TWI224194B - Membrane-based assay devices that utilize time-resolved fluorescence - Google Patents

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TWI224194B
TWI224194B TW092121327A TW92121327A TWI224194B TW I224194 B TWI224194 B TW I224194B TW 092121327 A TW092121327 A TW 092121327A TW 92121327 A TW92121327 A TW 92121327A TW I224194 B TWI224194 B TW I224194B
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Description

1224194 玖、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本案爲延續部分美國申請序列編號10/228,836，此申請於2⑻2 年8月27曰。 【先前技術】 已發展出運用螢光標籤的試驗，以促進分析物的偵檢。螢光一般 爲三階段作用。在第一階段，由外部能量供給能量，比如白熱燈或雷射， 並以螢光化合物吸收，產生一電子單態。在第二階段，螢光化合物經歷構 形變化期間，激態存於有限時間，並也可加入眾多可能與本身分子環境交 互作用。在此期間，部分散發激態能量，自螢光放射開始產生鬆弛狀態。 第三階段爲螢光放射階段，其中放射能量，螢光化合物回到本身基態。放 射能量比本身的激發能量(光或雷射)低，且因此有較長波長。能量或波長 的替換或差芳允终自激發能量偵檢及分離。 傳統螢光偵檢一般利用波長過濾，以自激發光子分離出放射光 子，並引起可錄輸出，通常作爲電子信號或攝影影像。無論如何，傳統螢 光偵檢技術存有數個問題。例如，大部分生物流體擁有可減少偵檢準確度 的自動螢光。試驗設備也可擁有一些自動螢光。這些干擾由許多傳統螢光 標籤(例如介於20〜50 nm)的小斯托克轉移(Stokes shifts)提高。 爲響應一些傳統螢光偵檢技術的問題，發展如“光譜儀” (time-resolved)螢光的已知技術。光譜儀螢光牽涉以短波動光激發螢光標 籤’然後在測量剩下耐久螢光信號之前的激發之後，等待一段時間(例如大 约100〜200微秒之間）。在此方式中，除去任何短暫螢光背景信號及分散激 發放射線。雖然“光譜儀”技術已經成功運用於一些類型的試驗設備中， 比如試管儀器(cuvette4)aseci instruments)，儘管如此，在其他類型的試驗設 備(比如薄膜設備)中尚合併光譜儀技術。
Mavis-C:\WINSOFT\WJ\Pk001.08~\0859\PK-001-0859.doc2004/l/6 5 1224194 口 尤其，傳統光譜儀系統(比如單色器)牵涉非常複雜且昂貴的儀 器。舉例來説，-般探討實驗用螢光⑽雙重單色器系統，_單色器使用 於挑選激發波長，其他單色器伽於挑·檢波長。此雜程度徹底增加 系統費用，也需龐大、非攜帶式且笨重的儀器。另外，當與薄膜一起使用 時’傳統的光_系統爲有問題。換句減，在義設備中，分析物的濃 度減少，嗎可藉減體流經多孔雜而稀釋。不巧，背景干擾變得問題 在此低分析濃度下增加問題，因爲偵檢的螢錢度較低。因麟膜結構也 有益於反映放射光，偵檢器作精確測量標籤分析物的螢光強度能力實質上 減少。事實上’放射^^信號的強度—般爲三到四級大小，此比由多孔薄 膜反射的激光小。 如此，目前需要有簡單、便宜且有效的系統於薄膜試驗設備中測 量螢光。 【發明内容】 依照本發明的一實施例，揭發偵檢存於試驗樣本中的分析物存在 或數量，其包含： 1. 提供流式的試驗設備，包含與螢光標籤流體傳遞的 多孔薄膜，螢光標籤具有約大於1微秒的螢光放射 壽命，多孔薄膜定義爲一偵檢地區； ϋ· 螢光標籤與試驗樣本接觸，以形成混合物(例如溶 液、懸浮液等等)； iii · 允彡午此合物流至偵檢地區； iv. 將光譜儀螢光閲讀機置放於最接近偵檢地區，螢光 閲讀機包含波動激發能量及時閘(time-gated)偵檢 器。 V. 以波動激發能量在偵檢地區激發螢光標籤，其中激
Mavis-C:\WINSOFT\SWkO〇l 〇8~\〇859\PK-0〇l-0859.doc2004/l/6 6 發引起勞光標籤放射一偵檢信號;以及 νι·以時閘偵檢器測量偵檢信號的強度。 螢光標籤可包括#、鏑、銪、朗稀土難化贼其化合物。再 者，在-些實施例中，螢光標籤可具有约大於ω微秒的放射壽命，在_ 些實犯例中約大於50微秒，且在一些實施例中約爲1〇〇至1〇〇〇微秒。同 樣地，螢光標籤可具有約大於5〇 nm的斯托克轉移(St〇kes shifts)，在一些 實施例中約大於1〇〇 nm，且在一些實施例中約爲25〇〜35〇 nm。假使理想 的話，標籤可與微顆粒一起使用，此以分析物的特定連結構件變更。 螢光閲讀機可使用於精確激發標籤及偵檢薄膜試驗設備上的螢 光’此不需使用昂貴的構件，比如單色器或狹窄的放射帶寬光學濾光鏡。 舉例來説，在—實補巾，波舰魏量爲魏質二減。螢光_機也 可含有定時電路(例如A/D變換器、微處理機、放大器、分配器、水晶振 盈器楚日曰體、觸發性電路等等)與波動激發能量與時閘债檢器聯繫，以控 制信號的波動及偵檢。 依照本發明的實施例，揭發試驗樣本中分析物的存在及數量，包 含： L 提供流式的試驗設備，包含與結合探針流體傳遞的 多孔薄膜，此含有一稀土屬螯化物，此稀土屬螯化 物具有約大於50微秒的螢光放射壽命，以及約大於 100nm的Stokes shift，多孔薄膜定義爲一偵檢地區 及一校正地區;以及 ϋ· 結合探針與試驗樣本接觸，以形成混合物； ϋ 允$午混合物流至偵檢地區及校正地區； iv* 將光譜儀螢光閲讀機置放於最接近偵檢地區及校正 地區，螢光閲讀機包含波動光放射二極體及包含矽
Mavis-C:\WINSOFTVi^lJ\Pk001 ·08〜\0859\ΡΚ-001 -0859.doc2004/l/6 7 1224194 光質二極體之時閘偵檢器及其組合； V· 以波動光放射二極體在偵檢地區及校正地區中激發 稀土屬螯化物，其中激發引起稀土屬螯化物在偵檢 地區放射偵檢信號，並引起稀土屬螯化物在校正地 區放射校正信號； vi. 以時閘偵檢器測量偵檢信號及校正信號的強度； vii· 比較偵檢信號與校正信號的強度，其中試驗樣本内 的分析物數量與由校正信號強度校正的彳貞檢信號強 度成比例。 在偵檢地區中的螢光標籤可自校正地區中的螢光標籤同時或個 别激發。同樣地，偵檢信號及校正信號也可同時或個别測量。 下面更詳細探討本發明的其他特性及觀點。 【實施方式】 如此處所使用“分析物”(analyte)—詞意謂一般適用於铺檢物質。 例如，分析物可包括抗原物質、半抗原、抗體及其化合物。分析物包括(但 不受限)毒素、有機化合物、蛋白質、縮氨酸、微生物、氨基酸、核酸、贺 爾蒙、類固醇、維他命、藥劑(包括那些執行治療目的以及執行被禁止的目 的）、藥劑媒介物或副產品、細菌、病毒顆粒及代謝物或對任何上面物質的 抗體。一些分析物的特定範例包括血清蛋白鐵、肌氨酸酐激膝 MEB(CK-MIB)、毛地黄、癲立停、苯基巴比妥(phenobarbitol)、卡巴氮平 (carbamazepine)、萬古徽素、硫酸紫菌素(gentamycin)、茶驗、帝拔癲(valproic acid)、異金雞納鹼、leutinizing 贺爾蒙(LH)、毛囊增生激素(follicle-stimulating hormone，FSH)、雌二酮、黄體脂酮、C-反應蛋白質、lipocalins、IgE抗體、 維他命B2微球蛋白、糖化血色素（glycated hemoglobin，Gly· Hb)、皮質醇、 洋地黄毒素、N-acetylprocainamide(NAPA)、procainamide、德國麻療的抗
