CN104714008B - 一种免疫层析试纸条及其制作方法与检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种免疫层析试纸条，包括：样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫以及背衬板，硝酸纤维素膜包括检测线与质控线，硝酸纤维素膜还包括双抗线。双抗线设置于检测线与质控线之间。本发明提供的免疫层析试纸条及其制作方法与检测方法，不仅保留了传统免疫层析检测试纸条操作简便、结构简单、低成本的优点，还有效避免了传统试纸条在待测物高浓度时产生的假阴性现象，有效提高免疫层析法检测的准确性，扩大了线性检测范围；不局限于检测线的信号强度，而是综合利用显示区上三条线的信号强度以及三者信号强度的关系，因而能够准确地判断待测物的浓度，大大提高了免疫层析检测的灵敏度和特异性。

Description

一种免疫层析试纸条及其制作方法与检测方法

技术领域

本发明涉及免疫层析检测技术，特别涉及增加了一条判定线的免疫层析试纸条及其制作方法与检测方法。

背景技术

免疫层析技术是将免疫标记技术与层析技术结合起来的一种新型检测技术，可以利用标记物的显色特性，实现对待测物的定性、半定量、定量分析。它是以微孔滤膜为固相载体，以待测液为流动相，利用微孔滤膜的毛细作用及虹吸作用引导待测液体向前流动，同时待测液中的相关成分和固定在滤膜上的抗原或抗体发生反应，形成免疫复合物后，滞留在检测线上，通过对标记物颜色的深浅或荧光的光密度分析，从而得到直观的检测结果。

目前，大多数商业化的定点即时检测手段主要是以免疫层析试验(ICA)居多，该试验也被称之为横向测流检测(LFT)。免疫层析试验操作非常简单，结合了免疫学实验的原理与薄层色谱技术，加样后即可在规定时间内如10分钟或20分钟左右得到检测结果。

免疫层析试纸条主要包含五个部分：加样区(样品垫)、标记区(结合垫)、显示区(硝酸纤维素膜)、吸水区(吸水垫)以及背衬板。

样品垫可以是纤维素、玻璃纤维、人造纤维等等滤过性介质，主要目的是过滤样本中的颗粒、调节样本的pH以及结合样本中干扰随后层析反应的成分；结合垫可以是玻璃纤维、聚酯纤维或者人造纤维，主要目的是装载标记物如纳米金标记单抗、二抗等并在层析检测中稳定地释放这些标记物；硝酸纤维素膜的主要作用是固化抗原或者抗体等并提供层析检测反应的场所，在免疫层析实验中主要用接触式或非接触式点样仪在膜上线状固化抗原或抗体等形成检测线(T线)和质控线(C线)；吸水垫一般为高密度的纤维素，是层析反应的动力源，控制着层析反应中待检样品持续流动的方向；背衬则为聚苯乙烯或者其他塑料材料，用于为免疫层析试纸条的层叠结构提供刚性支持。

当样品垫加入待检样品如血清、尿液等，如果待检样品中有靶分子，则与结合垫中的标记物反应形成复合物，在毛细作用下通过硝酸纤维素膜向吸收垫方向流动，并被硝酸纤维素膜上固化的相应的抗原或抗体等配体分子捕获(捕获位置分别在检测线和质控线上)而被肉眼或者与标记物对应的设备检测到。

根据免疫学反应形式的不同可以将免疫层析试纸条分为两种类型：三明治夹心检测和竞争检测。前者利用检测线上固化的捕获抗体或者抗原对分析物进行捕获固定，同时标记抗体或者抗原对分析物进行标记，由此形成夹心结构复合物，主要用于检测具有多个结合位点的较大分析物，人们熟知的早早孕自检试纸条就是利用这种技术。

而竞争检测是待检分析物与检测线上固化的同等分析物竞争结合垫上的抗体或者其他配体标记物，结果的判定与三明治夹心检测法正好相反，主要用于检测只有单个结合位点的小分子分析物。

免疫层析试纸条结果的判读主要有以下两种：一是直接肉眼观察检测线是否显色来判断待测物的有无；二是用相关仪器读取试纸条检测线上的信号强度，给出一个定量或半定量的待测物含量，其信号强度和待测物含量呈正相关关系。

而免疫层析检测法这种检测模式由于其简便、有效、廉价等优点，在目前的定点即时检测中的市场需求依然十分旺盛，基于此检测模式的各种标记分析方式还在不断被开发并应用到如蛋白检测、核酸检测、病毒学、细菌学、抗生素等领域中。

