KR20150074057A - 복수 종의 목적 물질을 동시에 검출 또는 정량하기 위한 분석 방법 및 분석 키트 - Google Patents

복수 종의 목적 물질을 동시에 검출 또는 정량하기 위한 분석 방법 및 분석 키트 Download PDF

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Abstract

복수 종의 목적 물질을 동시에 검출 또는 정량하기 위해서, 프로브 비드로부터의 신호광을 국재화한다. 단일의 용기 내에 수용된, 복수 종의 목적 물질을 포획하기 위한 물질이 각각 고정된 복수의 담체가 발광하고, 이 발광을 용기 외부로부터 측정함으로써 복수 종의 목적 물질을 동시에 검출 또는 정량하기 위한 분석 방법으로서, 광학 필터를 통하여 담체로부터의 발광을 측정함으로써 원하는 담체로부터의 발광을 선택적으로 수광하는 상기 방법. 단일의 용기 내에 수용된, 복수 종의 목적 물질을 포획하기 위한 물질이 각각 고정된 복수의 담체가 발광하고, 이 발광을 용기 외부로부터 측정함으로써 복수 종의 목적 물질을 동시에 검출 또는 정량하기 위한 분석 키트로서, 복수 종의 목적 물질을 포획하기 위한 물질이 각각 고정된 복수의 담체와, 원하는 담체로부터의 발광을 선택적으로 수광하기 위한 광학 필터를 포함하는 상기 분석 키트.

Description

복수 종의 목적 물질을 동시에 검출 또는 정량하기 위한 분석 방법 및 분석 키트{ANALYSIS METHOD AND ANALYSIS KIT FOR SIMULTANEOUSLY DETECTING OR QUANTITATING MULTIPLE TYPES OF TARGET SUBSTRANCES}
본 발명은 복수 종의 목적 물질을 동시에 검출 또는 정량하기 위한 분석 방법 및 분석 키트에 관한 것이다.
복수의 분석 대상을 동시에 검출하기 위한 기술로서, BIST (Beads array In Single Tip) 가 개발되었다 (비특허문헌 1). BIST 란, 항원이나 유전자 등의 측정 대상 물질과 결합하는 항체, 항원, 혹은 DNA 단편 등의 생체 분자를 고정화시킨 직경 1 ㎜ 의 프로브 비드를 원통상의 칩 (이하,「캐필러리」라고 부른다) 부분에 나열하여 봉입한 디바이스이다. 이 BIST 는, 마그트레이션 장치의 노즐에 끼워 맞출 수 있으므로, 핵산 추출과 동일한 자동화 장치 (예를 들어, Magtration (등록 상표) System 6GC, Magtration (등록 상표) System 12GC Plus (프리시전·시스템·사이언스사 제조)) 를 사용하여, 하이브리다이제이션 반응 또는 항원 항체 반응 및 세정 조작을 할 수 있다. 발생하는 시그널은 스캐너 (예를 들어, BISTnner (프리시전·시스템·사이언스사 제조)) 로 검출된다.
BIST 의 기술적인 최대의 특징으로는, 캐필러리 중에 상이한 목적 물질을 포획하기 위한 프로브 비드가 복수 배치되어, 다항목의 동시 검출이 가능한 점에 있다. 갑상선 자극 호르몬 (TSH: thyroid stimulating hormone) 이나 이것과 동시에 검사됨으로써, 임상상의 유용성이 높은 FT3 (Free Triiodo thyronine), FT4 (Free thyroxine) 의 정량 검사로의 응용에 있어서는, 실용상 요구되는 검출 농도역이 광범위하게 이른다 (TSH:0.05 - 50 uIu/㎖, FT3:0.5 - 20 pg/㎖, FT4:0.1 - 10 ng/㎗, 다이나믹 레인지에서 103 정도). 이 때문에, 다항목 동시 검사를 실현하기 위해서는, 각 프로브 비드로부터의 신호광 (목적 물질의 농도에 비례하여 강도가 증가하는 광) 을 국재화시켜, 다른 프로브 비드로부터의 신호광과의 간섭을 억제해야 한다. 그러나 지금까지는, 신호광의 국재화는 충분하다고는 할 수 없었다.
