MX2007013522A - Dispositivo de ensayo teniendo capacidades de deteccion dentro de la region de efecto de gancho. - Google Patents

Abstract

Se proporciona un dispositivo de ensayo de flujo lateral para detectar la presencia o cantidad de un analito dentro de una muestra de prueba. El dispositivo utiliza zonas multiples, una de las cuales sirve como un indicador de si el analito de prueba esta o no en la muestra de prueba dentro de la region de "efecto de gancho". Basado sobre esta indicacion, puede ser seleccionada una tecnica para correlacionar una intensidad de senal medida con una concentracion de analito o rango de concentraciones. Por ejemplo, cuando se determino que la muestra de prueba cae afuera de la region de "efecto de gancho" la concentracion de analito puede ser determinada usando una parte de una curva de respuesta de dosis. Por otro lado, cuando se de determino que la muestra de prueba cae dentro de la concentracion "efecto de gancho", la concentracion de analito puede ser determinada usando otra parte de la curva de repuesta de dosis. Alternativamente, la muestra puede simplemente ser diluida para volver a llevar a cabo el ensayo. El presente inventor ha descubierto que tal tecnica de deteccion puede simplemente, rapidamente y exactamente detectar un analito presente a cualquier concentracion.

Description

DISPOSITIVOS DE ENSAYO TENIENDO CAPACIDADES DE DETECCIÓN DENTRO DE LA REGIÓN DE EFECTO DE ANCHO Antecedentes de la Invención Varios procedimientos y dispositivos analíticos son comúnmente empleados en ensayos de flujo al través para determinar la presencia y/o la concentración de analitos que pueden estar presentes en una muestra de prueba. Por ejemplo, los inmunoensayos utilizan mecanismos de los sistemas inmunes, en donde los anticuerpos son producidos en respuesta a la presencia de antígenos que son patógenos o extraños a los organismos. Estos anticuerpos y antígenos, por ejemplo, inmunoreactivos, son capaces de unirse unos con otros, por ende ocasionando un mecanismo de reacción altamente específica que puede usarse para determinar la presencia o la concentración de ese particular antígeno en una muestra biológica.

Hay varios bien conocidos métodos de inmunoensayos que usan inmunoreactivos etiquetados con un componente detectable de tal forma que el analito puede detectarse analíticamente. Por ejemplo, los formatos de ensayo del "tipo de intercalado" típicamente involucran mezclado de la muestra de prueba con sondeo de detección conjugadas con un específico miembro de unión (por ejemplo anticuerpo) para el que el analíto forme complejos entre el analito y los sondeos conjugados. Estos complejos son entonces dejados contactar a un material receptivo (por ejemplo, anticuerpos) inmovilizados dentro de la zona de detección. El aglutinado ocurre entre los complejos conjugados de analito/sondeo y el material receptivo inmovilizado, por ende localizando los complejos "intercalados" que son detectables para indicar la presencia del analito. Esta técnica puede usarse para obtener resultados cuantitativos o semicuantitativos . Algunos ejemplos de tales ensayos del tipo de intercalado son descritos en las patentes de los Estados Unidos de América números 4,168,146 otorgada a Grubb y otros; y 4,366,241 otorgada a Tom y otros. Una técnica alternativa es el ensayo del "tipo competitivo". En un ensayo competitivo, la sonda etiquetada es generalmente conjugada con una molécula que es idéntica a, o un análogo de, el analito. Por tanto, la sonda etiquetada compete con el analito de interés del material disponible receptivo. Los ensayos competitivos son típicamente usados para la detección de analitos tales como haptenos, cada hapteno siendo monovalente y capaz de aglutinar solamente una molécula de anticuerpo. Ejemplos de dispositivos de inmunoensayo competitivos son descritos en las patentes de los Estados Unidos de América números 4,235,601 otorgada a Deutsch y otros; 4,442,204 otorgada a Liotta; y 5,208,535 otorgada a Buechler y otros.

A pesar de los beneficios logrados de estos dispositivos, muchos ensayos convencionales de flujo lateral encuentran significativas inexactitudes cuando se exponen a concentraciones relativamente altas de analitos. Por ejemplo, cuando el analito está presente a altas concentraciones, una parte sustancial del analito en la muestra de prueba puede dejarse en exceso y por tanto no formar complejos con las pruebas conjugadas. Por tanto, al alcanzar la zona de detección, el analito no complejo compete con el analito completado para sitios de aglutinado. Debido a que el analito no complejo no está etiquetado con una prueba, no puede detectarse. Consiguientemente, si un significativo número de sitios de aglutinado se ocupan por el analito sin complejo, el ensayo puede exhibir una "negativa falsa". Este problema es comúnmente referido como el "efecto de gancho" o "pro-zona".

Varias técnicas para reducir el "efecto de gancho" en inmunoensayos han sido propuestas. Por ejemplo, la patente de los Estados Unidos de América número 6,183,972 otorgada a Kuo y otros, describe una tira de un material poroso a través del cual un fluido de prueba sospechoso de contener al analito puede fluir por capilaridad. La tira tiene al menos dos distintas regiones de captura en las cuales anticuerpos inmovilizados específicos a un primer epítope del analito son inmovilizados. Los anticuerpos específicos a un segundo epítope del analito también son empleados que soportan una etiqueta detectable. Cuando está presente en concentraciones suficientes, el analito parcialmente bloquea el aglutinado del anticuerpo inmovilizado con el primer epítope del analito. Por tanto, un intercalado del anticuerpo inmovilizado, analito, y anticuerpo etiquetado es formado en las regiones de captura. La señal emitida del anticuerpo etiquetado en cada una de las distintas regiones de captura por tanto proporciona un patrón de señales que es único a la concentración del analito. El juego de señales es matemáticamente combinado para crear una curva de respuesta a la dosis monótona para el factor de bloqueo del aglutinante entre el anticuerpo inmovilizado y el primer epítope del analito.

Una necesidad aún existe, sin embargo, por una mejorada técnica para determinar la concentración del analito dentro de la región del "efecto de gancho" de una manera exacta, sin embargo sencilla y de costo efectivo.

Síntesis de la Invención De conformidad con una incorporación de la presente invención, un dispositivo de ensayo de flujo lateral es descrito para detectar la presencia o cantidad de un analito dentro de una muestra de prueba. El dispositivo de ensayo de flujo lateral comprende una membrana porosa en comunicación con pruebas de detección conjugadas. El analito es capaz de formar complejos con las pruebas de detección conjugadas. La membrana porosa define una zona de detección dentro de la cual un primer material receptivo es inmovilizado, el primer material receptivo está siendo configurado para de forma preferencial aglutinar al analito, sea complejo o no complejo con las pruebas de detección conjugadas. La membrana porosa también define una zona de indicador localizada hacia abajo de la zona de detección y dentro de la cual un segundo material receptivo es inmovilizado. El segundo material receptivo está configurado para de manera preferente aglutinar a pruebas de detección conjugadas de no complejo. La zona de detección y la zona de indicador son capaces de producir señales capaces de medirse.

La intensidad de la señal del indicador capaz de medirse es comparable a una referencia estándar para determinar si la concentración del analito dentro de la muestra de prueba está dentro de la región de efecto de gancho. La referencia estándar representa una intensidad o rango de intensidades de la señal del indicador en o cerca de una concentración de saturación del analito .

Es descrito un método para detectar cuantitativamente o semi-cuantitativamente un analito dentro de una muestra de prueba. El método comprende contactar la muestra de prueba con una membrana porosa de un dispositivo de flujo lateral. La membrana porosa está en comunicación con pruebas de detección conjugadas y además define una zona de detección y una zona de indicación localizada hacia abajo de la zona de detección. El método comprende medir la intensidad de una señal de detección producida en la zona de detección y la intensidad de una señal de indicación producida en la zona de indicación.

El método además comprende comparar la intensidad de la señal medida del indicador a una referencia estándar, la referencia estándar representa una intensidad o rango de intensidades de la señal del indicador en o cerca de una conocida concentración de saturación del analito.

Otras características y aspectos de la presente invención son descritos en mayor detalle abajo.

Breve Descripción de los Dibujos Una completa y autorizada descripción de la presente invención, incluyendo el mejor modo de la misma, dirigida a uno con habilidad ordinaria en el arte, es señalada más particularmente en el resto de la especificación, la cual hace referencia a las figuras que se adjuntan en las cuales: La Figura 1 es una vista en perspectiva de una incorporación de un dispositivo de ensayo de flujo lateral de la presente invención; La Figura 2 es una ilustración gráfica de la relación entre una concentración del analito y las intensidades de la señal de las zonas de detección y del indicador de conformidad con una incorporación de la presente invención; La Figura 3 es una ilustración esquemática del mecanismo usado para una incorporación de la presente invención antes del desempeño del ensayo; La Figura 4 ilustra la incorporación de la figura 3 después de completar el ensayo; La Figura 5 ilustra una incorporación de un método para determinar si una concentración de analito está dentro de la región de "efecto de gancho", y para determinar semi-cuantitativamente o cuantitativamente la concentración del analito; La Figura 6 es la curva de respuesta de dosis para el Ejemplo 4 en el cual la intensidad de la señal es tramada en contra de la concentración de proteína de reacción cruzada (CRP) ; La Figura 7 es la curva de respuesta de dosis para el Ejemplo 5 en el cual la intensidad de la señal es tramada en contra de la concentración de proteína de reacción cruzada (CRP) ; La Figura 8 es la curva de respuesta de dosis para el Ejemplo 6 en el cual la intensidad de la señal es tramada en contra de la concentración de proteína de reacción cruzada (CRP) ; La Figura 9 es la curva de respuesta de dosis para cada una de las concentraciones de partícula conjugada del Ejemplo 8 en el cual la intensidad (por ejemplo, la tasa Rann) producida por la zona de detección es tramada en contra de la concentración de proteína de reacción cruzada (CRP) ; La Figura 10 es la curva de respuesta de dosis para cada una de las concentraciones de partícula conjugada del Ejemplo 8 en el cual la intensidad (por ejemplo, la tasa Rann) producida por la zona del indicador es tramada en contra de la concentración de proteína de reacción cruzada (CRP) ; La Figura 11 es la curva de respuesta de dosis para el Ejemplo 9 en el cual la intensidad de la tasa Rann de la zona de detección y de la zona del indicador son tramadas en contra de la concentración CRP para el tamaño de la partícula de oro de 40 nanómetros, una densidad óptica conjugada de 1.0, una concentración de la línea del anticuerpo de 0.5 miligramos por mililitro, y una concentración de la línea CRP de 0.5 miligramos por mililitro; La Figura 12 es la curva de respuesta de dosis para el Ejemplo 9 en el cual la intensidad de la tasa Rann de la zona de detección y de la zona del indicador son tramadas en contra de la concentración de proteína de reacción cruzada (CRP) para el tamaño de la partícula de oro de 60 nanómetros, una densidad óptica conjugada de 1.0, una concentración de la línea del anticuerpo de 0.5 miligramos por mililitro, y una concentración de la línea de proteína de reacción cruzada (CRP) de 0.5 miligramos por mililitro; La Figura 13 es la curva de respuesta de dosis para el Ejemplo 9 en el cual la intensidad de la tasa Rann de la zona de detección y de la zona del indicador son tramadas en contra de la concentración de proteína de reacción cruzada (CRP) para el tamaño de la partícula de oro de 40 nanómetros, una densidad óptica conjugada de 1.0, una concentración de la línea del anticuerpo de 0.1 miligramos por mililitro, y una concentración de la línea de proteína de reacción cruzada (CRP) de 0.5 miligramos por mililitro; La Figura 14 es la curva de respuesta de dosis para el Ejemplo 9 en el cual la intensidad de la tasa Rann de la zona de detección y de la zona del indicador son tramadas en contra de la concentración de proteína de reacción cruzada (CRP) para el tamaño de la partícula de oro de 60 nanómetros, una densidad óptica conjugada de 1.0, una concentración de la línea del anticuerpo de 0.5 miligramos por mililitro, y una concentración de la línea de proteína de reacción cruzada (CRP) de 0.5 miligramos por mililitro; La Figura 15 es la curva de respuesta de dosis para el Ejemplo 9 en el cual la intensidad de la tasa Rann de la zona de detección y de la zona del indicador son tramadas en contra de la concentración de proteína de reacción cruzada (CRP) para el tamaño de la partícula de oro de 40 nanómetros, una densidad óptica conjugada de 2.5, una concentración de la línea del anticuerpo de 0.1 miligramos por mililitro, y una concentración de la línea de proteína de reacción cruzada (CRP) de 0.5 miligramos por mililitro; El repetido uso de caracteres de referencia en la presente especificación y dibujos es intencionado para presentar las mismas o análogas características o elementos de la invención.

