CN104737002A - 用于同时检测或定量多种目标物质的分析方法和分析试剂盒 - Google Patents

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CN104737002A CN201380054754.9A CN201380054754A CN104737002A CN 104737002 A CN104737002 A CN 104737002A CN 201380054754 A CN201380054754 A CN 201380054754A CN 104737002 A CN104737002 A CN 104737002A
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Abstract

为了同时检测或定量多种目标物质，将来自探针微珠的信号光局部化。一种分析方法，其通过收容在单一容器内的、分别固定有用于捕获多种目标物质的多个载体发光，并从容器外部测定该发光，来同时检测或定量多种目标物质，其中，通过隔着滤光器来测定源自载体的发光，由此选择性地接受源自所需的载体的发光。一种分析试剂盒，其包括：分别固定有用于捕获多种目标物质的多个载体，和用于选择性地接受源自所需的载体的发光的滤光器，所述分析试剂盒用于通过收容在单一容器内的、分别固定有用于捕获多种目标物质的多个载体发光，并从容器外部测定该发光，来同时检测或定量多种目标物质。

Description

用于同时检测或定量多种目标物质的分析方法和分析试剂盒
技术领域
本发明涉及用于同时检测或定量多种目标物质的分析方法和分析试剂盒。
背景技术
作为用于同时检测多个分析对象的技术，开发了BIST(Beads array InSingle Tip)(非专利文献1)。BIST是指，在圆筒状的芯片(以下称为“毛细管”)部分排列封入有直径1mm的探针微珠的器件。所述探针微珠固定有与抗原、基因等测定对象物质结合的抗体、抗原或者DNA片段等生物体分子。该BIST能够嵌合于Magtration装置的喷嘴，因此能够使用与核酸提取相同的自动化装置(例如，Magtration(注册商标)System 6GC，Magtration(注册商标)System 12GC Plus(Precision system Science公司制))来进行杂交反应或抗原抗体反应和清洗操作。产生的信号可以利用扫描仪(例如，BISTnner(Precision system Science公司制))进行检测。
BIST技术的最大特征在于，毛细管中配置有多个用于捕获不同目标物质的探针微珠，能够实现多项目的同时检测。在应用到甲状腺刺激激素(TSH：thyroid stimulating hormone)、通过与其同时检验而临床上的有用性高的FT3(Free Triiodo thyronine)、FT4(Free thyroxine)的定量检验中，实用上所要求的检测浓度域涉及广范围(TSH：0.05-50uIu/mL，FT3：0.5-20pg/mL，FT4：0.1-10ng/dL，以动态范围计为103左右)。因此，为了实现多项目同时检验，必须使来自各探针微珠的信号光(强度与目标物质的浓度成比例地增加的光)局部化、并抑制与来自其他探针微珠的信号光的干渉。但是，至今为止，信号光的局部化还不能说是充分达到的。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：遺伝子多型簡易測定法CMC出版刊“月刊バイオインダストリー2008年9月号”
发明内容
发明要解决的课题
为了同时检测或定量多种目标物质，本发明的目的在于使来自探针微珠的信号光局部化。
解决课题的方法
本发明人经过广泛深入的努力，结果发现，通过在BIST中隔着滤光器来测定来自探针微珠的发光，能够选择性地接受来自所需的探针微珠的发光，并完成了本发明。
本发明的要旨如下所述。
(1)一种分析方法，其通过收容在单一容器内的、分别固定有用于捕获多种目标物质的物质的多个载体发光，并从容器外部测定该发光，来同时检测或定量多种目标物质，其中，通过隔着滤光器来测定源自载体的发光，由此选择性地接受源自所需的载体的发光。
(2)如(1)所述的方法，其中，滤光器设置于容器表面，或者容器本身为滤光器。
(3)如(1)或(2)所述的方法，其中，容器本身为滤光器。
(4)如(1)～(3)中任一项所述的方法，其中，使用测定对象的发光的波长区域中的光线透射率为70％以下的滤光器。
(5)如(1)～(4)中任一项所述的方法，其中，载体呈球状。
