MXPA05001679A - Ensayos a base de membrana que usan fluorescencia resuelta con el tiempo. - Google Patents

Abstract

Se proporciona un dispositivo de ensayo a base de membrana para detectar la presencia o la cantidad de un analito que reside en una muestra de prueba. El dispositivo utiliza la fluorescencia resuelta con el tiempo para detectar las senales generadas por las etiquetas fluorescentes excitadas. Debido a que las etiquetas pueden tener un tiempo de vida de emision relativamente larga, la interferencia de fondo de corta vida puede ser practicamente eliminada a traves de una deteccion de fluorescencia retrasada. Ademas, el lector fluorescente resultante puede tener un diseno simple y barato. Por ejemplo, en una incorporacion, el lector puede utilizar un fotodiodo de silicio y un diodo emisor de luz pulsado (LED) para excitar exactamente las etiquetas y detectar la fluorescencia sobre un dispositivo de ensayo a base de membrana sin requerir el uso de componentes costosos tal como monocromatores o filtros opticos de ancho. de banda de emision estrecha.

Description

ENSAYOS A BASE DE MEMBRANA QUE USAN FLUORESCENCIA RESUELTA CON EL TIEMPO Solicitudes Relacionadas La presente solicitud es una continuación en parte de la solicitud de patente de los Estados Unidos de América número de serie 10/228,836, presentada el 27 de agosto de 2002.

Antecedentes de la Invención Los ensayos han sido desarrollados que emplean etiquetas fluorescentes para facilitar la detección del analito. La fluorescencia es generalmente el resultado de un proceso de tres etapas. En la primera etapa, la energía es suministrada por una fuente externa, tal como una lámpara incandescente o un láser, y absorbida por el compuesto fluorescente, creando un estado individual de excitación electrónica. En la segunda etapa, el estado excitado existe por un tiempo finito durante el cual el compuesto fluorescente experimenta cambios de conformación y también es sometido a una multitud de posibles interacciones con su ambiente molecular. Durante este tiempo, la energía del ' estado excitado es parcialmente disipada, produciendo un estado relajado del cual se origina la emisión de fluorescencia. La tercera etapa es la etapa de emisión de fluorescencia en donde la energía es emitida, regresando al compuesto fluorescente a su estado base. La energía emitida es más baja que su energía de excitación (luz o láser) y por tanto de una más larga longitud de onda. Este cambio o diferencia en la energía o la longitud de onda permite que la emisión de energía sea detectada y aislada de la energía de excitación.

La detección de fluorescencia convencional típicamente utiliza el filtrado de la longitud de onda para aislar los fotones de emisión de los fotones de excitación, y un detector que registra los fotones de emisión y produce una salida registrable, usualmente como una señal eléctrica o una imagen fotográfica. Sin embargo, varios problemas existen con las técnicas de detección de fluorescencia convencional. Por ejemplo, la mayoría de los fluidos biológicos poseen una auto-fluorescencia que puede disminuir la exactitud de la detección. El dispositivo de ensayo también puede poseer alguna auto-fluorescencia. Estas interferencias son resaltadas por pequeños cambios de Stokes de muchas de las etiquetas fluorescentes convencionales, por ejemplo, entre 20 a 50 nanómetros .

En respuesta a algunos de los problemas con las técnicas de detección de fluorescencia, fue desarrollada una técnica conocida como la fluorescencia resuelta por tiempo". La fluorescencia resuelta por tiempo involucra la excitación de la etiqueta fluorescente con un corto pulso de luz, entonces esperando un cierto tiempo (por ejemplo, entre aproximadamente 100 a 200 microsegundos) después de la excitación antes de medir la restante señal fluorescente de larga vida. De esta forma, son eliminadas cualesquiera señales de fondo fluorescente de corta vida y la radiación de la excitación diseminada. Aún cuando las técnicas "resueltas por tiempo" han sido exitosamente empleadas en algunos tipos de dispositivos de ensayo, tales instrumentos con base de cubeta, problemas no obstante permanecen en las técnicas que incorporan la resolución por tiempo en otros tipos de dispositivos de ensayo, tales como dispositivos con base de membrana .

En particular, los sistemas resueltos por tiempo convencionales, tales como aquellos con base de mono-cromática, involucran instrumentos muy complejos y caros. Por ejemplo, un típico fluorimetro de laboratorio de grado de investigación es un sistema dual monocromático, con un monocromático utilizado para seleccionar la longitud de onda de la excitación y otro monocromático es utilizado para seleccionar la longitud de onda de la detección. Este nivel de complejidad drásticamente aumenta los costos del sistema y también requiere un instrumento pesado, voluminoso y no portátil. Además, los sistemas de resolución por tiempo convencionales son también problemáticos cuando se usan en conjunto con dispositivos de ensayo con base de membrana. Específicamente, en un dispositivo con base de membrana, la concentración del analito es reducida debido a que es diluido por un liquido que puede fluir a través de la membrana porosa. Desafortunadamente, la interferencia de fondo se vuelve problemática de más a tan bajas concentraciones de analito debido a que la intensidad de fluorescencia a detectarse es relativamente baja. Debido a que la estructura de la membrana también tiende a reflejar la luz emitida, la capacidad del detector de adecuadamente medir la intensidad fluorescente del analito etiquetado es sustancialmente reducida. De hecho, la intensidad de la señal fluorescente emitida es tipicamente de tres o cuatro órdenes de magnitud más pequeña que la luz de excitación reflejada por la membrana porosa.

Como tal, una necesidad actualmente existe para un sistema simple, barato y efectivo para medir la fluorescencia en un dispositivo de ensayo con base de membrana.

Síntesis de la Invención De conformidad con una incorporación de la presente invención, un método para detectar la presencia o la cantidad de un analito que reside en una muestra de prueba es descrita que comprende: i) proporcionar un dispositivo de ensayo por medio de flujo que comprende de una membrana porosa en comunicación de fluido con una etiqueta fluorescente, la etiqueta fluorescente tiene una vida de emisión fluorescente mayor de alrededor de 1 mierosegundo, la membrana porosa define una zona de detección; ii) contactar la etiqueta fluorescente con la muestra de prueba para formar una mezcla (por ejemplo, solución, suspensión, etc.). iii) permitir a la mezcla el fluir a la zona de detección; iv) colocar un lector de fluorescencia resuelta por tiempo próximo a la zona de detección, el lector de fluorescencia comprende una fuente de excitación pulsada y un detector de encerrado por tiempo; v) excitar la etiqueta fluorescente en la zona de detección con la fuente de excitación impulsada, en donde la excitación ocasiona que la etiqueta fluorescente emita una señal de detección; y vi) medir la intensidad de la señal de detección con el detector de encierro por tiempo.

La etiqueta fluorescente puede incluir un quelato lantánido de samario, disprosio, europio, terbio, o combinaciones de los mismos. Además, en algunas incorporaciones, la etiqueta fluorescente puede tener un tiempo de vida de emisión mayor de alrededor de 10 microsegundos , en algunas incorporaciones mayores de alrededor de 50 microsegundos, y en algunas incorporaciones, desde alrededor de 100 a alrededor de 1000 microsegundos . De igual forma, la etiqueta fluorescente puede tener un cambio Stokes mayor de alrededor de 50 nanómetros, en algunas incorporaciones, mayor de alrededor de 100 nanómetros, y en algunas incorporaciones, desde alrededor de 250 a alrededor de 350 nanómetros. Si se desea, la etiqueta puede usarse en conjunto con una microparticula que está modificada con un especifico miembro aglutinante para el analito.

El lector fluorescente puede usarse para exactamente excitar etiquetas y detectar la fluorescencia sobre un dispositivo de ensayo con base de membrana sin requerir el uso de componentes caros, tales como monocromáticos o filtros ópticos de banda ancha de emisión angosta. En una incorporación, por ejemplo, la fuente de excitación pulsada es un fotodiodo de silicio. El lector fluorescente también puede contener cronometrado de circuito (por ejemplo, convertidores A/D, microprocesadores, amplificadores, divisores, osciladores de cristal, transistores, circuitos de golpe, etc.) en comunicación con la fuente de excitación pulsada y el detector encerrado por tiempo para controlar la señal de pulsación y la detecció .

De conformidad con otra incorporación de la presente invención, un método para detectar la presencia o la cantidad de un analito que reside en la muestra de prueba es descrito que comprende: i) proporcionar un dispositivo de ensayo por medio de flujo que comprende una membrana porosa en comunicación fluida con una sonda conjugada que contiene un quelato lantánido, el quelato lantánido que tiene un tiempo de vida de emisión fluorescente mayor de alrededor de 50 microsegundos y un cambio Stokes mayor de alrededor de 100 nanómetros, la membrana porosa definiendo una zona de detección y una zona de calibración; y ii) contactar la sonda conjugada con la muestra de prueba para formar una mezcla; iii) permitir a la mezcla el fluir a la zona de detección y la zona de calibración; iv) colocar un lector fluorescente de resolución por tiempo próximo a la zona de detección y la zona de calibración, el lector fluorescente comprende de un diodo de emisión de luz pulsada y un detector encerrado por tiempo que comprende un fotodiodo de silicio, y combinaciones de los mismos; v) excitar el quelato lantánido a la zona de detección y la zona de calibración con el diodo emisor de luz pulsada, en donde la excitación ocasiona que el quelato lantánido en la zona de detección emita una señal de detección y el quelato lantánido en la zona de calibración emita una señal de calibración; vi) medir la intensidad de la señal de detección y la señal de calibración con el detector de tiempo encerrado; vii) comparar la intensidad de la señal de detección a la señal de calibración, en donde la cantidad del analito dentro de la muestra de prueba es proporcional a la intensidad de la señal de detección calibrada por la intensidad de la señal de calibración.

La etiqueta fluorescente en la zona de detección puede ser excitada simultáneamente o separadamente desde la etiqueta fluorescente en la zona de calibración. De igual forma, la señal de detección y la señal de calibración también pueden medirse simultáneamente o separadamente.

Otras características y aspectos de la presente invención son descritos en mayor detalle abajo.