Descripción Detallada de las Incorporaciones Representativas Definiciones Como se usa aquí, el término "analito" generalmente se refiere a una sustancia para detectarse. Por ejemplo, los analitos pueden incluir sustancias antigénicas, haptenos, anticuerpos, y combinaciones de los mismos. Los analitos incluyen, pero no están limitados a, toxinas, compuestos orgánicos, proteínas, péptidos, micro-organismos, aminoácidos, ácidos nucleicos, hormonas, esteroides, vitaminas, drogas (incluyendo aquellas administradas para propósitos terapéuticos, así como aquellas administradas para propósitos ilícitos), drogas intermediarias o derivados, bacterias, partículas de virus, almidones, hongos, protozoarios, y metabolitos de o anticuerpos de cualquiera de las anteriores sustancias. Los ejemplos específicos de algunos analitos incluyen ferritina; creatinina quinasa MB (CK-MB) ; digoxina; fenitoina; fenobarbitol; carbamazepina; vancomicina; gentamicina; teofilina; ácido valpróico; quinidina; hormona luteinizante (LH) ; hormona estimulante de folículo (FSH) ; estradiol, progesterona; proteína reactiva C; lipocalinas; anticuerpos IgE; citoquinas; vitamina B2 micro-globulina; hemoglobina glicatada (Gly. Hb) ; cortisol; digitoxina; N-acetilprocainamida (NAPA) ; procainamida; anticuerpos de rubéola, tal como rubéola IgG y rubéola IgM; anticuerpos de toxoplasmósis, tales como toxoplasmósis IgG (Toxo-IgG) y toxoplasmósis IgM (Toxo-IgM) ; testosterona; salicilatos; acetaminofeno; antígeno de superficie del virus de hepatitis B (HBsAg) ; anticuerpos de antígeno de núcleo de hepatitis B, tal como antígeno de núcleo anti-hepatitis B IgG e IgM (Anti-HBC) ; virus de inmunodeficiencia humana 1 y 2 (HIV 1 y 2); virus humana de leucemia de célula T 1 y 2 (HTLV) ; antígeno de hepatitis B e (HBeAg) ; antígeno de anticuerpos de hepatitis B e (Anti-HBe) ; virus de la influenza; hormona de estimulación de la tiroides (TSH); tiroxina (T4); triodotironina total (Total T3) ; triodotironina libre (Libre T3) ; antígeno carcinoembriónico (CEA) ; lipoproteínas, colesterol y triglicéridos; y alfa fetoproteína (AFP) . Las drogas de abuso y sustancias controladas incluyen, pero no son intencionadas para limitarse a, anfetaminas; metanfetaminas; barbitúricos tales como amobarbital, secobarbital, pentobarbital, fenobarbital, y barbital; benzodiazepinas, tales como librium y valium; canabinoides, tales como hashish y marihuana; cocaína; fentanil; LSD; metacualone; opiáceos, tales como heroína, morfina, codeína, hidromorfona, hidrocodona, metadona, oxicodona, oximorfona y opio; fenciclidina; y propoxiheno. Otros potenciales analitos pueden describirse en las patentes de los Estados Unidos de América números 6,436,651 otorgada a Everhart y otros, y la 4,366,241 otorgada a Tom y otros.

Como se usa aquí, el término "muestra de prueba" generalmente se refiere a un material biológico sospechoso de contener el analito. La muestra de prueba puede derivarse de una fuente biológica, tal como un fluido fisiológico, incluyendo, sangre, fluido intersticial, saliva, fluido del lente ocular, fluido espinal cerebral, sudor, orina, leche, fluido ascitis, mucosa, fluido sinovial, fluido peritoneo, fluido vaginal, fluido amniótico, esputo, semen, o similares. Además de los fluidos fisiológicos, otras muestras de líquido pueden usarse, tales como agua, productos alimenticios, etc., para el desempeño de ensayos de producción ambiental o de producción alimenticia. Además, un material sólido sospechoso de contener al analito también puede usarse como la muestra de prueba. La muestra de prueba puede usarse directamente como se obtiene de la fuente biológica o siguiendo un previo tratamiento para modificar el carácter de la muestra. Por ejemplo, tal previo tratamiento puede incluir preparar plasma de sangre, diluyendo fluidos viscosos, etc. Métodos para el previo tratamiento también pueden involucrar filtración, precipitación, diluido, destilación, mezclado, concentración, inactivado de componentes de interferencia, el añadido de reactivos, lixiviado, etc. Además, también puede beneficiarse para modificar una muestra de prueba sólida para formar un medio líquido o para liberar al analito.

Descripción Detallada Se hará ahora referencia en detalle a varias incorporaciones de la invención, uno o más ejemplos de los cuales son señalados abajo. Cada ejemplo es proporcionado a modo de explicación de la invención, no de limitación de la invención. De hecho, será aparente para aquellos con habilidad en el arte que varias modificaciones y variaciones pueden hacerse en la presente invención sin apartarse del alcance o del espíritu de la invención. Por ejemplo, características ilustradas o descritas como parte de una incorporación, pueden usarse sobre otra incorporación para producir aún otra incorporación. Por lo tanto, es la intención que la presente invención cubre tales modificaciones y variaciones como vienen dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas y de sus equivalencias .

En general, la presente invención está dirigida a un dispositivo de ensayo de flujo lateral para detectar la presencia de un analito dentro de una muestra de prueba. El dispositivo utiliza múltiples zonas, una de las cuales sirve como un indicador de si de todos modos el analito en la muestra de prueba está dentro de la región de "efecto de gancho". Con base en esta indicación, una técnica puede seleccionarse para correlacionar una intensidad de la señal medida a una concentración del analito o del rango de concentraciones. Por ejemplo, cuando se determina que la muestra de prueba cae fuera de la región del "efecto de gancho", la concentración del analito puede determinarse usando una parte de una curva de respuesta de dosis. Por otro lado, cuando se determina que la muestra de prueba cae dentro de la concentración del "efecto de gancho", la concentración del analito puede determinarse usando otra parte de la curva de respuesta a la dosis. Alternativamente, la muestra puede simplemente diluirse para volver a realizar el ensayo. Los actuales inventores han descubierto que tal técnica de detección puede simplemente, rápidamente, y acertadamente detectar un analito presente en cualquier concentración.

Con referencia a la Figura 1, por ejemplo, una incorporación de un dispositivo de ensayo de flujo lateral 20 que puede realizarse de conformidad con la presente invención será ahora descrita en mayor detalle. Como se muestra, el dispositivo 20 contiene una membrana porosa 23 opcionalmente soportada por un material rígido de soporte 21. En general, la membrana porosa 23 puede hacerse de cualquier variedad de materiales a través de los cuales la muestra de prueba es capaz de pasar. Por ejemplo, los materiales usados para formar la membrana porosa 23 pueden incluir, pero no limitarse a, materiales naturales, sintéticos, o que ocurren naturalmente que son modificados sintéticamente, tales como polisacáridos (por ejemplo, materiales de celulosa tales como derivados de papel y de celulosa, tales como acetato de celulosa y nitrocelulosa) ; sulfona de poliéter; polietileno; nylon; fluoruro de polivinilideno (PVDF) ; poliéster; polipropileno; sílice; materiales inorgánicos, tales como alumina desactivada, tierra diatomácea, MgS04, u otro material dividido finamente inorgánico uniformemente dispersado en una matriz de polímero poroso, con polímeros tales como cloruro vinilo, copolímero de propileno-cloruro vinilo, y copolímero acetato vinilo-cloruro-vinilo; tela, ambos que ocurren naturalmente (por ejemplo, algodón) y sintéticos (por ejemplo, nylon o rayón) ; geles porosos, tales como geles de sílice, agarosa, dextran, y gelatina; películas poliméricas, tales como poliacrilamida, etc. En una particular incorporación, la membrana porosa 23 está formada de nitrocelulosa y/o materiales de sulfona de poliéter. Deberá entenderse que el término "nitrocelulosa" se refiere a esteres de ácido nítrico de celulosa, que pueden ser nitrocelulosa sola, o una mezcla de éster de ácido nítrico y de otros ácidos, tales como ácidos carboxílicos alifáticos desde 1 a 7 átomos de carbón.

El tamaño y forma de la membrana porosa 23 puede generalmente variar como es prontamente reconocida por aquellos con habilidad en el arte. Por ejemplo, una tira de membrana porosa puede tener una longitud desde alrededor de 10 a alrededor de 100 milímetros, en algunas incorporaciones desde alrededor de 20 a alrededor de 80 milímetros, y en algunas incorporaciones, desde alrededor de 40 a alrededor de 60 milímetros. El ancho de la tira de la membrana también puede estar en el rango desde alrededor de 0.5 a alrededor de 20 milímetros, en algunas incorporaciones desde alrededor de 1 a alrededor de 15 milímetros, y en algunas incorporaciones, desde alrededor de 2 a alrededor de 10 milímetros. Igualmente, el grosor de la tira de la membrana es generalmente pequeño suficiente para permitir la detección con base en la transmisión. Por ejemplo, la tira de la membrana puede tener un grosor de menos de alrededor de 500 micrómetros, en algunas incorporaciones de menos de alrededor de 250 micrómetros, y en algunas incorporaciones, de menos de alrededor de 150 micrómetros .

Como se señala arriba, el soporte 21 lleva a la membrana porosa 23. Por ejemplo, el soporte 21 puede colocarse directamente adyacente a la membrana porosa 23 como se muestra en la Figura 1, o una o más capa de intervención pueden colocarse entre la membrana porosa 23 y el soporte 21. Sin importar, el soporte 21 puede generalmente formarse de cualquier material capaz de llevar a la membrana porosa 23. El soporte 21 puede formarse de un material que es transmisible a la luz, tal como materiales transparentes o difusos de forma óptica (por ejemplo translúcidos). También, es generalmente deseado que el soporte 21 sea impermeable al líquido de tal forma que el fluido que fluye a través de la membrana 23 no se filtra a través del soporte 21. Ejemplos de adecuados materiales para el soporte incluyen, pero no están limitados a, vidrio, materiales poliméricos, tales como poliestireno, polipropileno, poliéster (por ejemplo, película de Mylar®) , polibutadieno, polivinilcloruro, poliamida, policarbonato, epóxidos, metacrilatos, y polimelamina, etc. Para proporcionar un respaldo suficientemente estructural para la membrana porosa 23, el soporte 21 es generalmente seleccionado de tener un cierto grosor mínimo. Igualmente, el grosor del soporte 21 es típicamente no tan grande como para contrariamente afectar sus propiedades ópticas. Por tanto, por ejemplo, el soporte 21 puede tener un grosor que está en el rango desde alrededor de 100 a alrededor de 5,000 micrómetros, en algunas incorporaciones desde alrededor de 150 a alrededor de 2,000 micrómetros, y en algunas incorporaciones, desde alrededor de 250 a alrededor de 1,000 micrómetros. Por ejemplo, una adecuada tira de la membrana que tiene un grosor de alrededor de 125 micrómetros puede obtenerse de Millipore Corp., de Bedford, Massachussets, bajo el nombre de "SHF 180UB25".

Como es bien conocido en el arte, la membrana porosa 23 puede moldearse en el soporte 21, en donde el laminado resultante puede cortarse por matriz a un deseado tamaño y forma. Alternativamente, la membrana porosa 23 puede simplemente laminarse al soporte 21 con, por ejemplo, un adhesivo. En algunas incorporaciones, una membrana porosa de nitrocelulosa o de nylon es adherida a una película de Mylar®.

Un adhesivo es usado para unir la membrana porosa a la película de Mylar®, tal como un adhesivo sensible a la presión. Las estructuras laminadas de este tipo se cree que son comercialmente disponibles de Millipore Corp., de Bedford, Massachussets. Aún otros ejemplos de adecuadas estructuras laminadas de dispositivo de ensayo son descritos en la patente de los Estados Unidos de América número 5,075,077 otorgada a Durley III y otros, la cual es incorporada aquí en su totalidad por referencia a la misma para todos los propósitos.

El dispositivo 20 también puede contener una almohadilla absorbente 28. La almohadilla absorbente 28 generalmente recibe el fluido que ha migrado a través de toda la membrana porosa 23. Como es bien conocido en el arte, la almohadilla absorbente 28 puede asistir en promover acción capilar y flujo capilar a través de la membrana 23.

Para inicia la detección de un analito dentro de la muestra de prueba, un usuario puede directamente aplicar la muestra de prueba a una parte de la membrana porosa 23 a través de la cual puede desplazarse en la dirección ilustrada por la flecha "L" en la Figura 1. Alternativamente, la muestra de prueba puede primero aplicarse a una almohadilla de muestra (no mostrada) que está en comunicación de fluido con la membrana porosa 23. Algunos adecuados materiales que pueden usarse para formar la almohadilla de muestra incluyen, pero no están limitados a, nitrocelulosa, celulosa, almohadillas de polietileno poroso, y papel de filtro de fibra de vidrio. Si se desea, la almohadilla de muestra puede también contener uno o más reactivos de previo tratamiento del ensayo, ya sea unidos de manera difusa o no difusa a la misma.

En la incorporación ilustrada, la muestra de prueba se desplaza desde la almohadilla de muestra (no mostrada) a una almohadilla conjugada 22 que está colocada en comunicación con un extremo de la almohadilla de muestra. La almohadilla conjugada 22 está formada de un material a través del cual la muestra de prueba es capaz de pasar. Por ejemplo, en una incorporación, la almohadilla conjugada 22 está formada de fibras de vidrio. Aún cuando solamente una almohadilla conjugada 22 es mostrada, deberá entenderse que múltiples almohadillas conjugadas también pueden usarse en la presente invención.