유전자 다형 간이 측정법 CMC 출판간 「월간 바이오 인더스트리 2008년 9월호」
본 발명은 복수 종의 목적 물질을 동시에 검출 또는 정량하기 위해서, 프로브 비드로부터의 신호광을 국재화하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 예의 노력한 결과, BIST 에 있어서, 광학 필터를 통하여 프로브 비드로부터의 발광을 측정함으로써 원하는 프로브 비드로부터의 발광을 선택적으로 수광할 수 있는 것을 알아내어, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.
본 발명의 요지는 이하와 같다.
(1) 단일의 용기 내에 수용된, 복수 종의 목적 물질을 포획하기 위한 물질이 각각 고정된 복수의 담체가 발광하고, 이 발광을 용기 외부로부터 측정함으로써 복수 종의 목적 물질을 동시에 검출 또는 정량하기 위한 분석 방법으로서, 광학 필터를 통하여 담체로부터의 발광을 측정함으로써 원하는 담체로부터의 발광을 선택적으로 수광하는 상기 방법.
(2) 광학 필터가 용기 표면에 설치되거나, 혹은 용기 자체가 광학 필터가 되는 (1) 에 기재된 방법.
(3) 용기 자체가 광학 필터가 되는 (1) 또는 (2) 에 기재된 방법.
(4) 측정 대상의 발광의 파장대에 있어서의 광선 투과율이 70 ％ 이하인 광학 필터를 사용하는 (1) ∼ (3) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(5) 담체가 구상인 (1) ∼ (4) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(6) 담체가 1 차원적 또는 2 차원적으로 배치되어 있는 (1) ∼ (5) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(7) 발광이 화학 발광 또는 형광이고, 발광의 파장대가 340 - 900 ㎚ 의 범위 내에 있는 (1) ∼ (6) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(8) 단일의 용기 내에 수용된, 복수 종의 목적 물질을 포획하기 위한 물질이 각각 고정된 복수의 담체가 발광하고, 이 발광을 용기 외부로부터 측정함으로써 복수 종의 목적 물질을 동시에 검출 또는 정량하기 위한 분석 키트로서, 복수 종의 목적 물질을 포획하기 위한 물질이 각각 고정된 복수의 담체와, 원하는 담체로부터의 발광을 선택적으로 수광하기 위한 광학 필터를 포함하는 상기 분석 키트.
(9) 용기 자체가 광학 필터인 (8) 에 기재된 분석 키트.
(10) 발광이 화학 발광 또는 형광이고, 발광의 파장대가 340 - 900 ㎚ 의 범위 내에 있는 (8) 또는 (9) 에 기재된 분석 키트.
본 발명에 의해 복수 종의 목적 물질을 동시에 검출 또는 정량하는 계에 있어서, 목적 물질을 포획하기 위한 물질이 고정된 프로브 비드로부터의 신호광을 국재화시켜, 다른 프로브 비드로부터의 신호광과의 간섭을 억제할 수 있게 되었다.
본 명세서는, 본원의 우선권의 기초인 일본 특허출원, 일본 특허출원 2012-232488호의 명세서 및/또는 도면에 기재되는 내용을 포함한다.
도 1 은 BIST 캐필러리 내 구성을 나타낸다.
도 2a： BIST 에 의한 TSH (0.5 uIU/㎖) 측정에 있어서의 캐필러리 중앙부에 있는 프로브 비드 유래의 발광 피크를 나타낸다. 도 2b： BIST 에 의한 TSH (25 uIU/㎖) 측정에 있어서의 캐필러리 중앙부에 있는 프로브 비드 유래의 발광 피크를 나타낸다. 도 2c ：캐필러리 재료의 흡광도와 신호광 피크의 값의 관계를 나타낸다.
도 3a ：도 2b 의 데이터를 피크값으로 규격화하고, 세로축을 log 스케일로 표시한 그래프. 도 3b ： 캐필러리 소재의 흡광도와 피크폭 (세로축이 1/3,000 이 되는 폭) 의 관계를 나타낸다. 도 3c ： 캐필러리 재료의 흡광도와, 피크값과 피크폭의 비 (P/W 비) 의 관계를 나타낸다 (Abs = 0.0 일 때의 P/W 비를 1 로 하여, 상대적인 P/W 비를 플롯).