Breve Descripción de los Dibujos Una completa y autorizada descripción de la presente invención, incluyendo el mejor modo de la misma, dirigida a uno con habilidad en el arte, es señalada más particularmente en el resto de la especificación, que hace referencia a las figuras adjuntas en donde: La Figura 1 es una vista en perspectiva de una incorporación de un dispositivo con base de membrana de la presente invención; La Figura 2 es un diagrama esquemático de una incorporación de un lector fluorescente resuelto por tiempo que puede usarse en la presente invención, incluyendo los componentes electrónicos representativos del mismo; La Figura 3 es un diagrama esquemático de otra incorporación de un lector fluorescente resuelto por tiempo que puede usarse en la presente invención, incluyendo los componentes electrónicos representativos del mismo; La Figura 4 es un diagrama esquemático de otra incorporación de un lector fluorescente resuelto por tiempo que puede usarse en la presente invención, incluyendo los componentes electrónicos representativos del mismo; La Figura 5 es un gráfico de excitación normalizada y de los espectros de emisión para los resultados obtenidos en el Ejemplo 2; La Figura 6 es un gráfico de la intensidad fluorescente normalizada en contra de la concentración del analito (nanogramos por mililitro) para los resultados obtenidos en el Ejemplo 4.

El repetido uso de los caracteres de referencia en la presente especificación y los dibujos son intencionados para representar las mismas o análogas características o elementos de la invención.

Descripción Detallada de las Incorporaciones Representativas Definiciones Como se usa aqui, el término "analito" generalmente se refiere a una sustancia a detectarse. Por ejemplo, analitos pueden incluir sustancias antigénicas, haptenos, anticuerpos, y combinaciones de los mismos. Los analitos incluyen, pero no están limitados a, toxinas, compuestos orgánicos, proteínas, péptidos, microorganismos, amino ácidos, ácidos nucleicos, hormonas, esferoides, vitaminas, drogas (incluyendo aquellas administradas con propósitos terapéuticos así como aquellas administradas por propósitos ilícitos) , drogas intermedias o productos derivados, bacterias, partículas de virus, y metabolicos de o anticuerpos a cualquiera de las anteriores sustancias. Específicos ejemplos de algunos analitos incluyen a ferritina; creatinina quinasa MIB (CK-MB) , digoxina; fenitoina; fenobarbital; carbamazepina; vancomicina; gentamicina; teofilina; ácido valproico; quinidina; hormona leutinizante (LH) ; hormona estimulante del folículo (FSH) , estradiol; progesterona; proteína reactiva C; lipocalina; anticuerpos IgE; vitamina B2 micro-globulina; hemoglobina glicatada (Gly.Hb) ; cortisona; digitoxina; N-acetilprocainamida- (NAPA) ; procainamida; anticuerpos para rubella, tal como rubella-IgG y rubella IgM; anticuerpos al toxoplasmosis, tales como toxoplasmosis IgG (Toxo-IgG) y toxoplasmosis IgM (Toxo-IgM) ; testosterona; salicilatos ; acetaminofen; antígeno de superficie de virus de hepatitis B (HBsAG) ; anticuerpos al antígeno de núcleo de hepatitis B, tales como antígeno de núcleo anti-hepatitis B IgG y el IgM (Anti-HBC) ; virus de inmunodeficiencia humana 1 y 2 (HIV 1 y 2) ; virus de leucemia humana de célula T 1 y 2 (HTLV) ; antígeno e de hepatitis B (HBeAg) ; anticuerpos de antígeno e de hepatitis B (Anti-HBe) ; hormona estimulante de tiroides (TSH) ; tiroxina (T4) ; triiodotironina total (Total T3) ; triiodotironina libre (Libre T3) ; antígeno carcinoembriónico (CEA) ; y proteína alfa fetal (AFP) . Las drogas de abuso y las sustancias controladas incluyen, pero no están limitadas a, anfetaminas; meta-anfetaminas; barbitúricos, tales como amobarbital, secobarbital, pentobarbital, fenobarbital, y barbital; benzodiacepinas, tales como librium y valium; canabinoides, tales como hashish y marihuana; cocaína; fentanil; LSD; meta-acualone; opiáceos, tales como heroína, morfina, codeína, hidromorfona, hidrocodona, metadona, oxicodona, oximorfona, y opio; fenciclidina; y propoxiheno. Otros analitos potenciales pueden describirse en las patentes de los Estados Unidos de América números 6,436,651 otorgada a Everhart y otros y 4,366,241 otorgada a Tom y otros.

Como se usa aqui, el término "muestra de prueba" generalmente se refiere a un material que se sospecha contiene el analito. La muestra de prueba puede usarse directamente como es obtenida de la fuente o siguiendo un previo tratamiento para modificar el carácter de la muestra. La muestra de prueba puede derivarse de cualquier fuente biológica, tal como un fluido fisiológico, incluyendo, sangre, fluido intersticial, saliva, fluido de lente ocular, fluido espinal cerebral, sudor, orina, leche, fluido ascético, ronco, fluido sinovial, fluido peritoneo, fluido vaginal, fluido amniótico, o similares. La muestra de prueba puede ser previamente tratada antes de usar, tal como la preparación de plasma de la sangre, el diluir fluidos viscosos, y similares. Los métodos de tratamiento pueden involucrar la filtración, la precipitación, la dilución, destilación, concentración, el inactivado de los componentes que interfieren, y la adición de reactivos. Además de los fluidos fisiológicos, otras muestras de líquido pueden ser usadas tales como agua, productos alimenticios y similares para el desempeño de los ensayos de producción de alimentos y ambientales. Además, un material sólido que se sospecha que contiene el analito puede usarse como la muestra de prueba. En algunas instancias puede ser benéfico el modificar una muestra de prueba sólida para formar un medio líquido o para liberar el analito.

Descripción Detallada Se hará ahora referencia en detalle a varias incorporaciones de la invención, uno o más ejemplos de los cuales son señalados abajo. Cada ejemplo es proporcionado a modo de explicación de la invención, no de limitación de la invención. De hecho, será aparente para aquellos con habilidad en el arte que varias modificaciones y variaciones pueden hacerse en la presente invención sin apartarse del alcance o del espíritu de la invención. Por ejemplo, las características ilustradas o descritas como parte de una incorporación pueden usarse en otra incorporación para producir aún otra incorporación. Por tanto, se intenta que la presente invención cubra tales modificaciones y variaciones como vienen dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas y sus equivalencias.

En general, la presente invención está dirigida a un dispositivo de ensayo con base de membrana para detectar la presencia o la cantidad de un analito que reside en una muestra de prueba. El dispositivo utiliza fluorescencia resuelta por tiempo para detectar las señales generadas por las etiquetas fluorescentes excitadas. Debido a que las etiquetas pueden tener un tiempo de vida de larga emisión, interferencia de fondo de varias fuentes, tales como luz esparcida y auto-fluorescente, puede ser prácticamente eliminada durante la detección. Además, el lector fluorescente usado en la presente invención puede tener un diseño simple y barato. Por ejemplo, en una incorporación, el lector puede utilizar un diodo de emisión de luz pulsada (LED) y un foto-diodo de silicio para exactamente excitar las etiquetas y detectar la fluorescencia sobre un dispositivo de ensayo con base de membrana sin requerir el uso de componentes caros, tales como mono-cromáticos o filtros ópticos de banda ancha de emisión angosta.

Con referencia a la Figura 1, por ejemplo, una incorporación de un dispositivo de ensayo por medio de flujo 20 puede formarse de conformidad con la presente invención, será ahora descrito en mayor detalle. Como se muestra, el dispositivo 20 contiene una membrana porosa 23 opcionalmente soportada por un material rígido 21. En general, la membrana porosa 23 puede hacerse de cualquiera de una variedad de materiales a través de los cuales la muestra de prueba es capaz de pasar. Por ejemplo, los materiales usados para formar la membrana porosa 23 pueden incluir, pero no están limitados a, materiales naturales, sintéticos, o que ocurren naturalmente que son sintéticamente modificados, tales como polisacáridos (por ejemplo, materiales de celulosa tales como papel y derivados de celulosa, tales como acetato de celulosa y nitrocelulosa) ; poliéter sulfona; membranas de nylon; silicio, materiales inorgánicos, tales como alúmina desactivada, tierra diatomacea, MgSO-a, u otro material dividido finamente inorgánico uniformemente dispersado en una matriz de polímero poroso, con polímeros tales como cloruro de vinil, copolímero vinil cloruro-propileno, y copolímero acetato cloruro de vinil-vinil; tela tanto naturalmente ocurrente (por ejemplo, algodón) y sintética (por ejemplo, nylon o rayón) ; geles porosos, tales como geles de silicio, agarosa, dextran, y gelatina; películas poliméricas, tales como poliacrilamida; y similares. En una particular incorporación, la membrana porosa 23 está formada de materiales de nitrocelulosa y/o de poliéster sulfona. Deberá entenderse que el término "nitrocelulosa" se refiere a esteres de ácido nítrico de celulosa, que pueden ser de nitrocelulosa sola, o un éster mezclado de ácido nítrico y otros ácidos, tales como ácidos carboxílicos alifáticos que tienen desde 1 a 7 átomos de carbono.

El dispositivo 20 también puede contener una almohadilla de transmisión 28. La almohadilla de transmisión 28 generalmente recibe fluido que ha migrado a través de toda la membrana porosa 23. Como es bien conocido en el arte, la almohadilla de transmisión 28 puede asistir en promover acción capilar y el flujo de fluido a través de la membrana 23.

Para iniciar la detección de un analito dentro de la muestra de prueba, un usuario puede directamente aplicar la muestra de prueba a una parte de la membrana porosa 23 a través de la cual puede desplazarse. Alternativamente, la muestra de prueba puede primero aplicarse a una almohadilla de muestreo (no mostrada) que está en comunicación de fluido con la membrana porosa 23. Algunos adecuados materiales que pueden usarse para formar la almohadilla de muestreo incluyen, pero no están limitados a, nitrocelulosa, celulosa, almohadillas de polietileno poroso, y papel de filtro de fibra de vidrio. Si se desea, la almohadilla de muestreo puede también contener uno o más reactivos de previo tratamiento de ensayo, ya sea acoplados difusos o no difusos a la misma.

En una incorporación ilustrada, la muestra de prueba se desplaza desde la almohadilla de muestreo (no mostrada) a una almohadilla conjugada 22 que está colocada en comunicación con un extremo de la almohadilla de muestreo. La almohadilla conjugada 22 está formada de un material a través de la cual la muestra de prueba es capaz de pasar. Por ejemplo, en una incorporación, la almohadilla conjugada 22 está formada de fibras de vidrio. Aún cuando solamente la almohadilla conjugada 22 es mostrada, deberá entenderse que las otras almohadillas conjugadas también pueden usarse en la presente invención.