Para facilitar la detección precisa de la presencia o ausencia de un analito dentro de la muestra de prueba, una cantidad predeterminada de pruebas de detección son aplicadas a varias ubicaciones del dispositivo 20. Cualquier sustancia generalmente capaz de producir una señal que es detectable visualmente o por un dispositivo instrumental puede usarse como pruebas de detección. Adecuadas sustancias detectables pueden incluir, por ejemplo, compuestos luminiscentes (por ejemplo, fluorescentes, fosforescentes, etc.); compuestos radioactivos; compuestos visuales (por ejemplo, tintes coloreados o sustancias metálicas, tales como oro) ; liposomas u otras vesículas que contienen sustancias que producen señales; enzimas y/o sustratos, etc. Otras adecuadas sustancias detectables pueden describirse en las patentes de los Estados Unidos de América números 5,670,381 otorgada a Jou y otros; y 5,252,459 otorgada a Tarcha y otros, las cuales son incorporadas aquí en su totalidad por referencia a la misma para todos los propósitos. Si la sustancia detectable es coloreada, la radiación ideal electromagnética es luz de una onda de longitud complementaria. Por ejemplo, pruebas de detección azul fuertemente absorben la luz roja.

En algunas incorporaciones, la sustancia detectable puede ser un compuesto luminiscente que produce una señal detectable de forma óptica. Por ejemplo, adecuadas moléculas fluorescentes pueden incluir, pero no están limitadas a, fluoresceína, quelatos de europio, ficobiliproteína, rodamina, y sus derivados y análogos. Otros adecuados compuestos fluorescentes son nanocristales semiconductores comúnmente referidos como "puntos quantum". Por ejemplo, tales nanocristales pueden contener un núcleo de la fórmula CdX, en donde X es selenio (Se), telurio (Te), azufre (S) , etc. Los nanocristales pueden también ser pasivos con una capa sobrepuesta de la fórmula YZ, en donde Y es cadmio (Cd) ó zinc (Zn) , y Z es azufre (S) ó selenio (Se) . Otros ejemplos de adecuados nanocristales semiconductores pueden también describirse en las patentes de los Estados Unidos de América números 6,261,779 otorgada a Barbera-Guillem y otros; y 6,585,939 otorgada a Dapprich, las cuales son incorporadas aquí en su totalidad por referencia a la misma para todos los propósitos .

Además, adecuados compuestos fosforescentes pueden incluir complejos de metal de uno o más metales, tales como rutenio, osmio, renio, iridio, rodio, platino, indio, paladio, molibdeno, tecnecio, cobre, hierro, cromo, tungsteno, zinc, etc. Especialmente preferibles son el rutenio, renio, osmio, platino, y paladio. El complejo de metal puede contener uno o más ligaduras que facilitan la solubilidad del complejo en un ambiente acuoso o no acuoso. Por ejemplo, algunos adecuados ejemplos de ligaduras incluyen, pero no están limitados a, piridina; pirazina; isonicotinamida; imidazol; bipiridina; terpiridina; fenantrolina; dipiridofenazina; porfirina; porfina; y derivados de los mismos. Tales ligaduras pueden ser, por ejemplo, sustituidas con alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, aralquilo, aralquilo sustituido, carboxilato, carboxaldehido, carboxamida, ciano, amino, hidroxi, imino, hidroxicarbonilo, aminocarbonilo, amidina, guanidio, ureida, grupos que contienen sulfuro, grupos que contienen fósforo, y el éster carboxilato de N-hidroxisuccinimida .

Las porfirinas y los complejos de metal porfina poseen grupos pirrol acoplados juntos con puentes de metileno para formar estructuras cíclicas con cavidades interiores de quelación de metal. Muchas de estas moléculas exhiben fuertes propiedades fosforescentes a temperatura ambiente en adecuados solventes (por ejemplo, agua) y un ambiente libre de oxígeno. Algunos adecuados complejos porfirina que son capaces de exhibir propiedades fosforescentes incluyen, pero no están limitados a, platino (II) coproporfirina-I y III, paladio (II) coproporfirina, rutenio coproporfirina, zinc (II)-coproporfirina-I, derivados de los mismos, etc. Igualmente, algunos adecuados complejos de porfina que son capaces de exhibir propiedades fosforescentes incluyen, pero no están limitados a, platino (II) tetra-meso-fluorofenilporfina y paladio (II) tetra-meso-fluorofenilporfina . Aún otros adecuados complejos de porfirina y/o porfina son descritos en las patentes de los Estados Unidos de América números 4,614,723 otorgada a Schmidt y otros; 5,464,741 otorgada a Hendrix; 5,518,883 otorgada a Soini; 5,922,537 otorgada a Ewart y otros; 6,004,530 otorgada a Sagner y otros; y 6,582,930 otorgada a Ponomarev y otros, las cuales son incorporadas aquí en su totalidad por referencia a la misma para todos los propósitos.

Los complejos de metal bipiridina también pueden utilizarse como compuestos fosforescentes. Algunos ejemplos de adecuados complejos bipiridina incluyen, pero no están limitados a, bis [ (4 , 4' -carbometoxi) -2, 2 ' -bipiridina] 2- [3- (4-metil-2, 2' -bipiridina-4-yl) propil] -1, 3-dioxolan rutenio (II); bis (2, 2' bipiridina) [4- (butan-1-al) -4 ' -metil-2, 2' -bi-piridina] rutenio (II); bis (2, 2' bipiridina) [4- (4'metil-2, 2 ' -bipiridina-4' -yl) -ácido butírico] rutenio (II); tris (2, 2' bipiridina) rutenio (II) ; (2,2' -bipiridina) [bis-bis (1, 2-difenilfosfino) etileno] 2- [3- (4 -metil-2, 2' -bipiridina-4 ' yl) propilo] -1, 3-dioxolano osmio (II) ; bis (2, 2' -bipiridina) [4- (4 ' -metil-2, 2' -bipiridina) -butilamina] rutenio (II); bis (2, 2' -bipiridina) [l-bromo- (4' -metil-2, 2' -bipiridina-4-yl) butano] rutenio (II); bis(2,2'-bipiridina) maleimidohexanoico ácido, 4-metil-2, 2 ' -bipiridina-4'butilamida rutenio (II), etc. Aún otros adecuados complejos de metal que pueden exhibir propiedades fosforescentes pueden describirse en las patentes de los Estados Unidos de América números 6,613,583 otorgada a Richter y otros; 6,468,741, otorgada a Massey y otros; 6,444,423 otorgada a Meade y otros; 6,362,011 otorgada a Massey y otros; 5,731,147 otorgada a Bard y otros; y 5,591,581 otorgada a Massey y otros, las cuales son incorporadas aquí en su totalidad por referencia a la misma para todos los propósitos.

En algunos casos, los compuestos luminiscentes pueden tener una vida de emisión relativamente larga y pueden tener un relativamente largo "eje de Stokes". El término "eje de Stokes" es generalmente definido como el desplazamiento de líneas o bandas espectrales de radiación luminiscente a una más larga emisión de longitud de onda que las líneas o bandas de excitación. Un relativamente largo eje de Stokes permite a la excitación de la longitud de onda de un compuesto luminiscente para permanecer aparte de sus longitudes de onda de emisión y es deseable debido a la gran diferencia que entre las longitudes de onda de excitación y de emisión hacen más fácil el eliminar la radiación de excitación reflejada de la señal emitida. Además, más largo eje de Stokes también minimiza la interferencia de las moléculas luminiscentes en la muestra y/o el esparcido de luz debido a las proteínas o coloides, que están presentes con algunos fluidos del cuerpo (por ejemplo, sangre) . Además, un más largo eje de Stokes también minimiza el requerimiento de filtros de alta precisión, más caros, para eliminar la interferencia de fondo. Por ejemplo, en algunas incorporaciones, los compuestos luminiscentes tienen un eje de Stokes de más de alrededor de 50 nanómetros, en algunas incorporaciones de más de alrededor de 100 nanómetros, y en algunas incorporaciones, desde alrededor de 100 a alrededor de 350 nanómetros.

Por ejemplo, ejemplares compuestos fluorescentes que tienen un más largo eje de Stokes incluyen a quelatos lantanida de samario (Sm (III)), disprosio (Dy (III)), europio (Eu (III)), y terbio (Tb (III)). Tales quelatos pueden exhibir emisiones de larga vida, de banda angosta, fuertemente cambiados en rojo después de la excitación del quelato a sustancialmente más cortas longitudes de onda. Típicamente, el quelato posee una banda de fuerte excitación ultravioleta debido a un cromóforo localizado cerca del lantánido en la molécula. Subsiguientemente a la excitación por el cromóforo, la energía de excitación puede transferirse del excitado cromóforo al lantánido. Esto es seguido por una emisión fluorescente característica del lantánido. Los quelatos de europio, por ejemplo, tienen ejes Stokes de alrededor de 250 a alrededor de 350 nanómetros, en comparación a solamente alrededor de 28 nanómetros para la fluoresceína. También la fluorescencia de los quelatos de europio son de larga vida, con tiempos de vida de alrededor de 100 a alrededor de 1000 micro-segundos, en comparación a alrededor de 1 a alrededor de 100 nanosegundos para otras etiquetas fluorescentes. Además, estos quelatos tienen unos espectros de emisión angostos, típicamente que tienen bandas anchas de menos de alrededor de 10 nanómetros a alrededor de 50% de emisión. Un adecuado quelato de europio es el N- (p-isotiocianatobencilo) -dietileno triamina tetraacético ácido-europio"1"3 (Eu) .

Además, los quelatos de lantánido que son inertes, estables, e intrínsecamente fluorescentes en soluciones o suspensiones acuosas también pueden usarse en la presente invención para negar la necesidad por reactivos de formación de micelas, que son con frecuencia usados para proteger los quelatos que tienen limitada solubilidad y problemas de templado en soluciones o suspensiones acuosas. Un ejemplo de tal quelato es 4- [2- (4-isotiocianatofenilo) etinilo] -2, 6-bis ( [carboximetil) amino] metilo) -piridino [Referencia: Lovgren, T., y otros; Clin. Chem., 42, 1196-1201(1996)]. Varios quelatos de lantánido también muestran excepcionalmente altas proporciones de señal a ruido. Por ejemplo, uno de tales quelatos es un quelato tetradentato ß-dicetonato-europio [Ref: Yuan, J. y Matsumoto, K. ; Anal. Chem., 70,596-601 (1998)]. Además de las etiquetas fluorescentes descritas arriba, otras etiquetas que son adecuadas para usar en la presente invención pueden describirse en las patentes de los Estados Unidos de América números 6,030,840 otorgada a Mullinax y otros; 5,585,279 otorgada a Davidson; 5,573,909 otorgada a Singer y otros; 6,242,268 otorgada a Wieder y otros; y 5,637,509 otorgada a Hemmila y otros, las cuales son incorporadas aquí en su totalidad por referencia a la misma para todos los propósitos.

Sustancias detectables, tales como son descritas arriba, pueden usarse solas o en conjunto con una partícula (algunas veces referidas como "gotas" o "micro-gotas") . Por ejemplo, partículas que ocurren naturalmente, tales como núcleos, micoplasma, plásmidos, plástidos, células mamíferas (por ejemplo, eritrocitos fantasmas) , microorganismos unicelulares (por ejemplo bacterias) , polisacáridos (por ejemplo, agarosa), etc., pueden usarse. Además, partículas sintéticas también pueden utilizarse. Por ejemplo, en una incorporación, micro-partículas de látex que son etiquetadas con tintes fluorescentes o de color son utilizadas. Aún cuando cualquier partícula sintética puede usarse en la presente invención, las partículas son típicamente formadas de poliestireno, estírenos butadieno, terpolímero estirenoacrílico-vinilo, polimetilmetacrilato, polietilmetacrilato, estireno-maléico anhídrido copolímero, polivinilo acetato, polivinilpiridino, polidivinilbenceno, polibutilenotereftalato, acrilonitrilo, vinilcloruro-acrilatos, etc., o un aldehido, carboxilo, amino, hidroxilo. O derivados de hidrazida de los mismos. Otras adecuadas partículas pueden describirse en las patentes de los Estados Unidos de América números 5,670,381 otorgada a Jou y otros; 5,252,459 otorgada a Tarcha y otros; y la publicación de patente de los Estados Unidos de América número 2003/0139886 otorgada a Bodzin y otros, las cuales son incorporadas aquí en su totalidad por referencia a la misma para todos los propósitos. Ejemplos comercialmente disponibles de adecuadas partículas fluorescentes incluyen a micro-esferas carboxilatadas fluorescentes vendidas por Molecular Probes, Inc., bajo los nombres de marca de "FluoSphere" (Rojo 580/605) y "TransfluoSphere" (543/620), así como "Rojo Texas" y 5- 6-carboxitetrametilrodamina, que son también vendidos por Molecular Probes, Inc. Además, ejemplos comercialmente disponibles de adecuadas micro-partículas de látex coloreadas, incluyen a gotas de látex carboxilatado vendido por Bang's Laboratory, Inc. Partículas metálicas (por ejemplo, partículas de oro) también pueden utilizarse en la presente invención.