이하, 본 발명의 실시형태에 대해 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 단일의 용기 내에 수용된, 복수 종의 목적 물질을 포획하기 위한 물질이 각각 고정된 복수의 담체가 발광하고, 이 발광을 용기 외부로부터 측정함으로써 복수 종의 목적 물질을 동시에 검출 또는 정량하기 위한 분석 방법으로서, 광학 필터를 통하여 담체로부터의 발광을 측정함으로써 원하는 담체로부터의 발광을 선택적으로 수광하는 상기 방법을 제공한다.
용기는, 발광을 용기 외부로부터 측정 가능하면 어떠한 것이어도 되는데, 투광성이어도 되고, 수지나 유리 등의 광을 투과하는 재질인 것이 바람직하다. 또, 용기의 형상은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 세관, 피펫상 등의 형상이어도 된다. 예를 들어 BIST 의 경우, 용기는 내부에 수용한 액체의 흡인 토출이 가능한 원통상의 칩이다.
본 발명 방법에 있어서, 용기의 투명도를 높임으로써, 신호광의 확산을 저감 시킬 수 있다. 용기의 두께 1 ㎜ 의 헤이즈값은 20 ％ 이하이면 되고, 바람직하게는 10 ％ 이하이고, 보다 바람직하게는 1 ％ 이하이다. 두께 1 ㎜ 의 헤이즈값이 20 ％ 이하인 용기의 재질로는, 폴리프로필렌, 폴리카보네이트, 폴리스티렌, 폴리메틸메타크릴레이트, 고리형 폴리올레핀, 폴리메틸펜텐 등을 예시할 수 있다.
헤이즈값은 투명성의 정도를 나타내는 값으로, JIS K 7136 에서는 전광선 투과율에 대한 확산 투과율의 비로서 정의되어 있다.
또, 발광 또는 방사의 파장대에 있어서의 용기의 굴절률은 1.6 이하이면 되고, 바람직하게는 1.55 이하이고, 보다 바람직하게는 1.50 이하이다. 굴절률이 1.6 이하인 용기의 재질로는, 폴리프로필렌, 폴리카보네이트, 폴리스티렌, 폴리메틸메타크릴레이트, 고리형 폴리올레핀, 폴리메틸펜텐 등을 예시할 수 있다.
목적 물질은, 혈액, 혈청, 소변, 림프액, 구강 내 점막, 손톱, 가래 등의 생체 시료, 하천수, 호수, 해수, 토양 등의 시료에 포함되는 분석 대상이 되는 물질일 수 있다. 목적 물질로는, 핵산, 단백질, 항원, 항체, 효소, 당 등의 생체 물질, 살모넬라균, 대장균 등의 세균류, 코발트, 철, 몰리브덴, 구리, 아연, 비소, 카드뮴, 바나듐 등의 금속 등을 예시할 수 있다.
목적 물질은, 측정 가능한 표지가 이루어져도 되며, 측정 가능한 표지로는, 형광 표지, 화학 발광 표지, 전기 화학 발광 표지, 효소 표지, 방사성 표지, 자기 표지 등을 예시할 수 있다. 표지 물질로는, Marine Blue, Cascade Blue, Cascade Yellow, Fluorescein, Rhodamine, Phycoerythrin, CyChrome, PerCP, Texas Red, Allophycocyanin, PharRed, Oregon Green-488, Cy 계 색소 (예를 들어 Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy7 등), Alexa 계 색소 (예를 들어 Alexa-488, Alexa-532, Alexa-546, Alexa-633, Alexa-680, Alexa-700, Alexa-750 등), BODIPY 계 색소 (예를 들어 BODIPY FL, BODIPY TR- 등) 등의 형광 물질, 루미놀, 아크리딘, 아다만틸디옥타센, 옥살산에스테르, 로핀, 루시게닌, 이소루미놀 유도체 등의 화학 발광 물질, 트리스-비피리딘-(4-메틸술폰) NHS 에스테르루테늄 (II) 착물, 디페닐안트라센, 테트라페닐안트라센 등의 전기 화학 발광 물질, POD (Hydrogen peroxidase), AP (alkaline phosphatase), β갈락토시다아제, 글루코오스옥시다아제, 글루코오스옥시다아제, 글루코오스-6-인산 탈수소 효소 등의 효소 등을 예시할 수 있다. 이 밖에도, 방사성 동위 원소 (예를 들어 3H, 14C, 32P, 33P, 35S, 125I 등) 등의 방사성 물질 등의 표지 물질을 사용해도 된다.
