MXPA06005123A - Metodo para extender el rango de deteccion dinamica de dispositivos de ensayo - Google Patents
Metodo para extender el rango de deteccion dinamica de dispositivos de ensayoInfo
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Abstract
Se proporciona un dispositivo de ensayo de flujo continúo para detectar la presencia o la cantidad de un analito que reside en la muestra de prueba. El dispositivo utiliza una zona de detección y una zona de compensación dentro de las cuales están inmovilizados los reactivos de captura. El presente inventor a descubierto que la presencia de una zona de compensación puede permitir la detección de un analito sobre rangos de concentración extendidos. En particular, la zona de compensación facilita el aglutinamiento de las sondas que de otra manera aglutinarádentro del interior del dispositivo de ensayo o que exhibirá"autoenfriamiento".
Description
MÉTODO PARA EXTENDER EL RANGO DE DETECCIÓN DINÁMICA DE DISPOSITIVOS DE ENSAYO
Antecedentes de la invención
Varios procedimientos y dispositivos analíticos son comúnmente empleados en los ensayos de flujo para determinar la presencia y/o la concentración de analitos que pueden estar presentes en una muestra de prueba. Por ejemplo, los inmunoensayos utilizan mecanismos de los sistemas inmunes, en donde los anticuerpos son producidos en respuesta a la presencia de antígenos que son patogénicos o extraños a los organismos. Estos anticuerpos y antígenos, por ejemplo, inmunoreactivos, son capaces de aglutinar uno con otro, provocando por tanto un mecanismo de reacción altamente específico que puede ser usado para determinar la presencia o la concentración de ese antígeno particular en una muestra biológica.
Hay varios métodos de inmunoensayo muy conocidos que usan inmunoreactivos etiquetados con un componente que puede ser detectado de manera que el analito puede ser analíticamente detectado. Por ejemplo, los ensayos de tipo de "emparedado" típicamente involucra el mezclar la muestra de prueba con sondas detectables, tal como látex teñido o un radio isótopo, los cuales son conjugados con un miembro aglutinante específico para el analito. Las sondas conjugadas forman complejos con el analito. Estos complejos entonces alcanzan una zona de anticuerpos inmovilizados en donde el aglutinamiento ocurre entre los anticuerpos y el analito para formar "complejos de emparedados" ternarios. Los complejos de emparedado están localizados en la zona para la detección de analito. Esta técnica puede ser usada para obtener resultados cuantitativos o semicuantitativos . Algunos ejemplos de los ensayos de tipo de emparedado están descritos en las Patentes de los Estados Unidos de América Nos. 4,168,146 otorgada a Grubb y otros y 4,366,241 otorgada a Tom y otros. Una técnica alterna es el ensayo "de tipo competitivo" . En un ensayo de "de tipo competitivo" la etiqueta es típicamente un análogo-analito o analito etiquetado que compite por el aglutinamiento de un anticuerpo con un analito no etiquetado presente en la muestra. Los ensayos competitivos son típicamente usados para la detección de analitos tales como haptenos, cada hapteno siendo monovalente y capaz de aglutinar solo una molécula de anticuerpo. Los ejemplos de los dispositivos de inmunoensayo competitivos están descritos en las patentes de los Estados Unidos de América Nos. 4,235,601 otorgada a Deutsch y otros, 4,442,204 otorgada Liotta, y 5,208,535 otorgada a Buechler y otros .
A pesar de los beneficios logrados de estos dispositivos, muchos ensayos de flujo lateral convencionales encuentran inexactitudes significantes cuando se exponen a concentraciones de analito relativamente altas. Por ejemplo, los ensayos que descansan sobre la detección óptica (por ejemplo la fluorescencia, la reflectancia, la fosforescencia etc . ) frecuentemente se hacen inexactos a concentraciones de analito altas. Específicamente, las sondas son usualmente no solo capturadas en la superficie del dispositivo de membrana, sino también en dentro del interior del dispositivo de ensayo. Desafortunadamente, la mayoría de las técnicas de detección óptica no son capaces de detectar aquellas sondas capturadas profundas dentro del interior del dispositivo de ensayo. Además, las sondas fluorescentes algunas veces exhiben un "autoenfriamiento" cuando se colocan muy juntas. El autoenfriamiento es un fenómeno muy conocido que ocurre cuando dos o más materiales fluorescentes interactúan fotoquímicamente para enfriar la fluorescencia de cada uno. Por tanto, las sondas pueden comenzar a exhibir un autoenfriamiento a concentraciones de analito altas, lo cual resulta en una disminución en la intensidad fluorescente. Aquellos problemas frecuentemente limitan el rango de detección y resultan en una detección inexacta de un analito.
En respuesta a estos u otros problemas, se han propuesto varias configuraciones de ensayo. Por ejemplo, la patente Europea 0462376 otorgada a Ching describe un dispositivo de ensayo que incluye una fase sólida que tiene por lo menos dos sitios de detección definidos y marcados en un contacto de flujo-fluido de secuencia. El primer sitio de detección es un sitio de captura inmovilizado con un reactivo de captura capaz de competir con el analito para aglutinar a un conjugado. Un segundo sitio de detección es un sitio de recuperación de conjugado que incluye un agente de recuperación de conjugado diferente del reactivo de captura para aglutinar al conjugado o a un complejo del mismo que pasa a través del sitio de captura. Al - aumentar la cantidad de analito en la muestra de prueba, más sitios de unión del conjugado son ocupados por las moléculas de analito y menos conjugado está libre para aglutinar al reactivo de captura. En vez de esto, los complejos de conjugado/analito pasan a través del sitio de captura y emigran adentro del sitio de recuperación de conjugado. El análisis comparativo de las cantidades de etiqueta en cada sitio indica la cantidad de analito en la muestra de prueba .
No obstante, aún existe una necesidad de un método para extender el rango de detección dinámica de un dispositivo de ensayo en una manera de costo efectiva y simple.
Síntesis de la invención
De acuerdo con la incorporación de la presente invención, está descrito un dispositivo de ensayo de flujo continúo para detectar la presencia o cantidad de un analito que reside en una muestra de prueba. El dispositivo de ensayo de flujo continuo comprende una membrana porosa que está en comunicación con las sondas de detección y las sondas de calibración, las sondas de detección estando conjugadas con un miembro de aglutinamiento específico para el analito. Si se desea, las sondas de detección conjugadas pueden comprender una sustancia seleccionada del grupo que consiste de cromógenos, catalizadores, compuestos luminiscentes (por ejemplo fluorescentes, fosforescentes etc.), compuestos radioactivos, etiquetas visuales, liposomas y combinaciones de los mismos. El miembro aglutinante específico puede ser seleccionado del grupo que consiste de antígenos, haptenos, aptámeros, anticuerpos primarios o secundarios, biotina y combinaciones de los mismos.
La membrana porosa define una zona de detección dentro de la cual está inmovilizado un primer reactivo de captura que está configurado para aglutinar a por lo menos una parte de las sondas de detección conjugadas o complejos de las mismas para generar una señal de detección teniendo una intensidad. En una incorporación, el primer reactivo de captura es seleccionado del grupo que consiste de antígenos, haptenos, proteína A o G, neutravidina, avidina, estreptavidina, captavidina, anticuerpos primarios o secundarios, y complejos de los mismos. Por ejemplo, el primer reactivo de captura puede aglutinar a complejos formados entre el analito y las ondas de detección conjugadas.
Para extender además el rango de detección dinámica del dispositivo de ensayo, la membrana porosa también define una zona de compensación localizada hacia debajo de la zona de detección. Un segundo reactivo de captura está inmovilizado dentro de la zona de compensación que está configurada para aglutinar a las sondas de detección conjugadas o complejos de las mismas que pasan a través de la zona de detección para generar una señal de compensación que tiene una intensidad. En una incorporación, el segundo reactivo de captura es seleccionado del grupo que consiste de antígenos, haptenos, proteína A o G, neutravidina, avidina, estreptavidina, captavidina, anticuerpos primarios o secundarios, y complejos de los mismos. En otra incorporación, el segundo reactivo de captura comprende un polielectrolito. El polielectrolito puede ser cargado positivamente, cargado negativamente, anfifílico etcétera. Sin importar la materia seleccionada para el segundo reactivo de captura, la intensidad de la señal de compensación es inversamente proporcional a la intensidad de la señal de detección. Por tanto, la proporción de la intensidad de la señal de detección a la intensidad de la señal de compensación es proporcional a la concentración de analito, y por tanto puede ser usada para determinar la cantidad del analito en la muestra de prueba.
La exactitud de las señales de detección y compensación bajo las condiciones de prueba reales puede además ser mejoradas usando las técnicas de auto calibración. Específicamente, la membrana porosa también está en comunicación con las sondas de calibración y comprende una zona de calibración dentro de la cual está inmovilizado un tercer reactivo de captura que está configurado para aglutinar a las sondas de calibración para generar una señal de calibración que tiene una intensidad. La señal de calibración es esencialmente constante en intensidad en relación a las intensidades de las señales de detección y de compensación. Por tanto, la señal de calibración puede ser usada para calibrar las señales de detección y compensación.
De acuerdo con otra incorporación de la presente invención, está descrito un método para detectar la presencia o la cantidad de un analito que reside en una muestra de prueba. El método comprende :
(i) proporcionar un dispositivo de ensayo de flujo continuo que comprende una membrana porosa, la membrana porosa está en comunicación con las sondas de detección y las sondas de calibración, las sondas de detección están conjugadas con un miembro aglutinante específico para el analito, la membrana porosa define una zona de detección dentro de la cual está inmovilizado un primer reactivo de captura, una zona de compensación dentro de la cual está inmovilizado un segundo reactivo de captura, y una zona de calibración dentro de la cual está inmovilizado un tercer reactivo de captura, en donde la zona de compensación está localizado hacia abajo de la zona de detección;
ii) poner en contacto una muestra de prueba que contiene el analito con las sondas de detección conjugadas y las ondas de calibración;
iii) medir la intensidad de la señal de detección generada en la zona de detección, una intensidad de señal de compensación generada en la zona de compensación, y una intensidad de señal de calibración generada en la zona de calibración;
iv) comparar la intensidad de la señal de detección con la señal de compensación, en donde la intensidad de la señal de compensación es inversamente proporcional a la intensidad de la señal de detección; y
v) calibrar las intensidades comparadas de la señal de detección y de la señal de compensación con la intensidad de la señal de calibración, en donde la intensidad de la señal de calibración es esencialmente constante en relación a las intensidades de la señal de detección y de la señal de calibración. Si se desea, el método puede además comprender el generar una curva de calibración mediante el dibujar la proporción de la intensidad de la señal de detección a la intensidad de señal de compensación calibrada por la intensidad de la señal de calibración para una pluralidad de concentraciones de analito predeterminadas .