Cuando se utiliza, la forma de las partículas puede generalmente variar. En una particular incorporación, por ejemplo, las partículas son de forma esférica. Sin embargo, deberá entenderse que otras formas son también contempladas por la presente invención, tales como placas, varillas, discos, barras, tubos, formas irregulares, etc. Además, el tamaño de las partículas también puede variar. Por ejemplo, el tamaño promedio (por ejemplo, diámetro) de las partículas puede estar en el rango desde alrededor de 0.1 nanómetros a alrededor 100 mieras, en algunas incorporaciones, desde alrededor de 1 nanómetro a alrededor de 10 mieras, y en algunas incorporaciones, desde alrededor de 10 a alrededor de 100 nanómetros .

En algunas instancias, puede ser deseable el modificar las pruebas de detección de alguna manera de tal forma que son más prontamente capaces de unir al analito. En tales instancias, las pruebas de detección pueden modificarse con ciertos miembros específicos de unión que son adheridos a las mismas para formar pruebas conjugadas. Específicos miembros de unión generalmente se refieren a un miembro de un específico par de unión, por ejemplo, dos diferentes moléculas donde una de las moléculas químicamente y/o físicamente se une a la segunda molécula. Por ejemplo, miembros de unión específicos inmunoreactivos pueden incluir a antígenos, haptenos, aptámeros, anticuerpos (primarios o secundarios) , y complejos de los mismos, incluyendo aquellos formados por métodos de recombinación del ADN o síntesis péptido. Un anticuerpo puede ser un anticuerpo mono-clonal o poli-clonal, una proteína de recombinación o una mezcla o fragmentos de los mismos, así como una mezcla de un anticuerpo y de otros específicos miembros de unión. Los detalles de la preparación de tales anticuerpos y sus adecuaciones para uso como específicos miembros de unión son bien conocidos para aquellos con habilidad en el arte. Otros comunes específicos pares de unión incluyen pero no están limitados a, biotina y avidina (o derivados de los mismos) , biotina y la estreptavidina, carbohidratos y lectinas, secuencias complementarias de nucleótidos (incluyendo secuencias de prueba y captura de ácido nucleico usados en ensayos de hibridización del ADN para detectar una secuencia de ácido nucleico objetivo), complementarias secuencias de péptido incluyendo aquellas formadas por métodos de recombinación, moléculas de efecto y recepción, hormona y proteína de unión de hormona, cofactores de enzima y enzimas, inhibidores de enzima, y enzimas, etc. Además, específicos pares de unión pueden incluir a miembros que son análogos del original miembro de unión específico. Por ejemplo, un derivado o fragmento del analito (por ejemplo, "análogo") puede usarse en tanto que tiene al menos un epítope en común con el analito.

Los específicos miembros de unión pueden generalmente unirse a las pruebas de detección usando cualquiera de una variedad de técnicas bien conocidas. Por ejemplo, unión covalente de específicos miembros de unión a las pruebas de detección (por ejemplo, partículas) puede lograrse usando carboxílico, amino, aldehido, bromoacetilo, yodo- acetilo, tiol, epoxi y otro reactivo o grupo funcional de enlace, así como radicales libres residuales y cationes radicales, a través de los cuales una reacción de acoplado de proteína puede lograrse. Un grupo funcional de superficie también puede incorporarse como un comonómero funcional debido a que la superficie de la prueba de detección puede contener una relativamente alta concentración de superficie de grupos polares. Además, aún cuando las pruebas de detección son con frecuencia funcionales después de la síntesis, tales como con poli (tiofenol) , las pruebas de detección pueden ser capaces de dirigir enlazado covalente con una proteína sin necesidad de ulterior modificación. Por ejemplo, en una incorporación, el primer paso de la conjugación es la activación de los grupos carboxílicos sobre la superficie de prueba usando carbodiimida. En el segundo paso, los grupos de ácido carboxílico activados son reactivados con un grupo amino de un anticuerpo para formar una unión amida. El acoplado de la activación y/o del anticuerpo puede ocurrir en un amortiguador, tal como un salino amortiguado con fosfato (PBS) (por ejemplo, pH de 7.2 ) ó 2- (N-morfolino) etano ácido sulfónico (MES) (por ejemplo, pH de 5.3). Las pruebas resultantes de detección pueden entonces contactarse con etanolamina, por ejemplo, para bloquear cualesquiera sitios restantes activados. Sobre todo, este proceso forma una prueba de detección conjugada, donde el anticuerpo es unido de forma covalente a la prueba. Además de la unión covalente, otras técnicas de unión, tales como adsorción física, también pueden utilizarse en la presente invención.

Con referencia de nuevo a la Figura 1, la membrana porosa 23 define varias zonas configuradas para realizar el ensayo. Por ejemplo, la membrana porosa 23 define una zona de detección 31 que contiene un primer material receptivo. El primer material receptivo es inmovilizado sobre la membrana porosa 23 y puede seleccionarse de los mismos materiales como los miembros específicos de unión descritos arriba, incluyendo, por ejemplo, antígenos; haptenos; proteínas de unión de anticuerpos, tales como la proteína A, proteína G, o la proteína A/G; neutravidina (un derivado de la avidina deglicosilatada) , avidina (una glicoproteína altamente catiónica de 66,000 daltons), estreptavidina (una proteína no glicosilatada de 52,800 daltons), o captavidina (un derivado de avidina nitrada) ; primarios o secundarios anticuerpos, y derivados o fragmentos de los mismos. En una incorporación, por ejemplo, el primer material receptivo es un anticuerpo específico a un antígeno dentro de la muestra de prueba. El primer material receptivo sirve como un sitio estacionario de unión para complejos formados entre el analito y las pruebas de detección conjugadas. Específicamente, los analitos, tales como anticuerpos, antígenos, etc., típicamente tienen dos o más sitios de unión (por ejemplo, epítopes) . Al alcanzar la zona de detección 31, uno de estos sitios de unión es ocupado por el específico miembro de unión de la prueba conjugada. Sin embargo, el sitio libre de unión del analito puede unirse al primer material receptivo inmovilizado. Al ser unido al material receptivo inmovilizado las pruebas complejas forman un nuevo complejo ternario intercalado.

El dispositivo de ensayo 20 también contiene una zona de indicador 35 que está colocada hacia abajo de la zona de detección 31. La zona de detección 35 contiene un segundo material receptivo que es inmovilizado sobre la membrana porosa 23. El segundo material receptivo sirve como un sitio estacionario de unión para las pruebas de detección conjugadas. Para lograr la deseada unión dentro de la zona del indicador 35, es generalmente deseado que el segundo material receptivo sea capaz de diferenciar entre aquellas pruebas de detección que son complejas con el analito y aquellas que no permanecen complejas. Por ejemplo, en una incorporación, el segundo material receptivo incluye una molécula que tiene al menos un epítope en común con el analito, tal como moléculas de analito, o derivados o fragmentos (por ejemplo, análogo) del mismo, de tal forma que es capaz de específicamente unirlo a un anticuerpo conjugado cuando no es complejo con el analito.

Alternativamente, el segundo material receptivo puede incluir un material biológico que no es una molécula de analito o análogo del mismo, pero sin embargo es capaz de preferentemente unir a pruebas de detección conjugadas no complejas. En una incorporación, por ejemplo, el primer material receptivo puede ser un anticuerpo monoclonal, tal como una anti-proteína de reacción cruzada (CRP) IgGi. Las pruebas de detección son conjugadas con un anticuerpo monoclonal diferente al anticuerpo monoclonal del primer material receptivo, tal como un anti- de proteína de reacción cruzada (CRP) IgG2. En esta particular incorporación, el segundo material receptivo puede ser un anticuerpo secundario, tal como Cabra anti-humano, IgG F(ab')2/ el cual ha sido adsorbido en contra de fragmentos Fc y por tanto reacciona solamente con la parte fab del IgG. Por tanto, cuando ningún analito está presente, el anticuerpo secundario es capaz de unir al dominio de unión libre "Fab" de la anti-proteína de reacción cruzada (CRP) IgG2 anticuerpo monoclonal. Sin embargo, cuando un antígeno está presente en la muestra de prueba, primero se hace complejo con el dominio de unión "Fab" de la anti-proteína de reacción cruzada (CRP) IgG2 anticuerpo monoclonal. La presencia del antígeno hace al dominio de unión "Fab" incapaz para subsiguiente unión con el anticuerpo secundario. De esta manera, el anticuerpo secundario dentro de la zona del indicador 35 es capaz de manera preferencial unir a pruebas de detección sin complejos.

Aún cuando la zona de detección 31 y la zona del indicador 35 proporcionan resultados exactos, es algunas veces difícil el determinar la concentración relativa del analito dentro de la muestra de prueba bajo actuales condiciones de prueba. Por lo tanto, el dispositivo de ensayo 20 también puede incluir una zona de calibración 32. En esta incorporación, la zona de calibración 32 está formada sobre la membrana porosa 23 y está colocada hacia abajo desde la zona de detección 31 y la zona del indicador 35. Alternativamente, sin embargo, la zona de calibración 32 puede también colocarse hacia arriba desde la zona de detección 31 y/o la zona del indicador 35.

La zona de calibración 32 es proporcionada con un tercer material receptivo que es capaz de unir a cualesquiera pruebas de calibración que pasan a través de la longitud de la membrana 23. Cuando se utilizan, las pruebas de calibración pueden contener una sustancia detectable que es la misma o diferente que la sustancia detectable usada para las pruebas de detección. Además, las pruebas de calibración pueden también conjugarse con un específico miembro de unión, tal como se describió arriba. Por ejemplo, en una incorporación, las pruebas de calibración biotinilatadas pueden usarse. Hablando generalmente, las pruebas de calibración son seleccionadas de tal manera que no unen al primero o segundo material receptivo en la zona de detección 31 y a la zona del indicador 35. El tercer material receptivo de la zona de calibración 32 puede ser el mismo o diferente que los materiales receptivos usados en la zona de detección 31 o en la zona del indicador 35. Por ejemplo, en una incorporación, el tercer material receptivo es un material receptivo biológico, tal como antígenos, haptenos, proteínas de unión de anticuerpo (por ejemplo, proteína A, proteína G, proteína A/G) , neutravidina, avidina, estreptavidina, captavidina, anticuerpos primarios o secundarios, o complejos de los mismos. También puede desearse el utilizar varios materiales no biológicos para el tercer material receptivo (por ejemplo, poli-electrolitos) de la zona de calibración 32, tal como se describe en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos de América número 2003/0124739 a nombre de Song y otros, la cual es incorporada aquí en su totalidad por referencia a la misma para todos los propósitos.

Cuando se utilizan, los poli-electrolitos pueden tener una carga neta positiva o negativa, así como una carga neta que es generalmente neutra. Por ejemplo, algunos adecuados ejemplos de poli-electrolitos que tienen una carga positiva neta incluyen, pero no están limitados a, polilisina (comercialmente disponible de sigma-Aldrich Chemical Co., Inc., de St. Louis, Missouri), polietilenoimina; epiclorohidrina funcionalizada de poliaminas y/o poliamidoaminas, tales como poli (dimetilamina-co-epiclorohidrina) ; polidialilodimetil-amonio cloruro; derivados de celulosa catiónica, tal como copolímeros de celulosa o derivados de celulosa injertados con un monómero soluble en agua de amonio cuaternario; etc. En una particular incorporación, pueden utilizarse CelQuat® SC-230M ó H-100 (disponibles de National Starch & Chemical, Inc.), que son derivados de celulosa que contienen un monómero soluble en agua de amonio cuaternario. Además, algunos adecuados ejemplos de poli-electrolitos que tienen una carga negativa neta incluyen, pero no están limitados a, ácidos poliacrílicos, tales como ácido poli (etileno-co-metacrílico, sal de sodio), etc. También deberá entenderse que otros poli-electrolitos pueden también utilizarse, tales como poli-electrolitos anfifílicos (por ejemplo, que tienen partes polares y no polares) . Por ejemplo, algunos ejemplos de adecuados poli-electrolitos anfifílicos incluyen, pero no están limitados a, poli (estirilo-b-N-metil 2-vinil piridinio ioduro) y poli (estirilo-b-acrílico ácido), ambos de los cuales están disponibles de Polymer Source, Inc., de Dorval, Canadá.

Aún cuando cualquier poli-electrolito puede generalmente usarse, el poli-electrolito seleccionado para una particular aplicación puede variar dependiendo de la naturaleza de las pruebas de detección, las pruebas de calibración, la membrana porosa, etc. En particular, la carga distribuida de un polielectrolito permite el unirlo a sustancias que tienen una carga opuesta. Por lo tanto, por ejemplo, los polielectrolitos que tienen una carga positiva neta son con frecuencia mejor equipados para unir con las pruebas que son cargadas negativamente, mientras que los polielectrolitos que tienen una carga negativa neta son con frecuencia mejor equipados para unirse a pruebas que son cargadas positivamente. Por lo tanto, en tales instancias, la interacción iónica entre estas moléculas permite la unión requerida para que ocurra dentro de la zona de calibración 32. No obstante, aún cuando la interacción iónica es principalmente utilizada para lograr la deseada unión en la zona de calibración 32, los polielectrolitos también pueden unirse con pruebas que tienen una carga similar.