1、现有判定方法容易导致高浓度待测物检验假阴性现象

高浓度的待测物中，会有大量的未与标记区抗体结合的游离抗原剩余，该游离抗原层析的速度会快于待测物中与标记区抗体结合形成的免疫复合物的层析速度，从而抢先与T线的抗体相结合，占用结合位点，导致免疫复合物无位点空间和T线结合，从而表现出假阴性。

由于免疫层析检测有其操作简单、无需专业人员操作等优点，就要求其所用的免疫层析试纸条必须结构简单、体积短小、便于携带及操作。

理论上讲，当在加样区滴加待测物后，经过标记区时，待测物应该与标记的抗体混合接触，特异性结合后形成免疫复合物，形成的免疫复合物再继续向前流经显示区发生反应并显示检测结果。

而因为其体积短小，长度较短，当在加样区滴加待测物后，在毛细作用下，待测液体被快速虹吸经过标记区、显示区。因为待测物与标记的抗原或抗体接触的时间较短，必然会存在抗原抗体反应不充分的现象，那么就会有未被捕获的待测物和已经形成的免疫复合物共同虹吸至显色区，而免疫复合物因为比游离待测物空间位阻大，其流动速度要落后于游离的待测物，所以就会有未被捕获的待测物先于免疫复合物到达检测线上，与固定在显示区的抗原或抗体反应，占据理论上本该结合免疫复合物的位点，导致检测线上滞留的免疫复合物减少，检测线上的信号强度就会比理论上的弱，所以容易出现假阴性的结果。

2、目前试纸条结果的判读方法中，只要质控线显色，无论是肉眼观察还是仪器读取结果，大都只是观察检测线上的信号强度，结果判定依据单一，容易产生误差。

由于传统的基于纳米金的免疫层析试纸条是肉眼直接观察，灵敏度有限，其他方法，例如酶法、银染增强法、化学发光法或是荧光法，有的需要荧光激发，产生化学发光，配合检测设备进行检查，操作复杂且成本较高。

本领域技术人员致力于提供一种免疫层析试纸条及其制作方法与检测方法，既能够操作简单且成本较低，又能够有效降低免疫层析检测假阴性现象的发生率，具有更高的灵敏度。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种免疫层析试纸条，硝酸纤维素膜除了检测线与质控线，还包括双抗线，能够有效降低免疫层析检测假阴性现象的发生率，具有更高的灵敏度。

本发明还提供一种免疫层析试纸条的制作方法。

本发明还提供一种双抗线免疫层析检测方法，与现有的免疫层析检测中单独质控线辅助判定法相比，能够有效降低免疫层析检测假阴性现象的发生率，灵敏度更高、特异性更强、检测快速且操作简便。

本发明提供一种免疫层析试纸条，包括：样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫以及背衬板，硝酸纤维素膜包括检测线与质控线，硝酸纤维素膜还包括双抗线。

本发明的免疫层析试纸条，包含新的判定线，即双抗线，该判定线根据其组成成分命名的，因其含有抗原和抗体，故名为双抗。其中抗体的作用是固定抗原，不参与检测过程中的反应；抗原的作用是在检测过程中捕获标记抗体。

进一步地，双抗线设置于检测线与质控线之间。

进一步地，双抗线包括抗原，抗原为与待测物相同的纯抗原溶液。

进一步地，双抗线还包括与抗原对应的抗体，抗原被抗体结合并固定在硝酸纤维素膜上。

进一步地，标记抗体为胶体金、磁性纳米粒子、量子点或上转换纳米材料中的一种。

本发明还提供一种免疫层析试纸条的制作方法，包括以下步骤：

(1)制作标记抗体；

(2)将标记抗体固定于结合垫；

(3)在硝酸纤维素膜上制作检测线、双抗线及质控线；

(4)制作样品垫；

(5)在背衬板上依次粘贴样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，各相邻垫之间相互重叠约1.5mm。

硝酸纤维素膜最靠近背衬板，结合垫和吸水垫分别搭接在硝酸纤维素膜的两端，样品垫搭接在结合垫的另一端。

进一步地，步骤(3)中在硝酸纤维素膜上制作双抗线包括以下步骤：

(31)采用多克隆抗体溶液在硝酸纤维素膜的双抗线区域喷一条待测物的抗体线，抗体线的宽度、长度与检测线的宽度、长度相同；

(32)用聚乙二醇(PEG)和N-羟基丁二酰亚胺(NHs)处理过的抗原溶液喷在双抗线区域；

(33)双抗线区域发生抗原抗体的免疫反应后，抗体的Fab端(Fab端为一个抗体分子上的两个抗原结合位点)被抗原结合封闭，使得抗原分子通过抗原-抗体结合作用力而间接固定在硝酸纤维素膜上。