Otras características y aspectos de la presente invención están discutidos en mayor detalle abajo.
Breve descripción de los dibujos
Una descripción completa y habilitante de la presente invención, incluyendo el mejor modo de la misma, dirigida a uno con una habilidad ordinaria en el arte, se establece más particularmente en el resto de la descripción, la cual hace referencia a las figuras anexas en las cuales:
La figura 1 es una vista en perspectiva de una incorporación de un dispositivo de ensayo de flujo continuo de la presente invención.
La figura 2 es una ilustración gráfica de la incorporación para conjugar covalentemente un anticuerpo a unas sondas de detección.
La figura 3 es una ilustración gráfica de la relación entre la concentración de analito y las intensidades de señal para las zonas de detección y compensación de acuerdo con la incorporación de la presente invención; y
La figura 4 es una ilustración gráfica de un mecanismo usado para una incorporación de un formato de ensayo de emparedado de la presente invención.
El uso repetido de los caracteres de referencia en la presente descripción y en los dibujos se intenta que represente las mismas características o elementos análogos de la invención .
Descripción detallada de las incorporaciones representativas
Definiciones
Como se usó aquí, el término "analito" se refiere generalmente a una sustancia que va a ser detectada. Por ejemplo, los analitos pueden incluir substancias antigénicas, haptenos, anticuerpos y combinaciones de los mismos. Los analitos incluyen, pero no se limitan a toxinas, compuestos orgánicos, proteínas, péptidos, microorganismos, aminoácidos, ácidos nucleicos, hormonas, esteroides, vitaminas, drogas (incluyendo aquellas administradas para propósitos terapéuticos así como aquellas administradas para propósitos ilícitos) , intermediarios o subproductos de drogas, bacterias, partículas de virus y metabolitos de o anticuerpos para cualquiera de las substancias anteriores. Los ejemplos específicos de algunos analitos incluyen ferritina; creatinina quinasa MB(CK-MB); digoxina; fenitoina; fenobarbitol; carbamacepina; vancomicina; gentamicina; teofilina, ácido valpróico; quinidina; hormona luteizinante (LH) ,- hormona estimuladora de folículo (FSH) ; estradiol, progesterona; proteína reactiva-C; lipocalinas;
anticuerpos IgE; citocinas; vitamina B2 micro-globulin; hemoglobina glicatada (Gly.Hb) ; cortisol; digitoxina; N- acetilprocainamida (NAPA) ; procainamida ; anticuerpos para rubela, tal como rubela-IgG y rubela IgM; anticuerpos para toxoplasmosis, tal como toxoplasmosis IgG (Toxo-IgM) y toxoplasmosis IgM (Toxo-IgM) ; testosterona; salicilatos; acetaminofen; antígeno de superficie de virus de hepatitis B (HBsAg) ; anticuerpos para el antígeno de núcleo hepatitis B, tal como antígeno de núcleo B Anti-Hepatitis IgG y IgM (Anti-HBC) ; virus de inmunodeficiencia humana -1 y 2 (HIV 1 y 2) ; virus de leucemia de célula-T humana 1 y 2 (HTLV) ; antígeno B e de hepatitis (HBeAg) ; anticuerpos antígeno de hepatitis B e
(Anti-HBe) ; virus de influenza; hormona de estimuladora de la tiroides (TSH) ; tiroxina (T4) ; triyodotironina (Total T3) ; triyodotironina (Libre T3); antígeno carcinoembroíco (CEA); lipoproteínas, colesterol, triglicéridos; y fetoproteína alfa
(AFP) . Las drogas de abuso y las substancias controladas se incluyen pero no se intenta que estén limitadas a anfetamina; metafetamina, barbituratos tal como amobarbital, secobarbital, pentobarbital, fenobarbital y barbital; benzodiacepinas tal como libro y valium; canabinoides, tal como hashish y marihuana, cocaína; fentanil; LSD, metacualona; opiatos tal como heroína, como morfina, codeína, hidromorfona, hidrocodona, metadona, oxicodona, oximorfona y opio; fenciclidina; y propoxifeno. Otros analitos potenciales pueden estar descritos en las patentes de los Estados Unidos de América Nos. 6,436,651 otorgada a Everhart y otros 4,366,241 otorgada a Tom y otros.
Como se usó aquí, el termino "muestra de pruebas" generalmente se refiere a un material que se sospecha de contener el analito. La muestra de prueba puede como por ejemplo, incluir materiales obtenidos directamente de una fuente así como materiales tratados previamente usando técnicas tales como pero no limitándose a filtración, precipitación, dilución, destilación, mezclado, concentración en activación de componentes de interferencia, la adición de reactivos y otros. La muestra de prueba puede ser derivada de una fuente biológica, tal como un fluido fisiológico, incluyendo sangre, fluido intersticial, saliva, un fluido de lentes ocular, fluido espinal cerebral, sudor, orina, leche, fluido ascitis, moco, fluido sinovial, fluido peritoneal, fluido vaginal, fluido amniótico o similar. Además de los fluidos fisiológicos, otras muestras líquidas pueden ser usadas, tal como agua, productos alimenticios y otros. Además, un material sólido que se sospecha de contener el analito puede ser usado como la muestra de prueba .
Descripción Detallada
Se hará ahora referencia en detalle a varias incorporaciones de la invención, uno o más ejemplos de los cuales se establecen abajo. Cada ejemplo se proporciona por vía de explicación de la invención y no delimitación de la invención. De hecho, ser evidente para aquellos expertos en el arte el que pueden hacerse varias modificaciones y variaciones en la presente invención sin departir del alcance o espíritu de dicha invención. Por ejemplo, las características ilustradas o descritas como parte de una incorporación, pueden ser usadas sobre otra incorporación para dar aún otra incorporación adicional. Por tanto, se intenta que la presente invención cubra tales modificaciones y variaciones como caigan dentro del alcance de las reivindicaciones anexas y de sus equivalentes.
En general, la presente invención está dirigida a un dispositivo de ensayo de flujo continúo para detectar la presencia o cantidad de un analito que reside en una muestra de prueba. El dispositivo utiliza una zona de detección y una zona de compensación dentro de las cuales están los reactivos de captura inmovilizados. El presente inventor a descubierto que la presencia de una zona de compensación puede permitir la detección de un analito sobre rangos de concentración extendidos. En particular, la señal de la zona de compensación puede compensar por la perdida de señal que resulta de esas sondas que están embebidas muy profundo dentro del interior del dispositivo de ensayo y/o esas sondas que exhiben un auto enfriamiento .
Refiriéndonos a la figura 1, por ejemplo, una incorporación de un dispositivo de ensayo de flujo continúo de tipo de emparedado 20 que puede ser formado de acuerdo a la presente invención se describirá ahora en mayor detalle. Como se mostró, el dispositivo 20 contiene una membrana porosa 23 opcionalmente sostenida por un material rígido 21. En general, la membrana porosa 23 puede hacerse de cualquiera de una variedad de materiales a través de los cuales la muestra de prueba es capaz de pasar. Por ejemplo, los materiales usados para formar la membrana porosa 23 pueden incluir, pero no se limitan a materiales naturales, sintéticos o que ocurran naturalmente que son modificados sintéticamente, tal como polisacáridos (por ejemplo materiales de celulosa tal como papel y derivados de celulosa tal como acetato de celulosa y nitrocelulosa) ; poliéter sulfona; polietileno; nylon; fluoruro de de polivinilideno (PVDF) ; poliéster, polipropileno; sílice; materiales inorgánicos, tal como alúmina desactivada, tierra diatomácea, gS0 , u otro material finamente dividido inorgánico dispersado en forma uniforme en una matriz de polímero poroso; con polímeros tales como cloruro de vinilo, copolímero de cloruro de vinilo-propileno, y copolímero de acetato de vinilo-cloruro de vinilo; tela, tanto que ocurre naturalmente (por ejemplo algodón) y sintética (por ejemplo nylon o rayón); geles porosos, tal como gel de sílice, agarosa, dextran, y gelatina; películas poliméricas, tal como poliacrilamida; y similar. En una incorporación particular, la membrana porosa 23 está formada de materiales de nitrocelulosa y/o poliéter sulfona. Deberá entenderse que el término "nitrocelulosa" se refiere a esteres de ácido nítrico de celulosa, los cuales pueden ser nitrocelulosa sola o una mezcla de éster de ácido nítrico y otros ácidos, tal como los ácidos carboxílicos alifáticos teniendo de desde 1 a 7 átomos de carbono .
El dispositivo 20 también puede contener una almohadilla de transmisión 28. La almohadilla de transmisión 28 generalmente recibe fluido que emigra a través de la membrana porosa completa 23. Como se conoce bien en el arte, la almohadilla de transmisión 28 puede ayudar el promover la acción capilar y el flujo de fluido a través de la membrana 23.
Para iniciar la detección de un analito dentro de la muestra de prueba como a un usuario puede directamente aplicar la muestra de prueba a una parte de la membrana porosa 23 a través de la cual está puede entonces desplazarse en la dirección ilustrada por la flecha "L" en la figura 1. Alternativamente, la muestra de prueba puede primero ser aplicada a una almohadilla de muestra (no mostrada) que está en comunicación de fluido con la membrana porosa 23. Algunos materiales adecuados que pueden ser usados para formar la almohadilla de muestra incluyen, pero no se limitan a nitrocelulosa, celulosa, almohadillas de polietileno porosas, y papel de filtro de fibra de vidrio. Si se desea, la almohadilla de muestra también puede contener uno o más reactivos de pretratamiento de ensayo, ya sea difusivamente o no difusivamente sujetados a la misma.
En la incorporación ilustrada, la muestra de prueba se desplaza desde la almohadilla de muestra (no mostrada) a una almohadilla conjugada 22 y es colocada en comunicación con un extremo de la almohadilla de muestra. La almohadilla conjugada 22 está formada de un material a través del cual la muestra de prueba es capaz de pasar. Por ejemplo, en una incorporación, la almohadilla conjugada 22 está formada de fibras de vidrio. Aún cuando solo una almohadilla conjugada 22 está mostrada, deberá entenderse que otras almohadillas conjugadas también pueden ser usadas en la presente invención.