Debido a que el polielectrolito está diseñado para unir a las pruebas, es típicamente deseado que el polielectrolito sea sustancialmente inmovilizado no de forma difusa sobre la superficie de la membrana porosa 23. De otro modo, las pruebas pueden no ser prontamente detectables por un usuario. Por lo tanto, los polielectrolitos pueden aplicarse a la membrana porosa 23 de tal manera que sustancialmente no son difusos en la matriz de la membrana porosa 23. En particular, los polielectrolitos típicamente forman una unión iónica y/o covalente con los grupos funcionales presentes sobre la superficie de la membrana porosa 23 de tal forma que permanezcan inmovilizados en la misma. Aún cuando no se requiere, la formación de uniones covalentes entre el polielectrolito y la membrana porosa 23 puede desearse para más permanentemente inmovilizar al polielectrolito en la misma. Por ejemplo, en una incorporación, los monómeros usados para formar el polielectrolito son primero formados en una solución y entonces aplicados directamente a la membrana porosa 23. Varios solventes (por ejemplo, solventes orgánicos, agua, etc.) pueden utilizarse para formar la solución. Una vez aplicados, la polimerización de los monómeros es iniciada usando calor, radiación por rayo de electrón, polimerización radical libre, etc. En algunas instancias, conforme los monómeros se polimerizan forman unión covalente con ciertos grupos funcionales de la membrana porosa 23, por ende inmovilizando al electrolito resultante en la misma. Por ejemplo, en una incorporación, un monómero etilenoimina puede formar una unión covalente con un grupo carboxilo presente sobre la superficie de algunas membranas porosas (por ejemplo, nitrocelulosa).

En otra incorporación, el polielectrolito puede formarse antes de la aplicación a la membrana porosa 23, si se desea, el polielectrolíto puede primero formarse en una solución usando solventes orgánicos, agua, etc. Después de ello, la solución del polielectrolito es aplicada directamente a la membrana porosa 23 y entonces secada. Con el secado, el polielectrolito puede formar una unión iónica con ciertos grupos funcionales presentes sobre la superficie de la membrana porosa 23 que tienen una carga opuesta a la del polielectrolito. Por ejemplo, en una incorporación, el polietilenoimina cargado positivamente puede formar una unión iónica con grupos carboxilo cargados negativamente presentes sobre la superficie de algunas membranas porosas (por ejemplo, nitrocelulosa) .

Además, el polielectrolito puede también enlazarse en forma cruzada a la membrana porosa 23 usando varias bien conocidas técnicas. Por ejemplo, en algunas incorporaciones, las poliaminas funcionales de epiclorohidrina y/o poliamidoaminas pueden usarse como un polielectrolito cargado positivamente, capaces de enlazarse en forma cruzada. Ejemplos de estos materiales son descritos en las patentes de los Estados Unidos de América número 3,700,623 otorgada a Keim y 3,772,076 otorgada a Keim, y la 4,537,657 otorgada a Keim, las cuales son aquí incorporadas en su totalidad por referencia a la misma para todos los propósitos y se cree que son vendidas por Hercules, Inc., de Wilmington, Delaware, bajo la designación de marca de Kymene™. Por ejemplo, el Kymene™ 450 y 2064 son poliamina funcionalizada de epiclorohidrina y/o compuestos de poliamidoamina que contienen anillos de epóxido y grupos de amonio cuaternario que pueden formar uniones covalentes con grupos carboxilo presentes en ciertos tipos de membranas porosas (por ejemplo, nitrocelulosa) y enlazados en forma cruzada con la columna del polímero de la membrana porosa cuando se cura. En algunas incorporaciones, la temperatura de enlazado en forma cruzada puede estar en el rango desde alrededor de 50 grados centígrados a alrededor de 120 grados centígrados y el tiempo de enlazado en forma cruzada puede estar en el rango desde alrededor de 10 a alrededor de 600 segundos .

Aún cuando varias técnicas para inmovilizar no difusas los polielectrolitos sobre la membrana porosa 23 han sido descritas arriba, deberá entenderse que cualquier otra técnica para inmovilizar de forma no difusiva los compuestos de polielectrolito pueden usarse en la presente invención. De hecho, los métodos antes mencionados son solo intencionados para ser ejemplares de las técnicas que pueden usarse en la presente invención. Por ejemplo, en algunas incorporaciones, ciertos componentes pueden añadirse a la solución del polielectrolito que puede sustancialmente inhibir la difusión de tales polielectrolitos en la matriz de la membrana porosa 23.

La zona de detección 31, la zona del indicador 35, y la zona de calibración 32 puede cada una proporcionar cualquier número de regiones distintas de detección de tal forma que el usuario puede mejor determinar la concentración de uno o más analitos dentro de la muestra de prueba. Cada región puede contener los mismos materiales receptivos, o puede contener diferentes materiales receptivos. Por ejemplo, las zonas pueden incluir dos o más regiones distintas (por ejemplo, líneas, puntos, etc.). Las regiones pueden disponerse en forma de líneas en una dirección que es sustancialmente perpendicular al flujo de la muestra de prueba a través del dispositivo de ensayo 20. Igualmente, en algunas incorporaciones, las regiones pueden disponerse en forma de líneas en una dirección que es sustancialmente paralela al flujo de la muestra de prueba a través del dispositivo de ensayo 20.

En algunos casos, la membrana 23 también puede definir una zona de control (no mostrada) que da una señal al usuario que el ensayo se está desarrollando adecuadamente. Por ejemplo, la zona de control (no mostrada) puede contener un material receptivo inmovilizado que es generalmente capaz de formar una unión química y/o física con las pruebas o con el material receptivo inmovilizado en las pruebas. Algunos ejemplos de tales materiales receptivos incluyen, pero no están limitados a, antígenos, haptenos, anticuerpos, proteína A ó G, avidina, estreptavidina, anticuerpos secundarios, y complejos de los mismos. Además, también puede desearse el utilizar varios materiales no biológicos para el material receptivo de la zona de control. Por ejemplo, en algunas incorporaciones, el material receptivo de la zona de control puede también incluir un polielectrolito, tal como se describe arriba, que puede unir a las pruebas no capturadas. Debido a que el material receptivo en la zona de control es solo específico para sondas, una señal se forma sin importar si el analito está presente. La zona de control puede estar colocada en cualquier ubicación a lo largo de la membrana 23, pero está colocada preferiblemente hacia abajo de la zona de detección 31 y de la zona de indicador 35.

Aún cuando varias incorporaciones de las configuraciones del dispositivo se han descrito anteriormente, deberá entenderse, que el dispositivo de la presente invención puede generalmente tener cualquier configuración deseada, y no requiere contener todos los componentes descritos anteriormente. Varias otras configuraciones del dispositivo, por ejemplo, se describieron en las patentes de los Estados Unidos de América números 5,395,754 otorgada a Lambotte y otros; 5,670,381 otorgada a Jou y otros; y 6,194,220 otorgada a Malick y otros, las cuales son incorporadas aquí en su totalidad por referencia a las mismas para todos los propósitos .

Sin importar su configuración particular de este dispositivo de ensayo 20, la zona de indicador 35 y la zona de detección 31 funcionan en tándem para mejorar la exactitud de detección de analito. Refiriéndonos a las figuras 3-4, una incorporación particular de un método para detectar la presencia de una concentración en exceso de antígenos se describirá ahora en mayor detalle. Inicialmente, como se mostró en la figura 3, una muestra de prueba que contiene un antígeno A es aplicada a la almohadilla de muestra (no mostrada) y se desplaza en la dirección "L" a la almohadilla conjugada 22, en donde el analito A se mezcla con las sondas de detección 41 conjugadas con un anticuerpo y las sondas de calibración 43 conjugadas con biotina (por ejemplo "biotinilatadas") . En la incorporación ilustrada en la figura 3, el antígeno A se une con las sondas de detección conjugadas 41 para formar complejos de sonda conjugada/analito 49. Algo del antígeno A permanece libre debido a la disponibilidad limitada de las sondas de detección conjugadas 41. Como se mostró en la figura 4, el antígeno libre A y los complejos 49 entonces se desplazan a la zona de detección 31, dentro de la cual está inmovilizado un anticuerpo 51. El antígeno libre A y los complejos 49 compiten por los sitios de unión sobre el anticuerpo inmovilizado 51. Cualquier antígeno A restante y los complejos 49 se desplazan a la zona indicadora 35, dentro de la cual está inmovilizada una molécula A* que es idéntica en naturaleza al antígeno A. Sin embargo, debido a que el antígeno A y los complejos 49 no poseen un sitio para el aglutinamiento en la molécula A*, éstos generalmente pasan a través de la zona indicadora 35 hasta que alcanzan la almohadilla absorbente 28. Finalmente, las sondas de calibración biotinilatadas 43 se desplazan a través de ambas la zona de detección 31 y la zona indicadora 35 para aglutinar con la estreptavidina (no mostrada) , la cual está inmovilizada dentro de la zona de calibración 32. La intensidad de la señal es producida por cualquier sonda de detección 41 capturadas en la zona de detección 31 y en la zona de indicador 35 puede entonces ser medida. Además, la intensidad de la señal producida por las sondas de calibración 43 en la zona de calibración 32 también puede ser medida, y deberá generalmente permanecer constante para cualquier concentración de analito.

Si se desea, un lector óptico puede ser usado en algunas incorporaciones para medir la intensidad de las sondas. La configuración actual y la estructura del lector óptico pueden generalmente variar como se entiende fácilmente por aquéllos expertos en el arte. Por ejemplo, las técnicas de detección óptica que pueden ser utilizadas incluyen, pero no se limitan a luminiscencia (por ejemplo fluorescencia, fosforescencia, etc.), absorbencia (por ejemplo fluorescente ó no fluorescente), difracción, etc. Un espectrofotómetro de reflectancia adecuado está descrito por ejemplo en la solicitud de patente de los Estados Unidos de América publicación número 2003/0119202 de Kaylor y otros, la cual es incorporada aquí en su totalidad por referencia a la misma para todos los propósitos. En otra incorporación, un espectrofluorómetro de modo de reflectancia puede ser usado para detectar la presencia de sondas que exhiben fluorescencia. Los espectrofluorometros adecuados y las técnicas de detección relacionadas están descritas, por ejemplo, en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos de América número 2004/0043502 de Song y otros, la cual se incorpora aquí en su totalidad por referencia para todos los propósitos. En forma similar, también puede ser usado un sistema de detección de modo- transmisión para detectar la presencia de las sondas de detección.

Típicamente, el lector óptico contiene una fuente de iluminación que es capaz de emitir radiación electromagnética y un detector que es capaz de registrar una señal (por ejemplo luz transmitida ó reflejada, fluorescencia emitida ó fosforescencia, etc.). La fuente de iluminación puede ser cualquier dispositivo conocido en el arte que sea capaz de proporcionar radiación electromagnética, tal como la luz en el rango visible o casi visible (por ejemplo la luz infrarroja ó ultravioleta) . Por ejemplo, las fuentes de iluminación adecuadas que pueden ser usadas en la presente invención incluyen, pero no se limitan a los diodos emisores de luz (LED) , lámparas instantáneas, lámparas fluorescentes de cátodo frío, lámparas electroluminiscentes y otros. La iluminación puede ser multiplexada y/o colimada. En algunos casos, la iluminación puede ser pulsada para reducir cualquier interferencia de fondo. Además, la iluminación puede ser continua ó puede combinar una iluminación pulsada y de onda continua (CW) en donde los rayos de iluminación múltiples son multiplexados (por ejemplo un rayo pulsado es multiplexado con un rayo CW) , permitiendo la discriminación de la señal entre una señal inducida por la fuente CW y una señal inducida por la fuente pulsada. Por ejemplo, en algunas incorporaciones, LEDs (por ejemplo los diodos rojos de arsenido de galio aluminio, los diodos verdes de fósfido de galio, diodos verdes de fósfido de arsenido galio ó los diodos de ultravioleta (UV) /azul/violeta de nítrido galio indio) son usados como la fuente de iluminación pulsada. Un ejemplo comercialmente disponible de un diodo de excitación UV LED adecuado para usarse en la presente invención es el modelo NSHU550E (de Nichia Corporation) , la cual emite 750 a 1000 microwatts de potencia óptica a una corriente hacia adelante de 10 miliamperos (3.5-3.9 voltios) en un rayo con un ancho completo a una mitad máxima de 10°, una longitud de onda pico de 370-375 nanómetros, y un ancho medio espectral de 12 nanómetros.

En algunos casos, la fuente de iluminación puede proporcionar una iluminación difusa al dispositivo de ensayo.