Mavis-C:\WINSOFT\#jplj\Pk001.08~\0859\PK-001-0859.doc2004/l/6 g 1224194 體(比如德國麻療-IgG及德國麻疹IgM)、住血原病蟲的抗體(比如住血原病 蟲IgG(Toxo-IgG)及住血原病蟲IgM(ToxoIgM))、睪丸激素、水楊酸鹽、 乙醯氨酚(acetaminophen)、B型肝炎病毒表面抗體(HBsAg)、B型肝炎核心 抗體(比如B型肝炎核心抗原lgG及IgM(抗-HBC))、人體免疫缺陷病毒i 及2(HIV1及2)、人體T細胞白血病病毒1及2(HTLV)、B型肝炎e抗原 (HBeAg)、B型肝炎e抗體(Anti-HBe)、促甲狀腺激素(TSH)、甲狀腺素(T4)、 總三碘甲狀腺素(Total T3)、游離三碘甲狀腺素(Free T3)、carcin〇embry〇ic 抗原(CEA)以及阿爾發胎兒蛋白(aipha fetal protein, AFP)。溢用藥劑及控制 物質包括(並無受限)安非他命、曱基安非他命、巴必妥酸鹽(barbiturates)(比 _ 如戊巴比妥、第二巴必妥、戊基巴比毋妥、苯巴比妥及巴必妥）、非巴比妥 類(benzodiazepine)(比如librium及爲你安(valium))、大麻驗(比如印度大麻 葉及大麻煙）、古柯鹼、吩坦尼(fentanyl)、LSD、白板(methaqualone)、鎮靜 劑(比如每洛英、嗎啡、可待因、二氫嗎啡g同(hydromojphone)、二氫可待因 _ (hydrocodone)、美沙g同、經氫可待因酮(〇XyC〇(j〇ne)、經二氫嗎啡酉同 (oxymoiphone)以及鴉片）、環烴六胺以及pr〇p〇xyhene。其他潛在分析物可 由EYgrhart等人描述於美國專利編號第6,436,6S1號及Tom等人描沭於墓 國專利編號第4,366,241號。 如此處所使用“試驗樣本”(test sample)一詞一般意謂將含有分析鲁 物加入的材料4驗樣本可直接使用獲自下面預先處理方式來源，以變更 樣本特性。試驗樣本可衍生於生物來源，比如生理液(包括血液、組織液、 唾液眼睛水曰曰體液、腦脊髓液(cerebrai Spinai 、汗、尿液、乳汁、 腹液、raucous、關節液、腹膜液、陰道液等等。試驗樣本可在使用之前事 先處理，比如自血液、稀釋黏液等等準備血漿。處理方法可牵涉過濾、沉 殿、稀釋、祕、、濃縮、干擾構件的.決速關閉及添加試劑。除了生理液外， 可使用其他液體樣本，比如水、食物製品及環境或食物製造試驗作業。另
Mavis-C:\WINSOFT\ 專手 IJVPkOO 1.08〜\0859\PK-001-0859. doc2004/1/6 9 1224194 外，認爲含有分析物的固態材料可使用作爲試驗樣本。在一些實例中，此 有利於變更固態樣本形成液態物質或分離分析物。 目前引用詳述本發明的各種不同實施例，下面發表一或更多範 例。每個範例經由發明説明提供，並對發明無限制。事實上，那些精通技 藝的人士顯然無須達反發明範園或精神而可對本發明做各種不同變更及 變動。例如，説明或描述一實施例部分的特性可使用於另一實施例，以又 產生進-步實施例。因此，本發明意圖在附加中請專利細及其同等物内 涵蓋此變更及變動。 -般而言，本發明爲針對-薄膜試驗設備，以偵檢存於試驗樣本鲁 中的分析物存在或數量。設備利用光譜儀螢光偵檢由激發螢光標籤產生的 信號。因爲標籤可具有長放射壽命，且在偵檢期間，可實際除去出自許多 來源(比如濺散光以及自動螢光)的背景干擾。另外，使麟本發明的榮光 閲謂機可具有簡單及便宜設計。例如，在—實施例中，機可利用波動 光放射二極體(LED)及矽光質二極體來精確激發標籤，並偵檢薄膜試驗設 備的螢光，此不需使用昂貴的構件，比如單色器或狹窄放射波帶寬度濾光 器。 u 引用第一圖，例如，目前將更詳述根據本發明形成的流式試驗設 備(20)。如圖，設備(20)含有多孔薄膜(23)，此任意由硬材(21)支撐。一般修 而a ’多孔薄膜(23)可由任何各種材料經由試驗材料而形成。舉例來説， 使用於形成多孔薄膜(23)的材料可包括(但不受限)天然、合成或天然發生的 材料(合成變更，比如多醣類(例如紙)及纖維素衍生物(比如纖維素醋酸人造 絲及硝酸纖維素)）、聚醚磺胺、尼龍材料、矽石、無機材料(比如無活性的 蓉土、石夕藻土、MgS04或劃一分布於多孔聚合基質中與聚合物(比如氣化 歸、氣化埽-丙烯共聚物以及氣化烯-醋酸乙烯酯共聚物)相同的其他無機細 分衬料）、衣類、兼具天然發生(例如棉布)及合成(例如尼龍或人造絲）、多
Mavis-C:\WINSOFT\WJ\Pk001.08~\0859\PK-001-0859.doc2004/l/6 10 1224194 孔凝膠(比如矽凝膠、洋菜膠、葡聚糖及動物膠）、聚合薄膜(比如聚丙歸§兔 胺)等等。在一特别實施例中，多孔薄膜(23)由硝化纖維素與/或者聚§旨橫胺 材料形成。將了解“硝化纖維素”(nitrocellulose)引用硝酸§旨纖維素，此可 爲單獨的硝化纖維素或硝酸酯與其他酸類(比如具有1至7個碳原子的月旨肪^ 族羧酸）。 設備(20)也可含有一芯吸襯墊(28)。芯吸襯墊(28)—般接收移經全 部多孔薄膜(23)的流體。如所知的技藝，芯吸襯墊(28)可幫助促進毛細管作 用，且流體流經薄膜(23)。 欲開始偵檢試驗樣本内的分析物，使用者可經由移動而直接運用 試驗樣本至多孔薄膜(23)部分。或者，試驗樣本首次可運用於取樣襯塾(無 圖示），此與多孔薄膜(23)有流體傳遞。可使用於形成取樣襯墊的一些適當 材料包括(但不受限)硝化纖維素、纖維素、多孔聚乙烯襯墊及玻璃纖維過 濾紙。假使理想的話，取樣襯墊也可含有一或更多化驗預先處理試劑，不 是散佈就是非散佈附著。 在説明的實施例中，試驗樣本從取樣襯墊(無圖示)移動至結合襯 墊(22)，此與取樣襯墊的一末端有聯繫。結合襯墊(22)由通過試驗樣本的材 料形成。舉例來説，在一實施例中，結合襯墊(22)由玻璃纖維形成。雖然 僅經由一結合襯墊(22)，將了解其他結合襯墊也可使用於本發明中。 爲了促進精確偵檢試驗樣本内是否有分析物存在，在設備(20)的 各個位置使用標籤。標籤可使用於偵檢分析物及校正。一般來説，至少使 用於設備(20)的標籤部分含有螢光化合物。一般而言，此螢光化合物可爲 螢光分子、聚合物、樹狀聚合物、顆粒等等。 依照本發明，螢光標籤構成允許“光譜儀螢光偵檢” (timeiesdved fluorescenCe detection)。在激發之後及測量剩餘的耐久螢光信 號之前’光譜儀螢光牵涉以短波光激發螢光標籤，然後一般等待一段時間