목적 물질은, 직접적으로 표지되어도 되고, 간접적으로 표지되어도 된다. 예를 들어 후술하는 실시예에 있어서는, 샌드위치 ELISA 법이 이용되고 있다. 구체적으로는, 담체에 고정된 1 차 항체에 항원인 목적 물질이 결합된 후, 2 차 항체인 비오틴 표지 항체가 목적 물질에 결합된다. 또한 이 2 차 항체에 대하여, 화학 발광을 촉매하는 스트렙토아비딘화된 HRP 가 결합되어, 목적 물질을 표지한다.
목적 물질을 포획하기 위한 물질은, 목적 물질과 결합하는 물질이면 되고, 항체, 항원, DNA 단편, 금속 착물, 그 외 저분자 화합물 등을 예시할 수 있는데, 이들에 한정되는 것은 아니다.
담체는, 부정형 입자, 구 (비드), 실 (스트랜드), 자성 비드 등의 어떠한 형상이어도 되는데, 구상인 것이 바람직하다. 담체가 구 (비드) 또는 자성 비드의 형상을 취하는 경우에는, 구 (비드) 또는 자성 비드의 각각에 상이한 목적 물질을 포획하기 위한 물질이 고정되어 있으면 된다. 담체가 실의 형상을 취하는 경우에는, 실의 상이한 위치의 각각에 상이한 목적 물질을 포획하기 위한 물질이 고정되어 있으면 된다. BIST 의 경우, 담체는 구 (비드) 의 형상을 취한다.
구 (비드) 는, 크기는 1 ㎜ 정도이고, 플라스틱이나 세라믹 등의 재질인 것이면 되고, 이와 같은 구 (비드) 는, 일본 공개특허공보 2000-346842호, 일본 공표특허공보 평14-534657호 등에 기재되어 있다.
자성 비드는, 크기는 수십 ㎛ 이고, 플라스틱이나 세라믹 등에 철분 등을 혼합하여 자기화한 것이면 된다. 이와 같은 자성 비드는, 일본 공개특허공보 평8-62224호 (일본 특허공보 제3115501호 명세서), 국제 공개 WO96/29602 팸플릿, 국제 공개 WO97/44671 팸플릿 등에 기재되어 있다.
실 (스트랜드) 은, 크기는 직경 0.1 ㎜ 정도이고, 수지계의 재질인 것이면 되고, 이와 같은 실은, 일본 공개특허공보 2006-214759호, 국제 공개 WO01/53831 팸플릿, 국제 공개 WO2003/7901 팸플릿 등에 기재되어 있다.
담체는, 1 차원적 또는 2 차원적으로 배치되어 있으면 된다. 담체가 1 차원적으로 배치되어 있다란, 관측된 발광 신호가 어느 담체에서 유래하는 것인지를 특정하기 위해서 필요한 위치 정보가 1 차원인 상태를 의미하고, 예를 들어 BIST 에 있어서, 담체 (비드) 는 1 차원적으로 배치되어 있다고 할 수 있다. 담체가 2 차원적으로 배치되어 있다란, 관측된 발광 신호가 어느 담체에서 유래하는 것인지를 특정하기 위해서 필요한 위치 정보가 2 차원인 상태를 의미하고, 예를 들어 플레이트 상에 담체를 단층으로 전면에 깔은 측정 키트는, 담체가 2 차원적으로 배치된 것이라고 할 수 있다.