Por ejemplo, un arreglo de fuentes de luz de punto múltiple (por ejemplo LEDs) puede simplemente ser empleado para proporcionar la iluminación relativamente difusa. Otra fuente de iluminación particularmente deseada que es capaz de proporcionar una iluminación difusa en una manera relativamente barata es un dispositivo electroluminiscente (EL) . Un dispositivo electroluminiscente es generalmente una estructura de capacitor que utiliza un material luminiscente (por ejemplo partículas de fósforo) colocadas entre electrodos, por lo menos uno de los cuales es transparente para permitir a la luz el escapar. La aplicación de un voltaje a través de los electrodos genera un campo eléctrico de cambio dentro del material luminiscente que hace que éste emita luz.

El detector puede generalmente ser cualquier dispositivo conocido en el arte que sea capaz de percibir una señal. Por ejemplo, el detector puede ser un detector de imágenes electrónicas que está configurado para una discriminación espacial. Algunos ejemplos de tales sensores de formación de imagen electrónica incluyen los dispositivos acoplados-carga lineal de alta velocidad (CCD) , los dispositivos de inyección de carga (CID) , los dispositivos de semiconductor-óxido-metal-complementarios (CMOS), y otros.

Tales detectores de imagen, por ejemplo, son generalmente arreglos de dos dimensiones de sensores de luz electrónicos, aún cuando los detectores de imágenes lineales (por ejemplo los detectores CCD lineales) que incluyen una línea única de píxeles detectores ó sensores de luz, tal como, por ejemplo, aquéllos usados para escanear imágenes, también pueden ser usados. Cada arreglo incluye un juego de posiciones únicas conocidas que puede referirse como "direcciones". Cada dirección en un detector de imagen está ocupada por un sensor que cubre un área (por ejemplo un área típicamente conformada como una caja ó un rectángulo). Esta área es generalmente mencionada como un "píxel" ó área de píxel. Un píxel detector, por ejemplo, puede ser un sensor CCD, CID, ó un CMOS, ó cualquier otro dispositivo ó sensor que detecta ó mide la luz. El tamaño de los píxeles detectores puede variar ampliamente, y pueden en algunos casos tener un diámetro ó longitud tan baja como de 0.2 micrómetros.

En otras incorporaciones, el detector puede ser un sensor de luz que carece de capacidades de discriminación espacial. Por ejemplo, los ejemplos de tales sensores de luz pueden incluir los dispositivos fotomultiplicadores, los fotodiodos, tal como los fotodiodos de avalancha ó los fotodiodos de silicio y otros. Los fotodiodos de silicio son algunas veces ventajosos en el sentido de que éstos son baratos, sensibles, capacidades de una operación a alta velocidad (tiempo de elevación corto/ancho de banda alto) , y están fácilmente integrados en la mayoría de otra tecnología de semiconductor y de circuito monolítico. Además, los fotodiodos de silicio son físicamente pequeños, lo cual les permite el ser incorporados fácilmente en un sistema para usarse con un dispositivo a base de membrana. Si los fotodiodos de silicio son usados, entonces el rango de longitud de onda de la señal emitida puede estar dentro del rango de sensibilidad el cual es de 400 a 1100 nanómetros.

Generalmente hablando, la determinación cualitativa, cuantitativa ó semi-cuantitativa de la presencia ó de la concentración de un analito puede lograrse de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, como se declaró arriba, la cantidad de analito puede ser cuantitativa ó semi-cuantitativamente determinada mediante el uso de intensidades de las señales producidas por las sondas capturadas en la zona de detección 31 y de la zona de indicador 35, y opcionalmente con la señal de intensidad en la zona de calibración 32. La habilidad para utilizar diferentes intensidades de señal para determinar la concentración de analito está ilustrada gráficamente en la figura 2. Deberá entenderse que las intensidades de señal no necesariamente tienen que seguir la relación ilustrada, y que está relación se da solo para propósitos de ejemplo. En este aspecto, la figura 2 muestra la relación de la intensidad de señal de las sondas de detección de las figuras 3 y 4 para ambas la zona indicadora 35 y la zona de detección 31. Para los propósitos de ilustración solamente, la figura 2 no incluye una intensidad de señal de calibración. Sin embargo, como se discutió anteriormente, una intensidad de señal de calibración puede ser utilizada para calibrar los resultados. Por ejemplo, la proporción de Id a | c en contra de la concentración de analito puede ser dibujada para desarrollar la curva de respuesta de dosis discutida arriba.

Como se mostró en la figura 2, cuando no está presente el antígeno A en la muestra de prueba, todas las sondas de detección 41 se unen al antígeno A* dentro de la zona indicadora 35 y producen una intensidad de señal de indicador ("10") que está a un valor máximo. La zona de detección 31 no produce señal. Al aumentar su concentración, el antígeno A comienza a formar los complejos 49 con las sondas de detección conjugadas 41. Los complejos 49 poseen un epítope capaz de unir con el anticuerpo 51 en la zona de detección 31. Esto provoca una disminución en la intensidad de la señal de indicador " l0'J y también hace que la producción de la intensidad de la señal de detección "ld" en la zona de detección 31. La intensidad de la señal indicadora "10" continúe disminuyendo y la intensidad de la señal de detección "Id" continúe aumentando hasta que la concentración del antígeno A excede la cantidad de las sondas de detección conjugadas disponibles 41. Esto es conocido como la "concentración de saturación" del analito. A la concentración de saturación, el analito A libre y los complejos 49 comienzan a competir para unir los sitios en la zona de detección 31. Por tanto, la intensidad de la señal de detección "I " alcance su valor máximo. Este valor es generalmente conocido debido a la cantidad de sondas de detección 41 que se selecciona para corresponder a la cantidad del anticuerpo disponible 51 en la zona de detección 31. Al aumentar adicionalmente la concentración de antígeno, la intensidad de la señal de detección "Id" comienza a disminuir debido a la presencia escalada del antígeno A no etiquetado libre dentro de la zona de detección 31. Además, en ó cerca de la concentración de saturación de analito, ninguna intensidad de señal indicador será teóricamente detectada ya que todas las sondas de detección 41 complejaran con el analito A, y subsecuentemente se unirán al anticuerpo 51 dentro de la zona de detección 31. En la práctica, sin embargo, un número pequeño de sondas de detección 41 puede unirse al antígeno A* dentro de la zona indicadora 35 de manera que es aún producida a una intensidad de señal de indicador relativamente baja "10".

De acuerdo con la presente invención, varias regiones de la curva de respuesta de dosis de la figura 2 pueden ser empleadas selectivamente para convertir una intensidad de señal de detección medida a concentración de analito. Por ejemplo, la "región A" de la curva está definida entre las concentraciones de analito "A0" y "Ai". En esta región, la intensidad de la señal de detección yace sobre casi la relación lineal con la concentración de analito. Por tanto, "la región A" de la figura 2 puede ser usada para convertir exactamente la intensidad de señal de detección medida "Id" a una concentración de analito. En forma similar, las definiciones de "región C" de la curva se define entre las concentraciones de analito "A2" y "A3". De nuevo, en esta región, la intensidad de la señal de detección yace sobre casi la relación lineal con la concentración de analito. Por tanto, la "región C" de la figura 2 también puede ser usada para convertir exactamente la intensidad de la señal de detección medida "ld" a una concentración de analito actual. La "región B" de la curva de detección la cual se define entre las concentraciones de analito "Ai" y "A2" es relativamente constante, y como tal, es algunas veces difícil el obtener una correlación exacta para la concentración de analito. Por tanto, si son deseados los resultados cuantitativos, el usuario puede diluir una muestra de prueba subsecuente y después volver a llevar a cabo el ensayo. Alternativamente, la intensidad de señal de indicador puede ser usada sola ó en conjunción con la intensidad de señal de detección para proporcionar un resultado cuantitativo. Si solo son deseados los resultados semi-cuantitativos, la concentración de analito puede decirse simplemente que cae entre el rango de concentraciones de analito "Ai" y "A2".

Para determinar cual región de la curva de respuesta de dosis de la figura 2 es más adecuada para una muestra de prueba particular, se desea generalmente el primero determinar si la concentración de analito está dentro de la región de "efecto de gancho". En este aspecto, una intensidad de señal medida "10" puede ser comparada a un estándar de referencia que es predeterminado para una concentración de saturación conocida del analito. La "referencia estándar" puede ser un valor de intensidad único ó éste puede abarcar un rango de valores que se cree que corresponden a la concentración de saturación dentro de un cierto margen de error. Los límites superior e inferior del rango de valores pueden ser seleccionados con base en la extensión en que varía la intensidad de señal de indicador sobre corridas de prueba múltiples para la misma concentración de saturación de analito conocida. Por ejemplo, en la figura 2, el estándar de referencia puede ser definido entre los valores de intensidad "li" y "12" lo cual corresponde a las concentraciones de analito "Ai" y "A2" respectivamente. Una intensidad de señal medida "10" que es mayor que el estándar de referencia (por ejemplo mayor que el límite superior "li") sirve como un indicador de que la concentración de analito está fuera de la región de "efecto de gancho" mientras que una intensidad de señal medida "10" que es la misma ó menor que el estándar de referencia (por ejemplo menos que el límite superior "li") sirve como un indicador de que la concentración de analito está dentro de la región de "efecto de gancho".

Refiriéndonos a la figura 5, por ejemplo, una incorporación de un método 100 está mostrada para determinar si la concentración de analito está dentro de la región de "efecto de gancho". Algunas variables son usadas como entradas en el método 100, incluyendo la intensidad de señal de detección medida "ld'J en la intensidad de señal de indicador medida "10", y el límite superior li y el límite inferior 12 del estándar de referencia. El primer paso del método 100 es el de determinar si la intensidad de señal medida "10" es mayor que el límite superior "li". Si esto es así, la concentración de analito está fuera de la región de "efecto de gancho" y la "región A" de la curva de respuesta de dosis puede ser usada para convertir la intensidad de señal de detección medida "ld" a una concentración de analito. Si la intensidad de señal medida "10" es menor que el límite superior "li", el siguiente paso del método 100 es el de determinar si la concentración de analito está en ó cerca de la concentración de saturación ó si ésta está muy arriba de la concentración de saturación. Por tanto, el método 100 determina si la intensidad de señal medida "10" es menor que el límite inferior "12" y si esto es así, la "región C" de la curva de respuesta de dosis puede ser usada para convertir la intensidad de señal de detección medida "Id" a una concentración de analito. Si la intensidad de señal medida "10" es mayor que el límite inferior "12" pero menor que el límite superior "l?" (por ejemplo el mismo que el estándar de referencia) , el paso final del método 100 es el de determinar si los resultados semicuantitativos ó cuantitativos son deseados. Si son deseados los resultados cuantitativos, el método 100 da instrucciones al usuario de diluir una muestra de prueba subsecuente y después volver a llevar a cabo el ensayo. Alternativamente, la intensidad de señal de indicador medida "10" también puede usarse sola ó en conjunción con la intensidad de señal de detección "Id" para proporcionar resultados cuantitativos. Por ejemplo, como se mostró en la figura 2, la curva de indicador es relativamente lineal dentro de la "región B" de la curva de la señal de detección. Por tanto, dentro de esta región, la curva de indicador puede proporcionar resultados de detección exactos. Además, si solo son deseados los resultados semicuantitativos, el método 100 simplemente indica que la concentración de analito cae dentro del rango de concentraciones de analito "Ai" y "A2" mostradas en la figura 2.

Los métodos de correlación, tal como se describió anteriormente, pueden llevarse a cabo automáticamente y/o manualmente. Por ejemplo, un microprocesador puede opcionalmente ser empleado para seleccionar automáticamente la técnica de correlación deseada y para convertir la medición del detector a un resultado que indique cuantitativamente ó semicuantitativamente la concentración del analito. El microprocesador puede incluir una capacidad de memoria para permitir al usuario el llamar los últimos varios resultados. Aquéllos expertos en el arte apreciarán que cualquier dispositivo de memoria leíbles por computadora, tal como RAM, ROM, EPROM, EEPROM, tarjetas de memoria instantánea, discos de video digital, cartuchos Bernoulli, y otros, pueden usarse. Si se desea, los resultados pueden ser llevados a un usuario usando un exhibidor de cristal líquido (LCD) ó LED.

La presente invención puede ser entendida mejor con referencia a los siguientes ejemplos.

EJEMPLO 1 La capacidad para formar un dispositivo de ensayo de flujo lateral fue demostrada. La membrana porosa de nitrocelulosa (HF 120 de Millipore, Inc.) teniendo una longitud de aproximadamente de 30 centímetros fue laminada sobre las tarjetas de soporte. El anticuerpo monoclonal para la proteína reactiva-C fue inmovilizado sobre la membrana porosa para formar una zona de detección. El anticuerpo fue obtenido de BiosPacific, Inc., (catálogo #A58040136P) y tiene una concentración de 1 miligramo por mililitro. El antígeno CRP fue inmovilizado sobre la membrana porosa para formar una zona de indicador. El antígeno fue obtenido de Biogénesis Inc., de Kingston, New Hampshire, y tuvo una concentración de 2.78 miligramos por mililitro. El Goldline™ (una solución de polilisina obtenida de British Biocell International) fue desvestida sobre la membrana para formar una zona de control. La zona de indicador fue colocada entre la zona de detección y la zona de control. Una almohadilla de transmisión de celulosa (Millipore Co . ) fue laminada con un extremo (más cerca de la zona de control) de la membrana. Las muestras de membrana fueron entonces secadas por una hora a una temperatura de 37 °C.