Mavis-C:VWINSOFT\ 專和J\Pk001.08〜\0859\PK-001-0859.doc2004/l/6 (例如大約100至200微秒）。在此方式中，除去任何短暫螢光背景信號及 散佈激發放射線。除去多個背景信號會造成靈敏度2至4級，此大於傳統 螢光。因此’光譜儀螢光偵檢藉由利用某螢光材料的螢光特徵而設計成減 少來自放射或來自散佈作用（由散佈激發放射線所引起)的背景信號。 尤其理想光譜儀螢光標籤的選擇標準包括較長放射壽命。如上所 示，理想的是，在散發任何短暫背景信號之後，標籤適當放射本身信號。 再者，長螢光壽命使得可能使用時閘螢光測量的低價電路。舉例來説，使 用於本發明的螢光標籤可具有約大於1微秒的螢光壽命，在一些實施例中 約大於10微米，在一些實施例中約大於5〇微米，且在一些實施例中约爲 1〇〇微米至1〇〇〇微米。另外，螢光標籤也可具有較大的“斯托克轉移” (Stokes shifts)。此項“斯托克轉移”一般定義爲以光譜線或波帶的發光放 射線取代比激發線或波帶長的放射波長。較大的斯托克轉移允許螢光標籤 的激發波長剩餘遠離本身放射波長，且爲理想的，因爲激發及放射波長的 巨大差兴使得較容易自放射信號除去反射激發放射線。進一步，巨大的斯 托克轉移也使樣本與/或者光散佈中的螢光分子干擾減至最低，此乃由於蛋 白質或膠體存有一些體液(例如血液）。另外，巨大斯托克轉移也使昂貴、 高精密過濾器的需求減至最低，以除去背景干擾。舉例來説，在一些實施 例中，螢光標籤具有約大於50nm的斯托克轉移，且在一些實施例中約大 於100 nm，且在一些實施例中約爲250至350 nm。 具有較長放射壽命及較大斯托克轉移的一種螢光化合物稀土屬 螯化物爲釤(Sm(瓜))、鏑(Dy(ΠΙ))、銪(Eu(ΙΠ))、铽(Tb(瓜))的稀土屬螯化物。 在較短波長螯合激發之後，此螯化物可顯示強大的紅色轉移、狹窄波帶、 耐久放射物。一般，螯化物具有一強紫外線激發波帶，此乃由於色基位於 接近分子中的稀土屬。隨後藉由色基的激發，激發能量可自激發色基轉移 至稀土屬。此伴隨稀土屬的螢光放射特徵。例如，僅與約28 nm螢光比較
Mavis-C:\WINSOFT\ 專餅k001.08〜\0859\PK-001-0859.doc2004/l/6 12 1224194 下，螯化銪特别具有約250至350 nm的大斯托克轉移。同時，與約}至 100 nm的其他螢光標籤比較下，螯化銪的螢光爲耐久的，具有的壽命約爲 100至1000微秒。另外，這些螯化物具有非常狹窄的放射光譜，一般约在 50%放射中具有约小於1〇 nm的帶寬。適當的螯化銪爲正<對異硫氰化甲 基冬)、^乙歸二胺4-醋酸-Eu+3。 另外，在水溶液或懸浮液中爲非活性、穩定且具備螢光的稀土屬 螯化物也可使用於本發明中，以取消分子團形成試劑的需求，此常常使用 於保護在水溶液或懸浮液中具有限制溶解性及淬火問題。此螯合物的一範 例爲4-{2♦異硫氰化甲基苯)_2,6_二([正，正二(羧甲基)氨基]甲基定[參籲 考：Lovgren，T.等人;Clin. Chem· 42, 1196-1201(1996)]。數個稀土屬螯化物 也特别顯示高信號-聲響比例。舉例來説，此螯化物爲四齒狀的召 -diketcmate-螯化銪[參考·· Yuan，j 及 matsum〇t〇, K ;Ana][⑶咖 7〇， 596-601(1998)]。除了上面所述的螢光標籤外，適當使用於本發明的其他標 籤由描述於美國專利編號第6,030,840號;^^的美國專 利編號第5,585,279號;gjgger等A的美國專利編號第5,573,909 ^；Wieder 產Λ的美國專利編號第6,242,268號;以及Hemmila菩人的盖同專利螞碑竿 5,637,509號，其完全合併於此作爲參考目的。 螢光標籤可使於各種方式，以形成—探針。舉例來説，標籤可 _ 單獨使用以形成探針。或者，標籤可與聚合物、微囊脂、樹狀分子及其他 微或十億分之一刻度結構連結使用，以形成探針。另外，標籤可與微顆粒 (有時稱爲珠狀（beads)或“微珠狀”(micr〇bea(js))連結使用，以形成探 針。例如，可使用自然發生的微顆粒(比如原子核、黴椠g屬(零。咖_)、 質粒、質體、哺乳動物細胞(例如紅血球沙）、丹細胞微生物(例如細菌）、多 醣類(例如瓊膠）、矽石、玻璃、纖維素顆粒等等）。進一步，也可利用合成 的微顆粒。舉例來説，在一實施例中，利用標有螢光或有色染料的乳膠微
Mavis-C:\WINSOFT\ 專和J\Pk001.08〜\0859\ΡΚ-001 -0859.doc2004/l/6 1224194 顆粒。雖然本發明使用任何乳膠微顆粒，乳膠微顆粒一般由聚苯乙烯、丁 一歸苯乙烯、苯乙婦丙烯基-乙婦基三聚物、聚甲基丙婦酸甲酉旨 (polymethylmethacrylate)、聚乙基丙烯酸甲酯、苯乙烯-順丁烯二肝共聚物、 聚醋酸乙烯酯、聚乙埽。定、聚二乙烯苯、聚丁埽對苯二甲酸酯、丙烯腈、 氯化烯-丙烯酸酯等等或乙醛、羧基、氨基、羥基或其癆得治衍生物。其他 適當的微顆粒由Jou等人描述於美國專利編號第5,67〇,38i號以及Tarcha 等人描述於美國專利編號第5,252,459號，其完全合併於此作爲參考。 在一些實施例中，微顆粒可爲磁性。一般，材料考慮爲“磁性”， 假使受磁場用途影響，比方舉例來説，假使吸引或拒絶或具有可查知的感 修 文性或感應的磁性。例如，可使用於添加磁性特性至探針之適當磁性反應 材料的一些範例包括(但不受限)順磁性材料、超順磁性材料、鐵磁材料、 亞鐵磁材料及metamagnetic材料。特定範例爲金屬(比如鐵、鎳、鈷、鉻、 鐘等等）、稀土屬元素(比如钕、甸1等等）、合金(比如紹、錄、鉛、銅等等的 磁性合金）、氧化物(比如氧化鐵(F^4)、氧化亞鐵(Fe2〇3)、氧化鉻(Cr〇2)、 氧化鈷(CoO)、氧化鎳(Ni〇2)、氧化錳(Μη》3)等等）、合成材料(比如鐵酸鹽 等等)以及固態溶液(比如具有氧化鐵的磁鐵礦等等）。 s利用顆粒時，比如上面所述，顆粒的平均直捏一般理想下可依 照-些因素而改變，比如挑選的顆粒類型、薄膜的孔徑及薄膜的組成。舉籲 例來説，在一實施例中，微粒標籤範圍約爲〇 〇1微米至丨”㈨微米，在一 -實知例中約爲0.01微米至1〇〇微米，且在一些實施例中約讀微米至 10微米。在一特别實施例中，顆粒具有約01 S 2微米的平均直徑。一般， 果▲實貝上爲球形，雖然其他形狀可適當使用於本發明中，&括(並不限定） 子桿子、棒子、不規則性狀等等。將由精通技藝明白，可廣泛變化顆 粒的組成、形狀、大小與/或者密度。 在-些實例中，理想的是在一些方式中可變更探針，因此能夠更