목적 물질을 포획하기 위한 물질은, 공유 결합, 화학 흡착, 물리 흡착, 전기적 상호 작용, 소수적 상호작용, 반데르발스힘, 수소 결합 등에 의해 담체에 고정되어 있다.
목적 물질의 분석은, 목적 물질을 포획하기 위한 물질과 목적 물질을 액체에 침지된 상태에서 접촉시키고, 그 후 발생하는 발광을 측정함으로써 실시할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 광학 필터를 통하여 담체로부터의 발광을 측정함으로써 원하는 담체로부터의 발광을 선택적으로 수광할 수 있다.
본 명세서에 있어서,「원하는 담체로부터의 발광을 선택적으로 수광한다」란, 예를 들어 BIST 에 있어서의 캐필러리벽을 전파하는 광이나, 수광면의 법선에 대해 비스듬히 입사하는 광을 수직광에 비하여 선택적으로 차광하는 등, 복수의 담체간의 광학적 교차를 억제하는 것 이외에, 백그라운드광의 효과를 저감시키는 것도 포함한다.
본 명세서에 있어서,「복수 담체로부터의 발광 신호의 광학적 교차」란, 복수의 담체로부터의 발광 신호가 동시에 검출기로 수광되어, 각 담체로부터의 발광 신호를 분리할 수 없는 상태를 말한다.
광학 필터를 통하여 발광을 측정함으로써 신호광의 확산을 저감시킬 수 있다. 광학 필터는, 측정 대상의 발광의 파장대에 있어서의 광선 투과율이 70 ％ 이하이면 되고, 바람직하게는 측정 대상의 발광의 파장대에 있어서의 광선 투과율이 8 ％ ∼ 70 ％, 보다 바람직하게는 20 ％ ∼ 60 ％ 이다.
광학 필터는, 폴리프로필렌, 폴리카보네이트, 폴리스티렌, 폴리메틸메타크릴레이트, 고리형 폴리올레핀, 폴리메틸펜텐, 폴리에틸렌테레프탈레이트 등의 재료를 안트라퀴논계 착색제, 페리논계 착색제, 복소고리계 착색제, 카본 블랙, 산화티탄 등의 착색제로 착색함으로써 제조할 수 있다.
광학 필터는 용기와는 별도로 준비해도 되고, 용기 자체를 광학 필터로 해도 된다. 용기와는 별도로 광학 필터를 준비하는 경우에는, 광학 필터는 용기 표면에 설치하면 되고, 예를 들어 용기 벽면 형상을 따라 용기 벽면에 밀착시킨 상태로 설치하면 된다.
발광은, 화학 발광, 형광 또는 전기 화학 발광 등일 수 있지만, 화학 발광 또는 형광이고, 발광의 파장대가 340 - 900 ㎚ 이면 된다. 발광은, 형광계, 분광 광도계, 신틸레이션 카운터, 포토 다이오드, CCD, CMOS, 광 전자 증배관 등의 공지된 기술을 사용하여 용기 외부로부터 측정할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서는, 복수 종의 목적 물질이 동시에 검출 또는 정량된다. 복수 종이란, 적어도 2 종, 예를 들어 2, 3, 4, 5 종 또는 그 이상이다. 복수 종의 목적 물질을 포획하기 위한 물질이 각각 복수의 담체에 고정된다. 예를 들어 BIST 의 경우, 전체 길이 50 ㎜ 의 캐필러리에 프로브 비드 (목적 물질을 포획하기 위한 물자가 고정된 비드) 및 차광 비드를 병용하여 50 개 정도의 비드를 배치할 수 있다. 프로브 비드에는 블랭크와 내부 표준을 포함해도 된다. 블랭크란, 포획 물질이 고정되어 있지 않은 담체이다. 내부 표준이란, 검체에는 함유할 수 없고, 분석 전에 첨가되는 이미 알려진 농도의 표준 물질을 포획하는 물질이 고정되어 있는 담체이다.