本发明还提供一种使用免疫层析试纸条的检测方法，包括以下步骤：

(1)将待测样品加入免疫层析试纸条的样品垫；

(2)采用检测仪检测免疫层析试纸条检测线上的信号强度；

(3)根据免疫层析试纸条的信号强度与浓度对应的二次函数，以及步骤(2)中读取的信号强度，得到信号强度对应的两个浓度值，其中一个为位于二次函数曲线最高点左侧的第一浓度值，另一个为位于最高点右侧的第二浓度值；

(4)比较免疫层析试纸条的双抗线和质控线的信号强度，如果双抗线上的信号强度大于质控线上的信号强度，则待测样品中待测物的浓度为第一浓度值；如果双抗线上的信号强度小于质控线上的信号强度，则待测样品中待测物的浓度为第二浓度值。

进一步地，步骤(3)中免疫层析试纸条的信号强度与浓度对应的二次函数获得的方法包括以下步骤：

(31)配制一组浓度梯度的待测物标准液，滴加到免疫层析试纸条的样品垫上；

(32)5～20分钟后用检测仪检测硝酸纤维素膜上检测线、双抗线、质控线的信号强度；

(33)分别将步骤(32)中得到的信号强度及其所对应的待测物浓度进行Log函数变换；

(34)以变换后的待测物浓度值作X轴，以变换后的信号强度值作Y轴，分别作出检测线、双抗线及质控线的标准曲线；

(35)得出检测线上信号强度与浓度对应的二次函数公式。

与现有技术相比，本发明提供的免疫层析试纸条及其制作方法与检测方法具有以下有益效果：

(1)不仅保留了传统免疫层析检测试纸条操作简便、结构简单、低成本的优点，还有效避免了传统试纸条在待测物高浓度时产生的假阴性现象，有效提高免疫层析法检测的准确性，扩大了线性检测范围；

(2)不局限于检测线的信号强度，而是综合利用显示区上三条线的信号强度以及三者信号强度的关系，因而能够准确地判断待测物的浓度，大大提高了免疫层析检测的灵敏度和特异性。

附图说明

图1是本发明的一个实施例的免疫层析试纸条的结构示意图；

图2是图1所示的免疫层析试纸条的检测线、双抗线及质控线的标准曲线。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不局限于此。

本发明所述的标记粒子可以为胶体金、磁性纳米粒子、量子点或上转换纳米材料等任一种。

如图1所示，本发明的一个实施例的免疫层析试纸条，包括样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜7、吸水垫8以及背衬板1，硝酸纤维素膜7包括检测线4与质控线6，硝酸纤维素膜7还包括双抗线5。

双抗线5设置于检测线4与质控线6之间。

双抗线5包括抗原，抗原为与待测物相同的纯抗原溶液。

双抗线5还包括与抗原对应的抗体，抗原被抗体结合并固定在硝酸纤维素膜上。

标记抗体为胶体金、磁性纳米粒子、量子点或上转换纳米材料中的一种。

双抗线的固定方式是：先用抗体溶液在硝酸纤维素膜双抗线区域(质控线和检测线之间)喷一条待测物的抗体线，宽度长度同质控线和检测线，再将用聚乙二醇(PEG)和N-羟基丁二酰亚胺(NHs)处理过的待测物液体喷在相同位置，待该区域发生抗原抗体的免疫反应，抗体的Fab端被抗原结合封闭，则待测物靶分子通过抗原-抗体结合作用力而间接固定在硝酸纤维素膜上。

试纸条其余制作步骤同现有方法：显示区包含有检测线、双抗线和质控线。其中，检测线包被有与待测物相关的抗原或者抗体，质控线包被有与标记区抗原或抗体相对应的特异性反应物(通常是IgG多抗)。标记区的结合垫上固定有标记抗体。最后将样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜7、吸水垫8几部分材料依次搭接粘贴在背衬板上，如图1所示。

本实施例的免疫层析试纸条采用如下方法制作，包括以下步骤：

(1)制作标记抗体；

(2)将标记抗体固定于结合垫；

(3)在硝酸纤维素膜上制作检测线、双抗线及质控线；

(4)制作样品垫；

(5)在背衬板上依次粘贴样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜7、吸水垫8，各相邻垫之间相互重叠约1.5mm。