(6)如(1)～(5)中任一项所述的方法，其中，1维或2维地配置载体。
(7)如(1)～(6)中任一项所述的方法，其中，发光为化学发光或荧光，发光的波长区域在340-900nm的范围内。
(8)一种分析试剂盒，其包括：分别固定有用于捕获多种目标物质的物质的多个载体，和用于选择性地接受源自所需的载体的发光的滤光器，所述分析试剂盒用于通过收容在单一容器内的、分别固定有用于捕获多种目标物质的物质的多个载体发光，并从容器外部测定该发光，来同时检测或定量多种目标物质。
(9)如(8)所述的分析试剂盒，其中，容器本身为滤光器。
(10)如(8)或(9)所述的分析试剂盒，其中，发光为化学发光或荧光，发光的波长区域在340-900nm的范围内。
发明效果
根据本发明，在同时检测或定量多种目标物质的体系中，能够使源自固定有用于捕获目标物质的物质的探针微珠的信号光局部化，并抑制与源自其他探针微珠的信号光的干渉。
本说明书包括作为本申请优先权基础的日本专利申请日本特愿2012‐232488的说明书和/或附图中记载的内容。
附图说明
图1示出BIST毛细管内构成。
图2-1(左上)示出基于BIST的TSH(0.5uIU/mL)测定中源自位于毛细管中央部的探针微珠的发光峰。图2-2(右上)示出基于BIST的TSH(25uIU/mL)测定中源自位于毛细管中央部的探针微珠的发光峰。图2-3(下)示出毛细管材料的吸光度与信号光峰的值的关系。
图3-1(左上)是以峰值将图2-2的数据归一化并用log尺度显示纵轴的图表。图3-2(右上)示出毛细管材料的吸光度与峰宽度(纵轴为1/3,000的宽度)的关系。图3-3(下)示出毛细管材料的吸光度和峰值与峰宽度之比(P/W比)的关系(将Abs＝0.0时的P/W比设为1，以相对P/W比进行绘图)。
具体实施方式
以下对本发明的实施方式进行更详细的说明。
本发明提供一种分析方法，其通过收容在单一容器内的、分别固定有用于捕获多种目标物质的物质的多个载体发光，并从容器外部测定该发光，来同时检测或定量多种目标物质，其中，通过隔着滤光器来测定源自载体的发光，由此选择性地接受源自所需的载体的发光。
对于容器而言，只要能够从容器外部测定发光，则可以为任意容器，但适合具有透光性，优选树脂、玻璃等透射光的材质。另外，容器的形状没有特别限制，可以为细管、移液管状等形状。例如，在BIST的情况下，容器为能够进行收容在内部的液体的吸引、吐出的圆筒状芯片。
本发明的方法中，通过提高容器的透明度，能够降低信号光的扩散。容器的厚度1mm的雾度值适合为20％以下，优选为10％以下，更优选为1％以下。作为厚度1mm的雾度值为20％以下的容器的材质，可例示：聚丙烯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、环状聚烯烃、聚甲基戊烯等。
雾度值为表示透明性的程度的值，JIS K7136中定义为扩散透射率与总光线透射率之比。
另外，发光或放射的波长区域中的容器的折射率适合为1.6以下，优选为1.55以下，更优选为1.50以下。作为折射率为1.6以下的容器的材质，可以例示：聚丙烯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、环状聚烯烃、聚甲基戊烯等。
目标物质可以为血液、血清、尿、淋巴液、口腔内粘膜、指甲、喀痰等生物体试样、河水、湖水、海水、土壌等试样中含有的作为分析对象的物质。作为目标物质，可以例示：核酸、蛋白质、抗原、抗体、酶、糖等生物体物质，沙门氏菌、大肠杆菌等细菌类，钴、铁、钼、铜、锌、砷、镉、钒等金属等。
目标物质可以进行能够测定的标记，作为能够测定的标记，可以例示：荧光标记、化学发光标记、电化学发光标记、酶标记、放射性标记、磁标记等。作为标记物质，可以例示：海军蓝(Marine Blue)、级联蓝(CascadeBlue)、级联黄(Cascade Yellow)、荧光黄(Fluorescein)、罗丹明(Rhodamine)、藻红蛋白(Phycoerythrin)、CyChrome、PerCP、德州红(Texas Red)、别藻蓝蛋白(Allophycocyanin)、PharRed、俄勒冈绿(Oregon Green)-488、Cy系色素(例如Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy7等)、Alexa系色素(例如，Alexa-488、Alexa-532、Alexa-546、Alexa-633、Alexa-680、Alexa-700、Alexa-750等)、BODIPY系色素(例如，BODIPYFL、BODIPY TR-等)等荧光物质，鲁米诺(luminol)、吖啶、金刚烷基环二氧乙烷、草酸酯、洛芬、光泽精、异氨基苯二酰肼衍生物等化学发光物质，三联吡啶-(4-甲基砜)NHS酯钌(II)络合物、二苯基蒽、四苯基蒽等电化学发光物质，POD(Hydrogen peroxidase，过氧化氢酶)、AP(alkaline phosphatase，碱性磷酸酶)、β半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶等酶等。另外，也可使用放射性同位元素(例如，3H、14C、32P、33P、35S、125I等)等放射性物质等标记物质。