Para facilitar la detección exacta de la presencia o de la ausencia de un analito dentro de la muestra de prueba, una cantidad predeterminada de sondas de detección son aplicadas a varios lugares del dispositivo 20. Cualquier sustancia generalmente capaz de generar una señal que es detectable visualmente o mediante un dispositivo instrumental puede ser usada como sondas de detección. Varias sustancias adecuadas pueden incluir cromógenos; catalizadores; compuestos luminiscentes (por ejemplo fluorescentes, fosforescentes, etc.); compuestos radioactivos; etiquetas visuales, e incluyendo partículas metálicas (por ejemplo oro) y no metálicas coloidales, partículas de tinte, enzimas o substratos, o partículas de látex de polímero orgánico; liposomas u otras vesículas que contienen sustancias productoras de señal y otros. Por ejemplo, algunas enzimas adecuadas para usarse como sondas de detección están descritas en la patente de los Estados Unidos de América No. 4,275,149 otorgada a Litman y otros, la cual está incorporada aquí en su totalidad por referencia a la misma para todos los propósitos . Un ejemplo de un sistema de substrato/enzima es la enzima alcalina fosfatasa y el substrato nitro azul tetrasolio-5- bromo-4-cloro-3-indolil fosfato o un derivado o análogo del mismo, o el substrato 4-metilumbeliferil-fosfato. Otras sondas de detección adecuadas pueden estar descritas en las patentes de los Estados Unidos de América Nos. 5,670,381 otorgada a Jou y otros y 5,252,459 otorgada a Tarcha y otros, las cuales son incorporadas aquí en su totalidad por referencia a las mismas para todos los propósitos .
En algunas incorporaciones, las sondas de detección pueden contener un compuesto fluorescente que produce una señal detectable. El compuesto fluorescente puede ser una molécula fluorescente, polímero, dendrimero, partícula y otros. Algunos ejemplos de moléculas fluorescentes adecuadas, por ejemplo, incluyen pero no se limitan a floroeceina, quelatos de uropio, ficobiliproteína, rodamina y sus derivados y análogos.
Las sondas de detección tales como las descritas anteriormente pueden ser usadas solas o en conjunción con una micropartícula (algunas veces mencionada como "perlas" o "microperlas" ) . Por ejemplo, las micropartículas que ocurren naturalmente tal como los núcleos, micoplasma, plásmidos, plásticos, células de mamífero (por ejemplo fantasmas editorcitos) , microorganismos unicelulares (por ejemplo bacterias), polisacáridos (por ejemplo agarosa) y otros pueden usarse. Además, las micropartículas sintéticas también pueden ser utilizadas. Por ejemplo, en una incorporación las micropartículas de látex están marcadas con un tinte coloreado o fluorescente son utilizadas. Aún cuando cualquier micropartícula de látex puede ser usada en la presente invención, las micropartículas de látex son típicamente formadas de poliestireno, butadieno estirenos, terpolímero de vinilo-estireno acrílico, polimetil metacrilato, polietil metacrilato, copolímero de anhídrido maléico-estireno, acetato de polivinilo, polivinil piridino, polidivinilbenceno, polibutilen tereftalato, acrilonitrilo, vinilcloruro-acrilatos y otros o un aldehido, carboxilo, amino, hidroxilo o derivado hidrazida del mismo. Otras micropartículas adecuadas pueden estar descritas en las patentes de los Estados Unidos de América Nos .5, 670, 381 otorgada a Jou y otros y 5,252,459 otorgada a Tarcha y otros, las cuales son incorporadas aquí en su totalidad por referencia a las mismas para todos los propósitos. Los ejemplos comercialmente disponibles de las partículas fluorescentes adecuadas incluyen las microesferas carboxilatadas fluorescentes vendidas por Molecular Probes, Inc., bajo los nombres de comercio "PluoSphere" (Rojo 580/605) y "TransfluoShpere" (543/620) , así como "Texas Red" y 5-y6-carboxitetrametilrodamina, la cual también se vende por Molecular Probes, Inc. En adición, los ejemplos comercialmente disponibles de micropartículas de látex coloreadas adecuadas se incluyen las cuentas o perlas de látex carboxilatadas vendidas por Bang's Laboratory, Inc.
Cuando se utiliza, la forma de las partículas puede generalmente variar. En una incorporación particular, por ejemplo, las partículas son de forma esférica. Sin embargo, deberá entenderse que también están contempladas otras formas por la presente invención tal como placas, varillas, discos, barras, tubos, formas irregulares etc. Además, el tamaño de las partículas también puede variar. Por ejemplo, el tamaño promedio (por ejemplo diámetro) de las partículas puede variar de desde alrededor de 0.1 nanómetros a alrededor de 1000 mieras, en algunas incorporaciones de desde alrededor de 0.1 nanómetros a alrededor de 100 mieras y en algunas incorporaciones desde 1 nanómetro a alrededor de 10 mieras. Por ejemplo, son frecuentemente deseadas las partículas de "escala-miera" . Cuando se utilizan tales partículas de escala-miera pueden tener un tamaño promedio de desde alrededor de 1 miera alrededor de 1000 mieras, en algunas incorporaciones de desde alrededor de 1 miera a alrededor de 100 mieras; y en algunas incorporaciones de desde alrededor de 1 miera a alrededor de 10 mieras. En forma similar, las partículas "de escala nano" también pueden ser utilizadas. Tales partículas de "escala-nano" pueden tener un tamaño promedio de desde alrededor de 0.1 a alrededor de 10 nanómetros, en algunas incorporaciones de desde alrededor de 0.1 a alrededor de 5 nanómetros y en algunas incorporaciones de desde alrededor de 1 a alrededor de 5 nanómetros .
En algunas incorporaciones, se desean el modificar las sodas de detección en alguna manera de manera que estas sean más fácilmente capaces de aglutinar al analito. En tales casos, las sondas de detección pueden ser modificadas con ciertos miembros de aglutinamiento específicos que son adheridos a las mismas para formar las sondas conjugadas. Los miembros de aglutinamiento específicos generalmente se refieren a un miembro de un par de aglutinamiento específico, por ejemplo, dos moléculas diferentes en donde una de las moléculas aglutina química y/o físicamente a la segunda molécula. Por ejemplo, los miembros de aglutinamiento específicos inmuno reactivos pueden incluir antígenos, haptenos, aptámeros, anticuerpos (primario o segundario) y complejos de los mismos incluyendo aquellos formados por métodos de ADN recombinantes o síntesis de péptido. Un anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal, una proteína recombinante o una mezcla (s) o fragmento (s) de la misma, así como una combinación de un anticuerpo y otros miembros aglutinantes específicos. Los detalles de la preparación de tales anticuerpos y de su adecuación para usarse como miembros aglutinantes específicos son muy conocidos por aquellos expertos en el arte. Otros pares aglutinantes específicos comunes se incluyen pero no se limitan a biotina y avidina (o derivados de los mismos) , biotina o estreptavidina, carbohidratos y lectinas, secuencias de nucleótido complementarias (incluyendo secuencias de ácido nucleico de captura y de sonda usados en los ensayos de hibridización ADN para detectar la secuencia de ácido nucleico especificas) , la secuencias de péptido complementarias incluyendo aquellas formadas por métodos recombinantes, las moléculas de efector y receptor, hormona y proteína aglutinante de hormona, cofactores de enzima y enzimas, inhibidores de enzima y enzimas y otros. Además, los pares aglutinantes específicos pueden incluir miembros que son análogos del miembro aglutinante específico. Por ejemplo, un derivado fragmento del analito, por ejemplo un analito-análogo, puede ser usado siempre que este tenga por lo menos un epitope en común con el analito.
Los miembros aglutinantes específicos pueden generalmente ser sujetados a las sondas de detección usando cualquiera de una variedad de técnicas muy conocidas. Por ejemplo, la sujeción covalente de los miembros aglutinantes específicos a las sondas de detección (por ejemplo partículas) puede ser lograda usando grupos carboxílicos, amino, aldehido, bromoacetilo, iodoacetilo, tiol, epoxi y otros grupos funcionales de enlace o reactivos, así como radicales libres residuales y cationes radicales, a través de los cuales puede lograrse una reacción de acoplamiento de proteína. Un grupo funcional de superficie también puede ser incorporado como un comonómero funcionalizado debido a que la superficie de las sondas de detección puede contener una concentración relativamente alta de superficie de los grupos polares. Además, aún cuando las sondas de detección son frecuentemente funcionalizadas después de la síntesis, en ciertos casos, tal como poli (tiofenol) , las micropartículas son capaces de erigir un enlace covalente con una proteína sin la necesidad de una modificación adicional. Por ejemplo, refiriéndonos a la figura 2 , está ilustrada una incorporación de la presente invención para conjugar covalentemente una sonda de detección que contiene partículas. Como se mostró, el primer paso de conjugación es la activación de grupos carboxílicos sobre la superficie de sonda usando carbodiimida. En el segundo paso, los grupos de ácido carboxílico activado son reaccionados con un grupo amino de un anticuerpo para formar un enlace amida. La activación y/o el acoplamiento de anticuerpo puede ocurrir en un amortiguador, tal como agua sala amortiguada con fosfato
(PBS) (por ejemplo pH de 7.2) o 2- (N-morfolino) ácido etanosulfónico (MES) por ejemplo pH de 5.3). Como se mostró, las sondas de detección resultantes pueden entonces ser bloqueadas con etanolamina, por ejemplo, para bloquear cualesquier sitios activados restantes. En general, este proceso forma una sonda de detección conjugada, en donde el anticuerpo está sujetado covalentemente a la sonda. Además de unir covalentemente, otras técnicas de sujeción, tal como la adsorción física también pueden utilizarse en la presente invención.
Refiriéndonos de nuevo a la figura 1, el dispositivo de ensayo 20 también puede contener una zona de detección 31 dentro de la cual está inmovilizado un primer reactivo de captura que es capaz de aglutinar a las sondas de detección conjugadas. Por ejemplo, en algunas incorporaciones, el primer reactivo de captura puede ser un reactivo de captura biológica . Tal reactivos de captura biológica son muy conocidos en el arte y pueden incluir, pero no se limitan a antígenos, haptenos, proteína A o G, neutravidina, avidita, estreptavidina, captavidina, anticuerpos primarios o secundarios (por ejemplo policlonal, monoclonal etc.) y complejos de los mismos. En muchos casos, se desea que estos reactivos de captura biológicos sean capaces de aglutinar a un miembro aglutinante específico (por ejemplo anticuerpo) presente en las sondas de detección. El primer reactivo de captura sirve como un sitio aglutinante estacionario para complejos formados entre el analito y las sondas de detección conjugadas. Específicamente, los analitos, tal como los anticuerpos, antígenos, etc., típicamente tienen dos o más sitios aglutinantes (por ejemplo epitopes) . Al alcanzar la zona de detección 31, uno de estos sitios aglutinantes es ocupado por el miembro aglutinante específico de la sonda conjugada. Sin embargo, el sitio aglutinante libre del analito puede aglutinar al reactivo de captura inmovilizado. Al ser unido al reactivo de captura inmovilizado, las sondas complejadas forman un nuevo complejo de emparedado ternario.