硝酸纤维素膜最靠近背衬板，结合垫和吸水垫分别搭接在硝酸纤维素膜的两端，样品垫搭接在结合垫的另一端。

步骤(3)中在硝酸纤维素膜上制作双抗线包括以下步骤：

(31)采用多克隆抗体溶液在硝酸纤维素膜的双抗线区域喷一条待测物的抗体线，抗体线的宽度、长度与检测线的宽度、长度相同；

(32)用聚乙二醇(PEG)和N-羟基丁二酰亚胺(NHs)处理过的抗原溶液喷在双抗线区域；

(33)双抗线区域发生抗原抗体的免疫反应后，抗体的Fab端被抗原结合封闭，使得抗原分子通过抗原-抗体结合作用力而间接固定在硝酸纤维素膜上。

Fab是抗原结合片段，直接结合抗原。一个抗体分子上的两个抗原结合部位是相同的，位于两臂末端称抗原结合片段(antigen-binding fragment,Fab)。"Y"的柄部称结晶片段(crystalline fragment，FC)，糖结合在FC上。

以下具体说明胶体金标记的单克隆抗体检测C反应蛋白的双抗线快速检测试纸条的制作方法。

步骤一：胶体金偶联C反应蛋白抗体

把1ml粒径为20nm的胶体金溶液置于0.1ml的硼酸盐缓冲液(PH9.0，0.005M)，混合待用；用PBS缓冲液将抗CRP单克隆抗体稀释到1mg/ml待用。取10ulCRP单抗与胶体金液体混合，室温下反应30分钟，30分钟后再加入0.1ml含有1mgBSA的PBS缓冲液，4℃封闭反应60分钟，封闭后在10℃,12000rpm离心15分钟，弃上清后用10mM的Tris-HCl洗涤两次，保存液(10mM Tris–HCl,pH 7.4,0.1％BSA,0.05％NaN3)保存后即得胶体金标记物探针。

步骤二：结合垫的处理及标记抗体的固定

1.将玻璃纤维素膜浸泡在含有5％蔗糖、2％海藻糖、0.02M BST缓冲液中1小时润湿后，28℃干燥1小时即得结合垫。

2.所得胶体金偶联抗C反应蛋白抗体复合物，按照15cm/ml的用量均匀喷涂在结合垫上，静置20分钟后，置于28℃恒温干燥箱干燥1小时，封袋置于4℃保存备用。

步骤三：硝酸纤维素膜的选取及抗体的固定

1.硝酸纤维素膜选自商品化的Millipore135，孔径8um。

2.用PH7.0的PBS缓冲液分别将抗C反应蛋白多克隆抗体、C反应蛋白、抗鼠IgG稀释到1mg/ml。配制含有1％NHS-PEG的10mM的PB缓冲液并将其与1mg/ml的C反应蛋白混合反应1小时。

3.用Bio Dot喷膜机在硝酸纤维素膜上分别包被抗原或抗体制备出检测线、双抗线及质控线。检测线上喷膜1mg/ml的抗C反应蛋白多克隆抗体，质控线上喷膜1mg/ml的抗鼠IgG，双抗线上先喷一条1mg/ml的抗C反应蛋白多克隆抗体，液体干燥后，在同位置喷1mg/ml已与NHS-PEG反应的C反应蛋白。各线之间间隔距离约3mm，线条宽度约0.8mm。喷膜完成后放在28℃恒温干燥箱干燥1小时，封袋置于4℃保存备用。

步骤四：样品垫的处理

将玻璃纤维素膜浸泡在含有2％NaCl、0.5％BSA、TritonX-100、0.02M BS缓冲液中1小时润湿后，28℃干燥1小时，封袋置于4℃保存备用。

步骤五：试纸条的组装

在背衬板上依次粘贴所得样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，各相邻垫之间相互重叠约1.5mm。试纸条组装完成后，用自动切膜机将完成组装的试纸条进行切割，宽度约4mm，将做好的试纸条与干燥剂一起装入铝箔袋内密封保存。

步骤六：试纸条检测结果的判定

配制一组浓度梯度的C反应蛋白标准液，分别滴加到上述制备好的免疫层析试纸条上，5～20分钟后用检测仪检测硝酸纤维素膜上检测线、双抗线、质控线的信号强度，并将信号强度及其所对应的C反应蛋白浓度作Log函数变换，以变换后的浓度值作X轴，以变换后的信号强度值作Y轴，分别作出检测线、双抗线及质控线的标准曲线，得出检测线上信号强度与浓度对应的二次函数公式。