복수 종의 목적 물질을 동시에 검출 또는 정량하려면, 포획 물질은 다른 포획 물질의 존재 유무에 관계없이, 특이적으로 목적 물질을 포획하기 위해, 상이한 종류의 포획 물질이 고정된 복수 종류의 담체를 동일 용기 내에 배치시키고, 액상의 검체를 이들에 접촉시킴으로써 복수 종의 목적 물질을 동시에 검출할 수 있다.
또, 본 발명은 단일의 용기 내에 수용된, 복수 종의 목적 물질을 포획하기 위한 물질이 각각 고정된 복수의 담체가 발광하고, 이 발광을 용기 외부로부터 측정함으로써 복수 종의 목적 물질을 동시에 검출 또는 정량하기 위한 분석 키트로서, 복수 종의 목적 물질을 포획하기 위한 물질이 각각 고정된 복수의 담체와, 원하는 담체로부터의 발광을 선택적으로 수광하기 위한 광학 필터를 포함하는 상기 분석 키트를 제공한다.
담체, 광학 필터, 용기, 발광에 대해서는 상기 서술하였다.
이하에, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 이들에 아무런 영향을 받지는 않는다.
실시예
BIST (Bead array In Straw Tip) 는, 항체나 핵산 등, 생체 분자가 고상된 직경 1 ㎜ 의 프로브 비드에 의해 항원이나 유전자 등의 목적 물질을 포획·검출하기 위한 기술로서 개발되었다. 기술적인 최대의 특징으로는, 원통상의 칩 (이하,「캐필러리」) 중에 상이한 목적 물질을 포획하기 위한 프로브 비드가 복수 배치되어 다항목의 동시 검출이 가능한 점에 있다. 갑상선 자극 호르몬 (TSH: thyroid stimulating hormone) 이나 이것과 동시에 검사됨으로써, 임상상의 유용성이 높은 FT3, FT4 의 정량 검사로의 응용에 있어서는, 실용상 요구되는 검출 농도역이 광범위하게 이른다 (TSH:0.05 - 50 uIu/㎖, FT3:0.5 - 20 pg/㎖, FT4:0.1 - 10 ng/㎗ , 다이나믹 레인지로 103 정도). 이 때문에, 다항목 동시 검사를 실현하기 위해서는, 각 프로브 비드로부터의 신호광 (목적 물질의 농도에 비례하여 강도가 증가하는 광) 을 국재화시켜, 다른 프로브 비드로부터의 신호광과의 간섭을 억제해야 한다. 본 실시예에 있어서는, 신호광 국재화를 목적으로 하여, 캐필러리 착색의 효과를 검토하였다.
1. 요지
전체 길이 50 ㎜ 정도의 캐필러리에 의한 TSH 검출에 있어서, 6 농도 수준의 흑색 안료에 의해 착색된 캐필러리를 사용하여, TSH (항원 농도 0.5 및 25 uIU/㎖) 의 검출을 실시하였다. 그 결과, 캐필러리 착색의 효과는, 신호광 강도가 높은, TSH 항원 농도 25 uIU/㎖ 에서 현저하게 나타나고, 피크의 종횡비 ((피크의 높이)/(1/3,000 폭)) 는, 무착색시에 비해 최대 1.8 배 정도가 되었다. 캐필러리의 착색은 신호광의 국재화에 유효하고, BIST 의 다항목화에 대해 유용한 기술인 것이 확인되었다.
2. 실험 방법
2-1 캐필러리의 착색 및 투과율의 측정
스미토모 다우 주식회사 제조 폴리카보네이트 펠릿 (캘리버) 을, 서니 컬러 주식회사 제조 착색제 (드라이 컬러 Y-4-6033 스모크) 에 의해 5 수준의 농도로 착색 (두께 1 ㎜, 426 ㎚ 에 있어서 투과율로 약 7.7 ％, 19 ％, 28 ％, 62 ％, 70 ％) 한 착색 펠릿을 조정하였다.
이어서, 이들의 착색 펠릿을 두께 1 ㎜ × 가로세로 3 ㎜ 의 판재에 가공하고, 투과율 측정용의 테스트 피스를 제조하였다.
이 테스트 피스의 투과율을 주식회사 히타치 하이테크놀로지즈사 제조 분광 광도계 (U-3000) 에 의해 파장 340 - 1000 ㎚ 의 영역에서 측정하였다.