目标物质可以被直接标记，也可以被间接标记。例如，后述的实施例中，使用了三明治ELISA法。具体地，在固定于载体的一次抗体上结合作为抗原的目标物质后，使作为二次抗体的生物素标记抗体与目标物质结合。然后，在该二次抗体上结合催化化学发光的链霉素抗生物素蛋白化的HRP，标记目标物质。
关于用于捕获目标物质的物质，只要为与目标物质结合的物质，则可以例示：抗体、抗原、DNA片段、金属络合物、其他低分子化合物等，但并不限定于这些。
载体可以为无定形粒子、球(微珠)、丝(线)、磁性微珠等任意形状，但优选为球状。在载体采取球(微珠)或磁性微珠的形状的情况下，可以在各球(微珠)或磁性微珠上固定用于捕获不同目标物质的物质。在载体采取丝的形状的情况下，可以在丝的各不同位置处固定用于捕获不同目标物质的物质。在BIST的情况下，载体采取球(微珠)的形状。
球(微珠)的大小为1mm左右，可以为塑料、陶瓷等材质的物体，这样的球(微珠)记载于日本特开2000-346842号公报、日本特表平14-534657号公报等。
磁性微珠的大小为几十μm，可以通过使铁粉等与塑料、陶瓷等混合进行磁化而成。这样的磁性微珠记载于日本特开平8-62224号公报(专利第3115501号说明书)、国际公开WO96/29602小册子、国际公开WO97/44671小册子等。
丝(线)的大小为直径0.1mm左右，可以为树脂系的材质，这样的丝记载于日本特开2006-214759号公报、国际公开WO01/53831小册子、国际公开WO2003/7901小册子等。
载体适合1维或2维地配置。载体1维地配置是指，用于确定观测到的发光信号源自哪个载体所需要的位置信息是1维的状态，例如，BIST中，可以说载体(微珠)是1维地配置的。载体2维地配置是指，用于确定观测到的发光信号源自哪个载体所需要的位置信息是2维的状态，例如，在板上以单层铺满载体的测定试剂盒可以说载体是2维地配置的。
用于捕获目标物质的物质可以通过共价键、化学吸附、物理吸附、电相互作用、疏水相互作用、范德华力、氢键等固定于载体。
目标物质的分析可以通过如下方式进行：使用于捕获目标物质的物质和目标物质在浸渍于液体的状态下进行接触，然后测定产生的发光。
本发明的方法中，通过隔着滤光器来测定源自载体的发光，由此能够选择性地接受源自所需的载体的发光。
本说明书中，“选择性地接受源自所需的载体的发光”，例如包括：与垂直光相比选择性地遮蔽沿BIST中的毛细管壁传播的光、相对于受光面的法线从斜向入射的光等抑制多个载体间的光学交差，以及降低背景光的效果。
本说明书中，“源自多个载体的发光信号的光学交差”是指，源自多个载体的发光信号同时被检测器接受、且无法将源自各载体的发光信号分离的状态。
通过隔着滤光器来测定发光，能够使信号光的扩散降低。对于滤光器而言，测定对象的发光的波长区域中的光线透射率适合为70％以下，优选测定对象的发光的波长区域中的光线透射率为8％～70％，更优选为20％～60％。
滤光器可以通过将聚丙烯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、环状聚烯烃、聚甲基戊烯、聚对苯二甲酸乙二酯等材料用蒽醌系着色剂、紫苏酮(Perylone)系着色剂、杂环系着色剂、炭黑、氧化钛等色剂着色来制造。
滤光器可以在容器之外另外准备，也可以将容器本身作为滤光器。在容器之外另外准备滤光器的情况下，滤光器适合设置于容器表面，例如，适合沿容器壁面形状以与容器壁面密合的状态设置。
发光可以为化学发光、荧光或电化学发光等，但适合为化学发光或荧光，且发光的波长区域为340-900nm。发光可以使用荧光计、分光光度计、闪烁计数器、光电二极管、CCD、CMOS、光电子增倍管等公知的技术从容器外部进行测定。