根据待测样品对应的检测线信号强度，利用已得出的二次函数公式，可计算出出同一个信号强度对应的两个浓度值，函数曲线最高点左侧一个低浓度值和最高点右侧一个高浓度值，再通过比较双抗线和质控线的信号强度大小关系，如果双抗线上的信号强度大于质控线上的信号强度，则选取低浓度值，反之则选取高浓度值。

采用本实施例的免疫层析试纸条的检测方法，包括以下步骤：

(1)将待测样品加入免疫层析试纸条的样品垫；

(2)采用检测仪检测免疫层析试纸条检测线上的信号强度；

(3)根据免疫层析试纸条的信号强度与浓度对应的二次函数，以及步骤(2)中读取的信号强度，得到信号强度对应的两个浓度值，其中一个为位于二次函数曲线最高点左侧的第一浓度值，另一个为位于最高点右侧的第二浓度值；

(4)比较免疫层析试纸条的双抗线和质控线的信号强度，如果双抗线上的信号强度大于质控线上的信号强度，则待测样品中待测物的浓度为第一浓度值；如果双抗线上的信号强度小于质控线上的信号强度，则待测样品中待测物的浓度为第二浓度值。

进一步地，步骤(3)中免疫层析试纸条的信号强度与浓度对应的二次函数获得的方法包括以下步骤：

(31)配制一组浓度梯度的待测物标准液，滴加到免疫层析试纸条的样品垫上；

(32)5～20分钟后用检测仪检测硝酸纤维素膜上检测线、双抗线、质控线的信号强度；

(33)分别将步骤(32)中得到的信号强度及其所对应的待测物浓度进行Log函数变换；

(34)以变换后的待测物浓度值作X轴，以变换后的信号强度值作Y轴，分别作出检测线、双抗线及质控线的标准曲线；

(35)得出检测线上信号强度与浓度对应的二次函数公式。

本发明原理是：当待测液(内含靶分子抗原)滴在加样区，在毛细作用下，液体从检测线端向吸水纸端不断渗移，在此渗移过程中检测线上可能截留的物质包括未与标记区标记抗体反应的游离抗原和在标记区发生抗原-抗体免疫反应的复合物。双抗线上可能截留的物质是标记区内未与抗原发生免疫反应的标记抗体。质控线上可能截留的物质包括标记区未与抗原发生免疫反应的标记抗体和无法停留在检测线上的抗原-抗体免疫复合物。随着待测液中抗原浓度由零逐渐升高时，抗原、抗体在标记区反应相对完全，被捕获在检测线上的免疫复合物逐渐增多，信号数值增大。被捕获在双抗线和质控线上未与抗原反应的标记抗体均逐渐减少，信号数值降低。

而当待测液中抗原浓度超过一定浓度时，在标记区抗原、抗体反应不完全，会有大量的未反应游离抗原残留，继续参与渗移现象。由于单纯的抗原层析速度大于抗原抗体免疫复合物，优先被捕获在检测线上，占用了检测线上抗体的结合位点，从而导致检测线上捕获的免疫复合物逐渐减少，数值逐渐减小，而逐渐增多的免疫复合物均被捕获在质控线上，出现假阴性现象。该情况下，被捕获在双抗线上未与抗原反应的标记抗体仍然是逐渐减少，数值减弱。

根据此现象，用检测仪检测显示区检测线、双抗线、质控线的信号强度，并将信号强度及其所对应的抗原浓度作Log函数变换，以变换后的浓度值作X轴，以变换后的信号强度值作Y轴，分别作出检测线、双抗线及质控线的标准曲线图，如图2所示，得出检测线上信号强度与浓度对应的二次函数公式。

根据该公式可以准确的计算出待测液中抗原的浓度范围及准确数值。图2中，1为检测线，2为质控线，3为双抗线，横坐标为待测液中抗原浓度，纵坐标为信号数值。

如图2所示，质控线、双抗线的交点和检测线纵坐标的最大值几乎在同一垂直线。选取相对对称的检测线曲线作为计算曲线，双抗线和质控线曲线作为辅助判别曲线。

从检测线的趋势线图我们可以观察到，在曲线最高点的左右两侧均出现同一纵坐标数值对应不同大小两个横坐标数值，并且这两个横坐标数值出现在检测线曲线纵坐标最大值所对应的横坐标数值两侧，数值一大一小。此时，需要借助双抗线和质控线来进一步定量判定待测液中抗原浓度(横坐标单位)的范围。