Una partícula de suspensión fue formada mediante el mezclar 180 microlitros de partículas de oro conjugadas con anticuerpo monoclonal para CRP (BiosPacific, Inc., catálogo #A58110228P) , 375 microlitros de sucrosa en agua (20%) y 945 microlitros de agua. Las partículas de oro tuvieron un tamaño de partícula de 40 nanómetros y una densidad óptica de 56, y fueron obtenidos de British Biocell International. La suspensión fue cargada sobre una almohadilla conjugada de fibra de vidrio de 25 centímetros de largo (Millipore Co.). La almohadilla de fibra de vidrio fue secada a 37 °C por 2 horas para formar una almohadilla conjugada. La almohadilla conjugada fue entonces laminada sobre el otro extremo (más cerca de la zona de detección) de la membrana porosa. Una almohadilla de transmisión de celulosa (Millipore Co.), una almohadilla de muestra fue además laminada sobre la almohadilla conjugada. La tarjeta completa laminada fue entonces cortada en un dispositivo de ensayo de flujo lateral de 4 milímetros de ancho .

EJEMPLO 2 Los dispositivos de flujo lateral fueron formados como se describió en el ejemplo 1, excepto que fueron usados 2.23 miligramos por mililitro de anti-ratón de cabra IgG (Fc) para formar la zona de control.

EJEMPLO 3 La capacidad para formar un dispositivo de ensayo de flujo lateral fue demostrada. Una membrana porosa de nitrocelulosa (HF 120 de Millipore, Inc.) teniendo una longitud de aproximadamente de 30 centímetros fue laminada sobre las tarjetas de soporte. El anticuerpo monoclonal para la proteína reactiva-C (BiosPacific, Inc., catálogo #A58040136P) en 0.1% de solución acuosa de trehalosa fue inmovilizada sobre la membrana porosa para formar una zona de detección. El antígeno CRP fue inmovilizado sobre la membrana porosa para formar una zona indicadora. El antígeno fue obtenido de Biogénesis Inc., de Kingston, New Hampshire, y tuvo una concentración de 2.78 miligramos por mililitro. La fosfatasa alcalina anticabra (2.5 miligramos por mililitro, obtenida de Fitzgerald Industries International, Inc., de Concord, Massachussets) fue desvestida sobre la membrana para formar una zona de calibración. La zona indicadora fue colocada entre la zona de detección y la zona de calibración. Una almohadilla de transmisión de celulosa (Millipore Co . ) fue laminada con un extremo (más cerca de la zona de control) de la membrana. Las muestras de membrana fueron entonces secadas por una hora a una temperatura de 37°C. 160 microlitros de partículas de oro conjugadas con IgG de anti cabra conejo, 160 microlitros de partículas de oro conjugadas con anticuerpo monoclonal CRP (BiosPacific, Inc., catálogo #A58110228P) , 375 microlitros de sucrosa en agua (20%), y 785 microlitros de agua fueron mezclados para formar una suspensión de partículas. Las partículas de oro conjugadas con el conejo anti cabra IgG tuvieron un tamaño de 10 nanómetros, y fueron obtenidas de Sigma-Aldrich, Inc., de St . Louis, Missouri. Las partículas de oro conjugadas con el anticuerpo monoclonal CRP tuvieron un tamaño de partícula de 40 nanómetros, y fueron obtenidas de British Biocell International. La suspensión fue cargada sobre una almohadilla conjugada de fibra de vidrio de 20 centímetros de largo (Millipore Co . ) . La almohadilla de fibra de vidrio fue secada a 37 °C por 2 horas para formar una almohadilla conjugada. La almohadilla conjugada fue laminada sobre el otro extremo (más cerca de la zona de detección) de la membrana porosa. Una almohadilla de transmisión de celulosa (Millipore Co.) almohadilla de muestra fue además laminada sobre la almohadilla conjugada. La tarjeta completa laminada fue entonces cortada en un dispositivo de ensayo de flujo lateral de 4 milímetros de ancho.

EJEMPLO 4 La capacidad para detectar la presencia y la cantidad de un analito usando los dispositivos de ensayo de flujo lateral del ejemplo 1 fue determinada. Once (11) de los dispositivos de ensayo fueron probados. 120 microlitros de la proteína reactiva-C en amortiguador TBS fueron aplicados a la almohadilla de muestra de cada dispositivo. Fueron probadas diferentes concentraciones de CRP, por ejemplo, 0; 10; 50; 200; 500; 1,000; 2,000; 5,000; 20,000; 100,000; y 500,000 nanogramos por mililitro. Los dispositivos se dejaron revelar por 30 minutos. La intensidad de color de cada zona sobre cada dispositivo fue medida usando un espectrofotómetro a base de reflectancia. La intensidad en cada zona se resume en la tabla 1.

Tabla 1 : Intensidad para las Concentraciones CRP Las intensidades están colocadas en contra de concentración CRP en la figura 6. Como se mostró la zona indicadora es capaz de predecir si la concentración CRP está dentro de la región de "efecto de gancho".

EJEMPLO 5 Fue demostrada la capacidad para detectar la presencia y la cantidad de un analito usando los dispositivos de ensayo de flujo lateral del ejemplo 2. Once (11) de los dispositivos de ensayo fueron probados. 120 microlitros de la proteína reactiva-C en el amortiguador TBS fueron aplicados a la almohadilla de muestra de cada dispositivo. Diferentes concentraciones de CRP fueron probadas, por ejemplo, 0; 10; 50; 200; 500; 1,000; 2,000; 5,000; 20,000; 100,000; y 500,000 nanogramos por mililitro. Los dispositivos se dejaron revelar por 30 minutos. La intensidad de color de cada zona en cada dispositivo fue medida usando un espectrofotómetro a base de reflectancia. La intensidad en cada zona está resumida en la tabla 2.

Tabla 2 : Intensidad para las Concentraciones Las intensidades están colocadas en contra de concentración CRP en la figura 7. Como se mostró la zona indicadora es capaz de predecir si la concentración CRP está dentro de la región de "efecto de gancho".

EJEMPLO 6 Fue demostrada la capacidad para detectar la presencia y la cantidad de un analito usando los dispositivos de ensayo de flujo lateral del ejemplo 3. Once (11) de los dispositivos de ensayo fueron probados. 120 microlitros de la proteína reactiva-C en el amortiguador TBS fueron aplicados a la almohadilla de muestra de cada dispositivo. Diferentes concentraciones de CRP fueron probadas, por ejemplo, 0; 10; 50; 200; 500; 1,000; 2,000; 5,000; 20,000; 100,000; y 500,000 nanogramos por mililitro. Los dispositivos se dejaron revelar por 30 minutos. La intensidad de color de cada zona en cada dispositivo fue medida usando un espectrofotómetro a base de reflectancia. La intensidad en cada zona está resumida en la tabla 3.

Tabla 3 : Intensidad para las Concentraciones CRP Las intensidades están colocadas en contra de concentración CRP en la figura Como se mostró la zona indicadora es capaz de predecir si la concentración CRP está dentro de la región de "efecto de gancho".

EJEMPLO 7 Fue demostrada la capacidad para variar la sensibilidad de detección de un dispositivo de ensayo. Una suspensión de partículas fue inicialmente formada mediante diluir las partículas de oro conjugadas con el anticuerpo monoclonal para CRP (BiosPacific, Inc., catálogo #A58110228P) en 2 milimolares de Bórax (pH de 7.2) a una concentración a la cual la densidad óptica fue de 10. Las partículas de oro tuvieron un tamaño de partícula de 40 nanómetros. La suspensión fue rociada a una tasa de 25 microlitros por segundo (5 µl/cm, 5 cm/s) sobre una almohadilla conjugada de fibra de vidrio de 34 milímetros de largo (Millipore Co.) usando un módulo surtidor de reactivo "Kinematic 1600" (Kinematic Automation, Inc. de Twain Harte, California). La almohadilla de fibra de vidrio se dejó secar durante la noche a la temperatura ambiente y a una humedad relativa de menos de 20%.

La almohadilla conjugada fue entonces laminada sobre un extremo de una membrana porosa de nitrocelulosa (HF 180 de Millipore, Inc.) teniendo una longitud de aproximadamente de 30 centímetros. El anticuerpo monoclonal para la proteína reactiva-C (BiosPacific, Inc., catálogo #A58110228P) fue diluida a concentraciones de 0.2 y 0.3 miligramos por mililitro en amortiguador TBS. Los reactivos fueron desvestidos a tasas de 5 microlitros por segundo (1 µL/cm, 5 cm/s) sobre la membrana porosa usando un módulo de surtido de reactivo "Kinematic 1600" (de Kinematic Automation, Inc., de Twain Harte, California). El anticuerpo monoclonal inmovilizado formó una zona de detección colocado a 10 milímetros desde una orilla de la membrana. El antígeno CRP inmovilizado formó una zona indicadora colocada a 10 milímetros de la otra orilla de la membrana y 5 milímetros hacia abajo de la zona de detección. Una almohadilla de transmisión de vidrio/celulosa CF6 (de Whatman pie de Middlesex, Reino Unido) fue cortada a un ancho de 20 milímetros y se laminó a la membrana de nitrocelulosa. La tarjeta laminada fue cortada entonces en varillas de inmersión de flujo lateral completo de 4 milímetros de ancho.

Los dispositivos de ensayo resultantes fueron colocados en una caja (contiene 14 varillas de inmersión) y se desvistieron a mano usando una pipeta de desplazamiento positivo con un microlitro de cera CRP calibrado (0 a 480 microgramos por mililitro) obtenido de Kamiya Biomedical Co., de Seattle, Washington. El desvestido de cera fue colocado en el punto de 12 milímetros desde la orilla de la almohadilla GF 33. Los dispositivos de ensayo fueron probados mediante el aplicar 110 microlitros de amortiguador PBS (ph 7.2 con 2% de Tween 20) hacia arriba del punto de aplicación de sera, a fin de lavar el sera a lo largo de la tira de prueba. Los dispositivos se dejaron revelar por 30 minutos. La intensidad de color de cada zona sobre cada dispositivo fue determinada usando una escala visual ("escala Rann") variando de desde 0-11, en donde 0 representa sin color y 11 representa el color más intenso. La intensidad de cada zona está resumida en las tablas 4 y 5.

Tabla 4 : Intensidad de Zonas de Detección para la Concentración de Anticuerpos de 0.2 mg/ml Tabla 5 Intensidad de Zonas de Detección para la Concentración de Anticuerpos de 0.3 mg/ml Como se indicó arriba, la concentración del anticuerpo usado en la zona de detección puede ser variada para proporcionar las diferentes sensibilidades de detección. En esta manera, la concentración de anticuerpo puede ser controlada selectivamente para generar una curva de respuesta de dosis dentro de un rango sensitivo que se cree que corresponde mejor a las condiciones de prueba. Por ejemplo, la concentración de anticuerpo puede ser ajustada de manera que la región lineal de la curva de respuesta de dosis existe a una concentración de analito superior.

EJEMPLO 8 La capacidad de variar la sensibilidad de detección de un dispositivo de ensayo fue demostrada. La suspensión de partículas fueron formadas inicialmente mediante el diluir partículas de oro conjugadas con el anticuerpo monoclonal para CRP (BiosPacific, Inc., catálogo #A58110228P) en 2 milimolares de Bórax (pH de 7.2) a una concentración a la cual la densidad óptica fue de 5, 8, 10, 12, 15, 18 ó 20. Las partículas de oro tuvieron un tamaño de partícula de 40 nanómetros. Las suspensiones fueron rociadas a una tasa de 25 microlitros por segundo (5 µl/cm, 5 cm/s) sobre una almohadilla conjugada de fibra de vidrio de 34 milímetros de largo (Millipore Co . ) usando un módulo surtidor reactivo "Kinematic 1600" (de Kinematic Automation, Inc., de Twain Harte, California) . La almohadilla de fibra de vidrio se dejó secar durante la noche a la temperatura ambiente y a una humedad relativa de menos de 20%.

La almohadilla conjugada fue entonces laminada sobre un extremo de una membrana porosa de nitrocelulosa (HF 180 de Millipore, Inc.) teniendo una longitud de aproximadamente de 30 centímetros. El anticuerpo monoclonal para la proteína reactiva-C (BiosPacific, Inc., catálogo #A58110228P) fue diluido a una concentración de 0.1 miligramo por mililitro en amortiguador TBS. El antígeno CRP también fue obtenido de Biogénesis Inc., de Kingston, New Hampshire y se diluyó en una concentración de 3.4 miligramos por mililitro en amortiguador TBS. Los reactivos fueron desvestidos a tasas de 5 microlitros por segundo (1 µL/cm, 5 cm/s) sobre la membrana porosa usando un módulo de surtido de reactivo "Kinematic 1600" (Kinematic Automation, Inc., de Twain Harte, California). El anticuerpo monoclonal inmovilizado formo una zona de detección colocada 10 milímetros desde una orilla de la membrana. El antígeno CRP inmovilizado formo una zona indicadora colocada 10 milímetros desde la otra orilla de la membrana y 5 milímetros hacia abajo de la zona de detección. Una almohadilla de transmisión de vidrio/celulosa CF6 (de Whatman pie de Middlesex, Reino Unido) fue cortada a un ancho de 20 milímetros y se laminó a la membrana de nitrocelulosa. La tarjeta laminada fue entonces cortada en varillas de inmersión de flujo lateral completo de 4 milímetros de ancho.