La zona de detección 31 puede generalmente proporcionar cualquier número de regiones de detección distintas de manera que un usuario pueda determinar mejor la concentración de un analito particular dentro de esta muestra de prueba . Cada región puede contener los mismos reactivos de captura, o puede contener reactivos de captura diferentes para capturar analitos múltiples. Por ejemplo, la zona de detección 31 puede incluir dos o más regiones de detección distintas (por ejemplo líneas, puntos, etc.) . Las regiones de detección pueden estar colocadas en la forma de líneas en una dirección que es esencialmente perpendicular al flujo de la muestra de prueba a través del dispositivo de ensayo 20. En forma similar, en algunas incorporaciones, las regiones de detección pueden estar colocadas en la forma de líneas en una dirección que es esencialmente paralela al flujo de la muestra de prueba a través del dispositivo de ensayo.
Refiriéndonos de nuevo a la figura 1, la membrana porosa 23 también contiene una zona de compensación 35 colocada hacia debajo de la zona de detección 31. La zona de compensación 35 generalmente proporciona una región distinta única (por ejemplo una línea, punto, etcétera, aún cuando regiones múltiples son ciertamente contempladas por la presente invención. Por ejemplo, en la incorporación ilustrada, es utilizada una línea única. La zona de compensación 35 puede ser colocada en una dirección que es esencialmente perpendicular al flujo de la muestra de prueba a través del dispositivo 20. En forma similar, en algunas incorporaciones, la zona 35 puede ser colocada en una dirección que es esencialmente paralela al flujo de la muestra de prueba a través del dispositivo 20.
Sin importar su configuración, un segundo reactivo de captura es inmovilizado sobre la membrana 35 dentro de la zona de compensación 35. El segundo reactivo de captura sirve como un sitio aglutinante estacionario para cualesquier sondas de detección conjugadas y/o complejos de sonda conjugada/analito que no aglutinan al primer reactivo de captura en la zona de detección 31. Debido a que se desea que el segundo reactivo de captura aglutine a ambas sondas de detección conjugadas complejadas y no complejadas, el segundo reactivo de captura es normalmente diferente del primer reactivo de captura. En una incorporación, el segundo reactivo de captura es un reactivo de captura biológico (por ejemplo antígenos, haptenos, proteína A o G, neutravidina, avidina, estreptavidina, anticuerpos primarios o secundarios (por ejemplo policlonal, monoclonal etc.) y complejos de los mismos, que es diferente del primer reactivo de captura. Por ejemplo, el primer reactivo de captura puede ser un anticuerpo monoclonal (por ejemplo CRP Mabl) , mientras que el segundo reactivo de captura puede ser avidina (una glicoproteína de 66,000 daltons altamente catiónica), estreptavidina (una proteína de 52,800 daltons no glicoxilatada) , neutravidina (un derivado de avidina desglisolatado) y/o captavidina (un derivado de avidina nitratado) . En esta incorporación, el segundo reactivo de captura puede aglutinar a la biotina, la cual es biotinilatada o está contenida sobre las sondas de detección conjugadas con un anticuerpo monoclonal diferente del anticuerpo monoclonal del primer reactivo de captura (por ejemplo CRP Mab2) .
Además, también puede ser deseado el utilizar varios materiales no biológicos para el segundo reactivo de captura de la zona de compensación 35. En muchos casos, tales reactivos de captura no biológicos pueden ser particularmente deseados para asegurar mejor que todas las sondas de detección conjugadas restantes y/o los complejos de sonda conjugada/analito estén inmovilizados en la zona de compensación 35. Por ejemplo, en algunas incorporaciones, el segundo reactivo de captura puede incluir un polielectrolito.
Los polielectrolitos pueden tener una carga positiva o negativa neta, así como una carga neta que es generalmente neutral. Por ejemplo, algunos ejemplos adecuados de polielectrolitos teniendo una carga positiva neta incluyen pero no se limitan a polilisina (comercialmente disponible de Sigma-Aldrich Chemical Co., Inc. de St . Louis, Missouri) polietilenimina; poliaminas epiclorohidrina-funcionalizadas y/o poliamidoaminas, tal como poli (dimetilamina-co-epiclorohidrina) ; cloruro de polidialildimetilamonio; derivados de celulosa catiónicos, tales como copolímeros de celulosa o derivados de celulosa injertados con un monómero soluble en agua de amonio cuaternario; y otros; en una incorporación particular, los CelQuat® SC-230M o H-100 (disponible de Nacional Starch & Chemical, Inc.) los cuales son derivados celulósicos conteniendo un monómero soluble en agua de amonio cuaternario pueden ser utilizados. Además, algunos ejemplos adecuados de polielectrolitos teniendo una carga negativa neta incluyen, pero no se limitan a ácidos poliacrílicos tal como poli (ácido etileno-co-metacrílico, sal de sodio) y otros. También deberá entenderse que otros polielectrolitos pueden ser utilizados, tal como los polielectrolitos anfifílicos (por ejemplo teniendo partes polares y no polares). Por ejemplo, algunos ejemplos de los polielectrolitos anfifílicos adecuados incluyen, pero no se limitan a poli (estiril-b-N-metilo 2-vinilpiridinio ioduro) y poli (estiril-b-ácido acrílico), ambos de los cuales están disponibles de Polymer Source, Inc. de Dorval , Canadá .
Aún cuando cualquier polielectrolito puede ser generalmente usado, el polielectrolito seleccionado para una aplicación particular puede variar dependiendo de la naturaleza de las sondas de detección, de la membrana porosa y otros. En particular, la carga distribuida de un polielectrolito permite a este el aglutinar a sustancias que tienen una carga opuesta. Por tanto, por ejemplo, los polielectrolitos teniendo una carga positiva neta son frecuentemente mejor equipados para aglutinar con sondas de detección que están cargadas negativamente, mientras que los polielectrolitos que tienen una carga negativa neta son frecuentemente mejor equipados para aglutinar a las sondas de detección que están cargadas positivamente. Por tanto, en tales casos, la interacción iónica entre estas moléculas permite que ocurra el aglutinamiento requerido dentro de la zona de compensación 35. No obstante, aún cuando la interacción iónica es primariamente utilizada para lograr el aglutinamiento deseado en la zona de compensación 35, también se ha descubierto que los polielectrolitos pueden aglutinar con las sondas de detección teniendo una carga similar.
Debido a que el polielectrolito está diseñado para aglutinar a las sondas de detección, es típicamente deseado que el polielectrolito sea esencialmente inmovilizado no difusivamente sobre la superficie de la membrana porosa 23. De otra manera, las sondas de detección pueden no ser fácilmente detectables por un usuario. Por tanto, los polielectrolitos pueden ser aplicados a la membrana porosa 23 en una manera tal que estos no difunden esencialmente adentro de la matriz de la membrana porosa 23. En particular, los polielectrolitos típicamente forman un enlace iónico y/o covalente con los grupos funcionales presentes sobre la superficie de la membrana porosa 23 de manera que estos permanecen inmovilizados sobre la misma. Aún cuando no se requiere, la formación de uniones covalentes entre el polielectrolito y la membrana porosa 23 puede ser deseada para inmovilizar más permanentemente el polielectrolito sobre la misma.
Por ejemplo, en una incorporación, los monómeros usados para formar el polielectrolito son primero formados en una solución y después aplicados directamente a la membrana porosa 23. Varios solventes (por ejemplo solventes orgánicos, agua, etc.) Pueden ser utilizados para formar la solución. Una vez aplicada, la polimerización de los monómeros es iniciada usando calor, radiación de rayo electrónico, polimerización de radical libre y otros. En algunos casos, al polimerizar los monómeros, estos forman enlaces covalentes con ciertos grupos funcionales de la membrana porosa 23, inmovilizando por tanto el polielectrolito resultante sobre la misma. Por ejemplo, en una incorporación, un monómero de etilenimina puede formar un enlace covalente con el grupo carboxilo presente sobre la superficie de las membranas porosas (por ejemplo nitrocelulosa) .
En otra incorporación, el polielectrolito puede ser formado antes de la aplicación a la membrana porosa 23. Si se desea, el polielectrolito puede primero ser formado en una solución usando solventes orgánicos, agua y otros. Después, la solución de polielectrolito es aplicada directamente a la membrana porosa 23 y después se seca. Con el secado, el polielectrolito puede formar un enlace iónico con ciertos grupos funcionales presentes sobre la superficie de la membrana porosa 23 que tienen una carga opuesta al polielectrolito. Por ejemplo, en una incorporación, la polietilenimina cargada positivamente puede formar un enlace iónico con los grupos carboxilo cargados negativamente presentes sobre la superficie de algunas membranas porosas (por ejemplo nitrocelulosa) .
En adición, el polielectrolito también puede ser entrecruzado a la membrana porosa 23 usando varias técnicas muy conocidas. Por ejemplo, en algunas incorporaciones, pueden ser usadas las poliaminas y/o poliamidoaminas epiclorohidrina-funcionalizadas como un polielectrolito cargado positivamente entrecruzable . Los ejemplos de estos materiales están descritos en las patentes de los Estados Unidos de América Nos. 3,700,623 otorgado a Keim y 3,772,076 otorgada a Keim, 4,537,657 otorgada a Keim, los cuales son incorporadas en su totalidad con referencia a las mismas para todos los propósitos y se cree que se venden por Hercules, Inc., de ilmington, Del., bajo la designación de comercio Kymene™. Por ejemplo Kymene™ 450 y 2064 son compuestos de poliamina y/o poliamidoamina epiclorohidrina-funcionalizados que contienen anillos de epóxido y grupos de amonio cuaternario que pueden formar enlaces covalentes con los grupos de carboxilo presentes sobre ciertos tipos de membranas porosas (por ejemplo nitrocelulosa) entrecruzados con la columna de polímero de la membrana porosa cuando se curan. En algunas incorporaciones, la temperatura de entrecruzado puede variar de desde alrededor de 50°C a alrededor de 120°C y el tiempo de entrecruzamiento puede variar de desde alrededor de 10 a alrededor de 600 segundos.