Mavis-C：\WlNS〇FT\lCf[i^k001.08~\0859\PK-001-0859.doc2004/l/6 14 輕易接合至分析物。在此實例中，探針可依某特定連結構件(附著形成結合 探針)而變更。特定連結構件一般適用於特定連結組構件，即二個不同分 子，此處-個分子化學式與/或者物理式連結至第二分子。例如，免疫反應 特定連結構件可包括抗原、半抗原、配體核酸、抗體及其合成物，包糾 重組DNA錢或魏酸合成。題可鱗魅_乡株抗體、—重組蛋 白質或混合物或細片，⑽抗難其靖定連結構件的混合物。準備此 抗體以及適當制作爲特定連結構件的詳細説明爲著名的精通技藝。其他 共同特定連結組包括(但不受限)維生素Η及抗生物性蛋白維生素Η及鍵 黴抗生物素蛋白(streptavidin)、抗體連結蛋白質(比如蛋白f a或g)及抗 體、碳水化合物及親酷蛋白質(lectins)、補充核甘酸順序(包括標藏及捕獲 核酸順序，此使用於DNA雜交試驗，以偵檢目標核酸順序）、補充縮氨酸 順序(包括由重組方法軸）、侧器及較體分子賀爾蒙及錢蒙連結蛋 白質、酵素著輔因子(cofactor)及酵素、酵素抗化劑及酵素等等。再者，特 足連結組可包括最初特定連結構件的相似物。舉例來説，可使用分析物的 衍生物或片段(即分析物相似物)，只要與分析物相同具有至少一定位系統。 特定連結構件一般可使用任何各種已知技術而附著至探針。例 如，特定連結構件至探針(例如標有微顆粒)的共價附著可使用羧基、氨基、 乙醛、溴乙醯基、碘乙醯基、硫醇、環氧基及其他反應或連接官能基，以 及剩餘的自由基及陽離子基，此可經由蛋白質連結反應完成。表面官能基 也可併成官能共單體，因爲微顆粒的表面可含有較高的極性部分表面濃 度。另外，雖然微顆粒標籤常常在合成之後起作用，在某情形中，比如多 硫商分’微顆粒能與蛋白質直接共價連接，而不需進一步變更。舉例來説， 在一實施例中，接合的第一步驟爲在顆粒表面上使用碳化二亞胺 (cafbodiimide)活化羧基。在第二步驟中，活化羧酸基與抗體的氨基反應， 以形成一醯胺鍵。可在缓衝物中發生活性化與/或者抗體連結，比如嶙酸鹽
Mavis-C：\WINSOFT\^iim001.08~\0859\PK-00l-0859.d〇c2004/l/6 15 1224194 -緩衝食鹽水(PBS)(例如ρΗ7·2)或嗎林乙基磺酸(2[N-morph〇lino] ethane sulfonic acid)(MES)(例如pH5.3) 〇如圖，然後結果顆粒可用乙醇胺阻擋， 例如以形成標籤結合。除了共價鍵結外，其他附著技術(比如物質吸附作用） 也可利用於本發明中。 一般而言，各種流式試驗設備可;f艮據本發明構成與光譜儀螢光偵 檢系統一起使用。關於此點，目前將更詳述本發明的各種不同實施例。無 論如何，將了解下面探討的實施例僅爲範例，本發明也可考慮其他實施 例。例如’再度引用第一圖，概要説明偵檢存於試驗樣本内之分析物的一 系統。最初，將含有分析物的試驗樣本運用於取樣襯塾(無圖示)中。自取 籲 樣襯塾，然後試驗樣本可移至結合襯墊(22)，此處分析物與探針混合，以 形成分析合成物。舉例來説，在一實施例中，探針自微顆粒形成，此染有 稀土屬螯化物(比如上面所述），並連結至感興趣分析物的特定連結構件。 再者，因爲結合襯墊(22)與多孔薄膜(23)流體傳遞，合成物可自結合襯墊(22) 移至多孔薄膜(23)上的偵檢地區(31)。 偵檢地區(31)可含有一制動捕獲試劑，此一般可由與探針化學或 物理鍵結。舉例來説，在一些實施例中，黏合劑可含有一生物捕獲試劑。 舉例來説，在一些實施例中，捕獲試劑可爲生物捕獲試劑。此生物捕獲試 劑爲熟知的技藝，並可包括(但不限定)抗原、半抗原、抗體、蛋自質A或 _ G、抗生物性蛋白、鏈黴抗生物素蛋白(streptavidin)、第二抗體及其合成物。 在許多情形中，理想的是這些生物捕獲試劑可連結至微顆粒上的特定連結 構件(例如抗體）。另外，同樣理想的是可利用各種不同非生物材料作爲黏 口劑。例如’在_些實施财，黏合射包括可連結至賴獲探針的聚電 解質。聚電解質可具有淨正或負電荷，以及中性的淨電荷。例如，具有淨 正電何讀電解質的—些適當範例包括(但不受限)聚離氨酸(商業上獲自 始、蘇里州路易斯街的sig跡Aldrich化學有限公司）、聚次乙亞胺、α-環氧
Mavis-C:\WINSOFT\«Wk001.08~\0859\PK-001-0859.doc2004/l/6 16 1224194 -氣-丙烷官能聚胺與/或者樹狀高分子PAMAM( polyamidoamine)(比如聚二 甲胺-共α-環氧-氣-丙烷）、聚己二烯乙繞·氯化銨、陽離子纖維素衍生物(比 如纖維素共聚物或與季銨水-可溶單體接合的纖維素衍生物)等等。在一特 别實施例中，也可利用含有季銨水-可溶單體之纖維素衍生物的
CelQuat®SC-230M 或 Η-100(獲自 National Starch & Chemical，Inc.)。再者， 一些具淨負電荷之聚電解質的適當範例包括(但不受限)聚丙婦酸(比如聚 乙烯-共甲基丙埽酸、鈉鹽)等等。將也了解其他聚電解質也可利用於本發 明中，比如兩性聚電解質(即具有極性及非極性部分）。例如，適當兩性聚 電解質的-録例包括(但不錄)聚苯乙烯基_b正甲基2_乙烯敍鹽_ _ 化物以及聚苯乙烯基如丙烯酸，二者獲自加拿大D〇ryal的p〇lylmer s_e，
Inc. ° 這些捕獲湖作躲針結合/績合成物關定連結處。在一些實 例中’分析物(比如抗體、抗原等等)具有二個連結處。根據達到傭地區 (31) ’其十-連結處被合成探針的特定連結構件佔領。無論如何，分析物 的空連結處可連結至制動捕獲試劑。根據連結至制動捕獲試劑，合成探針 形成新的三元夾層合成物。 偵檢地區⑼-般可提供許多個别傭區域，因此使用者可更加 測定試驗樣本内的特别分析物濃度。每個區域可含有相同的捕獲試劑，或鲁 可含有用來捕獲多個分析物的不同捕獲試劑。舉例來説，偵檢地區⑼可 包括二或更多侧偵檢區_如線、點㈣。偵檢地區可配置於與試驗 樣本流經試驗設備(20)垂直的方向線中。同樣地，在一些實施例中，偵檢 區域可配置於與試驗樣本流經試驗設備平行的方向線中。 八 雖然偵k地區⑼可檩示存有分析物，常困於使用單獨碰地區 ⑼測定試驗樣本内的分析物之相對濃度。因此，試驗設綱也可包括一 也區(32)在此實犯例中，校正地區㈤在多孔薄膜⑼上形成，並自
Ma就Λ麵。卿獅〇〇1助85觸〇1魏如細^ 17 偵檢地區(Μ)順水而下。校正地區(32)提供可通過薄膜⑼連結至任何剩餘 未捕獲探針的捕獲試劑。尤其，根據與試驗樣本接觸。沒有連結至分析物 之任何未捕獲的探針移經偵檢地區(31)，並進入多孔薄膜(23)的校正地區 (32)。在校正地區(32)中，然後這些未捕獲探針連結至捕獲試劑。在校正地 區(32)所利用的捕獲試劑可與使用於偵檢地區(31)的捕獲試劑相同或相 異。再者’與偵檢地區(31)相似，校正地區(32)也可在任何方向中提供許多 個别校正區域，因此使用者可更加測定試驗樣本内的特别分析物濃度。每 個區域可含有相同捕獲試劑，或可含有不同捕獲試劑，以捕獲不同螢光標 籤0 校正區域可用不同黏合劑數量預先裝於多孔薄膜(23)，因此由每 個校正區域根據捕獲探針的移動而產生不同信號強度。每個校正區域内的 黏合劑之所有數量可藉由利用不同大小的校正區域或改變每個校正區域 中的黏合劑濃度或容量而變化。假使理想的話，過多的探針分子可運用於 試驗设備(20)中’因此每個校正區域達到本身裝滿及估計潛在的信號強 度。估計置放於校正區域的未捕獲探針數量，因爲運用於校正區域中的黏 合劑數量爲預估的且爲已知程度。 一旦捕獲，在偵檢及校正地區(31)、（32)的探針之螢光信號可使 用光譜儀閲讀機(5〇)測量。舉例來説，在此實施例中，螢光閲讀機(5〇)構成 將波光同時放射至偵檢及校正地區(31)、（32)。閲讀機(5〇)也可同時自激發 標籤在偵檢及校正地區(31)、（32)中接收螢光信號。或者，螢光閲讀機(50) 可構成連續將波光放射至偵檢地區(31)及校正地區(32)。另外，分散的螢光 閲讀機(無圖示)也可使用於測量校正地區(32)中的螢光信號。 螢光閲讀機(5〇)的結構一般可依照各種因素(比如費用、所需精確 程度、感興趣分析物的性質及濃度等等)而變化。一般，螢光閲讀機(5〇)利 用-或更乡波動激發能量及光電探測器互相與其他任意構件(比如爐光器)