Para facilitar la adecuada detección de la presencia o la ausencia de un analito dentro de la muestra de prueba, las etiquetas son aplicadas en varias ubicaciones del dispositivo 20. Las etiquetas pueden usarse para ambas la detección del analito y para la calibración. Hablando generalmente, al menos una parte de las etiquetas usadas en el dispositivo 20 contienen un compuesto fluorescente. En general, tales compuestos fluorescentes pueden ser moléculas fluorescentes, polímeros, dendrímeros, partículas, y similares.

De conformidad con la presente invención, las etiquetas fluorescentes están configuradas para permitir la "detección fluorescente resuelta por tiempo". La fluorescencia resuelta por tiempo involucra la excitación de la etiqueta fluorescente con un corto pulso de luz, entonces típicamente espera un cierto tiempo (por ejemplo, entre aproximadamente 100 a 200 microsegundos ) después de la excitación antes de la medición de la señal fluorescente de larga vida restante. De esta manera, son eliminadas cualesquiera señales de fondo fluorescentes de corta vida y la radiación de excitación esparcida. Esta capacidad de eliminar la mayoría de las señales de fondo puede resultar en sensibilidades que son 2 a 4 órdenes mayores que la fluorescencia convencional. Por tanto, la detección fluorescente resuelta por tiempo es diseñada para reducir las señales de fondo de la fuente de emisión o desde los procesos de dispersión (resultantes de la dispersión de la radiación de excitación) al tomar ventaja de las características de fluorescencia de ciertos materiales fluorescentes.

Los criterios de selección de las etiquetas particularmente deseadas para la fluorescencia resuelta por tiempo incluyen una relativamente larga vida de larga emisión. Como se indica antes, esto se desea de tal forma que emite su señal después de cualesquiera señales de fondo de corta vida disipadas. Además, una larga vida de larga fluorescencia hace posible el usar circuito de bajo costo para las mediciones fluorescentes encerradas por tiempo. Por ejemplo, las etiquetas fluorescentes usadas en la presente invención pueden tener una vida fluorescente mayor de alrededor de 1 microsegundo, en algunas incorporaciones mayores de alrededor de 10 microsegundos, en algunas incorporaciones mayores de alrededor de 50 microsegundos, y en algunas incorporaciones, desde alrededor de 100 microsegundos a alrededor de 1000 microsegundos. Además, la etiqueta fluorescente también puede tener un "cambio Stokes" relativamente grande. El término "cambio Stokes" es generalmente definido como el desplazamiento de lineas o bandas espectrales de radiación luminiscente a una más larga emisión de longitud de onda que las lineas o bandas de excitación. Un relativamente gran cambio Stokes permite que la excitación de la longitud de onda de la etiqueta fluorescente permanezca aparte de sus longitudes de onda de emisión y es deseable porque una gran diferencia entre la excitación y la emisión de longitudes de onda hace más fácil el eliminar la radiación por excitación reflejada de la señal emitida. Además, un gran cambio Stokes también minimiza la interferencia de las moléculas fluorescentes en la muestra y/o la dispersión de luz debido a las proteínas o los coloides, que están presentes con algunos fluidos del cuerpo (por ejemplo, sangre) . Además, un gran cambio Stokes también minimiza el requerimiento por filtros caros, de alta precisión para eliminar la interferencia de fondo. Por ejemplo, en algunas incorporaciones, las etiquetas fluorescentes tienen un cambio Stokes mayor de alrededor de 50 nanómetros, en algunas incorporaciones mayores de alrededor de 100 nanómetros, y en algunas incorporaciones, desde alrededor de 250 a alrededor de 350 nanómetros.

Un tipo de compuesto fluorescente que tiene ambas una relativamente larga vida de emisión y un relativamente largo cambio Stokes son los quelatos lantánido de samario (Sm(III)), disprosio (Dy (III)), europio (Eu (III)), y terbio (Tb (III)). Tales quelatos pueden exhibir emisión de larga vida, banda angosta, de cambio rojo después de la excitación del quelato en sustancialmente más cortas longitudes de onda. Típicamente, el quelato posee una fuerte banda de excitación ultravioleta debido a un cromóforo localizado cerca del lantánido en la molécula. Subsiguiente a la excitación por el cromóforo, la energía de excitación puede transferirse del cromóforo excitado al lantánido. Esto es seguido por una emisión fluorescente característica del lantánido. Los quelatos de europio, por ejemplo, tienen excepcionalmente grandes cambios Stokes de alrededor de 250 a alrededor de 350 nanómetros, en comparación a solamente alrededor de 28 nanómetros para el fluorescente. También, la fluorescencia de los quelatos de europio son de larga vida, con vidas de alrededor de 100 a alrededor de 1000 microsegundos , en comparación con alrededor de 1 a alrededor de 100 nano-segundos para otras etiquetas fluorescentes. Además, estos quelatos tienen espectros de emisión muy angostos, típicamente que tienen bandas anchas de menos de alrededor de 10 nanómetros a alrededor de 50% de emisión. Un adecuado quelato europio es el N- (p-isotiocianatobencilo) -dietileno triamina ácido tetraacético-Eu+3.

Además, los quelatos lantánido que están inertes, estables, e intrínsecamente fluorescentes en soluciones o suspensiones acuosas también pueden usarse en la presente invención para negar la necesidad por reactivos de formación de micela, que son con frecuencia usados para proteger los quelatos que tienen limitada solubilidad y problemas de templado en soluciones o suspensiones acuosas. Un ejemplo de tal quelato es el 4- [2- (4-isotiocianatofenilo) etinilo] -2, 6-bis ( [N,N-bis (carboximetil) aminojmetil) -piridino [Referencia: Lovgren, T . , y otros; Clin. Chem. 42, 1196-1201(1996)]. Varios quelatos lantánidos también muestran excepcionalmente altas proporciones de señal a ruido. Por ejemplo, uno de tales quelatos es un tetradentato ß-diquetonato-europio quelato [Referencia: Yuan, J. y Matsumoto, K. ; Anal, de Química 70, 596-601 (1998)]. Además de las etiquetas fluorescentes descritas antes, otras etiquetas que son adecuadas para usar en la presente invención pueden describirse en las patentes de los Estados Unidos de América números 6,030,840 otorgada a Mullinax y otros; 5,585,279 otorgada a Davidson; 5,573,909 otorgada a Singer y otros; 6,242,268 otorgada a Wieder y otros; y 5,637,509 otorgada a Hemmila y otros, las cuales son incorporadas aquí en su totalidad por referencia a la misma para todos los propósitos.

Las etiquetas fluorescentes pueden usarse en una variedad de formas para formar una sonda. Por ejemplo, las etiquetas pueden usarse solas para formar sondas . Alternativamente, las etiquetas pueden usarse en conjunto con polímeros, liposomas, dendrímeros, y otras estructuras a escala micro- o nano para formar sondas. Además, las etiquetas pueden usarse en conjunto con micro-partículas (algunas veces referidas como "gotas" o "micro-gotas") para formar sondas. Por ejemplo, las micro-partículas que ocurren naturalmente, pueden usarse tales como núcleos, micoplasma, plásmidos, plástidos, células mamarias (por ejemplo, fantasmas eritrocitos), microorganismos unicelulares (por ejemplo, bacterias), polisacáridos (por ejemplo, agarosa) , silicio, vidrio, partículas con base de celulosa, y similares. Además, las nano-partículas sintéticas también pueden utilizarse. Por ejemplo, en una incorporación, son utilizadas las micropartículas de látex que están etiquetadas con un tinte fluorescente o coloreado. Aún cuando cualquier micro-partícula de látex puede usarse en la presente invención, las micro-partículas de látex son típicamente formadas de poliestireno, estírenos butadieno, terpolímero estirenoacrílico-vinil, polimetilmetacrilato, polietilmetacrilato, copolímero estireno maléico anhídrido, polivinil acetato, polivinilpirridina, polidivinilbenceno, polibutilenotereftalato, acrilonitrilo, nonilcloruro- acrilatos, y similares, o un aldehido, carboxilo, amino, hidroxil, o derivados hidracida de los mismos . Otras micropartículas adecuadas pueden describirse en las patentes de los Estados Unidos de América números 5,670,381 otorgada a Jou y otros, y la 5,252,459 otorgada a Tarcha y otros, las cuales son aqui incorporadas en su totalidad por referencia a la misma para todos los propósitos.

En algunas incorporaciones, las microparticulas pueden ser magnéticas. Generalmente, un material es considerado "magnético" si es influenciado por la aplicación de un campo magnético, tal como, por ejemplo, si es atraído o reimpulsado o tiene una susceptibilidad o inducción detectable magnética. Por ejemplo, algunos ejemplos de adecuados materiales de respuesta magnética que pueden usarse para impartir propiedades magnéticas a una sonda incluyen, pero no están limitados a, materiales paramagnéticos, materiales súper-paramagnéticos, materiales ferromagnéticos, materiales ferromagnéticos, y materiales meta-magnéticos. Específicos ejemplos son los metales tales como hierro, níquel, cobalto, cromo, manganeso, y similares; elementos de lantánido tales como neodimio, erbio, y similares; aleaciones, tales como aleaciones magnéticas de aluminio, níquel, cobalto, cobre y similares; óxidos tales como óxido férrico (Fe304) , óxido ferroso (Fe203) , óxido de cromo (Cr02) , óxido de cobalto (CóO) , óxido de níquel (NÍO2) , óxido de manganeso (Mn203) , y similares; los materiales del compuesto tales como ferritos y similares; y soluciones sólidas, tales como magnetita con óxido férrico y similares.

Cuando las partículas son utilizadas, tal como se describió antes, el diámetro medio de las partículas puede generalmente variar como se desee dependiendo de factores tales como el tipo de partícula escogida, el tamaño del poro de la membrana, y la composición de la membrana. Por ejemplo, en algunas incorporaciones, el diámetro medio de las etiquetas de la partícula puede estar en el rango desde alrededor de 0.01 mieras a alrededor de 1,000 mieras, en algunas incorporaciones desde alrededor de 0.01 mieras a alrededor de 100 mieras, y en algunas incorporaciones, desde alrededor de 0.01 mieras a alrededor de 10 mieras. En una particular incorporación, las partículas tienen un diámetro medio desde alrededor de 0.1 a alrededor de 2 mieras. Generalmente, las partículas son sustancialmente esféricas en forma, aún cuando otras formas incluyen, pero no están limitadas a, placas, barras, varillas, formas irregulares, etc., y son adecuadas para uso en la presente invención. Como será apreciado por aquellos con habilidad en el arte, la composición, forma, tamaño, y/o densidad de las partículas pueden variar ampliamente.