选取方法是比较同一横坐标刻度所对应的双抗线和质控线的纵坐标数值大小，如果双抗线上的纵坐标数值大于质控线上的纵坐标数值，则判定为计算出的横坐标上较小的低浓度数值。反之，如果双抗线上的纵坐标数值小于质控线上的纵坐标数值，则判定为计算出的横坐标上较大的高浓度数值。按照此函数曲线计算，则无论待测液中抗原浓度过低或过高都能有效的避免传统试纸条产生的误差及准确判定高浓度抗原待测物引起的假阴性现象。

本发明提供的免疫层析试纸条及其制作方法与检测方法，不仅保留了传统免疫层析检测试纸条操作简便、结构简单、低成本的优点，还有效避免了传统试纸条在待测物高浓度时产生的假阴性现象，有效提高免疫层析法检测的准确性，扩大了线性检测范围；不局限于检测线的信号强度，而是综合利用显示区上三条线的信号强度以及三者信号强度的关系，因而能够准确地判断待测物的浓度，大大提高了免疫层析检测的灵敏度和特异性。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (6)

1.一种免疫层析试纸条，包括：样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫以及背衬板，所述硝酸纤维素膜包括检测线与质控线，其特征在于，所述硝酸纤维素膜还包括双抗线；

其中，所述双抗线设置于所述检测线与所述质控线之间；

所述双抗线包括抗原，所述抗原为与待测物相同的纯抗原溶液；所述双抗线还包括与所述抗原对应的抗体，所述抗原被所述抗体结合并固定在所述硝酸纤维素膜上。

2.如权利要求1所述的免疫层析试纸条，其特征在于，所述结合垫上有标记抗体，所述标记抗体的材料为胶体金、磁性纳米粒子、量子点或上转换纳米材料中的一种。

3.一种如权利要求1或2所述的免疫层析试纸条的制作方法，其特征在于，所述制作方法包括以下步骤：

(1)制作标记抗体；

(2)将所述标记抗体固定于结合垫；

(3)在硝酸纤维素膜上制作检测线、双抗线及质控线；

(4)制作样品垫；

(5)在背衬板上依次粘贴所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，各相邻垫之间相互重叠约1.5mm。

4.如权利要求3所述的制作方法，其特征在于，步骤(3)中在硝酸纤维素膜上制作双抗线包括以下步骤：

(31)采用多克隆抗体溶液在所述硝酸纤维素膜的双抗线区域喷一条待测物的抗体线，所述抗体线的宽度、长度与所述检测线的宽度、长度相同；

(32)用聚乙二醇(PEG)和N-羟基丁二酰亚胺(NHs)处理过的抗原溶液喷在所述双抗线区域；

(33)所述双抗线区域发生抗原抗体的免疫反应后，所述抗体的Fab端被抗原结合封闭，使得抗原分子通过抗原-抗体结合作用力而间接固定在所述硝酸纤维素膜上。

5.一种使用如权利要求1或2所述的免疫层析试纸条的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：

(1)将待测样品加入免疫层析试纸条的样品垫；

(2)采用检测仪检测免疫层析试纸条检测线上的信号强度；

(3)根据免疫层析试纸条的信号强度与浓度对应的二次函数，以及步骤(2)中读取的信号强度，得到所述信号强度对应的两个浓度值，其中一个为位于所述二次函数曲线最高点左侧的第一浓度值，另一个为位于所述最高点右侧的第二浓度值；

(4)比较所述免疫层析试纸条的双抗线和质控线的信号强度，如果所述双抗线上的信号强度大于所述质控线上的信号强度，则所述待测样品中待测物的浓度为第一浓度值；如果所述双抗线上的信号强度小于所述质控线上的信号强度，则所述待测样品中待测物的浓度为第二浓度值。

6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中免疫层析试纸条的信号强度与浓度对应的二次函数获得的方法包括以下步骤：

(31)配制一组浓度梯度的待测物标准液，滴加到所述免疫层析试纸条的样品垫上；

(32)5～20分钟后用检测仪检测硝酸纤维素膜上检测线、双抗线、质控线的信号强度；

(33)分别将步骤(32)中得到的信号强度及其所对应的待测物浓度进行Log函数变换；

(34)以变换后的待测物浓度值作X轴，以变换后的信号强度值作Y轴，分别作出检测线、双抗线及质控线的标准曲线；

(35)得出检测线上信号强度与浓度对应的二次函数公式。