Mavis-C:\WINSOFT\$f IJ\Pk001.08~\0859\PK-001 -0859.doc2004/l/6 Jg 1224194 聯繫。波_發及時_檢的使用可任意錢光器結合，此允許僅自勞光 標籤做縣攸碰，自—般槪暫存於樣本巾的其健麟拒放射物。 例如，引用第二圖，此顯示示範螢光閲讀機(50)的一實施例，包 括一激發能量(52)及一偵檢器(54)。本發明可使用各種不同激發能量(52)， 舉例來説，包括光放射二極體(LED)、閃光燈以及其他適當能量。也可多 重與/或者調整激發照明;舉例來説，來自多數附著能量(例如雷射)的各種不 同個别頻率光束可使用一排二色性反射鏡而調整及多重。進一步，照明可 爲連續或波動，或可結合連續波動(CW)及波動照明，此處多數照明光束爲 多重(例如波動光束與CW光束多重），此允許在螢光被cw能量感應及螢 鲁 光被波動能量感應之間有信號識别。舉例來説，砷化鎵LED二極體(例如 砷化鋁鎵紅色二極體、磚化鎵綠色二極體、坤化磷化鎵綠色二極體或氮化 銦鎵紫藍/藍/紫外線(UV)二極體)可使用作爲照明能量。適用於本發明中的 適當UV LED激發二極體之商業上利用範例爲M〇dei NSHU550E(Nichia Corporation) ’此在10毫安培(3·8〜3.9伏特)的正向電流中將750至1000微 瓦特的光學力量放射至在10度最高點具有全寬的光束，37〇〜375 nm的最 尚波長，以及I2 nm的光譜半寬。 進一步，可使用於本發明的適當偵檢器(54)範例包括(但不受限） 光電倍加管設備;光電二極體(比如崩潰光二極體(avalanche ph〇t〇di〇des)、矽 ⑩ 光質二極體(silicon photodiodes)等等);高速線性電荷耦合元件(CCD)、CID 元件或CMOS基本影像等等。在一實施例中，螢光系統利用石夕光質二極體 作爲螢光偵檢。矽光質二極體的優點爲便宜、靈敏、可高速作用(短上升時 間/高帶寬），且可輕易併入大部分其他半導體科技及單一電路。另外，石夕 光質二極體物質小，此能輕易併入使用於薄膜設備的系統中。假使使用矽 光質二極體，然後螢光放射線的波長範圍在靈敏度範園内，爲400至11〇〇 11111。另一偵檢器選擇爲〇(18(硫化鐵)光電導管(011〇1:〇〇〇11(111〇11\^〇611)，此具
Mavis-C:\WINSOFT\ 專罕 fJ\Pk001.08〜\0859\PK-001-0859.doc2004/l/6 19 1224194 有光譜靈敏度與人類視覺(視覺曲線)相似的優點，此可較輕易排拒反射激 發放射線。 濾光器(無圖示)可任意鄰接激發能量(52)及偵檢器(54)。濾光器在 激發波長範園中可具有高傳遞率値，及在一或更多不理想波長波袋中可具 有低傳遞率値，以自激發能量過濾出不理想波長。不理想的波長範園一般 包括產生可偵檢樣本自動螢光的波長，與/或者約25至1〇〇 nm的激發最大 波長’因此背景噪音的潛能來自散播的激發照明。可利用於本發明的濾光 氣之數個範例包括(但不受限)染色塑膠樹脂或動物膠、二色性過濾器、薄 多層薄膜干擾過濾器、塑膠或玻璃過濾器、環氧機或治療透明樹脂過濾 鲁 器。在一實施例中，偵檢器與/或者激發能量可埋入或裝入過濾器内。雖然 可利用濾光器，本發明的一有益觀點爲此過濾器常常不須結果爲光譜儀。 換句話説’由於延誤螢光放射，放射帶寬過濾器並不需要藉由激發能量過 濾、出任何短暫的營光。 再度引用第二圖，也可使用各種不同定時電路來控制激發能源 (52)的波動激發以及放射螢光的測量。例如，在圖解的實施例中，時脈源 (clock source)(56)(例如石英振|器(crystai 〇sciuat〇r))使用於提供控制頻率 能量至螢光閲讀機(5〇)中的其他電子構件。在此特别實施例中，例如，振 盪器⑽可產生20 MHz信號，此提供LED驅動程式/波動產生器(55)以及 · A/D變換器(64)。自振皇器(56)至a/d變換器㈣的時脈信號孔至趨變換 器(64)的運轉速度。將明白在此個别信號路徑中可利用除頻(如职⑶^ divuier)，假使運轉A/D變換器(64)的頻率，或假使理想的時脈頻率輸入led 驅動私式/波動產生器(55)不同於2〇 MHz。因此，將了解來自振盪器(56) 的信號可適當調整，以提供理想頻率信號。在一些實施例中，來自振靈器 (56)6你號也可提供微處理機⑽控制本身的轉動速度。依照本發明，可在 其他信號路徑中利用額外的頻率驅動程式。
Mavis-C:\WINSOFT\ 專利\Pk〇〇 1 ·〇8〜\〇859\ΡΚ-001 -0859.doc2004/l /6 20 1224194 微處理機(60)提供控制輸入波動產生器(55)，使得預定調整振盪 器(56)的20 MHz信號，以提供理想的波動期間及反覆速率(舉例來説，有 50%工作週期的丨kHz能量）。然後波動產生器(55)的信號可提供激發能量 (52)，控制本身波動反覆速率及照明的工作週期。在一些實施例中，在信 號路徑中提供電晶體至激發能量(52)，因此在激發能量(52)中提供可引起波 光信號的開關裝置。 如上所述，波光激發與附屬試驗設備連結的螢光標籤。在理想反 應時間(例如約100至200微秒)之後，偵檢器(54)偵檢由激發螢光標籤放射 的螢光k號，並產生電流i樣本。然後此電流可藉高速轉換電阻前置放大器 春 (78)轉變成一電壓程度，此可由較低下降時間及快速自彩度恢復爲特徵。 然後前置放大器(78)的輸出提供A/D變換器(64)的資料輸入。在前置放大 器(78)之後及A/D變換器之前，可在信號路徑中使用額外放大器構成部分 (比如預定獲得的放大器），以在適當電壓範園内於激發波動後緣產生一信 號，以供應至A/D變換器。A/D變換器(64)可爲高速變換器，此在附屬螢 光標籤的螢光壽命内具有足以取得許多點的取樣速率。取得設置前置放大 器(78)，使得資料數値掉落於激發波動後緣的最大a/d計數(例如12位元 變換器的2047)。然後A/D變換器(64)的動力範園内之資料最初表示爲理 想的螢光信號。假使樣本間隔以激發波動的上升時間及下降時間來做簡單 比較，然後取得設置前置放大器(78)，以確保A/D變換器(78)的上方1/2 或3/4動力範圍内的信號數値與放射波動的後緣一致。 A/D變換器(64)自前置放大器(78)取樣信號，並供至微處理機 (60)，此處軟體指令構成各種不同數位信號處理。當取樣债檢螢光信號時， 微處理機(60)的輸出提供進一步控制A/D變換器(64)。對前置放大器(78)(無 圖示)及A/D變換器(64)的控制信號可連續變更以達成最適當取得的取樣 間隔及觸發偏移。將了解雖然A/D變換器(64)及微處理機(60)描述爲個别