En algunas instancias, se desea modificar las sondas de alguna manera de tal forma que son más prontamente capaces de unir al analito. En tales instancias, las sondas pueden modificarse con ciertos miembros específicos de unión que son adheridos a los mismos para formar sondas conjugadas. Específicos miembros de unión se refieren a un miembro de un específico par de unión, por ejemplo, dos diferentes moléculas donde una de las moléculas une químicamente y/o físicamente a la segunda molécula. Por ejemplo, los miembros de unión específicos inmuno-reactivos pueden incluir a antígenos, haptenos, aptámeros, anticuerpos, y complejos de los mismos, incluyendo aquellos formados por métodos recombinantes de ADN o de síntesis de péptido. Un anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal, una proteína recombinante o una mezcla o fragmento de los mismos, así como una mezcla de un anticuerpo y de otros miembros específicos de unión. Lós detalles de la preparación de tales anticuerpos y de su compatibilidad para usar como miembros específicos de unión, es bien conocida para aquellos con habilidad en el arte. Otros pares de unión comunes específicos incluyen pero no están limitados a, biotin y avidin, biotin y estreptavidin, proteínas de unión de anticuerpo (tales como proteína A ó G) y anticuerpos, carbohidratos y lectinas, secuencias complementarias nucleótidos (incluyendo secuencias de ácido nucleico de etiqueta y de captura usadas en ensayos de hibridización del ADN para detectar una secuencia de ácido nucleico objetivo), secuencias de péptido complementario incluyendo aquellas formadas por métodos recombinantes, moléculas de efecto y receptoras, hormona y proteína de unión de hormona, cofactores de enzima y enzimas, inhibidores de enzima y enzimas, y similares. Además, específicos pares de unión pueden incluir a miembros que son análogos del original miembro específico de unión. Por ejemplo, un derivado o fragmento del analito, por ejemplo, un analito análogo, puede usarse en tanto que tiene al menos un epitope en común con el analito.

Los específicos miembros de unión pueden generalmente acoplarse a las sondas usando cualquier variedad de técnicas bien conocidas. Por ejemplo, acoplamiento covalente de los miembros específicos de unión a las sondas (por ejemplo, micro-partículas etiquetadas) puede ser utilizado el carboxílico, amino, aldehido, bromoacetilo, yodoacetilo, tiol, epoxi y otros reactores o grupos funcionales de enlace, así como radicales libres residuales y cationes radicales, a través de los cuales puede lograrse una reacción de acoplamiento de proteína. Un grupo funcional de superficie puede también incorporarse como un comonómero funcional debido a que la superficie de la micropartícula puede contener una concentración de superficie relativamente alta de grupos polares. Además, aún cuando las etiquetas de la micropartícula son con frecuencia funcionales después de la síntesis, en ciertos casos, tales como poli (tiofenol) , las micropartículas son capaces de enlazado covalente directo con una proteína sin la necesidad por ulterior modificación. Por ejemplo, en una incorporación, el primer paso de la conjugación es la activación de los grupos carboxilicos sobre la superficie de la partícula usando carboimida. En el segundo paso, los activados grupos de ácido carboxílico son reactivados con un grupo amino de un anticuerpo para formar cualquier unión amida. La activación y/o el acoplado de anticuerpo puede ocurrir en un amortiguador, tal como salino amortiguado con fosfato (PBS) (por ejemplo, pH de 7.2) o 2- (N-morfolino) ácido sulfónico etano (MES) (por ejemplo, pH de 5.3). Como se muestra, las partículas resultantes pueden entonces bloquearse con etanolamina, por ejemplo, para formar la etiqueta conjugada. Además de la unión covalente, otras técnicas de acoplamiento, tales como adsorción física, también pueden utilizarse en la presente invención.

En general, una variedad de dispositivos de ensayo por medio de flujo pueden construirse de conformidad con la presente invención para usar en conjunto con un sistema de detección fluorescente resuelto por tiempo. En este aspecto, varias incorporaciones de la presente invención serán ahora descritas en mayor detalle. Deberá entenderse que, sin embargo, las incorporaciones descritas abajo son solamente ejemplares, y que otras incorporaciones son también contempladas por la presente invención. Por ejemplo, con referencia de nuevo a la Figura 1, un sistema para detectar la presencia de un analito dentro de una muestra de prueba es esquemáticamente ilustrado. Inicialmente, la muestra de prueba que contiene un analito es aplicada a la almohadilla de muestreo (no mostrado) . De la almohadilla de muestreo, la muestra de prueba puede desplazarse a la almohadilla conjugada 22, donde el analito se mezcla con sondas para formar los analitos complejos. En una incorporación, por ejemplo, las sondas son formadas de micro-partículas que son teñidas con una etiqueta de quelato lantánido, tal como se describió antes, y unida a un especifico miembro de unión para el analito de interés. Además, debido a que la almohadilla conjugada 22 está en comunicación de fluido con la membrana porosa 23, los complejos pueden migrar desde la almohadilla conjugada 22 a una zona de detección 31 presente sobre la membrana porosa 23.

La zona de detección 31 puede contener un reactivo de captura inmovilizada que es generalmente capaz de formar una unión química o física con las sondas. Por ejemplo, en algunas incorporaciones, los aglutinantes pueden contener un reactivo de captura biológica. Por ejemplo, en algunas incorporaciones, el reactivo de captura puede ser un reactivo de captura biológica. Tales reactivos de captura biológica son bien conocidos en el arte y pueden incluir, pero no están limitados a, antígenos, haptenos, anticuerpos, proteína A ó G, avidina, estreptavidina, anticuerpos secundarios, y complejos de los mismos. En muchos casos, se desea que los reactivos de captura biológica sean capaces de unir a un miembro de unión específica (por ejemplo, anticuerpo) presente sobre las micro-partículas. Además, puede también desearse el utilizar varios materiales no biológicos para los aglutinantes. Por ejemplo, en algunas incorporaciones, los aglutinantes pueden incluir un poli-electrolito que puede aglutinar a las sondas no capturadas. Los poli-electrolitos pueden tener una red de carga positiva o negativa, a sí como una carga .de red que es generalmente neutral. Por ejemplo, algunos adecuados ejemplos de poli-electrolitos que tienen una carga de red positiva incluyen, pero no están limitados a, polilisina (comercialraente disponible de Sigma-Aldrich Chemical Co. Inc., de St. Louis, Missouri) , polietilenimina; epiclorohidrina-poliaminas funcionales y/o poliamidoaminas , tales como poli (dimetilamina-co-epiclorohidrina) ; polidialildimetil-amonio cloruro ; derivados de celulosa catiónica, tal como copolimeros de celulosa o derivados de celulosa injertada con un monómero soluble en agua de amonio cuaternario y similares. En una particular incorporación, pueden utilizarse, CelQuat® SC-230M ó H-100 (disponible de Nacional Starch & Chemical Inc.), que son derivados de celulosa que contienen un monómero soluble en agua de amonio cuaternario. Además, algunos adecuados ejemplos de poli-electrolitos que tienen una carga de red negativa incluyen, pero no están limitados a ácidos poliacrilicos, tales como poli (etileno-co-ácido metacrilico, sal de sodio) y similares. Deberá también entenderse que otros poli-electrolitos pueden también utilizarse en la presente invención, tales como poli-electrolitos anfifilicos (por ejemplo, que tienen partes polares y no polares) . Por ejemplo, algunos ejemplos de adecuados poli-electrolitos anfifilicos incluyen, pero no están limitados a, poli (espirilo-b-N-metil 2-vinil piridinio yoduro) y poli (espirilo-b-ácido acrilico) , ambos de los cuales están disponibles de Polymer Source, Inc., de Dorval, Canadá.

Estos reactivos de captura sirven como sitios aglutinantes estacionarios para conjugados de sonda y complejos de analito. En algunas instancias, los analitos, tales como anticuerpos, antigenos, etc., tienen dos sitios aglutinantes. Al alcanzar la zona de detección 31, uno de estos sitios aglutinantes es ocupado por el especifico miembro aglutinante de las sondas complejas. Sin embargo, el libre sitio aglutinante del analito puede aglutinar al reactivo de captura inmovilizado. Al ser atado al reactivo de captura inmovilizado, las sondas complejas forman un nuevo complejo intercalado ternario .

La zona de detección 31 puede generalmente proporcionar cualquier número de distintas regiones de detección de tal forma que un usuario puede mejor determinar la concentración de un particular analito dentro de una muestra de prueba. Cada región puede contener los mismos reactivos de captura, o puede contener diferentes reactivos de captura para capturar analitos múltiples. Por ejemplo, la zona de detección 31 puede incluir dos o más distintas regiones de detección (por ejemplo, lineas, puntos, etc.). Las regiones de detección pueden disponerse en forma de lineas en una dirección que es sustancialmente perpendicular al flujo de la muestra de prueba a través del dispositivo de ensayo 20. De igual manera, en algunas incorporaciones, las regiones de detección pueden disponerse en forma de lineas en una dirección que es sustancialmente paralela al flujo de la muestra de prueba a través del dispositivo de ensayo.

Aún cuando la zona de detección 31 puede indicar la presencia de un analito, es con frecuencia difícil de determinar la concentración relativa del analito dentro de la muestra de prueba usando solamente una zona de detección 31. Por tanto, el dispositivo de ensayo 20 puede también incluir una zona de calibración 32. En esta incorporación, la zona de calibración 32 está formada sobre la membrana porosa 23 y está colocada hacia debajo de la zona de detección 31. La zona de calibración 32 es proporcionada con un reactivo de captura que es capaz de aglutinar a cualesquiera sondas restantes no capturadas que pasan a través de la longitud de la membrana 23. En particular, al ser contactada con la muestra de prueba, cualquiera de las sondas no capturadas que no aglutinan al analito migra a través de la zona de detección 31 y entran en la zona de calibración 32 de la membrana porosa 23. En la zona de calibración 32, estas sondas no capturadas entonces aglutinan a los reactivos de captura. Los reactivos de captura utilizados en la zona de calibración 32 pueden ser los mismos o diferentes que los reactivos de captura usados en la zona de detección 31. Además, similar a la zona de detección 31, la zona de calibración 32 también puede proporcionar cualquier número de regiones de calibración distintas en cualquier dirección de tal forma que un usuario puede mejor determinar la concentración de un particular analito dentro de una muestra de prueba. Cada región puede contener los mismos reactivos de captura, o puede contener diferentes reactivos de captura para capturar diferentes etiquetas fluorescentes.