Aún cuando se han descrito arriba varias técnicas para inmovilizarla difusivamente los polielectrolitos sobre la membrana porosa 23, deberá entenderse que cualquier otra técnica para inmovilizar no difusivamente los compuestos polielectrolíticos puede ser usada en la presente invención. De hecho, los métodos antes mencionados son solo intentados como ejemplo de las técnicas que pueden usarse en la presente invención. Por ejemplo, en algunas incorporaciones, pueden ser agregados ciertos componentes a la solución de polielectrolito que pueden inhibir esencialmente la difusión de tales polielectrolitos adentro de la matriz de la membrana porosa 23.
Sin importar el material del cual es formado el segundo reactivo de captura, la zona de compensación 35 pueden mejorar el rango de detección de analito del dispositivo de ensayo 20. Este fenómeno está ilustrado gráficamente en la figura 3. Como se mostró, la intensidad de la señal en la zona de detección 31 ( "I_et" ) inicialmente aumenta entre más del analito es capturado en la zona de detección 31. Idealmente la señal de detección medida intensamente continuará aumentando linealmente para concentraciones de analito superiores . Sin embargo, los métodos de detección óptica (por ejemplo florescencia y reflectancia) no siempre proporcionan tal medida ideal, particularmente a concentraciones de sonda de detección relativamente altas. Específicamente, en algún punto, la zona de detección 31 será incapaz de señalar la acumulación de sondas de detección adicional. Como un resultado, la señal en la zona de detección 31 se nivelará o aún disminuirá. Por ejemplo, como se mostró en la figura 3, I__t puede comenzar a nivelar a una concentración de analito "Asat" al aumentar además la concentración de analito.
De acuerdo con la presente invención, sin embargo, la señal de intensidad en la zona de compensación ("Icom") puede ser medida para dar cuenta de la incapacidad de la zona de detección 31 para responder a las concentraciones de analitos superiores. Cuando nó está presente el analito, ICOm se estará a su intensidad máxima debido a que todas las ondas de detección conjugadas aglutinarán a la zona de compensación 35. Al ser aumentada la concentración de analito, ICOm en forma similar disminuye debido a la retención de un número mayor de complejos de sonda de analito/conjugadas por la zona de detección 31. Como un resultado de la relación inversamente proporcional entre las intensidades de señal de zona de compensación y de detección descritas arriba, el presente inventor a descubierto que la concentración de un analito puede ser medida más efectivamente sobre un rango extendido mediante el comparar la intensidad de señal en ambas las zonas de detección y de compensación. Específicamente, la cantidad total de las sondas de detección es predeterminada (por ejemplo empíricamente) . Debido a una cantidad predeterminada de zonas de detección que están presentes, la cantidad de sondas de detección capturadas en la zona de compensación 35 es inversamente proporcional a la cantidad de sondas de detección en la zona de detección 31. Por tanto, la cantidad de sondas de detección capturada en la zona de compensación 35 puede ser medida en forma relativamente exacta, aún cuando las cantidades grandes de sondas de detección son capturadas en la zona de detección 31 y la cantidad de tal cantidad de sondas de detección no puede ser medida exactamente. Por ejemplo, en una incorporación, la cantidad de analito es directamente proporcional a la relación de I_e a ICom- Basándose sobre el rango de intensidad en el cual caen las zonas de compensación y detección, el rango de concentración general para el analito puede ser determinado. Si se desea, la proporción de Idet a Icom puede ser puesta en contra de la concentración de analito para un rango de concentraciones de analito conocidas para generar una curva de intensidad. Para determinar la cantidad de analito en una muestra de prueba desconocida, la proporción de señal puede entonces ser convertida a la concentración de analito de acuerdo a la curva de intensidad. Deberá notarse que la eficiencia de captura de las sondas de detección conjugadas complejadas y no complejadas es generalmente la misma para cualquier muestra dada. En forma acorde, la variación en la eficiencia de captura no se cree que interfiera significativamente con los resultados de muestra-a-muestra debido a la proporción de intensidades (por ejemplo Idet/ICOm)es usada en vez de una intensidad de - señal absoluta . También deberá notarse que las relaciones matemáticas alternas entre I_et e Icom pueden ser dibujadas en contra de la concentración de analito para generar la curva de calibración. Por ejemplo, en una incorporación, el valor de I_e_ / (Idet + Icom) puede ser puesto en esquema en contra de concentración de analito para generar la curva de intensidad.
Aún cuando la zona de detección 31 y la zona de compensación 35 pueden indicar la presencia de un analito, es frecuentemente difícil el determinar exactamente la concentración relativa del analito dentro de la muestra de prueba bajo condiciones de prueba reales. Por tanto el dispositivo de ensayo 20 puede también incluir una zona de calibración 32. En esta incorporación, la zona de calibración 32 está formada sobre la membrana porosa 23 está colocada hacia abajo desde la zona de detección 31 y de la zona de compensación 35. Alternativamente, sin embargo, la zona de calibración 32 puede estar colocada hacia arriba de la zona de detección 31 y/o de la zona de compensación 35.
La zona de calibración 32 está provista con un tercer reactivo de captura que es capaz de aglutinar a las sondas de calibración que pasan a través de la longitud de la membrana 23. Las sondas de calibración pueden ser formadas de los mismos o diferentes materiales que las ondas de detección, y pueden ser conjugadas con un miembro aglutinante específico como se describió arriba. Generalmente hablando, las ondas de calibración son seleccionadas de tal manera que éstas no aglutinan al reactivo de captura primero y segundo de la zona de detección 31 y de la zona de compensación 35. El tercer reactivo de captura también puede ser el mismo diferente que el reactivo de captura usado en la zona de detección 31 o en la zona de compensación 35. Por ejemplo, en una incorporación, el tercer reactivo de captura es un reactivo de captura biológico, tal como antígenos, haptenos, proteína A o G, neutravidina, avidina, estreptavidina, captavidina, anticuerpos primarios o secundarios, o complejos de los mismos. Además, en forma similar a la zona de detección 31 y a la zona de compensación 35, la zona de calibración 32 puede también proporcionar cualquier número de regiones de calibración distintas en cualquier dirección de manera que un usuario pueda determinar mejor la concentración de un analito particular dentro de una muestra de prueba.
La zona de calibración 32 puede mejorar la exactitud del analito detectado. La zona de calibración 32 también puede eliminar el requerimiento de una calibración separada para mediciones llevadas a cabo a un diferente tiempo bajo condiciones diferentes. La cantidad total de las sondas de calibración y la cantidad total del tercer reactivo de captura sobre la zona de calibración 32 son determinadas. Por tanto, la cantidad de las sondas de calibración capturadas y la señal de calibración resultante idealmente fluctúa en una manera similar a lo que puede ocurrir en la zona de detección 31 con base en las condiciones de ensayo cambiantes, por ejemplo fluctuación de temperatura. Deseablemente, el tercer reactivo de captura tiene un perfil de degradación similar a aquél del primer reactivo de captura en la zona de detección 31. Las sondas de calibración también pueden tener un perfil de degradación similar a aquél de las sondas de detección. La fluctuación de señal de ambas las sondas de detección y las sondas de calibración es idealmente la misma o similar con las condiciones cambiadas .
Por tanto, la zona de calibración 32 puede ser usada para calibrar las intensidades de la zona de detección 31 y la zona de compensación 35 bajo condiciones de ensayo diferentes. Por ejemplo, refiriéndonos de nuevo a la figura 3, la cantidad de analito puede ser directamente proporcional a la relación de I__t para el producto de la intensidad de calibración ("lCai") y ICom(por ejemplo, Idet/lcaí) (Icom) ) • Si se desea, esto puede ser dibujado en contra de la concentración de analito para un rango de concentraciones de analito conocidas para generar una curva de calibración. Para determinar la cantidad de analito en una muestra de prueba no conocida, la relación de señal puede entonces ser convertida a la concentración de analito de acuerdo a la curva de calibración. También deberá notarse que las relaciones matemáticas alternas pueden ser dibujadas en contra de la concentración de analito para generar la curva de calibración.
Refiriéndonos a la figura 4, una incorporación de un método para detectar la presencia de un analito utilizando sondas fluorescentes se describirá ahora en mayor detalle . Inicialmente, una muestra de prueba que contiene un analito A es aplicada a la almohadilla de muestra. De la almohadilla de muestra, la muestra de prueba se desplaza en la dirección "L" a la almohadilla conjugada 22, en donde el analito A se mezcla con las sondas de detección fluorescentes conjugadas 41 y las sondas de calibración fluorescentes 43 (pueden o no estar conjugadas) . Aún cuando el uso de fluorescencia es utilizado en esta incorporación particular, deberá entenderse que otras técnicas de detección óptica, tal como la fosforescencia, la reflectancia etc., son igualmente adecuadas para usarse en la presente invención. Por ejemplo, en una incorporación, como se conoce bien en el arte, un espectrofotómetro de reflectancia o un lector puede ser utilizado para detectar la presencia de sondas que exhiban un color visual (por ejemplo microparticulas de látex teñidas) . Un lector de reflectancia adecuado está descrito, por ejemplo, en la solicitud de patente de los Estados Unidos de América publicación No. 2003/0119202 de Kaylor y otros, la cual se incorpora aquí en su totalidad por referencia a la misma para todos los propósitos .
No obstante, en la incorporación ilustrada de la figura 4, el analito A aglutina con las sondas de detección fluorescentes conjugadas 41 para formar los complejos de sonda conjugada/analito 49. En la zona de detección 31, estos complejos 49 son capturados por un primer reactivo de captura 90. Cualesquier sondas de detección fluorescentes conjugadas no complejadas 41 y/o los complejos de sonda conjugada/analito no unido 49 entonces se desplazan a la zona de compensación 35 en donde estos aglutinan a un segundo reactivo de captura (no mostrado) . Finalmente, las sondas de calibración fluorescentes 43 se desplazan a través de ambas las zonas de detección 31 y la zona de compensación 35 para aglutinar con un tercer reactivo de captura (no mostrado) en la zona de calibración 32.
