ES2761427T3

ES2761427T3 - Procedimientos para reducir interferencias

Info

Publication number: ES2761427T3
Application number: ES15813391T
Authority: ES
Inventors: Barbara Upmeier; Toralf Zarnt; Johannes Polz
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2014-12-18
Filing date: 2015-12-17
Publication date: 2020-05-19
Anticipated expiration: 2035-12-17
Also published as: US11156610B2; JP2018501483A; CN107003307A; CN107003307B; US20180128825A1; EP3234601B1; WO2016097116A1; JP6850254B2; EP3234601A1; US20220057393A1

Abstract

Un procedimiento para determinar un analito en una muestra sospechosa de comprender dicho analito, que comprende a) poner en contacto con dicha muestra al menos un primer y un segundo compuesto de captura para dicho analito, en el que dichos primer y segundo compuestos de captura son compuestos de captura no idénticos mensurablemente diferentes en al menos una propiedad química y/o física, en el que dichos compuestos de captura compiten en la unión a dicho analito, y en el que dichos compuestos de captura son polipéptidos; b) poner en contacto dichos compuestos de captura en contacto con dicha muestra con un especificador enlazado a un indicador, en el que dicho especificador compite en la unión a dichos compuestos de captura con dicho analito; c) determinar la cantidad de complejos que comprenden dicho especificador y un compuesto de captura; y d) determinar dicho analito en una muestra en base al resultado de la etapa c), en el que dicho segundo compuesto de captura se deriva o se puede derivar de dicho primer compuesto de captura por al menos uno de: (i) introducir al menos un intercambio de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de dicho primer compuesto de captura, (ii) producir dicho segundo compuesto de captura en un fondo celular diferente en comparación con dicho primer compuesto de captura, (iii) eliminar o prevenir la glucosilación de dicho segundo compuesto de captura en comparación con dicho primer compuesto de captura, (iv) purificar dicho segundo compuesto de captura por diferentes medios y/o por un procedimiento diferente en comparación con dicho primer compuesto de captura, (v) desnaturalizar y/o replegar dicho segundo compuesto de captura en diferentes condiciones en comparación con dicho primer compuesto de captura, y (vi) almacenar dicho segundo compuesto de captura en diferentes condiciones en comparación con dicho primer compuesto de captura.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimientos para reducir interferencias

Campo de la invención

La presente divulgación se refiere a un procedimiento para determinar un analito en una muestra sospechosa de comprender dicho analito, que comprende a) poner en contacto con dicha muestra al menos un primer y un segundo compuesto de captura para dicho analito, en el que dichos primer y segundo compuestos de captura son compuestos de captura no idénticos, y en el que dichos compuestos de captura compiten en la unión a dicho analito; b) poner en contacto dichos compuestos de captura en contacto con dicha muestra con un especificador, en el que dicho especificador compite en la unión a dichos compuestos de captura con dicho analito; c) determinar la cantidad de complejos que comprenden dicho especificador y un compuesto de captura; y d) determinar dicho analito en una muestra en base al resultado de la etapa c). La presente divulgación se refiere además a un procedimiento para mejorar la especificidad de un inmunoensayo indirecto para determinar un analito, que comprende reemplazar al menos un 10 % de un compuesto de captura por un compuesto de captura no idéntico; en el que el compuesto de captura reemplazado compite en la unión a dicho analito con el compuesto de captura introducido. La presente divulgación se refiere además a kits, dispositivos y usos relacionados con los procedimientos mencionados anteriormente.

Técnica relacionada

Las pruebas de laboratorio, en particular las pruebas inmunológicas, se han convertido en herramientas inestimables en el diagnóstico de enfermedad. Los inmunoensayos en particular han proporcionado la posibilidad de detectar específicamente analitos individuales o grupos de analitos en mezclas complejas, por ejemplo, líquidos corporales, tales como sangre o plasma. Sin embargo, se han identificado varias causas de interferencia en inmunoensayos, por ejemplo, reactividad cruzada de una sustancia interferente con un compuesto de captura, unión inespecífica del compuesto detector a una fase sólida, unión "puente" del compuesto de captura y el compuesto detector por anticuerpos heterófilos o, en particular, anticuerpos humanos anti-ratón (HAMA), por nombrar algunos (véase, por ejemplo, Park & Kricka (2013), capítulo 5.3- Interferences in Immunoassay, en The Immunoassay Handbook (cuarta edición), editado por David Wild, Elsevier, Oxford: 403; Schiettecatte (2012), Interferences in Immunoassays, Advances in Immunoassay Technology, Dr. Norman H.L. Chiu (Ed.)).