Mavis-C:\WINSOFT\^^IJ\Pk〇〇 1 .〇8~\0859\PK-〇〇 1 -0859.doc2004/1/6 2\ 1224194 構件，商業上可説是包括鮮—模財的二_件可糊於本發明中。處 理《後^微處理機⑽)可提供至少_檢器⑽貞檢的螢絲度之輸出指 。翻Tih供和器㈣’ @此提供制者有標籤產生的視覺標示之 螢光信號。顯示器㈣可提供使用者額外的交互作用特性，比如控制界面， 使用者可提供程序輸入微處理機(60)。 第三圖説明使用於螢光閲讀機(5〇)中表示特定電子構件的又另一 實施例。第三圖中的許多構件與第二_似，且此類實例中使用相同參考 ^舉例來説’第二圖的閲1買機(50)與第二圖比較的差異爲在相位延後 模、、且(57)中產生閘門信號。微處理機㈣的控制信號提供相位延後模組 (57)，以提供時脈信號的有效相位轉移。此轉移時脈信號(也稱爲閉門信號） 然後提供一混合器(58)，此處信號乘以由铺檢器㈣接收並通過前置放大器 的定期偵檢器信號。織，結果在供至趟變換器(64)之前，混合器(58) 的輸出傳送經過低通濾波器(l〇w pass filter)(62)。"D變換器(64)然後可測 量低通濾波器)(62)的輸出，以在閘門信號定義的間隔期間獲得螢光測量。 第四圖説明示範螢光閲讀機實施例(5〇)的又進一步二選一特性。 例如取樣/保持放大器(88)(有時也稱爲追縱及保持放大器(加ck_ancj_h〇id amplifier))顯示在特定點於外部信號控制下適時捕獲及保持電壓輸入信 號。使用本科技的取樣/保持放大器之特定樣本爲SHC5320元件，比如售 自Burr-Brown Corporation。在第四圖實施例中的取樣/保持放大器外部控 制信號引自延遲電路(92)，例如爲數位延遲電路，此使用計數機、基本邏 輯閘及正反器電路的估計延遲來驅動。延遲電路(92)自振盪器(56)引入一時 脈信號，及自除頻(90)引入一啓用信號(enable signal)，此比振盪器(56)產生 較少的頻率程度中單單提供定期信號。延遲電路(92)也可自微處理機(60) 引入一控制輸入，以能延遲程式輸入，以在取樣/保持放大器(88)中確保適 當取樣。延遲波動控制自電路(92)至取樣/保持放大器(88)的信號，因此關
Mavis-C:\WINSOFT\#ilJ\Pk001.08~\0859\PK-001-0859.doc2004/l/6 22 掉激發能量(52)後，引發在預調時間間隔中，自偵檢器(54)得到螢光信號。 不顧利用閲讀機(50)的結構，可由與估計分析物濃度有關在偵檢 地區(31)_彳示鉞捕獲所放射金光仏號is來確定分析物的數量。在一些實施 例中，強度信號Is也可與在校正地區(32)所捕獲的放射螢光強度信號乙做 比較。螢光強度信號Is可與螢光強度信號Ic做比較。在此實施例中，估計 並了解在校正地區(32)的標籤總數量，因此可使用校正目的。舉例來説， 在一些實施例中(例如夾層試驗），分析物的數量與1§與Ie的比率成正比。 在其他實施例中(例如競爭試驗），分析物的數量與1與1的比率成反比。 根據偵檢地區(31)的強度範圍減少，可測定分析物的一般濃度。結果，可 同時在大約相同情況下可處理校正及取樣試驗，因此以增加靈敏度而提供 可靠定量或半定量結果。 假使理想的話，對已知分析物濃度的範圍而言，1與、的比率可 標出與分析物濃度的對比，以產生一校正曲線。欲測定分析物在未知試驗 樣本中的分析物數量，然後可根據校正曲線將信號比率轉換成分析物濃 度。須注意在^與〗。之間的二擇一數學關係可標出與分析物濃度的對比， 以產生校正曲線。舉例來説，在一實施例中，Is/Is+I。的數値可標出與分析 物濃度的對比，以產生校正曲線。 如上所示，設備(20)可利用夾層形式、競爭形式等等。夾層試驗 形式一般牵涉試驗樣本與抗體混合至分析物。這些抗體可移動，並連接至 一標籤(比如染色標籤、膠狀金屬膠質溶液或一放射性同位素）。然後混合 物與含有固定抗體的條紋或地區之層析介質接觸至分析物中。分析介質常 常爲-片像浸賴彳的形^。當分析物及標示抗體的合成物在層析介質上 達到固定抗體時，產生連結，且連結標示抗體侷限於一處。此表示存有分 析物。可使用此技術獲得定量或半定量結果。此夾層試驗的一些範例由 描述於美國專利編號第4，168，146號，以及；^慶^的美國專
Mavis-CA麵㈣專獅亂_8峨·微⑽嶋％ 1224194 利編號第4,366,241號，其完全合併於此作爲所有參考目的。 在競爭試驗中’標籤一般爲標示分析物或分析物相似物，以使抗 體與樣本中未標示的分析物連結。競爭試驗一般使用於偵檢分析物(比如半 抗原），每個半抗原爲單價，且能夠僅連結一抗體分子。競爭免疫分析設備 的範例由Deutsch等人描述於美國專利編號第4,235,6〇1號，Li〇tta的美國 專利編號第4,442,2〇4號’以及Buechler等人的美國專利編號第5,208,535 號’其完全合併於此作爲參考所有目的。各種不同其他設備形狀與/或者試 驗形式也由Lambotte等人描述於美國專利編號第5,395,754號;J〇u等人的 美國專利編號第5,67〇,381號;以及Malick等人的美國專利編號第6，194,220 籲 號，其全部合併於此作爲參考所有目的。 雖然上面已描述各種不同設備形狀，將了解本發明的設備一般具 有任何理想形狀，並虛含有上面所述的所有構成要素。 本發明可參照下面範例而更加了解。 範例1 説明使用於薄膜設備中形成結合螢光顆粒。500微升的0.5%羧化 銪螯化物膠囊顆粒(〇·2〇微米，EU-P顆粒，獲自Molecular Probes，Inc·)以 100微升的PBS缓衝物(0.1克分子)清洗。然後40微升的清洗顆粒使用3 毫克的碳化二亞胺(carbodiimide)(獲自Polylsciences，Inc.)。允許混合物在室 溫(RT)下於一攪拌器上反應30分鐘。然後活性化顆粒以硼酸鹽經由離心力 以硼酸鹽緩衝物清洗二次。活性化顆粒以浴用超音波(bath sonication)2分 鐘而懸浮於200微升的硼酸鹽緩衝物中。 之後，將30微升的C-反應蛋白質(CRP)(4.9毫克/公撮，Mabl A58110228P，獲自加利福尼亞州的Emeryville之BiosPacific，Inc·)加入活性 化顆粒。允許反應混合物在室溫下於攪拌器中反應2.5小時。然後於輕微
Mavis-C:\WINSOFT\ 專利\Pk001 08~\0859\PK-001 -0859.doc2004/l/6 24 1224194 搖動30分鐘下，在〇·25公撮的〇.25克分子乙醇胺中收集並培養活性化顆 粒。然後以PBS清洗顆粒二次。然後於冰浴下，顆粒在pBS中1〇秒鐘探 測超音三次，並儲存於4°C下。 範例2 使用370 nm的激發波長及615 nm的放射波長，利用傳統 FluoroLogffl光譜螢光計(購自HoriibaGroup)測定結合形成於範例1的探針 顆粒之激發及放射光譜。 結果顯示於第五圖。如所示，探針顆粒的激發及放射光譜與未結 合的探針顆粒之激發及放射光譜相似，除了 430 nm峰和615 nm峰成比例 的結合較高外。結合探針顆粒在355 nm四周具有強大的激發峰，及在430 與615 nm有二個強大的放射峰。在430 nm中的放射峰相信能透過自配體 移至銪金屬中心的能量自d_d銪金屬離子轉移。 範例3 説明形成薄膜試驗的能力。最初，將由硝化纖維素製成的 Millipore SX多孔薄膜壓成具有大約長度爲30公分的一致輔卡。c-反應蛋 白質(CRP)單株抗體(Mab A58040136P，2·3毫克/公撮，獲自加利福尼亞州 的BiosPacific，Inc·)剝去薄膜，以形成一偵檢線。然後金線(g〇ldline)(多離 Μ胺酸(polylysine)，獲自British Biocell國際組織)剝去薄膜，以形成一校 正線。薄膜在37°C中乾燥1小時。 將校正纖維芯吸襯墊(Millipore公司)附著至薄膜的一末端。以獲 自Millipore公司的二個玻璃纖維襯塾(樣本及結合襯塾)將薄膜的其他末端 壓成薄片。將結合及芯吸襯墊直接與薄膜接觸，樣本襯墊直接與結合襯墊 接觸。結合襯墊與樣本襯墊每個具有4毫米的寬度。樣本襯墊以1%的多