Una vez capturada, la señal de fluorescencia de las sondas en la zona de detección 31, en la zona de compensación 35, y en la zona de calibración 32 puede ser medida usando la detección de fluorescencia. La fluorescencia es el resultado de un proceso de 3 fases de ocurre en ciertos compuestos fluorescentes. En la primera fase, la energía es suministrada por una fuente externa, tal como una lámpara incandescente o un láser y se absorbe por el compuesto fluorescente creando un estado singular electrónico excitado. En la segunda fase, el estado excitado sale para un tiempo determinado durante el cual el compuesto fluorescente sufre cambios de conformación y también se somete a una multitud de interacciones posibles con su ambiente molecular. Durante este tiempo, la energía de estado excitado es parcialmente disipada dando un estado relajado del cual se origina la emisión de fluorescencia. La tercera fase es la emisión de fluorescencia en donde la energía es emitida, regresando el compuesto fluorescente a su estado de tierra. La energía emitida es más baja que la energía de excitación (luz o láser) y por tanto de una longitud de onda más prolongada. Este cambio o diferencia en energía o longitud de onda permite a la energía de misión el ser detectada y aislada de la energía de excitación. La detección de florescencia generalmente utiliza un filtrado de longitud de onda para aislar los fotones de emisión de los fotones de excitación, y un detector que registra los fotones de emisión y produce una salida que puede ser registrada, usualmente como una señal eléctrica o una imagen fotográfica. Hay generalmente cuatro tipos reconocidos de detectores : Espectrofotómetros y lectores de microplaca; microscopios de florescencia; exploradores de florescencia; y citómetros de flujo. Un detector de florescencia adecuado para usarse con la presente invención es un Espectrofluorómetro FluoroLog III, el cual es vendido por SPEX Industries, Inc. de Edison, New Jersey.
Si se desea, una técnica conocida como "detección de florescencia resuelta con el tiempo" también puede ser utilizada en la presente invención. La detección de florescencia resuelta con el tiempo está diseñada para reducir las señales de fondo de la fuente de emisión o del proceso de esparcimiento (resultando de esparcimiento de la radiación de excitación) mediante el tomar ventaja de las características de florescencia de ciertos materiales fluorescentes, tal como los quelatos lantánida de europio (Eu(III) y terbio (Tb(III)).
Tales quelatos pueden exhibir una emisión de vida prolongada, de banda estrecha, cambiando-fuertemente roja después de la excitación del quelato a longitudes de onda esencialmente más cortas. Típicamente, el quelato posee una banda de absorción ultravioleta fuerte debido a un cromóforo localizado cerca del lantanida en la molécula. Subsecuentemente a la absorción de luz por el cromóforo, la energía de excitación puede ser transferida desde el cromóforo excitado a la lantanida. Esto es seguido por una característica de emisión de florescencia de lantánido. El uso de una detección de tiempo-compuerta y de excitación pulsada, combinada con filtros de emisión de banda estrecha, permite una detección específica de la florescencia desde el quelato de lantánido solamente, rechazando la emisión de otras especies presentes en la muestra que son típicamente de vida más corta o tienen una emisión de longitud de onda más corta. Otra técnica resuelta con el tiempo para medir la florescencia está descrita en las patentes de los Estados Unidos de América Nos. 5,581,279 otorgada a Davidson y 5,637,509 otorgada Hemmila y otros, las cuales son incorporadas aquí en su totalidad por referencia a los mismas para todos los propósitos .
Sin importar la técnica usada para medir la florescencia, la cantidad absoluta del analito puede ser determinada mediante el comparar la señal de florescencia en la zona de detección 31 con la señal de florescencia en la zona de compensación 35, y opcionalmente con la señal fluorescente en la zona de calibración 32. Por ejemplo, como se indico arriba, la cantidad de analito puede ser determinada por la proporción de I_et/(Icai) (Icom)/ y convertir está proporción a una concentración de analito usando una curva de calibración previamente determinada.
Aún cuando varias incorporaciones de las configuraciones del dispositivo sean descrito anteriormente, deberá entenderse que un dispositivo de la presente invención puede generalmente tener cualquier configuración deseada y no requiere contener todos los componentes descritos arriba . Varias otras configuraciones del dispositivo, por ejemplo están descritas en las patentes de los Estados Unidos de América Nos . 5,395,754 otorgada a Lambotte y otros; 5,670,381 otorgada a Jou y otros y 6,194,220 otorgada a Malick y otros, las cuales son incorporadas aquí en su totalidad por referencia a las mismas para todos los propósitos . También pueden ser usados varios formatos de ensayo para la prueba respecto de la presencia o la ausencia de un analito usando el dispositivo de ensayo de la presente invención. Por ejemplo, en la incorporación descrita arriba, un "formato de emparedado" es utilizado. Otros ejemplos de tales ensayos de tipo de emparedado están descritos en las Patentes de los Estados Unidos de América Nos. 4,168,146 otorgada a Grubb y otros y 4,366,241 otorgada a Tom y otros, las cuales son incorporadas aquí en su totalidad por referencia a las mismas para todos los propósitos. Además, también pueden ser utilizados otros formatos tal como formatos "competitivos" .
Los ejemplos de los dispositivos de inmunoensayo competitivos están descritos en las patentes de los Estados Unidos de América Nos. 4,235,601 otorgada a Deutsch y otros, 4,442,204 otorgada a Liotta y 5,208,535 otorgada a Buechler y otros, las cuales son incorporadas aquí en su totalidad por referencia a las mismas para todos los propósitos.
El presente inventor ha descubierto que la presencia de una zona de compensación sobre un dispositivo de ensayo puede permitir la detección de un analito sobre rangos de concentración extendidos en una manera simple, eficiente y de costo efectivo. En particular, la zona de compensación puede compensar por las señales perdidas que pudieran de otra manera resultar de las limitaciones de las técnicas de detección óptica.
La presente invención puede ser entendida mejor con referencia a los siguientes ejemplos:
EJEMPLO 1
Las sondas de detección fluorescentes conjugadas fueron formadas en la siguiente manera. Las partículas de látex carboxilatadas fueron encapsuladas con quelatos de europio teniendo un tamaño de partícula de 0.20 micrómetros, una concentración de sólidos de 0.5%, y exhibiendo florescencia a una longitud de onda de emisión de 615 nanómetros cuando se excitaron a una longitud de onda de 370 nanómetros. Las partículas fueron obtenidas de Molecular Probes, Inc., y se designaron como "Eu-P.".
Inicialmente, 500 microlitros de las partículas fueron lavados una vez con un mililitro de un amortiguador de carbonato y dos veces con un amortiguador de ácido 2- [N-morfolino] etanosulfónico (MES) (pH:6.1,20 milimolares) usando un centrífugo. Las partículas lavadas fueron resuspendidas en 250 microlitros de MES. Después, 3 miligramos de carboliimida
(de Polysciences, Inc.) fueron disueltos en 250 microlitros de
MES y se agregaron a las partículas suspendidas . La mezcla se dejó reaccionar a la temperatura ambiente por 30 minutos sobre un agitador. Las partículas activadas fueron entonces lavadas dos veces con un amortiguador de borato (Polysciences, Inc.) y fueron suspendidas de nuevo en 250 microlitros de amortiguador de borato. Treinta microlitros de el anticuerpo monoclonal de proteína-C (CRP Mabl) (3.4 miligramos por mililitro, A#5811 de BiosPacific, Inc.) fueron entonces agregados a las suspensiones de partículas. La mezcla fue dejada reaccionar a la temperatura ambiente durante la noche sobre un agitador de extremo-sobre-extremo . Durante el periodo de reacción, las suspensiones fueron sónicadas-baño dos veces . Las partículas fueron entonces recolectadas e incubadas en 250 microlitros de 0.1 de etanolamina molar (Polysciences, Inc.) bajo agitación suave por 15 minutos. Las partículas fueron lavadas dos veces con amortiguador hepes (N- [2-hidroxietilo] piperazina-N' - (2-ácido etanosulfónico) (20 milimolar, pH: 7.2). Los conjugados lavados fueron suspendidos en un mililitro de amortiguador hepes y se almacenaron a 4°C. EJEMPLO 2
Las sondas de calibración fluorescentes conjugadas fueron formadas como se describió en el ejemplo 1 excepto porque el CRP Mabl fue reemplazado con IgG de anti cabra y conejo (Cat#41-RG15 de BiosPacific, Inc. Inc.,) o IgG de cabra anti conejo (Cat#41-GR30 de BiosPacific, Inc.). Las ondas de calibración fluorescentes conjugadas fueron designadas como "Eu-P 41-RG15" y "Eu-P 41-GR30", respectivamente.
EJEMPLO 3
La habilidad para formar un dispositivo de ensayo de flujo lateral con una zona de detección y una zona de compensación fue demostrada. Una membrana porosa de nitrocelulosa (HF 12002 de Millipore, Inc.) teniendo una longitud de aproximadamente de 30 centímetros fue laminada sobre tarjetas de soporte. El Goldline™ (una solución de polilisina obtenida de British Biocell Internacional) fue desvestida sobre la membrana para formar una zona de compensación. Además, un anticuerpo monoclonal para la proteína reactiva-C (CRP Mab2) (A#5804, disponible de BiosPacific, Inc., concentración de 1 miligramo por mililitro) fue inmovilizada sobre la membrana porosa para formar una zona de detección. Las muestras de membrana fueron entonces secadas por una hora a una temperatura de 37°C.
Una almohadilla conjugada fue preparada como se describió abajo. 250 microlitros de las partículas de detección fluorescentes conjugadas Eu-P CRP del ejemplo 1 (concentración de 2.5 miligramos por mililitro en amortiguador hepes) fueron mezclados con 375 microlitros de Tween 20 (2% disponible de Aldrich) y 375 microlitros de sucrosa en agua (10%) . La mezcla fue sónicada con baño por 20 minutos. La suspensión fue entonces cargada sobre una almohadilla conjugada de fibra de vidrio de 15 centímetros de largo (Millipore Co.). La almohadilla de fibra de vidrio fue entonces secada a 37°C por 2 horas .
Una almohadilla de muestra fue preparada mediante el cargar 900 microlitros de Tween 20 (0.5%) sobre una almohadilla de muestra de fibra de vidrio de 15 centímetros de largo (Millipore Co.), y después secando la almohadilla a 37°c por 2 horas. Una almohadilla de transmisión de celulosa
(Millipore Co.), la almohadilla de muestra, y la almohadilla conjugada fueron entonces laminadas sobre la membrana porosa.
La tarjeta completa laminada fue entonces cortada en dispositivos de ensayo de flujo lateral de 4 milímetros de ancho .
EJEMPLO 4
Fue demostrada la habilidad para detectar la presencia de un analito usando un dispositivo de ensayo de flujo lateral. Específicamente, once (11) de los dispositivos de ensayo preparados como se describió en el ejemplo 3 fueron probados. 55 microlitros de sangre humana diluida (diluida por 100 veces) fueron clavadas con once (11) concentraciones CRP diferentes, variando de desde 0,0.2, 0.5, 1,2,10,40,100,200,500 y 2000 nanogramos por mililitro y aplicados a almohadillas de muestra separadas. Los dispositivos se dejaron desarrollar por 30 minutos.