En inmunoensayos competitivos, los analitos comprendidos en una muestra compiten con un analito marcado (especificador) para unirse a un compuesto de captura, que con frecuencia es un anticuerpo, o, en caso de que la presencia de anticuerpos para por ejemplo, un agente patógeno se vaya a someter a prueba en una muestra de suero, un antígeno de dicho agente patógeno. En caso de que la concentración de analito en la muestra sea alta, existe una fuerte competencia, que da lugar a una disminución en la unión del especificador al compuesto de captura, provocando una reducción de señal que, dependiendo del formato de prueba, da lugar a un resultado de prueba cuantitativa o cualitativa. Es una desventaja de los inmunoensayos conocidos en la técnica que los antígenos usados como compuesto de captura también pueden estar unidos por compuestos interferentes de la muestra. Estos compuestos interferentes compiten con el especificador para unir epítopos del compuesto de captura. Dependiendo de lo fuerte que sea la competencia, los resultados de prueba falsos son posibles, lo que provoca una disminución de la especificidad del inmunoensayo respectivo. Esta disminución en la especificidad puede ser especialmente pronunciada si se usan compuestos de captura complejos, potencialmente que incluso consisten en varias subunidades con un gran número de epítopos conformacionales, por ejemplo, cápsides víricas. En dichos casos, los procedimientos clásicos de eliminación de interferencia, por ejemplo, la adición de dianas alternativas para los compuestos interferentes, pueden ser ineficaces.

En inmunoensayos no competitivos, el analito se detecta poniendo en contacto el analito con un compuesto que se une específicamente al analito y que lleva un marcador en sí o bien que es la diana de una segunda molécula que lleva un marcador. Por tanto, en inmunoensayos no competitivos, la cantidad de analito se determina determinando la cantidad de complejos formados entre el analito y un compuesto detector que lleva un marcador. En consecuencia, los problemas de especificidad análogos se pueden afrontar como se describe anteriormente.

Los antígenos que inmunológicamente son solo ligeramente diferentes (por ejemplo, por una producción en un sistema de expresión diferente, secuencia de aminoácidos diferente, diferencia en glucosilación, diferencias en los procedimientos de purificación y replegamiento, así como diferencias en las condiciones amortiguadoras y de almacenamiento) tienen un alcance individual de interferencias. En consecuencia, las muestras que dan lugar a un resultado falso en un inmunoensayo con el antígeno X1 pueden proporcionar resultados correctos en una prueba con el antígeno X2 y viceversa. En consecuencia, el intercambio de un antígeno por un antígeno diferente con frecuencia no da lugar a una mejora de la especificidad, sino solo a un cambio del alcance de las muestras que dan lugar a resultados falsos.

El documento WO 2010/075475 A1 describe un anticuerpo para sFlt-1 y ensayos relacionados con el mismo, incluyendo el uso de sFlt-1 marcado de manera detectable en un ensayo competitivo. El documento WO 2014/195899 A1 describe un procedimiento para prevenir la agregación de partículas de detección en una prueba para detectar un analito diana multiepítopo que comprende dos o más epítopos similares o idénticos en una muestra. El documento EP 1683872 A1 enseña un procedimiento para incrementar la discriminación para un ADN diana que tiene un sitio polimórfico por adición de un ADN obstáculo y la variación de una base de sonda.

Problema que se va a resolver

Por lo tanto, es un objetivo de la presente invención proporcionar inmunoensayos mejorados evitando los problemas como se describe anteriormente.

Sumario de la invención

Estos problemas se resuelven por los procedimientos, kits, dispositivos y composiciones con los rasgos característicos de las reivindicaciones independientes. Los modos de realización típicos, que se podrían lograr de forma aislada o en cualquier combinación arbitraria, se enumeran en las reivindicaciones dependientes.

