한 흡수는 혼합물에 존재하는 예비-활성화제 시약(pre-activator reagent)과 상호작용하여 활성화제 시약을 생성하기 위한 것이고, 상기 활성화제 시약은 광학 성분과 상호작용하여 제1 광학 상태에서 제2 광학 상태로 변하도록 하기 위한 것인, 검출 방법.
제2항에 있어서,
상기 활성화제 시약은 반응성 산소 종인 것인, 검출 방법.
제3항에 있어서,
상기 반응성 산소 종은 일중항 산소(singlet oxygen)인 것인, 검출 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 기재 상에 제2 광학 상태를 갖는 국부 영역의 세트는 광학 현미경을 사용하여 검출되는 것인, 검출 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 광학 상태에 있을 때 광학 성분은 하나 이상의 파장의 빛을 흡수하고, 제2 광학 상태에 있을 때 광학 성분은 하나 이상의 다른 파장의 빛을 흡수하는 것인, 검출 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 및 제2 광학 상태 중 하나에 있을 때 광학 성분은 형광성이고, 제1 및 제2 광학 상태 중 다른 하나에 있을 때 광학 성분은 비형광성인 것인, 검출 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 및 제2 광학 상태 중 하나에 있을 때 광학 성분은 화학 발광성이고, 제1 및 제2 광학 상태 중 다른 하나에 있을 때 광학 성분은 비화학 발광성인 것인, 검출 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 광학 상태에서 제2 광학 상태로의 변화는 비가역적인 것인, 검출 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (i) 내지 (iii)이 세척 단계 없이 수행되는 것인, 검출 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
시료는 비처리된 것인, 검출 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 장치는 1초 이상 동안 전자기 방사선으로 조사되는 것인, 검출 방법.
시료에서 분석물을 검출하기 위한 장치로서, 상기 장치는,
기재의 표면에 부착된 광학 성분 및 결합 성분을 갖는 기재로서, 상기 광학 성분은 시료 내 분석물의 농도에 비례하여 기재의 표면에 결합된 리포터 시약의 조사된 감광제와의 상호작용에 응답하여, 제1 광학 상태에서 제2 광학 상태로 변화하여, 기재 상에 제2 광학 상태를 갖는 광학 성분의 국부 영역의 세트를 형성하는 것인, 기재를 포함하는 것인, 장치.
제13항에 있어서,
상기 장치는 카트리지를 포함하고, 상기 기재는 카트리지 내에 있으며, 상기 장치는 기재 상에 제2 광학 상태를 갖는 국부 영역의 세트를 검출하기 위한 검출기를 더 포함하는 것인, 장치.
시료에서 분석물을 검출하기 위한 시스템으로서, 상기 시스템은,
제13항 또는 제14항에 기재된 장치; 및
시료를 포함하는 혼합물을 형성하기 위한 리포터 시약으로서, 상기 리포터 시약은 감광제를 포함하고, 상기 감광제는 전자기 방사선을 흡수하여, 광학 성분과 상호작용하여, 광학 성분을 제1 광학 상태에서 제2 광학 상태로 변경할 수 있는 것인, 리포터 시약;을 포함하는 것인, 시스템.