Mavis-C:\WINSOFT\ 專#Pk001.08〜\0859\PK-001-0859.doc2004/l/6 25 1224194 羥乙烯山梨醇酑單月桂酸鹽(爲一種非離子表面活化劑，獲自名稱“Tween 20 ”下的σ-Aldrich)處理，並在37°C下乾燥2小時。結合襯墊以200微升 範例1的結合探針顆粒處理，並與PBS缓衝物、200微升的2%“Tween 20，， 及200微升的20%蔗糖混合。滲透的結合襯墊在烘箱中以37°C乾燥1.5小 時。 將產生的設備密封於袋内以儲存。 範例4 説明將範例3的設備用於偵檢分析物的存在。換句話説，提供八 個裝滿範例3設備的樣本。將40微升在PBS中有不同濃度(即1、2、5、 10、20、50及100 ng/公撮)的CRP溶液直接個别運用於每個樣本的樣本襯 墊中。設備允許作用30分鐘，且在個别爲370 nm及611.5 nm的激發波長 中測量偵檢線及校正線上的螢光。螢光以傳統FluoroLogffl光譜螢光計(購 自Horiba Group)使用正面模式測量。激發光束排列成與設備表面約呈 70°，且與放射的設備表面約呈45。。雖然反應可觀察約在15分鐘内完成， 此時間足以允許在螢光測量之前充分反應。 表I爲校正及偵檢線二者的螢光資料。 表I:螢光資料 樣本編號 1 2 3 4 5 6 7 8 CRP加入 0 1 2 5 10 20 50 100 (ng/ml) 偵傲射衾 19.7 27.2 34.7 75.8 89.1 170 336 402 度，《χισ3) 773 825 818 672 540 500 563 289
Mavis-C:\WINSOFT\ 專和J\Pk001.08〜\0859\PK-001-0859.doc2004/l/6 26 1224194 度，Ic(Xl〇-3) 第六圖顯示IS/(IS十Ic)的標準強度比率與CRP濃度的對比。標準強 度由測量樣本營光強度除以控制樣本的螢光強度。如所示，劑量反應曲線 (dose response curve)以校正線校正，且爲線型，尤其CRp濃度小於2〇 nm/ 公撮。 範例5 測定將範例3的設備用於偵檢分析物的存在。換句話説，提供五 _ 組每個含有四個裝滿範例3設備的樣本。將4〇微升在pBS中有不同濃度(即 卜2及5 ng/公撮)的CRP溶液直接個别運用於樣本襯墊中。設備允許作用 30分鐘，且在個别爲370 nm及611.5 nm的激發波長中測量偵檢線及校正 線上的勞光。螢光以傳統FluoroLogffl光譜螢光計使用正面模式測量。激 發光束排列成與設備表面約呈70。，且與放射的設備表面約呈45。。雖然反 應可觀察約在15分鐘内完成，此時間足以允許在螢光測量之前充分反應。 表Π及ΠΙ爲校正及偵檢線二者的螢光資料。
表I:螢光ϋ r 料(Vie) 組别 1 2 3 4 5 CRP加入 (ng/ml) 0 413/1.7 453/1.6 416/1.5 558/1.9 455/1.9 1 460/1.7 472/1.9 525/1.7 474/1.4 631/1.6 2 627/2.0 575/1.2 572/1.7 601/1.4 534/2.0 5 708/13 778/1.3 638/1.3 743/1.6 816/1.6
Mavis-C:\WINSOFn 專利\Pk001.〇8〜\0859\PK-〇〇i-〇859.d〇c2004/l/6 27 1224194 一 組别 (ΙΛ+Ι〇) Is CRP 加入(ng/ml) 一 0 0.2110/.0150 458/59 — 1 0.2367/0.0331 512/71 __ 2 0.2573/0.0418 582/35 __ 5 0.3422/0.0222 738/68 表111 :平均螢光強度/標準偏差(Is/Is+Ie)
因此，本發明的結果，可在偵檢期間實際除去出自許多能量(比 如分散光線及自動榮光)的干涉原因。另外，使用於本發明的勞光閲讀機可 具有簡單及便宜的設計。例如，在一實施例中，閲讀機可利用波動框放射 二極體(LED)及一矽光質二極體來精確激發標籤及偵檢薄膜試驗設備上的 螢光，此不須昂貴構件(比如單色器或狹窄的放射帶寬光學濾光鏡）。 儘管發明已用特定實施力詳細描述，將根據對前文的理解而了解 那些熟知技藝可輕易對這些實施例做思索變化及變❺。因此，本發明的範 園將評估附加申請專利範園及任何同等物。
Mavis-C:\WINSOFT\HffJ\Pk001.08~\0859\PK-001-0859.doc2004/l/6 28 1224194 【圖式簡單說明】 本發明針對一般熟知技藝的所有及能夠揭發的事物(包括其最佳 模式)尤其更發表於剩下的説明書中，此參照附圖，如下： 第一圖爲本發明薄膜設備之實施例的正視圖； 第二圖爲可使用於本發明光譜儀螢光閲讀機之—實施例的概要 圖表，包括代表性的電子構件； 第三圖爲可使用於本發明光譜雜光_機之 要圖表，包括代表性的電子構件； 第四圖爲可使用於本發明光譜儀螢光閲讀機之又另一實施例的 概要圖表，包括代表性的電子構件； 第五W錄細2帽到標準祕及鱗之_絲的曲線圖; 以及 第六圖爲標特賴度與制4之分析物濃物論丨)結果的曲 線圖。 重複使用於本案及圖示的參考特性意圖表示相同或類似發明的 特性或構成部分。 【圖式元件簡單說明】 20 flow-through assay device 流式試驗設備 _21 rigid material 硬材 22 conjugate pad 結合襯墊 _ 23 porous membrane 多孔薄膜 _28 wicking pad 芯吸襯墊 31 detection zone 偵檢地區_ 32 calibration zone 校正地區
Mavis-C:\WINSOFT\H#fj\Pk001.08~\0859\PK-001-0859.doc2004/l/6 29 1224194 50 fluorescence reader 螢光閲讀機 52 excitation source 激發能量 54 detector 偵檢器 55 pulse generator 波動產生器 56 oscillator 振盪器 57 phase delay module 相位延遲模組 58 mixer 混合器 60 microprocessor 微處理機 62 low-pass filter 低通濾波器 64 A/D converter A/D變換器 78 high-speed transimpedance preamplifier 高速轉換電阻前置放大器 86 display 顯示器 88 sample/hold amplifier 取樣/保持放大器 90 frequency divider 除頻 92 delay circuit 延遲電路
Mavis-C:\WINSOFT\ 專和J\Pk001.08~\0859\PK-001-0859.doc2004/l/6

Claims (1)