En consecuencia, la presente invención se refiere a un procedimiento para determinar un analito en una muestra sospechosa de comprender dicho analito de acuerdo con la reivindicación 1.

Además, la presente divulgación se refiere a un procedimiento para determinar un analito en una muestra sospechosa de comprender dicho analito, que comprende

a) poner en contacto con dicha muestra al menos un primer y un segundo compuesto de captura para dicho analito, en el que dichos primer y segundo compuestos de captura son compuestos de captura no idénticos, y en el que dichos compuestos de captura compiten en la unión a dicho analito;

b) poner en contacto dichos compuestos de captura en contacto con dicha muestra con un especificador, en el que dicho especificador compite en la unión a dichos compuestos de captura con dicho analito;

c) determinar la cantidad de complejos que comprenden dicho especificador y un compuesto de captura; y d) determinar dicho analito en una muestra en base al resultado de la etapa c).

Como se usa a continuación, los términos "tener", "comprender" o "incluir" o cualquier variación gramatical arbitraria de los mismos se usan de forma no exclusiva. Por tanto, estos términos se pueden referir tanto a una situación en la que, además del rasgo característico introducido por estos términos, no están presentes otros rasgos característicos en la entidad descrita en este contexto como a una situación en la que están presentes uno o más rasgos característicos adicionales. Como ejemplo, las expresiones "A tiene B", "A comprende B" y "A incluye B" se pueden referir tanto a una situación en la que, además de B, ningún otro elemento está presente en A (es decir, una situación en la que A consiste única y exclusivamente en B) como a una situación en la que, además de B, uno o más elementos adicionales están presentes en la entidad A, tales como elemento C, elementos C y D o incluso otros elementos.

Además, como se usa a continuación, los términos "preferentemente", "más preferentemente", "lo más preferentemente", "en particular", "más en particular", "específicamente", "más específicamente" o términos similares se usan junto con rasgos característicos opcionales, sin restringir posibilidades alternativas. Por tanto, los rasgos característicos introducidos por estos términos son rasgos característicos opcionales. La invención, como reconocerá un experto en la técnica, se puede realizar usando rasgos característicos alternativos. De forma similar, los rasgos característicos introducidos por "en un modo de realización de la invención" o expresiones similares están destinados a ser rasgos característicos opcionales, sin ninguna restricción con respecto a modos de realización alternativos de la invención, sin ninguna restricción con respecto a la posibilidad de combinar los rasgos característicos introducidos de dicha forma con otros rasgos característicos opcionales o no opcionales de la invención. El término "aproximadamente" en el contexto de valores o proporciones específicos de la presente invención se refiere a dicho valor o proporción /- 30 %, /- 20 %, /- 10 %, o, en un modo de realización, /- 5 % de un valor o proporción dado.

El procedimiento de la presente invención es un procedimiento in vitro. Además, puede comprender etapas además de las mencionadas específicamente. En particular, la etapa b) puede comprender las etapas de proporcionar una muestra, o la etapa c) puede comprender la adición de otros compuestos para facilitar la unión y detección. Además, algunas o todas las etapas pueden estar asistidas por equipo automatizado.

Como se usa en el presente documento, el término "determinar" se refiere a determinar al menos un rasgo característico inmunológico de un analito que se va a determinar por el procedimiento de la presente invención en la muestra. Los rasgos característicos inmunológicos de acuerdo con la presente invención, en un modo de realización, son rasgos característicos estructurales del analito que facilitan la detección del analito en una muestra por medios inmunológicos. En un modo de realización, dichos rasgos característicos inmunológicos facilitan la identificación, en otro modo de realización, la cuantificación, del analito por medios inmunológicos. En consecuencia, los rasgos característicos inmunológicos típicos son rasgos característicos que facilitan la diferenciación de dicho analito de otros compuestos químicos en una muestra. En un modo de realización, determinar un analito es establecer si un analito está presente o ausente en la muestra a una concentración por encima del límite de detección del procedimiento. Los procedimientos de determinación de un límite de detección son conocidos por el experto en la técnica. En otro modo de realización, determinar es determinar semicuantitativa o cuantitativamente la cantidad o concentración de un analito en una muestra. Para la determinación cuantitativa, se determinará la cantidad absoluta o precisa del analito o bien se determinará la cantidad relativa del analito. La cantidad relativa se puede determinar en un caso donde la cantidad precisa de un analito no se puede detectar o no se detectará. En dicho caso, se puede determinar si la cantidad en la que el analito está presente se incrementa o disminuye con respecto a una segunda muestra que comprende dicho analito en una segunda cantidad.