Las regiones de calibración pueden ser previamente cargadas sobre la membrana porosa 23 con diferentes cantidades del aglutinante de tal forma que una diferente intensidad de señal es generada por cada región de calibración con la migración de las sondas no capturadas. La cantidad total del aglutinante dentro de cada región de calibración puede variarse al utilizar las regiones de calibración de diferentes tamaños y/o al variar la concentración o volumen del aglutinante en cada región de calibración. Si se desea, un exceso de moléculas de sonda puede emplearse en el dispositivo de ensayo 20 de tal forma que cada región de calibración alcanza su potencial completo y predeterminado por intensidad de la señal. Esto es, la cantidad de sondas no capturadas que son depositadas sobre las regiones de calibración son predeterminadas debido a que la cantidad de aglutinante empleado sobre las regiones de calibración es fijado a un nivel predeterminado y conocido.

Una vez capturada, la señal fluorescente de las sondas en las zonas de detección y de calibración 31 y 32 puede medirse usando un lector de fluorescencia resuelta por tiempo 50. Por ejemplo, en esta incorporación, el lector de fluorescencia 50 es construido para emitir la luz pulsada simultáneamente sobre las zonas de detección y de calibración 31 y 32. El lector 50 también puede simultáneamente recibir la señal fluorescente desde las etiquetas excitadas en las zonas de detección y de calibración 31 y 32. Alternativamente, el lector de fluorescencia 50 puede construirse para sucesivamente emitir luz pulsada sobre la zona de detección 31 y la zona de calibración 32. Además, un separado lector de fluorescencia (no mostrado) también puede usarse para medir la señal fluorescente en la zona de calibración 32.

La construcción del lector de fluorescencia 50 puede generalmente variar dependiendo de una variedad de factores, tales como costo, el nivel de exactitud requerido, la naturaleza y concentración del analito de interés, y similares. Típicamente, el lector de fluorescencia 50 utiliza una o más fuentes de excitación pulsadas y de foto-detectores que están en comunicación unos con otros y otros opcionales componentes, tales como filtros ópticos. El uso de la excitación pulsada y de la detección encerrada por tiempo, opcionalmente combinadas con filtros ópticos, permite por la especifica detección de la fluorescencia desde solamente la etiqueta fluorescente, rechazando la emisión de otras especies presentes en la muestra que son típicamente de corta vida.

Por ejemplo, con referencia a la Figura 2, una incorporación de un ejemplar lector de fluorescencia 50 es mostrada que incluye una fuente de excitación 52 y un detector 54. Varias fuentes de excitación 52 pueden usarse en la presente invención, incluyendo, por ejemplo, diodos de emisión de luz (LED) , linternas, asi como otras adecuadas fuentes. La iluminación de excitación también puede ser multiplex y/o colimado; por ejemplo, rayos de varias discretas frecuencias de múltiples fuentes coherentes (por ejemplo, láser) pueden colimarse y multiplex usando una formación de espejos dicroicos . Además, la iluminación puede ser continua o pulsada, o puede combinar onda continua (CW) e iluminación pulsada donde múltiples rayos de iluminación son multiplex (por ejemplo, un rayo pulsado es multiplex con un rayo de onda continua (CW) ) , permitiendo la discriminación de señal entre la fluorescencia inducida por la fuente de onda continua (CW) y la fluorescencia inducida por la fuente pulsada. Por ejemplo, diodos de galio arsénido LED (por ejemplo, diodos rojos de aluminio galio arsénido, diodos verdes de galio fosfito, diodos verdes de galio arsénido fosfito, o diodos de indio galio nitrido violeta/azul/ultravioleta (ÜV) ) pueden usarse como una fuente de iluminación. Un ejemplo comercialmente adecuado de un diodo de excitación LED ultravioleta adecuado para usar en la presente' invención es el Modelo NSHU550E (Nichia Corporation) , el cual emite de 750 a 1000 micro-watts de energía óptica a una corriente directa de 10 miliamperes (3.5-3.9 voltios) en un rayo con un ancho completo a la mitad máxima de 10 grados, una longitud de onda pico de 370-375 nanometros, y una mitad de ancho espectral de 12 nanometros.

Además, ejemplos de adecuados detectores 54 que pueden usarse en la presente invención incluyen, pero no están limitados a, dispositivos foto-multiplicadores; fotodiodos, tales como fotodiodos de avalancha, fotodiodos de silicio, etc.; dispositivos de carga acoplada lineal (CCD) , dispositivos CID, o reflejantes con base CMOS; y similares. En una incorporación, el sistema fluorescente utiliza un fotodiodo de silicio para la detección fluorescente. Los fotodiodos de silicio son ventajosos en que son baratos, sensibles, capaces de operación de alta velocidad (corto tiempo de levantado y banda ancha) , y fácilmente integrados en la mayoría de otra tecnología semiconductora y de circuito monolítico. Además, los fotodiodos de silicio son físicamente pequeños, lo que les permite estar prontamente incorporados en un sistema para usar en los dispositivos con base de membrana. Si son usados los fotodiodos de silicio, entonces el rango de longitud de onda de la emisión fluorescente debe estar dentro de su rango de sensibilidad, que es de 400 a 1100 nanómetros. Otra opción de detector es una célula fotoconductora de sulfuro de cadmio (CdS) , que tiene la ventaja de tener una sensibilidad espectral similar a aquella de la visión humana (curva fotópica) que puede hacer el rechazo de la radiación de excitación reflejada más fácil.

Opcionalmente, los filtros ópticos (no mostrados) pueden disponerse adyacentes a la fuente de excitación 52 y del detector 54. Los filtros ópticos pueden tener alta transmisión en los rangos de longitud de onda de excitación y baja transmisión en una o más indeseables bandas de longitud de onda para filtrar las indeseables longitudes de onda de la fuente de excitación. Los indeseables rangos de longitud de onda incluyen aquellas longitudes de onda que producen detectable auto-fluorescencia de muestra y/o están dentro de alrededor de 25 a alrededor de 100 nanómetros de las longitudes de onda de excitación máxima y por tanto son potenciales fuentes de ruido de fondo de la iluminación de excitación dispersada. Varios ejemplos de filtros ópticos que pueden utilizarse en la presente invención incluyen, pero no están limitados a, filtros de resina plástica teñida o de gelatina, filtros dicroicos, filtros de interferencia de delgada película de múltiples capas, filtros de plástico o de vidrio, filtros de resina epoxi o de resina transparente curada. En una incorporación, el detector y/o la fuente de excitación puede incrustarse o encapsularse dentro del filtro. Aún cuando los filtros ópticos pueden ser utilizados, un aspecto benéfico de la presente invención es que tales filtros son con frecuencia no requeridos como resultado de la resolución por tiempo. Específicamente, debido al retraso en la emisión fluorescente, los filtros de banda ancha de emisión pueden no requerirse para filtrar cualquier fluorescencia de corta vida emitida por la fuente de excitación .

Refiriéndonos de nuevo a la figura 2, varios circuitos de medición de tiempo son también usados para controlar la excitación pulsada de la fuente de excitación 52 y la medición de la fluorescencia emitida. Por ejemplo, en la incorporación ilustrada, una fuente de reloj 56 (por ejemplo un oscilador de cristal) es empleada para proporcionar una fuente de frecuencia controlada a otros componentes electrónicos en el lector de fluorescencia 50. En ésta incorporación particular, por ejemplo, el oscilador 56 puede generar una señal de 20 megahertz, la cual está proporcionada a un generador de pulsación/impulsor LED 55 y a un convertidor A/D 64. La señal de reloj del oscilador 56 al convertidor A/D 64 controla la velocidad de operación del convertidor A/D 64. Deberá apreciarse que un divisor de frecuencia puede ser utilizado en tales trayectorias de señal respectivas si la frecuencia de operación de un convertidor A/D 64 o si la frecuencia deseada de la entrada de reloj al generador de pulsación/accionador LED 55 es diferente de 20 megahertz. Por tanto, deberá apreciarse que la señal del oscilador 56 puede ser modificada apropiadamente para proporcionar señales de una frecuencia deseada. En algunas incorporaciones, una señal del oscilador 56 también puede ser proporcionada a un microprocesador 60 para controlar su velocidad de operación. Los divisores de frecuencia adicionales pueden ser utilizados en otras trayectorias de señal de acuerdo con la presente invención.

El microprocesador 60 proporciona una entrada de control al generador de pulsación 55 de manera que la señal de 20 megahertz del oscilador 56 es ajustada en forma programada para proporcionar una duración de pulsación deseada y tasa de repetición (por ejemplo una fuente de 1 kilohertz con un ciclo de trabajo de 50%) . La señal del generador de pulsación 55 puede entonces ser proporcionada a la fuente de excitación 52, controlando su tasa de repetición de pulsación y el ciclo de trabajo de iluminación. En algunas incorporaciones, puede ser proporcionado un transistor en la trayectoria de la señal para la fuente de excitación 52, proporcionando por tanto unos medios de interruptor para efectuar una señal de luz pulsada en la fuente de excitación 52.

Como se describió anteriormente, la luz pulsada excita las etiquetas fluorescentes asociadas con los dispositivos de ensayo de objeto. Después de un tiempo de respuesta deseado (por ejemplo alrededor de 100 a alrededor de 200 microsegundos ) , el detector 54 detecta la señal de fluorescencia emitida por las etiquetas fluorescentes excitadas y genera una corriente eléctrica representativa de las mismas. Esta corriente eléctrica puede entonces ser convertida a un nivel de voltaje mediante un preamplxficador de transimpedancia de alta velocidad 78, el cual puede ser caracterizado por un tiempo de colocación relativamente bajo y una recuperación rápida de la saturación. La salida del preamplificador 78 puede entonces ser proporcionada a la entrada de datos de un convertidor A/D 64. Los elementos de amplificador adicionales (tal como un amplificador de ganancia programable) pueden ser empleados en la trayectoria de señal después del preamplificador 78 y antes de un convertidor A/D 64 para dar una señal dentro de un rango de voltaje apropiado en la orilla de cola de la pulsación de excitación para la provisión al convertidor A/D 64. El convertidor A/D 64 puede ser un convertidor de alta velocidad que tenga una tasa de muestra suficiente para adquirir muchos puntos dentro del tiempo de vida de fluorescencia de las etiquetas fluorescentes de objeto.