2-2 TSH 측정용 BIST 의 제조
2-2-1 항체 고층 비드의 제조
2-2-1-1 프로브 비드 30 개를 1 ㎖ 의 1 × PBS 로 샘플 튜브 내에서 수회 전도 혼화하여 세정하였다. 이것을 2 회 반복한 후, 액을 잘 제거하고, 1 × PBS, 20 ug/㎖·TSH ; TSH183 을 300 ul (10 ul/비드) 첨가하고, 4 ℃ 에서 O/N (19 h) 정치 (靜置) 하고, 항체를 고층 (固層) 하였다.
2-2-1-2 항체 고층 후, 1 ㎖ 의 1 × PBS, 0.05 ％ Tween20 으로 샘플 튜브 내에서 수회 전도 혼화하여 세정하였다. 이것을 2 회 반복한 후, 액을 잘 제거하고, 1 × PBS, 0.1 ％ Tween20, 1 ％ (w/w) Block Ace 를 300 ul (10 ul/비드) 첨가하고, RT 에서 3 h 정치하고, 블로킹하였다.
2-2-1-3 블로킹 후, 1 ㎖ 의 1 × PBS, 0.05 ％ Tween20 으로 샘플 튜브 내에서 수회 전도 혼화하여 세정하였다. 이것을 2 회 반복한 후, 액을 잘 제거하고, 1 × PBS 를 채웠다.
2-2-2 차광 비드의 제조
2-2-2-1 SiC 비드를 6.88 g (약 4000 개) 칭량하고, 15 ㎖ 의 1 × PBS 로 튜브 내에서 수회 전도 혼화하여 세정하였다. 이것을 2 회 반복한 후, 액을 잘 제거하고, 1 × PBS, 0.1 ％ Tween20, 1 ％ (w/w) Block Ace 를 15 ㎖ 첨가하고, RT 에서 1 h 로테이터에 의해 느릿하게 교반하고, 블로킹하였다.
2-2-2-2 블로킹 후, 15 ㎖ 의 1 × PBS, 0.05 ％ Tween20 으로 튜브 내에서 수회 전도 혼화하여 세정하였다. 이것을 2 회 반복한 후, 액을 잘 제거하고, 1 × PBS 를 채웠다. 사용하지 않는 분은 4 ℃ 보존하였다.
2-2-3 BIST 의 제조
TSH 프로브 비드 1 개와 차광 비드 49 개를 도 1 과 같이 충전하였다.
2-2-4 TSH 의 검출
2-2-4-1 하기 표와 같이 GC series 카트리지 (프리시전·시스템·사이언스 주식회사 제조) 에 시약을 첨가하고, SX-12GC (프리시전·시스템·사이언스 주식회사 제조) 에 세팅하였다. SX-12GC 콤보락 (프리시전·시스템·사이언스 주식회사 제조) 의 Hole-2 에 Sheath DN-100 (프리시전·시스템·사이언스 주식회사 제조) 과 함께 BIST 를 세팅하고, 약 110 분으로 반응이 종료되었다.
2-2-4-2 반응이 종료된 후, well 1 의 용액을 캐필러리 내에 채우고 측정까지 보존하였다. 측정 직전에 캐필러리 내의 용액을 제거한 후, 검출 시약 (ECL western detection reagents, GE 헬스케어 재팬 주식회사) 을 80 ul 흡인하였다. 그 후, PMT (Photomultipulator) 및 주사식 광파이버-검출 프로브를 갖는 프리시전·시스템·사이언스 주식회사 제조 LuBEA 에 의해 측정하였다.
Figure pct00001
Wash Buffer:(PBS)
Binding Buffer:(PBS)
TSH:Human TSH (인간 갑상선 자극 호르몬 (인간 혈청 유래))
Biotin 표지 항체:(항인간 TSH 항체를 비오틴 표지한 것)
Streptavidin-HRP:(Thermo scientific 사 제조)
3. 결과
항원 농도 0.5 및 25 uIU/㎖ 의 TSH 를 BIST 에 의해 측정했을 때의 주사 프로파일 (생(生) 데이터) 을 도 2a, 2b 에, 캐필러리 재료의 흡광도와 피크값의 관계를 도 2c 에 나타낸다. 발광의 피크값은 캐필러리 소재의 흡광도의 증가 (투과율의 저하) 와 함께 거의 직선적으로 감소하였다.