La fluorescencia para la zona de detección y la zona de calibración fue medida. Específicamente, al completarse el ensayo, cada dispositivo de flujo lateral fue montado sobre un soporte de muestra de un espectrofluorómetro Fluorolog III
(disponible de SA Instruments, Inc.) usando cinta. Las zonas de detección y compensación cada una ajustan en un orificio rectangular en el soporte de manera que el rayo de excitación brillará directamente sobre la zona mientras que el resto del dispositivo fue dejado bloqueado desde el rayo de excitación.
Las técnicas de fluorescencia resuelta con el tiempo fueron usadas. Específicamente, fueron usados los siguientes parámetros de experimento: (1) El ángulo del rayo de excitación a la superficie normal de los dispositivos fue de 70°C; el modo de detección fue cara frontal; el ancho de corte fue de 5 nanómetros; (4) el número de exploración fue 1; (5) la longitud de onda de excitación fue de 370 nanómetros; (6) la longitud de onda de emisión fue recolectada a 615 nanómetros; (7) la ventana de muestra fue de 3 milisegundos (ms) ; (8) el retraso inicial fue de 0.04 ms (9) el centelleo-por-tiempo fue de 50 ms; y (10) el número de centelleos fue 10.
La intensidad en la zona de detección para las concentraciones CRP de 0,0.2, 0.5, 1, 2, 10, 40, 100, 200, 500 y 2000 nanogramos por mililitro fue determinada como siendo de 10.4K, 12.4K, 14.7K, 15.8K, 27.0K, 61.7K, 99.1K, 145.8K, 190.4K, 214.5K, 206.0K respectivamente. La intensidad de la zona de compensación para las concentraciones CRP de 0,0.2, 0.5, 1, 2, 10, 40, 100, 200, 500 y 2000 nanogramos por mililitro fue determinada como siendo 280.9K, 216.3K, 165.0K, 187.5K, 170.0K, 123.7K, 65.4K, 56.0K, 8.2K, 3.9K, 2.3K respectivamente. La intensidad de la zona de detección inicialmente incrementada, pero nivelada a una concentración CRP de alrededor de 200 a 500 nanogramos por mililitro. La intensidad de la zona de compensación continúa disminuyendo aún a una concentración CRP tan alta como de 2000 nanogramos por mililitro. Por tanto, la proporción de la intensidad en la zona de detección a la intensidad en la zona de compensación presentará más exactamente la concentración CRP verdadera para concentraciones CRP superiores a alrededor de 200 nanogramos por mililitro.
EJEMPLO 5
La capacidad para formar un dispositivo de ensayo de flujo lateral con una zona de detección, una zona de calibración, y una zona de compensación fue demostrada. Una membrana porosa de nitrocelulosa (HF 12002 de Millipore, Inc.) teniendo una longitud de aproximadamente de 30 centímetros fue laminada sobre las tarjetas de soporte. El Goldline™ (una solución de polilisina obtenida de British Biocell Internacional) fue desvestida sobre la membrana para formar una zona de compensación. El anticuerpo monoclonal para la proteína reactiva-C (CRP Mab2) (A#5804, disponible de BiosPacific, Inc., concentración de 1 miligramo por mililitro) fue inmovilizada sobre la membrana porosa para formar una zona de detección. Además, el anticuerpo de antiprolactina de conejo (A#5804, disponible de BiosPacific, Inc., concentración de 1.8 miligramos por mililitro) fue inmovilizado entre la zona de detección y la zona de compensación sobre la membrana porosa para formar una zona de calibración. Las muestras de membrana fueron entonces secadas por una hora a una temperatura de 37°C.
250 microlitros de las partículas Eu-P CRP del ejemplo 1 (concentración de 2.5 miligramos por mililitro en amortiguador Hepes) y 100 microlitros de Eu-P GR30 (2.5 miligramos por mililitro en amortiguador Hepes) las partículas del ejemplo 2 fueron mezcladas con 300 microlitros de Tween 20 (2%, disponible de Aldrich) y 300 microlitros de sucrosa en agua (10%) . Las partículas Eu-P CRP fueron usadas como sondas de detección, mientras que las partículas Eu-P GR30 fueron usadas como sondas de calibración. La mezcla fue sonicada-baño por 20 minutos. La suspensión fue entonces cargada sobre una almohadilla conjugada de fibra de vidrio de 15 centímetros de largo (Millipore Co.). La almohadilla de fibra de vidrio fue entonces secada a 37°C por 2 horas.
Una almohadilla de muestra fue preparada mediante el cargar 900 microlitros de Tween 20 (0.5%) sobre una almohadilla de muestra de fibra de vidrio de 15 centímetros de largo (Millipore Co.) y después secando la almohadilla a 37°C por dos horas . Una almohadilla de transmisión de celulosa
(Millipore Co . ) , la almohadilla de muestra, y la almohadilla conjugada fueron entonces laminada sobre la membrana porosa. La tarjeta completa laminada fue entonces cortada en dispositivos de ensayo de flujo lateral de 4 milímetros de ancho.
EJEMPLO 6
Fue demostrada la capacidad para detectar la presencia de un analito usando el ensayo de flujo lateral. Específicamente, nueve (9) de los dispositivos de ensayo preparados como se describió en el ejemplo 5 fueron probados. 50 microlitros de amortiguador Hepes fueron clavados con nueve (9) diferentes concentraciones CRP, variando de 0, 5, 20, 100, 500, 1000, 2000 5000 y 10000 nanogramos por mililitro, y se aplicaron a las almohadillas de muestra separadas . Los dispositivos se dejaron desarrollar por 30 minutos.
La intensidad de florescencia de compuerta-tiempo fue medida como se describió en el ejemplo 4 con la excepción de que el tiempo de retraso fue de 0.04 milisegundos. La intensidad de la zona de detección para las concentraciones CRP de 0, 5, 20, 100, 500, 1000, 2000, 5000 y 10000 nanogramos por mililitro fue determinada como siendo 26.7K, 39.0K, 47.0K, 109K, 159K, 186K, 217K, 219K, 193K, respectivamente. La intensidad de la zona de calibración para las concentraciones CRP de 0, 5, 20, 100, 500, 1000, 2000, 5000 y 10000 nanogramos por mililitro fue determinado como siendo 96.6K, 136K, 101K, 119K, 103K, 88.7K, 86.8K, 88.1K, 87.9K, respectivamente. La intensidad en la zona de compensación para las concentraciones CRP de 0, 5, 20, 100, 500, 1000, 2000, 5000 y 10000 nanogramos por mililitro fue determinada como siendo 123K, 146K, 93.6K, 158K, 131K, 81.8K, 69.3K, 54.1K, 34.0K, respectivamente. Como se indico, la intensidad en la zona de detección inicialmente incrementada, pero entonces nivelada a una concentración CRP de alrededor de 2000 nanogramos por mililitro, mientras que la intensidad en la zona de compensación permaneció inicialmente permaneciendo constante antes de comenzar a disminuir a una concentración CRP de alrededor de 1000 nanogramos por mililitro. La intensidad de la zona de calibración permaneció relativamente constante. Por tanto, la proporción de la intensidad en la zona de detección a la intensidad en la zona de compensación calibrada por la intensidad en la zona de calibración, presentará más exactamente la verdadera concentración CRP para las concentraciones CRP de 2000 nanogramos por mililitro o superiores.
EJEMPLO 7
Fue demostrada la habilidad para formar un dispositivo de ensayo de flujo lateral medio con una zona de detección, una zona de calibración, y una zona de compensación. Una membrana porosa de nitrocelulosa (HF 12002 de Millipore, Inc.) teniendo una longitud de aproximadamente de 30 centímetros fue laminada sobre las tarjetas de soporte. El Goldline™ (una solución de polilisina obtenida de British Biocell Internacional) fue desvestida sobre la membrana para formar una zona de compensación. El anticuerpo monoclonal para la proteína reactiva -C (CRP Mab2) (A#5804 disponible de BiosPacific, Inc.), concentración de 1 miligramo por mililitro con una miligramo de trehalosa por mililitro) fue inmovilizada sobre la membrana porosa para formar una zona de detección. Además, el anticuerpo de antiprolactina de conejo (A#5804, disponible de BiosPacific; inc., concentración de 1.8 miligramos por mililitro) fue inmovilizado entre la zona de detección y la zona de compensación sobre la membrana porosa para formar una zona de calibración. Las muestras de membrana fueron entonces secadas por una hora a una temperatura de 37°C.
80 microlitros de partículas de oro conjugadas con cabra anti conejo IgG (tamaño de partícula de 10 nanómetros de Sigma) ("sondas de calibración") y 50 microlitros de partículas de oro conjugadas con CRP Mabl (tamaño de partícula de 40 nanómetros, de British Biocell Internacional) ("sondas de detección") fueron mezcladas con 280 microlitros de agua y 200 microlitros de sucrosa en agua (10%) . La suspensión fue entonces cargada sobre una almohadilla conjugada de fibra de vidrio de 10 centímetros de largo (Millipore Co . ) . La almohadilla de fibra de vidrio fue entonces secada a 37°C por 2 horas. Una almohadilla de muestra fue preparada mediante el cargar 300 microlitros de Tween 20 (0.5%) y 1200 microlitros de agua sobre una almohadilla de celulosa de 10 centímetros (Millipore Co.), y entonces seco la almohadilla a 37°C por dos horas. Una almohadilla de celulosa (Millipore Co.), la almohadilla de muestra y la almohadilla conjugada fueron entonces laminadas sobre la membrana porosa. La tarjeta completa laminada fue entonces cortada en dispositivos de ensayo de flujo lateral de 4 milímetros de ancho.
EJEMPLO 8
Fue demostrada la habilidad para detectar la presencia de un analito usando un dispositivo de ensayo de flujo lateral. Específicamente, diez (10) de los dispositivos de ensayo preparados como se describió en el ejemplo 7 fueron probados. 60 microlitros de amortiguador Hepes fueron clavados con diez (10) concentraciones CRP diferentes, variando de desde 0, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 y 2000 nanogramos por mililitro y se aplicaron a almohadillas de muestra separadas. Los dispositivos se dejaron desarrollar por 30 minutos.