La ganancia del preamplificador 78 puede ser puesta de manera que los valores de datos caigan debajo de la cuenta A/D máxima (por ejemplo 2047 para un convertidor de 12 bits) sobre la orilla de cola de la pulsación de excitación. Los datos dentro del rango dinámico del convertidor A/D 64 pueden entonces ser primariamente representativos de la señal de fluorescencia deseada. Si el intervalo de muestra es corto en comparación con el tiempo de elevación y el tiempo de caída de la pulsación de excitación, entonces la ganancia del preamplificador 78 puede ponerse para asegurar que los valores de señal dentro del superior de 1/2 o de 3/4 del rango dinámico de un convertidor A/D 78 correspondan a la orilla de cola de la pulsación de emisión.

Un convertidor A/D 64 toma muestras de la señal desde el preamplificador 78 y proporciona esto al microprocesador 60 en donde la instrucción de software está configurada para varios procesamientos de la señal digital. Una salida del microprocesador 60 se proporciona al convertidor A/D 64 para controlar además cuando la señal de fluorescencia detectada es muestreada. Las señales de control al preamplificador 78 (no mostradas) y al convertidor A/D 64 pueden ser continuamente modificadas para lograr la ganancia más apropiada, el intervalo de muestreo, y el descentrado del disparador. Podrá apreciarse que aún cunado el convertidor A/D 64 y el microprocesador 60 están mostrados como componentes distintos, los chips comercialmente disponibles que incluyen ambos de tales componentes en un módulo único también pueden ser utilizados en la presente invención. Después del procesamiento, el microprocesador 60 puede dividir por lo menos una salida indicativa de los niveles de fluorescencia detectados por el detector 54. Una de tal salida de ejemplo es proporcionada a un exhibidor 86, proporcionando por tanto a un usuario con una indicación visual de la señal de fluorescencia generada por la etiqueta. El exhibidor 86 puede proporcionar características interactivas adicionales, tal como una interconexión de control a la cual un usuario puede proporcionar entradas programables al microprocesador 60.

Aún otra incorporación de los componentes electrónicos específicos representativos para usarse en un lector de fluorescencia 50 está ilustrada en la figura 3. Muchos de los componentes de la figura 3 son análogos a aquellos de la figura 2 y de ésta manera son usados en tales casos los mismos caracteres de referencia. Por ejemplo, una diferencia en el lector 50 de la figura 3 en comparación a aquel de la figura 2 es la generación de una señal de compuerta en un módulo de retraso de fase 57. Una señal de control desde el microprocesador 60 se proporciona al módulo de retraso de fase 57 para programar el cambio de fase efectivo de una señal de reloj proporcionada al mismo. Esta señal de reloj cambiada (también mencionada como una señal de compuerta) es entonces proporcionada a una mezcladora 58 en donde la señal es multiplicada por la señal de detector periódica recibida por el detector 54 y pasada a través del preamplificador 78. La salida resultante de la mezcladora 58 es entonces enviada a través de un filtro de paso bajo 62 antes de proporcionarse a un convertidor A/D 64. El convertidor A/D 64 puede entonces medir la salida del filtro de paso bajo 62 para obtener una medición de la fluorescencia durante los intervalos definidos por la señal de compuerta.

Aún características alternas adicionales para una incorporación de lector de fluorescencia de ejemplo 50 están ilustradas en la figura 4. Por ejemplo, un amplificador de retención/muestra 88 (también algunas veces mencionado como un amplificador de seguir y retener) está mostrado que captura y retiene una señal de entrada de voltaje en puntos específicos en el tiempo bajo el control de una señal externa. Un ejemplo específico de un amplificador de muestra/retención para usarse con la presente tecnología es un chip SHC5320, tal como aquellos vendidos por Burr-Bro n Corporation. La señal de control externa de amplificador de retención/muestra en la incorporación de la figura 4 es recibida desde un circuito de retraso 92 el cual puede, por ejemplo, ser un circuito de retraso digital que deriva un retraso predeterminado de los contadores usando el cronómetro, las compuertas lógicas básicas y un circuito de cubierta móvil. El circuito de retraso 92 recibe una señal de reloj del oscilador 56 y una señal de habilitación desde el divisor de frecuencia 90 el cual simplemente proporciona una señal periódica a un nivel de frecuencia reducida que aquella generada en el oscilador 56. El circuito de retraso 92 puede también recibir una entrada de control desde un microprocesador 60 para permitir aspectos programables de un retraso para asegurar un muestreo adecuado en el amplificador de retención/muestra 88. La señal de control de pulsación retrasada desde el circuito de retraso 92 al amplificador de retención/muestra 88 por tanto dispara la adquisición de la señal de fluorescencia desde el detector 54 a intervalos de tiempo preestablecidos después de que la fuente de filtración 52 se ha apagado.

Sin importar la construcción de lector 50 utilizado, la cantidad del analito puede ser establecida mediante el correlacionar la señal de fluorescencia emitida, Is de las etiquetas capturadas en la zona de detección 32 a una concentración de analito predeterminada. En algunas incorporaciones, la señal de intensidad, Is, también puede ser comparada con una señal de intensidad de fluorescencia emitida, Ic, de las etiquetas capturadas en la zona de calibración 32. La señal de intensidad de fluorescencia Is, puede ser comparada a la señal de intensidad de fluorescencia Ic. En ésta incorporación, la cantidad total de las etiquetas en la zona de calibración 32 es predeterminada y conocida y por tanto puede ser usada para los propósitos de calibración. Por ejemplo, en algunas incorporaciones (por ejemplo ensayos de emparedados), la cantidad de analito es directamente proporcional a la relación de Is a Ic. En otras incorporaciones (por ejemplo ensayos competitivos) , la cantidad de analito es inversamente proporcional a la relación de Is a Ic. Basados sobre el rango de intensidad a la cual cae la zona de detección 31, el rango de concentración general para el analito puede ser determinado. Como un resultado, la calibración y prueba de muestra puede llevarse a cabo bajo aproximadamente las mismas condiciones al mismo tiempo, proporcionando por tanto resultados cuantitativos o semi-cuantitativos confiables, con una sensibilidad incrementada .

Si se desea, la relación de Is a Ic puede ser tramada en contra de la concentración de analito para un rango de concentraciones de analito conocidas para generar una curva de calibración. Para determinar la cantidad de analito en una muestra de prueba desconocida, la relación de señal puede entonces ser convertida a la concentración de analito de acuerdo a la curva de calibración. Deberá notarse que las relaciones matemáticas alternas entre Is e Ic pueden ser tramadas en contra de la concentración de analito para generar la curva de calibración. Por ejemplo, en una incorporación, el valor de Is/ ( Is + Ic) puede ser tramado en contra de la concentración de analito para generar la curva de calibración.

Como se indicó arriba, los formatos de emparedado, los formatos competitivos y similares, pueden ser utilizados para el dispositivo 20. Los formatos de ensayo de emparedado típicamente involucran el mezclar la muestra de prueba con anticuerpos al analito. Estos anticuerpos son móviles y son enlazados a una etiqueta tal como una de látex teñido, un sol metal coloidal o un radio isótopo. Esta mezcla es entonces puesta en contacto con un medio cromatográfico que contiene una banda o zona de anticuerpos inmovilizados al analito. El medio cromatográfico está frecuentemente en la forma de una tira que parece un palo para sumergir. Cuando el complejo del analito y el anticuerpo etiquetado alcanzan la zona de anticuerpos inmovilizados sobre el medio cromatográfico, el aglutinamiento ocurre y los anticuerpos etiquetados unidos son localizados en la zona. Esto indica la presencia del analito. Esta técnica puede ser usada para obtener resultados cuantitativos o semi-cuantitativos . Algunos ejemplos de tales ensayos de tipo de emparedado están descritos por las patentes de los Estados Unidos de América Nos. 4,168,146 otorgada a Grubb y otros y 4,366,241 otorgada a Tom y otros, las cuales son incorporadas aquí en su totalidad por referencia para todos los propósitos.

En un ensayo competitivo, la etiqueta es generalmente un analito etiquetado o un analito/análogo que compite por el aglutinamiento de un anticuerpo con un analito no etiquetado presente en la muestra. Los ensayos competitivos son típicamente usados para la detección de analitos tales como haptenos, cada hapteno siendo monovalente y capaz de aglutinar sólo una molécula de anticuerpo. Los ejemplos de los dispositivos de inmunoensayo competitivos están descritos en las patentes de los Estados Unidos de América Nos. 4,235,601 otorgada a Deutsch y otros, 4,442,204 otorgada a liotta, y 5,208,535 otorgada a Buechler y otros, la cuales son incorporadas aquí en su totalidad por referencia a las mismas para todos los propósitos. Varias otras configuraciones de dispositivos y/o formatos de ensayo también están descritos en las patentes de los Estados Unidos de América Nos. 5,395,754 otorgada a Lambotte y otros; 5,670,381 otorgada a Jou y otros; y 6,194,220 otorgada a Malick y otros, las cuales son incorporadas aquí en su totalidad por referencia para todos los propósitos .

Aún cuando se han descrito anteriormente varias incorporaciones de las configuraciones del dispositivo, deberá entenderse que un dispositivo de la presente invención puede generalmente tener cualquier configuración deseada y no requiere contener todos los componentes descritos anteriormente .

La presente invención puede ser entendida mejor con referencia a los siguientes ejemplos.

EJEMPLO 1 La capacidad para formar partículas de sonda fluorescente conjugada para usarse en un dispositivo a base de membrana fue demostrada. 500 mililitros de 0.5% de partículas encapsuladas de quelato de europio carboxilatadas (0.20 mieras, partículas EU-P, obtenidas de Molecular Probes, Inc.) fueron lavadas con 100 microlitros de un amortiguador PBS (0.1 molar). Fueron entonces aplicados 40 microlitros de las partículas lavadas aplicadas con 3 miligramos de carbodiimida (de Polysciences , Inc.) . La mezcla se dejó reaccionar a la temperatura ambiente (RT) por 30 minutos sobre un agitador. Las partículas activadas fueron entonces lavadas dos veces con un amortiguador de borato a través de centrifugación. Las partículas activadas fueron de nuevo suspendidas en 200 microlitros de un amortiguador de borato a través de una sonicación de baño de 2 minutos.