  1. 拾、申請專利範圍： ~種利用光譜儀螢光的偵檢方法，該方法包含·· 1 提供一流式試驗設備，其包含與螢光標籤流體傳遞的多孔薄 膜，該螢光標籤具有大於1微秒的螢光放射壽命，該多孔薄膜定 義爲一偵檢地區； ϋ· 該螢光標籤與試驗樣本接觸，以形成一混合物； W. 允許該混合物流至該偵檢地區； iv* 將光譜儀螢光閲讀機置放於最接近該偵檢地區，該螢光閲讀機 包含一波動激發能量及一時閘偵檢器； ν· 在該偵檢地區以波動激發能量激發該螢光標籤，其中該激發引 起螢光標籤放射一偵檢信號;以及 vi· 以時閘偵檢器測量偵檢信號的強度。 2·如申請專利範園第1項的方法，其中該螢光標籤具有大於10微秒的放 射壽命。 3·如申請專利範圍第1項的方法，其中該螢光標籤具有100〜1000微秒的 放射壽命。 4·如申請專利範圍第1項的方法，其中該螢光標籤具有大於50mn的斯 托克轉移。 5·如申請專利範園第1項的方法，其中該螢光標籤具有大於100nm的斯 托克轉移。 6.如申請專利範圍第1項的方法，其中該螢光標籤具有250〜350 nm的斯 把克轉移。 7·如申請專利範圍第1項的方法，其中該螢光標籤包括釤、鏑、銪、铽 的稀土屬螯化物或其化合物。 8·如申睛專利範圍第1項的方法，其中該螢光標籤爲螯化鋪。 Mavis-C:\WINSOFT\^^IJ\Pk001 ,〇8~\〇859\ΡΚ-0〇1 -〇859.doc2004/l/6 31 1224194 9·如申清專利範園第！項的方法，其中該勞光標籤使用於與微顆粒、奈 米奸、微麟、樹狀分子、聚合物或其化合物連結。 ίο·如申叫專利範圍第9項的方法，其中該螢光標籤使用於與以特定連結 分析物構件變更的微顆粒或奈米粒子連結。 11.如申請專利範園帛i項的方法，其中該偵檢地區包括多數價檢區域。 I2·如申請專利範圍第η項的方法，其中該偵檢區域含有連結至多數分析 物的多數捕獲試劑。 I3·如申請專利範圍第1項的方法，其中該多孔薄膜進一步定義爲一校正 地區，其中該混合物也允許流至該校正地區。 14.如申請專利範圍第13項的方法，其中該校正地區包括多數偵檢區域。 15·如申請專利範園第14項的方法，其中該校正區域含有連結至多數螢光 標籤的多數捕獲式劑。 16.如申請專利範園第13項的方法，進一步包含·· 該光譜儀螢光閲讀機置放鄰接該校正地區； 在該校正地區以波動激發能量激發該螢光標籤，其中該激發引起 螢光標籤放射一校正信號； 以時閘偵檢器測量校正信號的強度;以及 比較#、檢信號及校正信號的強度，其中試驗樣本内的分析物數量 · 與偵檢信號的強度成比例，此由校正信號的強度校正。 Π·如申請專利範圍第16項的方法，其中在該偵檢地區中的螢光標籤與在 該校正地區中的螢光標籤同時激發。 18.如申請專利範圍第16項的方法，其中同時測量該偵檢信號及校正信 號。 如申請專利範圍第16項的方法，其中該波動激發能量光放射二極體。 2〇·如申請專利範圍第16項的方法，其中該時閘偵檢器爲一矽光質二極 Mavis-C:\WINSOFT\^IJ\Pk001.08~\0859\PK-001-0859.doc2004/l/6 32 21·如申請專利範圍第16項的方法，其中該勞光閲讀機含有與波動激發能 量及時閘偵檢器聯繫的定時電路，該定時電路控制波動激發及偵檢。 22·如申請專利範圍第I6項的方法，其中光學過濾器鄰接該波勤激發能 量、該時閘偵檢器或其組合。 23· —種利用光譜儀螢光的偵檢方法’該方法包含： 1. 提供一流式試驗設備，其包含與含有螢光標籤的結合探針流體 傳遞的多孔薄膜，該螢光標籤具有大於1〇微秒的螢光放射壽命， S多孔薄膜定義爲一彳貞檢地區及一校正地區;以及 ii· 該結合探針與試驗樣本接觸，以形成一混合物； iii·允許該混合物流至該偵檢地區及校正地區； IV·將光譜儀螢光閲讀機置放於最接近該偵檢地區及校正地區，該 螢光閲讀機包含一波動激發能量及一時閘偵檢器； ν· 在該偵檢地區及校正地區以波動激發能量激發該螢光標籤，其 中★亥激發引起螢光標戴在該悄檢地區放射一偵檢信號及在該校正 地區放射一校正信號； VI.以時閘偵檢器測量偵檢信號及校正信號的強度;以及 vii·比較偵檢信號及校正信號的強度，其中試驗樣本内的分析物數 量與偵檢信號的強度成比例，此以校正信號的強度校正。 24·如申請專利範圍第23項的方法，其中該螢光標籤具有100〜1000微秒 的放射壽命。 25·如申請專利範圍第23項的方法，其中該螢光標籤具有大於50nm的斯 托克轉移。 26.如申請專利範圍第23項的方法，其中該螢光標籤具有250〜350 nm的 斯托克轉移。 Mavis-C:\WINSOFT\$f IJVPkOO 1.08~\0859\PK-001 -0859.doc2004/l/6 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 如申叫專利範圍第23項的方法，其巾該魏標籤包括釤、鏑、鋪、欽 的稀土屬螯化物或其化合物。 如申晴專利範目第27項的方法，其中該螢光標籤膽化銪。 如申凊專利細第23侧方法，其巾該螢光賴鋪檢地區與該營光 標戴同時激發。 如申凊專種’ 23項的方法，其巾_測量_檢信號及校正信 號。 如申請專利範圍第23項的方法，其中該波動激發能量爲波動光放射二 極體。 如申請專利範園第23項的方法，其中該時閘偵檢器爲矽光質二極體。 如申請專利範圍第23項的方法，其中該螢光閲讀機含有與該波動激發 能量及時閘偵檢器聯繫的定時電路，該定時電路控制波動激發及偵檢。 一種利用光譜儀螢光的偵檢方法，該方法包含： i· 提供一流式試驗設備，其包含與含有稀土屬螯化物的結合探針 流體傳遞的多孔薄膜，該稀土屬螯化物具有大於50微秒的螢光放 射壽命以及大於励nm的斯托克轉移，該多孔薄膜定義爲一偵檢 地區及一校正地區;以及 ϋ· 該結合探針與試驗樣本接觸，以形成一混合物； iii· 允許該混合物流至該偵檢地區及校正地區； iv· 將光譜儀螢光閲讀機置放於最接近該偵檢地區及校正地區，該 螢光閲讀機包含一波動激發能量及包含矽光質二極體的時閘偵檢 器； V· 在該偵檢地區及校正地區以波動光放射二極體激發該稀土屬螯 化物，其中該激發引起稀土屬螯化物在該偵檢地區放射一偵檢信 號及在該校正地區放射'校正信號； Mavis-C:\WINSOFT\^IJ\Pk001.08~\0859\PK-001-0859.doc2004/l/6 34 vi·以時閘偵檢器測量偵檢信號及校正信號的強度;以及 说比較偵檢信號及校正信號的強度，其十試驗樣本内的分析物數 量與偵檢信號的強度成比例，此以校正信龍的強度校正。 如申請專利麵第34項的方法，其中該稀土難化物選自由彭、銷、 銪、鉞或其化合物所組成。 如申請專利範圍第34項的方法，其中該稀土屬螯化物爲螯化銪。 如申凊專利範園第34項的方法’其中該波動光放射二極體爲紫外線光 放射二極體。 如申請專利範圍第34項的方法’其中該勞光閲讀機含有與該波動光放 射二極體及時閘偵檢器聯繫的定時電路。 如申請專利範園第34項的方法，其中在偵檢地區的螢光標籤與在校正 地區的螢光標籤同時激發。 如申請專利範圍第34項的方法，其中同時測量該偵檢信號及校正信 號。 如申請專利範園第34項的方法，其中該螢光信號具有100〜1000微秒 的放射壽命。 如申請專利範園第34項的方法，其中該螢光標籤具有25〇〜350 nm的 斯托克轉移。 Mavis-C：\WINSOFT\llilJ^PkOO 1 ,〇8~\0859\PK-〇〇 l-〇859.doc2004/l/6 35
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