Como se entenderá por el experto en la técnica, típicamente no habrá ningún requisito para determinar los complejos de primer compuesto de captura/analito y segundo compuesto de captura/analito por separado. Por tanto, en un modo de realización, los complejos del primer compuesto de captura y analito y del segundo compuesto de captura y analito se determinan juntos, es decir, de manera indiscriminada entre dicho primer y dicho segundo compuesto de captura. Por tanto, en un modo de realización, se determina la cantidad total de analito presente en un complejo con el primer compuesto de captura o bien el segundo compuesto de captura.

Como se entenderá por el experto en la técnica, la determinación del complejos analito/compuesto de captura dependerá del formato de ensayo elegido. En un modo de realización, el ensayo es un inmunoensayo competitivo, típicamente un inmunoensayo competitivo heterogéneo, es decir, un inmunoensayo, en el que un analito compite con un derivado marcado de dicho analito por la unión a un compuesto de captura unido a una superficie sólida, y en el que se determina la cantidad de derivado marcado de dicho analito unido a dicho compuesto de captura. En un modo de realización, el ensayo competitivo es un ensayo para anti-HBc, anti-VHA (anti virus de la hepatitis A), anti-HBe (anti antígeno e de la hepatitis B), folato, folato RbC (eritrocito), anti-TSH-R, vitamina D total, vitamina B12, tiroxina T4, FT 4 (tiroxina libre), tiroxina T3, FT 3 (triyodotironina libre), testosterona, progesterona, digitoxina, anti-TG, anti-TPO (anti peroxidasa tiroidea), DGEA o estradiol. En otro modo de realización, el inmunoensayo es un ensayo de tipo sándwich de doble antígeno ("DAGS") en el que un analito bivalente, por ejemplo, un anticuerpo, se une a un compuesto de captura unido a una superficie sólida, y en el que la cantidad de complejos analito/compuesto de captura se determina por la unión de un compuesto detector como se especifica en el presente documento a continuación para dichos complejos analito/compuesto de captura. En un modo de realización, el ensayo DAGS es un ensayo para IgG anti-toxoplasma, IgG anti-rubéola, anti-HBs 1G, VHC (virus de la hepatitis C), por ejemplo, VHC II, IgG CMV (citomegalovirus), sífilis, VIH (virus de la inmunodeficiencia humana) o Chagas (tripanosomiasis americana).

El término "molécula biológica" es conocido por el experto en la técnica y, típicamente, se refiere a una molécula producida por el metabolismo de al menos un organismo. En consecuencia, el término "macromolécula biológica" se refiere a un polímero producido por un organismo, en un modo de realización, a partir de precursores monómeros. Una macromolécula biológica típica es un polipéptido, ADN, ARN o un polisacárido.

El término "analito", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula química, en un modo de realización, una molécula orgánica, que se une al compuesto de captura y/o compuesto detector con afinidad suficiente para permitir la detección de un complejo analito/compuesto de captura y/o compuesto detector. En un modo de realización, la constante de disociación (Kd) del complejo analito/ligando es como máximo 10-7 mol/l, en otro modo de realización, como máximo 10-8 mol/l, en otro modo de realización, como máximo 10-9 mol/l. En un modo de realización, la constante de disociación del complejo formado entre el primer compuesto de captura y el analito y la constante de disociación del complejo formado entre el segundo compuesto de captura y el analito son diferentes en no más de un factor de cinco; en un modo de realización en no más de un factor de dos; en otro modo de realización en no más de un factor de 1,5. En un modo de realización, la constante de disociación del complejo formado entre el primer compuesto de captura y el analito tiene un valor de desde un 70 % a un 130 % de la constante de disociación del complejo formado entre el segundo compuesto de captura y el analito. En otro modo de realización, la constante de disociación del complejo formado entre el primer compuesto de captura y el analito tiene un valor de desde un 80 % a un 120 % de la constante de disociación del complejo formado entre el segundo compuesto de captura y el analito. En otro modo de realización, la constante de disociación del complejo formado entre el primer compuesto de captura y el analito tiene un valor de desde un 90 % a un 110 % de la constante de disociación del complejo formado entre el segundo compuesto de captura y el analito. En otro modo de realización, la constante de disociación del complejo formado entre el primer compuesto de captura y el analito y la constante de disociación del complejo formado entre el segundo compuesto de captura y el analito son esencialmente iguales o son iguales. En un modo de realización, el analito tiene una masa molecular de al menos 100 (correspondiente a 100 unidades de masa atómica, y a 100 Da; 1 Da correspondiente a 1,66x10-27 kg), en otro modo de realización, al menos 250, en otro modo de realización, al menos 500, o, en otro modo de realización, al menos 1000. En un modo de realización, el analito es una molécula biológica, en otro modo de realización, el analito es una macromolécula biológica. En otro modo de realización, el analito es un polipéptido.