Después, fueron agregados a las partículas activadas 30 microlitros de la proteína reactiva-C (CRP) (4.9 miligramos por mililitro, Mabl A58110228P, obtenido de BiosPacific, Inc., de Emeryville, California. La mezcla de reacción se dejó reaccionar a la temperatura ambiente sobre un agitador por 2.5 horas. Las partículas activadas fueron entonces recolectadas e incubadas en G.25 mililitros de 0.25 molar etanolamina bajo una agitación suave por 30 minutos. Las partículas fueron entonces lavadas dos veces con PBS. Las partículas fueron entonces sonicadas con sonda en PBS tres veces por 10 segundos bajo un baño de hielo y se almacenaron a 4o C.

EJEMPLO 2 Los espectros de excitación y de emisión de las partículas de sonda conjugadas formadas en el ejemplo 1 fueron determinadas usando un espectrofluorómetro FluoroLog III convencional (comprado de Horiba Group) usando una longitud de onda de excitación de 370 nanómetros y una longitud de onda de emisión de 615 nanómetros.

Los resultados están mostrados en la figura 5. Como se mostró, el espectro de excitación y de emisión de las partículas de sonda fueron similares a los espectros de excitación y de emisión de las partículas de sonda no conjugadas, excepto por la intensidad relativa del pico de nanómetro de 430 al pico de nanómetro 615 para el conjugado fue superior. Las partículas de sonda conjugadas tuvieron un pico de excitación fuerte a alrededor de 355 nanómetros y dos picos de emisión fuerte a 430 y 615 nanómetros. El pico de emisión a 430 nanómetros se creyó que originó del ligando mientras que el pico a 615 nanómetros se creyó que es de d-d transición de ión de metal de europio a través de transferencia de energía del ligando al centro de metal de europio.

EJEMPLO 3 Fue demostrada la capacidad para formar un ensayo a base de membrana. Inicialmente, las muestras de membrana porosas Millipore SX hechas de nitrocelulosa fueron laminadas sobre las tarjetas de soporte correspondientes que tienen una longitud de aproximadamente de 30 centímetros. El anticuerpo monoclonal de proteína C-reactiva (CRP) (Mab A58040136P, 2.3 miligramos/mi, obtenido de BiosPacific, Inc., de Emeryville, California) fue desvestido sobre la membrana para formar una línea de detección. El Goldline (una solución de polilisina obtenida de British Biocell Internacional) fue entonces desvestida sobre la membrana para formar una línea de calibración. La membrana fue secada por 1 hora a 37° C. üna almohadilla de transmisión de fibra celulósica (Millipore Co.) fue sujetada a un extremo de la membrana. El otro extremo de la membrana fue laminado con dos almohadillas de fibra de vidrio (almohadillas de muestra y conjugadas) obtenidas de Millipore Company. La almohadilla conjugada y la almohadilla de transmisión estuvieron en contacto directo con la membrana, y la almohadilla de muestra estuvo en contacto directo con la almohadilla conjugada. La almohadilla conjugada y la almohadilla de muestra cada una tuvieron un ancho de 4 milímetros. La almohadilla de muestra fue tratada con 1% de monolaurato de sorbitan polioxietileno (un surfactante no iónico disponible de Sigma-Aldrich bajo el nombre "Tween 20") y se secó a 37° C por 2 horas. La almohadilla conjugada fue tratada con 200 microlitros de las partículas de sonda conjugadas del ejemplo 1, se mezclaron con el amortiguador PBS, 200 microlitros de 2% "Tween 20", y 200 microlitros de 20% de sucrosa. La almohadilla conjugada empapada fue secada en un horno por 1.5 horas a 37° C.

Los dispositivos resultantes fueron sellados en una bolsa para almacenamiento.

EJEMPLO 4 La capacidad del dispositivo del ejemplo 3 para detectar la presencia de un analito fue determinada. Específicamente, ocho muestras completas de los dispositivos del ejemplo 3 fueron proporcionadas. 40 microlitros de la solución CRP de diferentes concentraciones en PBS (por ejemplo 0, 1, 2, 5, 10, 20, 50 y 100 nanogramos por mililitro) fueron directamente aplicados a las almohadillas de muestra de cada muestra respectivamente. Los dispositivos se dejaron desarrollar por 30 minutos y la fluorescencia sobre ambas la línea de detección y la línea de calibración fueron medidas a longitudes de onda de excitación de 370 nanómetros y 611.5 nanómetros, respectivamente. La fluorescencia fue medida con un espectrofluorómetro FluoroLog III convencional (comprado de Horiba Group) usando un modo de cara frontal. El rayo de excitación fue alineado a alrededor de 70° con respecto a la superficie del dispositivo normal y a alrededor de 45° con respecto a la superficie del dispositivo normal para la emisión. Aún cuando las reacciones fueron visualmente observadas como que fueron completas dentro de alrededor de 15 minutos, se dejó suficiente tiempo para una reacción completa antes de tomar las mediciones de fluorescencia.

La Tabla I da los datos de fluorescencia para ambas lineas de calibración y detección.

Tabla I : Datos de Fluorescencia La relación de intensidad normalizada de Is/ ( Is + Ic) en contra de la concentración CRP está mostrada en la figura 6. La intensidad normalizada fue obtenida mediante el dividir la intensidad de fluorescencia medida de la muestra por la intensidad de fluorescencia de una muestra de control. Como se mostró, la curva de respuesta de dosis está calibrada por la línea de calibración y es lineal, particularmente para concentraciones CRP de menos de 20 nanogramos por mililitro.

EJEMPLO 5 La capacidad del dispositivo del ejemplo 3 para detectar la presencia de un analito fue determinada. Específicamente, cinco grupos que cada uno contuvo cuatro muestras completas de los dispositivos del ejemplo 3 fueron proporcionados. 40 microlitros de la solución CRP de diferentes concentraciones en PBS (por ejemplo 0, 1, 2 y 5 nanogramos por mililitro) fueron directamente aplicadas a las almohadillas de muestra. Los dispositivos se dejaron desarrollar por 30 minutos y la fluorescencia sobre ambas la línea de detección y la línea de calibración fueron medidas a longitudes de onda de excitación de 370 nanómetros y 611.5 nanómetros, respectivamente. La fluorescencia fue medida con un espectrofluorómetro FluoroLog III convencional usando un modo de cara frontal. El rayo de excitación fue alineado a alrededor de 70° con respecto a la superficie del dispositivo normal y alrededor de 45° con relación a la superficie del dispositivo normal para la emisión. Aún cuando las reacciones fueron visualmente observadas como siendo completadas dentro de alrededor de 15 minutos, se dejó suficiente tiempo para la reacción completa antes de tomar las mediciones de fluorescencia .

Las Tablas II y III dan los datos para ambas lineas de calibración y de detección.

Tabla II: Datos de Fluorescencia (Is/Ie) Tabla III : Intensidad de Fluorescencia Promedio / Desviación Estándar (Is/Is + Ic) Por tanto, como un resultado de la presente invención, la interferencia de fondo de muchas fuentes, tal como la luz esparcida y la auto-fluorescencia pueden ser prácticamente eliminadas durante la detección. Además, el lector fluorescente usado en la presente invención puede tener un diseño simple y barato. Por ejemplo, en una incorporación, el lector puede utilizar un diodo de emisión de luz pulsada (LED) y un fotodiodo de silicón para excitar exactamente las etiquetas y detectar la fluorescencia sobre un dispositivo de ensayo a base de membrana sin requerir el uso de componentes costosos, tal como monocromatores o filtros ópticos de ancho de banda de emisión estrecha.

Aún cuando la invención ha sido descrita en detalle con respecto a las incorporaciones especificas de la misma, se apreciará por aquellos expertos en el arte, al lograr un entendimiento de lo anterior, que pueden concebirse fácilmente alteraciones, variaciones y equivalentes de éstas incorporaciones. Por tanto, el alcance de la presente invención debe ser evaluado como aquel de las reivindicaciones anexas y cualquiera equivalentes de las mismas.

Claims (42)

R E I V I N D I C A C I O N E S

1. Un método para detectar la presencia o cantidad de un analito que reside en una muestra de prueba, dicho método comprende : i) proporcionar un dispositivo de ensayo de flujo continuo que comprende una membrana porosa en comunicación de fluido con una etiqueta fluorescente, dicha etiqueta fluorescente tiene un tiempo de vida de emisión de fluorescencia de más de alrededor de 1 microsegundo, dicha membrana porosa define una zona de detección; ii) poner en contacto la etiqueta fluorescente con la muestra de prueba para formar una mezcla; iii) permitir a dicha mezcla el fluir a la zona de detección; iv) colocar un lector de fluorescencia de tiempo resuelto cerca de la zona de detección, dicho lector de fluorescencia comprende una fuente de excitación pulsada y un detector de tiempo-compuerta; v) excitar dicha etiqueta fluorescente en dicha zona de detección con dicha fuente de excitación pulsada, en donde dicha excitación provoca que la etiqueta fluorescente emita una señal de detección; y vi) medir la intensidad de la señal de detección con el detector de tiempo-compuerta.

2. Un método tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque la etiqueta fluorescente tiene un tiempo de vida de emisión de más de alrededor de 10 microsegundos .

3. Un método tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque la etiqueta fluorescente tiene un tiempo de vida de emisión de desde alrededor de 100 a alrededor de 1,000 microsegundos.

4. Un método tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque la etiqueta fluorescente tiene un cambio de Stokes mayor de alrededor de 50 nanómetros .

5. Un método tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque la etiqueta fluorescente tiene un cambio de Stokes mayor de alrededor de 100 nanómetros.

6. Un método tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque dicha etiqueta fluorescente tiene un cambio de Stokes de desde alrededor de 250 a alrededor de 350 nanómetros.

7. Un método tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque dicha etiqueta fluorescente incluye un quelato lantanida de samario, disprosio, europio, terbio, o combinaciones de los mismos.

8. Un método tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque dicha etiqueta fluorescente es quelato de europio.