이것에 대하여, 항원 농도 25 uIU/㎖ 의 데이터를 피크값으로 규격화한 데이터를 도 3a 에, 캐필러리 재료의 흡광도와 피크폭의 관계를 도 3b 에 나타낸다. 피크폭은 Abs = 0 내지 0.5 의 영역에서 급격하게 감소하고, 그 이상의 흡광도 영역에서는 큰 변화는 볼 수 없었다.
도 3c 에는, 캐필러리 재료의 흡광도와, 피크값과 피크폭의 비 (P/W 비) 의 관계를 플롯한 그래프를 나타낸다. P/W 비는 Abs = 0 내지 0.2 의 영역에서 급격하게 증가하고, 0.2 내지 0.8 의 영역에서 극대에 이르며, 이 때의 P/W 비는 1.7 - 1.8 정도였다. 또한, 흡광도가 높아지는 영역에서는, P/W 비는 다시 감소한다는 결과가 되었다.
4. 고찰
도 3c 의 결과로부터, BIST 에 있어서의 신호광의 국재화 (P/W 비의 최대화) 라는 과제에 있어서, 캐필러리 재료의 착색 (신호광의 차폐) 은 유효한 수단이고, 적당한 착색에 의해 P/W 비를 2 배 조금 안되게까지 증대될 가능성이 나타났다. 본 결과는, 신호광 분포의 원인 중 하나가 캐필러리벽을 전파하는 광인 것을 나타내고 있고, 재료의 착색에 의해 이 신호광의 캐필러리 전파 성분을 선택적으로 저감시킨다고 생각된다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원을 그대로 참고로 하여 본 명세서에 받아들이는 것으로 한다.
산업상 이용가능성
본 발명의 방법은, 복수의 생체 분자나 생체 분자와 결합하는 저분자의 검출 및 정량적인 해석에 이용할 수 있다.

Claims (10)

  1. 단일의 용기 내에 수용된, 복수 종의 목적 물질을 포획하기 위한 물질이 각각 고정된 복수의 담체가 발광하고, 이 발광을 용기 외부로부터 측정함으로써 복수 종의 목적 물질을 동시에 검출 또는 정량하기 위한 분석 방법으로서,
    광학 필터를 통하여 담체로부터의 발광을 측정함으로써 원하는 담체로부터의 발광을 선택적으로 수광하는, 분석 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    광학 필터가 용기 표면에 설치되거나, 혹은 용기 자체가 광학 필터가 되는, 분석 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    용기 자체가 광학 필터가 되는, 분석 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    측정 대상의 발광의 파장대에 있어서의 광선 투과율이 70 ％ 이하인 광학 필터를 사용하는, 분석 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    담체가 구상인, 분석 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    담체가 1 차원적 또는 2 차원적으로 배치되어 있는, 분석 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    발광이 화학 발광 또는 형광이고, 발광의 파장대가 340 - 900 ㎚ 의 범위 내에 있는, 분석 방법.
  8. 단일의 용기 내에 수용된, 복수 종의 목적 물질을 포획하기 위한 물질이 각각 고정된 복수의 담체가 발광하고, 이 발광을 용기 외부로부터 측정함으로써 복수 종의 목적 물질을 동시에 검출 또는 정량하기 위한 분석 키트로서,
    복수 종의 목적 물질을 포획하기 위한 물질이 각각 고정된 복수의 담체와, 원하는 담체로부터의 발광을 선택적으로 수광하기 위한 광학 필터를 포함하는, 분석 키트.
  9. 제 8 항에 있어서,
    용기 자체가 광학 필터인, 분석 키트.
  10. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서,
    발광이 화학 발광 또는 형광이고, 발광의 파장대가 340 - 900 ㎚ 의 범위 내에 있는, 분석 키트.
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