本发明的方法中，多种目标物质可同时检测或定量。多种是指至少2种，例如2、3、4、5种或其以上。用于捕获多种目标物质的物质被分别固定于多个载体。例如，在BIST的情况下，在全长50mm的毛细管中，对于探针微珠(固定有用于捕获目标物质的物质的微珠)和遮光微珠，总共可以配置50个左右的微珠。探针微珠中可以含有空白和内标。空白是指未固定有捕获物质的载体。内标是指，固定有捕获不会含有在样品中且在分析前添加的已知浓度的标准物质的物质的载体。
同时检测或定量多种目标物质时，无论是否存在其他捕获物质，捕获物质都特异地捕获目标物质，因此通过将固定有不同种类的捕获物质的多种载体配置在同一容器内，并使它们与液状样品接触，由此可以同时检测多种目标物质。
另外，本发明提供一种分析试剂盒，其包括：分别固定有用于捕获多种目标物质的物质的多个载体，和用于选择性地接受源自所需的载体的发光的滤光器，所述分析试剂盒用于通过收容在单一容器内的、分别固定有用于捕获多种目标物质的物质的多个载体发光，并从容器外部测定该发光，来同时检测或定量多种目标物质。
关于载体、滤光器、容器、发光，如上所述。
以下通过实施例具体地说明本发明，但本发明的范围并不受它们的影响。
实施例
BIST(Bead array In Straw Tip)是作为利用固相化有抗体、核酸等生物体分子的直径1mm的探针微珠来捕获、检测抗原、基因等目标物质的用途的技术而开发的。该技术的最大特征在于，圆筒状的芯片(以下称为“毛细管”)中配置有多个用于捕获不同目标物质的探针微珠，能够实现多项目的同时检测。在应用到甲状腺刺激激素(TSH：thyroid stimulatinghormone)、通过与其同时检验而临床上的有用性高的FT3、FT4的定量检验中，实用上所要求的检测浓度域涉及广范围(TSH：0.05-50uIu/mL，FT3：0.5-20pg/mL，FT4：0.1-10ng/dL，以动态范围计为103左右)。因此，为了实现多项目同时检验，必须使来自各探针微珠的信号光(强度与目标物质的浓度成比例地增加的光)局部化、并抑制与来自其他探针微珠的信号光的干渉。本实施例中，为了进行信号光局部化，研究了毛细管着色的效果。
1.要旨
在基于全长50mm左右的毛细管的TSH检测中，使用由6浓度标准的黑色颜料着色后的毛细管，进行TSH(抗原浓度0.5和25uIU/mL)的检测。结果，毛细管着色的效果在信号光强度高的TSH抗原浓度25uIU/mL中显著表现出来，峰的纵横比((峰的高度)/(1/3,000宽度))与无着色时相比，最大为1.8倍左右。可以确认，毛细管的着色对于信号光的局部化是有效的，是对于BIST的多项目化而言有用的技术。
2.实验方法
2-1毛细管的着色和透射率的测定
利用Sunny color公司制着色剂(Dry color Y-4-6033smoke)，将Sumitomo Dow公司制聚碳酸酯颗粒(CALIBRE)以5标准的浓度着色，制备着色(厚度1mm、在426nm处的透射率为约7.7％、19％、28％、62％、70％)后的着色颗粒。
然后，将这些着色颗粒加工为厚度1mm×3mm见方的板材，制作透射率测定用的测试样本。
利用公司日立高科公司制分光光度计(U-3000)，在波长340-1000nm的区域测定该测试样本的透射率。
2-2TSH测定用BIST的制作
2-2-1抗体固层微珠的制作
2-2-1-1用1ml的1×PBS在样品管内将30个探针微珠数次颠倒混和，进行清洗。将其重复2次后，充分除去液体，添加1×PBS、20ug/ml TSH；TSH183300ul(10ul/微珠)，在4℃下O/N(19h)静置，将抗体固层。
2-2-1-2抗体固层后，用1ml的1×PBS、0.05％Tween20在样品管内数次颠倒混和，进行清洗。将其重复2次后，充分除去液体，添加1×PBS、0.1％Tween20、1％(w/w)Block Ace 300ul(10ul/微珠)，在RT下静置3h，进行封闭。
2-2-1-3封闭后，用1ml的1×PBS、0.05％Tween20在样品管内数次颠倒混和，进行清洗。将其重复2次后，充分除去液体，注满1×PBS。
2-2-2遮光微珠的制作
2-2-2-1量取6.88g(约4000个)SiC微珠，用15ml的1×PBS在管内数次颠倒混和，进行清洗。将其重复2次后，充分除去液体，添加1×PBS、0.1％Tween20、1％(w/w)Block Ace 15ml，在RT下，用旋转混合器缓慢搅拌1h，封闭。
2-2-2-2封闭后，用15ml的1×PBS、0.05％Tween20在管内数次颠倒混和，进行清洗。将其重复2次后，充分除去液体，注满1×PBS。不使用的部分在4℃保存。
2-2-3BIST的制作
如图1所示地填充1个TSH探针微珠和49个遮光微珠。
2-2-4TSH的检测