Los dispositivos de ensayo resultante fueron colocados en una caja (contiene 14 varillas de inmersión) y se desvistieron a mano usando una pipeta de desplazamiento positivo con un microlitro de sera de CRP calibrado (0 a 480 microgramos por mililitro) obtenido de Kamiya Biomedical Co., de Seattle, Washington. La tira de sera fue colocada en el punto de 12 milímetros desde la orilla de la almohadilla GF 33. Los dispositivos de ensayo fueron probados mediante el aplicar 110 microlitros de amortiguador PBS (pH 7.2 con 2% de Tween 20) hacia arriba del punto de aplicación de sera, a fin de lavar el sera a lo largo de la tira de prueba. Los dispositivos se dejaron revelar por 30 minutos. La intensidad de color de cada zona sobre cada dispositivo fue medida usando la escala "Rann" descrita anteriormente. Los resultados están mostrados en las figuras 9-10.

Como se mostró en la figura 8, la cuerva de respuesta de anticuerpo ("zona de detección") y las intensidades de señal (por ejemplo "valores Rann") pueden variarse mediante el alterar la concentración de partícula conjugada (como se reflejó por la densidad óptica) . Similarmente, como se mostró en la figura 10, la curva de respuesta CRP ("zona indicadora") y las intensidades de señales también pueden ser variadas mediante el alterar la concentración de partículas conjugadas. Por tanto, como se indicó, la concentración de las partículas conjugadas puede ser controlada selectivamente para generar una curva de respuesta de dosis dentro de un rango de sensibilidad que se cree que corresponde mejor a las condiciones de la prueba.

EJEMPLO 9 Fue demostrada la capacidad para variar la sensibilidad de detección de un dispositivo de ensayo. Los dispositivos de ensayo de varillas medias fueron hechos para experimentos iniciales. Dos soluciones de anticuerpo monoclonal para CRP (BiosPacific, Inc., catálogo #A58110228P) fueron preparadas mediante el diluir la solución de suministro de anticuerpo en PBS 0/0 para dar 0.1 y 0.5 miligramos por mililitro de concentraciones. Cada solución fue entonces desvestida sobre las membranas de nitrocelulosa separadas (HF 120 de Millipore Inc.) teniendo una longitud de aproximadamente de 30 centímetros. Las soluciones fueron desvestidas a una tasa de 5 microlitros por segundo (1 µl/cm tasa de surtido con velocidad de cama de 5 cm/s) usando un módulo surtidor de reactivo "Kinematic 1600" (de Kinematic Automation, Inc., de Twain Harte, California) . Una solución CRP (de Biogénesis Inc., de Kingston, New Hampshire), diluida a 0.5 mg/mL en PBS 0/0 (pH de 7.2), fue también desvestida sobre la tarjeta usando el Kinematic 1600. Las tarjetas se dejaron secar a 37°C por una hora, y se laminaron con un pabilo de fibra celulósica de 20 milímetros de ancho (Millipore CFSP203000) . Las tarjetas fueron cortadas en tiras de 4 milímetros de ancho usando un cortador "Kinematic 2360" (Kinematic Automation, Inc., de Twain Harte, California) , resultando en varillas de inmersión de flujo lateral medio de 4 milímetros de ancho ("medias-varillas") .

Para la prueba, la suspensión de partículas de tamaños variables de partículas de oro previamente conjugadas con anticuerpo monoclonal para CRP (BiosPacific, Inc., catálogo #A58110228P) fueron usadas. Los tamaños estudiados en este ejemplo fueron conjugados de partículas de oro de 40 y 60 nanómetros de diámetro. Los conjugados de partícula fueron diluidos en TBS 1/0/1 a la densidad óptica deseada (OD) para la prueba, por ejemplo OD 1 y OD 2.5. Los estándares CRP de Scipac fueron diluidos en PBS 0/0 a un rango de concentración de 0-40 microgramos por mililitro, de manera que una vez mezclados con un volumen igual de conjugado de oro, éstos resultan en un rango de prueba de 0 a 20 microgramos por mililitro de CRP. Unos 20 microlitros de la solución CRP y 20 microlitros de la suspensión conjugada de oro fueron agregados a una placa de 96 pozos. Las muestras de varilla media fueron entonces colocadas en el pozo, y las pruebas se dejaron correr por 15 minutos antes de la calificación visual de las líneas de prueba resultantes. La calificación visual de la intensidad de color de cada zona sobre cada dispositivo se llevó a cabo usando una "escala Rann" variando de desde 0 (ningún color visible sobre la línea de prueba) a 11 (un color muy intenso sobre la línea de prueba) .

Los resultados están mostrados en las figuras 11-15. Como se mostró en las figuras 11-12 por ejemplo, una concentración de anticuerpo de 0.5 miligramos/ml en la zona de detección resultó en ya sea ninguna señal ó una señal débil (por ejemplo Rann = 1) en la zona indicadora entre las concentraciones CRP de 0.2 a 20 microgramos por mililitro. Disminuyendo la concentración anticuerpo a 0.1 mg/ml (figuras 13-14) aumenta la línea CRP ("zona indicadora") de la intensidad de señal y dando una curva CRP menos profunda. Además, mediante el aumentar la concentración conjugada de oro a una densidad óptica de 2.5, ambos el anticuerpo y las líneas CRP aumentaron en la intensidad de señal (figura 15). La línea CRP también comenzó a declinar cerca del punto en el cual la señal de anticuerpo alcanzó su pico (por ejemplo en el punto de "efecto de gancho") .

Aún cuando la invención se ha descrito en detalle con respecto a las incorporaciones específicas de la misma, se apreciará por aquéllos expertos en el arte, lograr un entendimiento de lo anterior, que pueden concebirse fácilmente alteraciones, variaciones y equivalentes de estas incorporaciones. Por tanto, el alcance de la presente invención debe evaluarse como aquél de las reivindicaciones anexas y cualquier equivalentes de las mismas.

Claims (20)

R E I V I N D I C A C I O N E S

1. Un dispositivo de ensayo de flujo lateral para detectar la presencia ó la cantidad de un analito dentro de una muestra de prueba, el dispositivo de ensayo de flujo lateral comprende una membrana porosa en comunicación con las sondas de detección conjugadas, en donde el analito es capaz de formar complejos con las sondas de detección conjugadas, la membrana porosa define: una zona de detección dentro de la cual está inmovilizado un primer material receptor, el primer material receptor estando configurado para preferiblemente unir al analito, ya sea complejado ó no complejado con las sondas de detección conjugadas, la zona de detección siendo capaz de producir una señal de detección medible; y una zona indicadora localizada hacia abajo de la zona de detección y dentro de la cual está inmovilizado un segundo material receptor, el segundo material receptor está configurado para unir preferiblemente a las sondas de detección conjugadas no complejadas, la zona indicadora siendo capaz de producir una señal indicadora medible; en donde la intensidad de la señal indicadora medible es comparable a un estándar de referencia para determinar si la concentración del analito dentro de la muestra de prueba está dentro de la región de efecto de gancho, el estándar de referencia representando una intensidad ó rango de intensidades de la señal indicadora en ó cerca de la concentración de saturación del analito.

2. El dispositivo de ensayo de flujo lateral tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque el segundo material receptor tiene por lo menos un epítope en común con el analito.

3. El dispositivo de ensayo de flujo lateral tal y como se reivindica en las cláusulas 1 ó 2, caracterizado porque el segundo material receptor incluye un antígeno ó un análogo del mismo.

4. El dispositivo de ensayo de flujo lateral tal y como se reivindica en la cláusula 3, caracterizado porque el analito es proteína reactiva-C.

5. El dispositivo de ensayo de flujo lateral tal y como se reivindica en una cualquiera de las cláusulas 1 a 4, caracterizado porque el material receptor incluye un anticuerpo ó un análogo del mismo.

6. El dispositivo de ensayo de flujo lateral tal y como se reivindica en una cualquiera de las cláusulas anteriores, caracterizado porque la membrana porosa además define una zona de calibración que es capaz de producir una señal de calibración.

7. El dispositivo de ensayo de flujo lateral tal y como se reivindica en una cualquiera de las cláusulas anteriores, caracterizado porque la señal de concentración del analito está por lo menos parcialmente determinada por la intensidad de la señal de detección.

8. El dispositivo de ensayo de flujo lateral tal y como se reivindica en una cualquiera de las cláusulas anteriores, caracterizado porque la concentración del analito está por lo menos parcialmente determinada de la intensidad de la señal indicadora.

9. Un método para detectar cuantitativamente ó semicuantitativamente un analito dentro de una muestra de prueba, el método comprende: i) contactar la muestra de prueba con una membrana porosa de un dispositivo de flujo lateral, la membrana porosa estando en comunicación con las sondas de detección conjugadas, la membrana porosa además define una zona de detección y una zona indicadora localizada hacia abajo de la zona de detección; ii) medir la intensidad de una señal de detección producida en la zona de detección y la intensidad de una señal indicadora producida en la zona indicadora; y iii) comparar la intensidad de señal indicadora con un estándar de referencia, el estándar de referencia representa una intensidad ó rango de intensidades de la señal indicadora en ó cerca de la concentración de saturación de un analito.

10. El método tal y como se reivindica en la cláusula 9, caracterizado porque comprende además seleccionar una técnica para convertir la intensidad de señal de detección medida a una concentración de analito ó rango de concentraciones basadas sobre si la intensidad de señal indicadora medida es menor que, menor que ó la misma que la estándar de referencia.

11. El método tal y como se reivindica en la cláusula 10, caracterizado porque además comprende generar una curva de respuesta de dosis mediante dibujar la intensidad de señal de detección para concentraciones de analito conocidas.

12. El método tal y como se reivindica en la cláusula 11, caracterizado porque la concentración de analito en la muestra de prueba es determinada usando una primera región de la curva de respuesta de dosis cuando la intensidad de señal indicadora medida es mayor que el estándar de referencia.

13. El método tal y como se reivindica en la cláusula 12, caracterizado porque la intensidad de señal de detección de la curva de respuesta de dosis soporta una relación lineal aproximada a la concentración de analito dentro de la primera región.

14. El método tal y como se reivindica en la cláusula 11, caracterizado porque la concentración de analito en la muestra de prueba es determinado usando una segunda región de la curva de respuesta de dosis cuando la intensidad de señal de indicador medida es menor que el estándar de referencia .

15. El método tal y como se reivindica en la cláusula 14, caracterizado porque la intensidad de señal de detección de la curva de respuesta de dosis soporta una relación lineal aproximada a la concentración del analito dentro de la segunda región.

16. El método tal y como se reivindica en la cláusula 11, caracterizado porque una tercera región de la curva de respuesta de dosis es usada cuando la intensidad de señal indicadora medida es la misma que el estándar de referencia, la tercera región proporcionando un rango dentro del cual cae la concentración del analito.

17. El método tal y como se reivindica en la cláusula 16, caracterizado porque la intensidad de señal indicadora soporta una relación lineal aproximada a la concentración de analito dentro de la tercera región.

18. El método tal y como se reivindica en una cualquiera de las cláusulas 11 a 17, caracterizado porque además comprende el controlar selectivamente la concentración de un material receptivo y/o de sondas de detección conjugadas usadas para generar la curva de respuesta de dosis para ayudar a lograr un cierto rango de sensibilidad para la curva de respuesta de dosis.

19. El método tal y como se reivindica en una cualquiera de las cláusulas 11 a 18, caracterizado porque una intensidad de señal de calibración es también usada para generar la curva de respuesta de dosis.

20. El método tal y como se reivindica en la cláusula 10, caracterizado porque la segunda muestra de prueba está diluida para el contacto con la membrana porosa cuando la intensidad de señal indicadora medida es aproximadamente la misma que el estándar de referencia. R E S U M E Se proporciona un dispositivo de ensayo de flujo lateral para detectar la presencia ó cantidad de un analito dentro de una muestra de prueba. El dispositivo utiliza zonas múltiples, una de las cuales sirve como un indicador de si el analito de prueba está ó no en la muestra de prueba dentro de la región de "efecto de gancho". Basado sobre esta indicación, puede ser seleccionada una técnica para correlacionar una intensidad de señal medida con una concentración de analito ó rango de concentraciones. Por ejemplo, cuando se determinó que la muestra de prueba cae afuera de la región de "efecto de gancho" la concentración de analito puede ser determinada usando una parte de una curva de respuesta de dosis. Por otro lado, cuando se determinó que la muestra de prueba cae dentro de la concentración "efecto de gancho", la concentración de analito puede ser determinada usando otra parte de la curva de respuesta de dosis. Alternativamente, la muestra puede simplemente ser diluida para volver a llevar a cabo el ensayo. El presente inventor ha descubierto que tal técnica de detección puede simplemente, rápidamente y exactamente detectar un analito presente a cualquier concentración.