La intensidad de reflectancia fue medida usando un lector de reflectancia. La intensidad de reflectancia en la zona de detección para las concentraciones CRP de 0, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 y 2000 nanogramos por mililitro fue determinado como siendo 0,0,0, 0.0498.0.0806, 0.4433, 1.418, 2.347, 2.407 y 2.402 respectivamente. La intensidad de reflectancia en la zona de calibración para las concentraciones CRP de 0, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 y 2000 nanogramos por mililitro fue determinada como siendo 1.072, 0.9650, 0.9752, 1.010, 0.9993, 0.8954, 1.030, 1.020, 1.035 y 1.070 respectivamente. La intensidad en la zona de compensación para las concentraciones CRP de 0, 5,10,20,50,100,200,500,1000 y 2000 nanogramos por mililitro fue determinada como siendo 1.414, 1.167, 1.345, 1.312, 1.045, 1.241, 1.331, 0.843, 0.6169 y 0.4608, respectivamente. Como se indicó, la intensidad de reflectancia en la zona de detección inicialmente incrementada, y después se nivelo a alrededor de una concentración CRP de alrededor de 500 nanogramos por mililitro, mientras que la intensidad en la zona de compensación inicialmente permaneció relativamente constante antes de comenzar a disminuir a una concertación CRP de alrededor de 2000 nanogramos por mililitro. La intensidad de la zona de calibración permaneció relativamente constante. Por tanto, la proporción de la intensidad de reflectancia en la zona de detección a la intensidad en la zona de compensación calibrada por la intensidad en la zona de calibración, presentará más exactamente la verdadera concentración CRP para concentraciones CRP de 500 nanogramos por mililitros superiores.
Aún cuando la invención se ha descrito en detalle con respecto a las incorporaciones específicas de la misma, se apreciará por aquellos experto en el arte, al obtener un entendimiento de lo anterior, que pueden concebirse fácilmente alteraciones, variaciones y equivalentes de estas incorporaciones. Por tanto, el alcance de la presente invención debe establecerse como aquél de las reivindicaciones anexas y cualesquier equivalentes de las mismas.
Claims (17)
1. Un método para detectar la presencia o cantidad de un analito que reside en la muestra de prueba, dicho método comprende : i) proporcionar un dispositivo de ensayo de flujo continuo que comprende una membrana porosa, dicha membrana porosa estando en comunicación con las sondas de detección y las sondas de calibración, dichas sondas de detección estando conjugadas con un miembro aglutinante específico para el analito, dicha membrana porosa define una zona de detección dentro de la cual está inmovilizado un primer reactivo de captura, una zona de compensación dentro de la cual está inmovilizado un segundo reactivo de captura, y una zona de calibración dentro de la cual un tercer reactivo de captura está inmovilizado, en donde dicha zona de compensación está localizada hacia debajo de la zona de detección; ii) poner en contacto a la muestra que contiene el analito con las sondas de detección conjugadas y las sondas de calibración; iii) medir una intensidad de señal de detección generada en la zona de detección, una intensidad de señal de compensación generada en dicha zona de compensación; y una intensidad de señal de calibración generada en la zona de calibración; iv) comparar la intensidad de dicha señal de detección con dicha señal de compensación, en donde la intensidad de dicha señal de compensación es inversamente proporcional a la intensidad de la señal de detección; y v) calibrar las intensidades comparadas de dicha señal de detección y de dicha señal de compensación con la intensidad de la señal de calibración, en donde la intensidad de la señal de calibración es esencialmente constante en relación a las intensidades de dicha señal de detección y de dicha señal de calibración.
2. Un método para detectar la presencia o la cantidad de un analito que reside en una muestra de prueba, dicho método comprende: i) proporcionar un dispositivo de ensayo de flujo continuo que comprende una membrana porosa, dicha membrana porosa estando en comunicación con unas sondas de detección óptica y las sondas de calibración óptica, dichas sondas de detección óptica estando conjugadas con un miembro de aglutinamiento específico para el analito, dicha membrana porosa define una zona de detección dentro de la cual está inmovilizado un primer reactivo de captura, una zona de compensación dentro de la cual está inmovilizado un segundo reactivo de captura, y una zona de calibración dentro de la cual está inmovilizado un tercer reactivo de captura, en donde dicha zona de compensación está localizada hacia debajo de dicha zona de detección; ii) poner en contacto una muestra de prueba que contiene el analito con dichas sondas de detección conjugadas ópticas y dichas sondas de calibración óptica; iii) medir ópticamente una intensidad de señal de detección generada en dicha zona de detección, una intensidad de señal de compensación generada en dicha zona de compensación y una intensidad de señal de calibración generada en dicha zona de calibración; iv) comparar la intensidad de dicha señal de detección con la señal de compensación, en donde la intensidad de dicha señal de compensación es inversamente proporcional a la intensidad de la zona de detección; y v) calibrar las intensidades comparadas de dicha señal de detección y de dicha señal de compensación con la intensidad de la señal de calibración en donde la intensidad de la señal de calibración está esencialmente constante en relación a las intensidades de la señal de detección y de la señal de calibración.
3. Un método tal y como se reivindica en la cláusulas 1 ó 2 caracterizado porque comprende excitar dichas sondas de detección conjugadas en la zona de detección y dicha zona de compensación, en donde dicha excitación hace que las sondas de detección conjugada se emitan dicha señal de detección y dicha señal de compensación.
4. Un método tal y como se reivindica en la cláusulas 1, 2 ó 3 caracterizado además porque comprende generar una curva de calibración mediante el dibujar la proporción de dicha señal de detección a dicha señal de compensación calibrada por la intensidad de la señal de calibración por una pluralidad de concentraciones de analito predeterminadas.
5. Un dispositivo de ensayo de flujo continúo para detectar la presencia o cantidad de un analito que reside en una muestra de prueba, dicho dispositivo de ensayo de flujo continuo comprende una membrana porosa, dicha membrana porosa estando en comunicación con las sondas de detección y las sondas de calibración, dichas sondas de detección estando conjugadas con un miembro aglutinante específico para el analito, dicha membrana porosa define: una zona de detección dentro de la cual está inmovilizado un primer reactivo de captura, dicho primer reactivo de captura está configurado para aglutinar por lo menos una parte de dichas sondas de detección conjugadas o complejos de las mismas para generar una señal de detección que tiene una intensidad; una zona de compensación localizada hacia abajo desde dicha zona de detección, en donde un segundo reactivo de captura está inmovilizado dentro de la zona de compensación, dicho segundo reactivo de captura está configurado para aglutinar a dichas sondas de detección conjugadas o complejos de las mismas que pasan a través de la zona de detección para generar la señal de compensación teniendo una intensidad, en donde la intensidad de dicha señal de compensación es inversamente proporcional a la intensidad de la señal de detección; y una zona de calibración dentro de la cual está inmovilizado un tercer reactivo de captura, dicho tercer reactivo de captura estando configurado para aglutinar a dichas sondas de calibración para generar una señal de calibración que es esencialmente constante en la intensidad en relación a las intensidades de dicha señal de detección y de dicha señal de compensación; en donde la cantidad del analito dentro de la muestra de prueba es proporcional a la proporción de dicha intensidad de señal de detección a dicha intensidad de señal de compensación, como se calibro por dicha intensidad de señal de calibración.
6. El dispositivo o método de ensayo de flujo continuo tal y como se reivindica en una o cualquiera de las cláusulas precedentes caracterizado porque dichas sondas de detección conjugadas comprenden una sustancia seleccionada del grupo que consiste de cromógenos, catalizadores, compuestos luminiscentes, compuestos radioactivos, etiquetas visuales, liposomas y combinaciones de los mismos .
7. El dispositivo o método de ensayo de flujo continúo tal y como se reivindica en una o cualquiera de las cláusulas precedentes caracterizado porque las sondas de detección conjugadas comprenden un compuesto luminiscente.
8. El dispositivo o método de ensayo de flujo continúo tal y como se reivindica en una o cualquiera de las cláusulas precedentes caracterizado porque dichas sondas de detección conjugadas comprenden una etiqueta visual.
9. El dispositivo o método de ensayo de flujo continúo tal y como se reivindica en una o cualquiera de las cláusulas precedentes caracterizado porque dicho miembro de aglutinamiento específico es seleccionado del grupo que consiste de antígenos, haptenos, aptámeros, anticuerpos primarios o secundarios, biotina y combinaciones de los mismos.
10. El dispositivo o método de ensayo de flujo continúo tal y como se reivindica en una o cualquiera de las cláusulas precedentes caracterizado porque dicho primer reactivo de captura es seleccionado del grupo que consiste de antígenos, haptenos, proteína A o G, neutravidina, avidina, estreptavidina, captavidina, anticuerpos primarios o secundarios, y complejos de los mismos.
11. El dispositivo o método de ensayo de flujo continúo tal y como se reivindica en una o cualquiera de las cláusulas precedentes caracterizado porque dicho segundo reactivo de captura es seleccionado del grupo que consiste de antígenos, haptenos, proteína A o G, neutravidina, avidina, estreptavidina, captavidina, anticuerpos primarios o secundarios y complejos de los mismos.
12. El dispositivo o método de ensayo de flujo continúo tal y como se reivindica en una o cualquiera de las cláusulas precedentes caracterizado porque dicho segundo reactivo de captura comprende un polielectrolito.
13. El dispositivo o método de ensayo de flujo continúo tal y como se reivindica en la cláusula 12 caracterizado porque dicho polielectrolito tiene una carga positiva neta.
14. El dispositivo o método de ensayo de flujo continúo tal y como se reivindica en la cláusula 13 caracterizado porque dicho polielectrolito es seleccionado del grupo que consiste de polilisina, polietilenimina, poliaminas epiclorohidrina-funcionalizadas o poliamidoaminas, cloruro de polidialildimetil-amonio, derivados de celulosa catiónicos y combinaciones de los mismos.
15. El dispositivo o método de ensayo de flujo continúo tal y como se reivindica en la cláusula 12 caracterizado porque dicho polielectrolito tiene una carga negativa neta.
16. El dispositivo o método de ensayo de flujo continúo tal y como se reivindica en una o cualquiera de las cláusulas precedentes caracterizado porque dicho tercer reactivo de captura comprende antígenos, haptenos, proteína A o G, neutravidina, avidina, estreptavidina, captavidina, anticuerpos primarios o secundarios o complejos de los mismos.
17. El dispositivo o método de ensayo de flujo continúo tal y como se reivindica en una o cualquiera de las cláusulas precedentes caracterizado porque el dispositivo de ensayo es un dispositivo de" ensayo de tipo de emparedado.
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US10719976 | 2003-11-21 |
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