2-2-4-1如下表所示，在GC系列药筒(Precision system Science公司制)中添加试剂，装载到SX-12GC(Precision system Science公司制)。在SX-12GC组合架(Precision system Science公司制)的Hole-2同时装载Sheath DN-100(Precision system Science公司制)和BIST，在约110分钟结束反应。
2-2-4-2反应结束后，在毛细管内注满孔1的溶液，并在测定前进行保存。在即将开始测定之前除去毛细管内的溶液，然后，吸取80ul检测试剂(ECL western detection reagents，GE Health Care Japan公司)。然后，用具有PMT(Photomultipulator，光电倍增管)和扫描式光纤检测探针的Precision system Science公司制LuBEA进行测定。
[表1]
Wash Buffer：(PBS)
Binding Buffer：(PBS)
TSH：Human TSH(人甲状腺刺激激素(来自人血清))
Biotin标记抗体：(对抗人TSH抗体进行生物素标记后的产物)
Streptavidin-HRP：(Thermo scientific公司制)
3.结果
用BIST测定抗原浓度0.5和25uIU/mL的TSH时，扫描曲线(原始数据)如图2-1、2-2所示，毛细管材料的吸光度与峰值的关系如图2-3所示。发光的峰值与毛细管材料的吸光度的增加(透射率的下降)一起近似直线地减少。
与此相对，以峰值将抗原浓度25uIU/mL的数据归一化后的数据如图3-1所示，毛细管材料的吸光度与峰宽度的关系如图3-2所示。峰宽度在Abs＝0至0.5的范围内急剧减少，在其以上的吸光度范围未见到显著的变化。
图3-3示出描绘有毛细管材料的吸光度和峰值与峰宽度之比(P/W比)的关系的图表。P/W比在Abs＝0至0.2的范围内急剧增加，在0.2至0.8的范围内达到最大，此时P/W比为1.7-1.8左右。另外，在吸光度变高的范围内，得到P/W比再次减少的结果。
4.考察
从图3-3的结果可认为，在BIST中的信号光的局部化(P/W比的最大化)的课题中，毛细管材料的着色(信号光的遮蔽)是有效的手段，通过适度的着色，能够将P/W比增大至接近2倍。该结果显示出，信号光分布的原因之一为沿毛细管壁传播的光，认为通过材料的着色，可使该信号光的毛细管传播成分选择性地降低。
本说明书中引用的全部出版物、专利和专利申请原样作为参考而并入本说明书中。
产业上的利用可能性
本发明的方法能够用于多个生物体分子、与生物体分子结合的低分子的检测和定量分析。

Claims (10)

1.一种分析方法，其通过收容在单一容器内的、分别固定有用于捕获多种目标物质的物质的多个载体发光，并从容器外部测定该发光，来同时检测或定量多种目标物质，其中，
通过隔着滤光器来测定源自载体的发光，由此选择性地接受源自所需的载体的发光。
2.如权利要求1所述的方法，其中，
滤光器设置于容器表面，或者容器本身为滤光器。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，
容器本身为滤光器。
4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，
使用测定对象的发光的波长区域中的光线透射率为70％以下的滤光器。
5.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，
载体呈球状。
6.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，
1维或2维地配置载体。
7.如权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，
发光为化学发光或荧光，发光的波长区域在340-900nm的范围内。
8.一种分析试剂盒，其包括：
分别固定有用于捕获多种目标物质的物质的多个载体，和
用于选择性地接受源自所需的载体的发光的滤光器，
所述分析试剂盒用于通过收容在单一容器内的、分别固定有用于捕获多种目标物质的物质的多个载体发光，并从容器外部测定该发光，来同时检测或定量多种目标物质。
9.如权利要求8所述的分析试剂盒，其中，
容器本身为滤光器。
10.如权利要求8或9所述的分析试剂盒，其中，
发光为化学发光或荧光，发光的波长区域在340-900nm的范围内。
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