9. Un método tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque dicha etiqueta fluorescente es usada en conjunción con una microparticula, una nanoparticula, un liposoma, un dendrimero, un polímero, o combinaciones de los mismos .

10. Un método tal y como se reivindica en la cláusula 9, caracterizado porque la etiqueta fluorescente es usada en conjunción con una microparticula o nanoparticula modificada con un miembro aglutinante específico para el analito .

11. Un método tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque la zona de detección incluye múltiples regiones de detección.

12. Un método tal y como se reivindica en la cláusula 11, caracterizado porque dichas regiones de detección contienen reactivos de captura múltiples para aglutinar a analitos múltiples.

13. Un método tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque dicha membrana porosa además define una zona de calibración, en donde dicha mezcla también se deja fluir a dicha zona de calibración.

14. Un método tal y como se reivindica en la cláusula 13, caracterizado porque dicha zona de calibración incluye regiones de detección múltiples.

15. Un método tal y como se reivindica en la cláusula 14, caracterizado porque dichas regiones de calibración contienen reactivos de captura múltiples para aglutinar a etiquetas fluorescentes múltiples.

16. Un método tal y como se reivindica en la cláusula 13, caracterizado además porque comprende: colocar dicho lector de fluorescencia resuelto en el tiempo a un lado de dicha zona de calibración; excitar dicha etiqueta fluorescente en dicha zona de calibración con dicha fuente de excitación pulsada, en donde dicha excitación provoca que dicha etiqueta fluorescente emita una señal de calibración; medir la intensidad de la señal de calibración con dicho detector de compuerta-tiempo; y comparar la intensidad de la señal de detección con la señal de calibración, en donde la cantidad del analito dentro de la muestra de prueba es proporcional a la intensidad de la señal de detección calibrada por la intensidad de la siguiente calibración.

17. Un método tal y como se reivindica en la cláusula 16, caracterizado porque dicha etiqueta fluorescente en dicha zona de detección es excitada simultáneamente con dicha etiqueta fluorescente en dicha zona de calibración.

18. Un método tal y como se reivindica en la cláusula 16, caracterizado porque dicha señal de detección y dicha señal de calibración son medidas simultáneamente.

19. Un método tal y como se reivindica en la cláusula 16, caracterizado porque dicha fuente de excitación pulsada es un diodo emisor de luz.

20. Un método tal y como se reivindica en la cláusula 16, caracterizado porque dicho detector de tiempo con compuerta es un fotodiodo de silicio.

21. Un método tal y como se reivindica en la cláusula 16, caracterizado porque dicho lector de fluorescencia contiene un circuito de tiempo en comunicación con dicha fuente de excitación pulsada y dicho detector de tiempo con compuerta, dicho circuito de tiempo controla la excitación pulsada y la detección.

22. Un método tal y como se reivindica en la cláusula 16, caracterizado porque es colocado un filtro óptico a un lado de dicha fuente de excitación pulsada, dicho detector de tiempo con compuerta o combinaciones de los mismos.

23. Un método para detectar la presencia o la cantidad de un analito que reside en una muestra de prueba, dicho método comprende: i) proporcionar un dispositivo de ensayo de flujo continuo que comprende una membrana porosa en comunicación de fluido con una sonda conjugada que contiene una etiqueta fluorescente, dicha etiqueta fluorescente tiene un tiempo de vida de emisión de fluorescencia de más de alrededor de 10 microsegundos, dicha membrana porosa define una zona de detección y una zona de calibración; y ii) poner en contacto dicha sonda conjugada con la muestra de prueba para formar una mezcla; iii) permitir a dicha mezcla el fluir a dicha zona de detección y a dicha zona de calibración; iv) colocar un lector de fluorescencia resuelto con el tiempo cerca de dicha zona de detección y de dicha zona de calibración, dicho lector de fluorescencia comprende una fuente de excitación pulsada y un detector de tiempo-compuerta; v) excitar dicha etiqueta fluorescente en dicha zona de detección y en dicha zona de calibración con dicha fuente de excitación pulsada, en donde dicha excitación hace que dicha etiqueta fluorescente emita una señal de detección en dicha zona de detección y una señal de calibración en dicha zona de calibración; vi) medir la intensidad de la señal de detección y de dicha señal de calibración con dicho detector de tiempo-compuerta; y vii) comparar la intensidad de la señal de detección con la señal de calibración en donde la cantidad del analito dentro de la muestra de prueba es proporcional a la intensidad de la señal de detección calibrada por la intensidad de la señal de calibración.

24. Un método tal y como se reivindica en la cláusula 23, caracterizado porque dicha etiqueta fluorescente tiene un tiempo de vida de emisión de desde alrededor de 100 a alrededor de 1,000 microsegundos.

25. Un método tal y como se reivindica en la cláusula 23, caracterizado porque dicha etiqueta fluorescente tiene un cambio de Stokes de más de alrededor de 50 nanómetros .

26. Un método tal y como se reivindica en la cláusula 23, caracterizado porque dicha etiqueta fluorescente tiene un cambio de Stokes de desde alrededor de 250 a alrededor de 350 nanómetros.

27. Un método tal y como se reivindica en la cláusula 23, caracterizado porque dicha etiqueta fluorescente incluye un quelato lantanida de samario, disprosio, europio, terbio, o combinaciones de los mismos.

28. Un método tal y como se reivindica en la cláusula 27, caracterizado porque dicha etiqueta fluorescente es quelato de europio.

29. Un método tal y como se reivindica en la cláusula 23, caracterizado porque dicha etiqueta fluorescente en dicha zona de detección es excitada simultáneamente con dicha etiqueta fluorescente en dicha zona de calibración.

30. Un método tal y como se reivindica en la cláusula 23, caracterizado porque dicha señal de detección y dicha señal de calibración son medidas simultáneamente.

31. Un método tal y como se reivindica en la cláusula 23, caracterizado porque dicha fuente de excitación pulsada es un diodo emisor de luz pulsado.

32. Un método tal y como se reivindica en la cláusula 23, caracterizado porque dicho detector de compuerta con el tiempo es un fotodiodo de silicio.

33. Un método tal y como se reivindica en la cláusula 23, caracterizado porque dicho lector de fluorescencia contiene un circuito de tiempo en comunicación con dicha fuente de excitación pulsada y dicho detector de compuerta-tiempo, dicho circuito de tiempo controla la excitación pulsada y la detección.

34. Un método para detectar la presencia o la cantidad de un analito que reside en una muestra de prueba, dicho método comprende: i) proporcionar un dispositivo de ensayo de flujo continuo que comprende una membrana porosa en comunicación de fluido con una sonda conjugada que contiene un quelato de lantánido, dicho quelato de lantánido tiene un tiempo de vida de emisión de fluorescencia de más de alrededor de 50 microsegundos y un cambio de Stokes mayor de alrededor de 100 nanómetros, dicha membrana porosa define una zona de detección y una zona de calibración; y ii) poner en contacto dicha sonda conjugada con la muestra de prueba para formar una mezcla; iii) permitir a dicha mezcla el fluir a dicha zona de detección y a dicha zona de calibración; iv) colocar un lector de fluorescencia resuelto con el tiempo cerca de dicha zona de detección y de dicha zona de calibración, dicho, lector de fluorescencia comprende un diodo emisor de luz pulsada y un detector de compuerta con el tiempo que comprende un fotodiodo de silicio; v) excitar dicho quelato de lantanida en dicha zona de detección y en dicha zona de calibración con dicho diodo emisor de luz pulsada, en donde dicha excitación hace que dicho quelato de lantanida en dicha zona de detección emita una señal de detección y dicho quelato de lantanida en dicha zona de calibración emita una señal de calibración; vi) medir la intensidad de la señal de detección y de la señal de calibración con dicho detector de tiempo con compuerta ; vii) comparar la intensidad de la señal de detección con la señal de calibración, en donde la cantidad del analito dentro de la muestra de prueba es proporcional a la intensidad de la señal de detección calibrada por la intensidad de la señal de calibración.

35. Un método tal y como se reivindica en la cláusula 34, caracterizado porque el quelato de lantanida es seleccionado del grupo que consiste de quelato de lantanida de samario, disprosio, europio, terbio, o combinaciones de los mismos .

36. Un método tal y como se reivindica en la cláusula 34, caracterizado porque el quelato lantanida es un quelato de europio.

37. Un método tal y como se reivindica en la cláusula 34, caracterizado porque el diodo emisor de luz pulsada es un diodo emisor de luz ultravioleta.

38. Un método tal y como se reivindica en la cláusula 34, caracterizado porque el lector de fluorescencia contiene un .circuito de tiempo en comunicación con dicho diodo emisor de luz pulsada y dicho detector de tiempo-con compuerta, dicho circuito de medición de tiempo controla la excitación pulsada y la detección.

39. Un método tal y como se reivindica en la cláusula 34, caracterizado porque dicha etiqueta fluorescente en dicha zona de detección es excitada simultáneamente con dicha etiqueta fluorescente en dicha zona de calibración.

40. Un método tal y como se reivindica en la cláusula 34, caracterizado porque dicha señal de detección y dicha señal de calibración son medidas simultáneamente.

41. Un método tal y como se reivindica en la cláusula 34, caracterizado porque dicha etiqueta fluorescente tiene un tiempo de vida de emisión de desde alrededor de 100 a alrededor de 1,000 microsegundos .

42. Un método tal y como se reivindica en la cláusula 34, caracterizado porque dicha etiqueta fluorescente tiene un cambio de Stokes de desde alrededor de 250 a alrededor de 350 nanómetros. R E S U E Se proporciona un dispositivo de ensayo a base de membrana para detectar la presencia o la cantidad de un analito que reside en una muestra de prueba. El dispositivo utiliza la fluorescencia resuelta con el tiempo para detectar las señales generadas por las etiquetas fluorescentes excitadas. Debido a que las etiquetas pueden tener un tiempo de vida de emisión relativamente larga, la interferencia de fondo de corta vida puede ser prácticamente eliminada a través de una detección de fluorescencia retrasada. Además, el lector fluorescente resultante puede tener un diseño simple y barato. Por ejemplo, en una incorporación, el lector puede utilizar un fotodiodo de silicio y un diodo emisor de luz pulsado (LED) para excitar exactamente las etiquetas y detectar la fluorescencia sobre un dispositivo de ensayo a base de membrana sin requerir el uso de componentes costosos tal como monocromatores o filtros ópticos de ancho de banda de emisión estrecha.