En un modo de realización, en caso de que el analito sea un polipéptido, el polipéptido es un antígeno producido por un agente infeccioso, por ejemplo, un virus o bacteria, o un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo producido por un sujeto frente a un antígeno producido por un agente infeccioso. En un modo de realización, el analito es un polipéptido, en otro modo de realización, un anticuerpo frente a un antígeno vírico, en otro modo de realización, frente a un polipéptido vírico o, en otro modo de realización, frente a un polipéptido de la cápside vírica. En un modo de realización, el polipéptido de la cápside vírica es un polipéptido de la cápside del virus de la hepatitis, en un modo de realización, un polipéptido de la cápside del virus de la hepatitis B (HB) o, en otro modo de realización, un antígeno del núcleo de HB (HBc). En consecuencia, el analito, en un modo de realización, es un anticuerpo frente a un polipéptido de la cápside del virus de la hepatitis, por ejemplo, frente a un polipéptido de la cápside del virus de la hepatitis B (HB), típicamente, frente a un antígeno del núcleo de HB (HBc) o un antígeno HBe. En un modo de realización, el primer compuesto de captura es el antígeno HBc como se muestra en n.° acceso a Genbank: Q17UT2 GI:123867942 (SEQ ID NO: 1). En otro modo de realización, el primer compuesto de captura es el antígeno HBc como se muestra en el n.° acceso a Genbank: Q17UT2 GI:123867942 (antígeno de núcleo del subtipo adw2 del virus de la hepatitis B, SEQ ID NO: 1) y el segundo compuesto de captura es el antígeno HBc como se muestra en el n.° acceso a Genbank P03147.1 GI:116947 (antígeno de núcleo del subtipo adw genotipo D del virus de la hepatitis B, SEQ ID NO: 2). En otro modo de realización, el primer y segundo compuestos de captura son secuencias de antígeno HBc seleccionadas de secuencias de antígeno HBc conocidas en la técnica, tales como secuencias de proteína HBcAg identificadas por su n.° acceso a Genbank P03148.3 GI:166215076, P03149.1 GI:116945, NP_647607.1 GI:21326588 y AY123424.1 GI:22203511.

En un modo de realización, para facilitar la clonación, el extremo N y/o C terminal de cada secuencia de antígeno de núcleo de VHB se puede acortar delecionando de 1 a 5 de los aminoácidos N y/o C terminales de dicha secuencia de antígeno. En otro modo de realización, se pueden añadir marcas que comprenden de 2 a 15 aminoácidos al extremo N terminal o bien C terminal o a ambos extremos del antígeno sin interferir con las propiedades antigénicas del antígeno de núcleo de VHB.

El término polipéptido, como se usa en el presente documento, en un modo de realización, incluye variantes y fragmentos de los polipéptidos específicamente indicados. Las variantes incluyen polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos que son al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % idénticas a las secuencias de aminoácidos indicadas específicamente, por ejemplo, mostradas en SEQ ID NO: 1 o 2. Los valores de porcentaje de identidad se calculan preferentemente sobre la región de secuencia de aminoácidos completa. Una serie de programas basados en una variedad de algoritmos está disponible para el trabajador experto para comparar diferentes secuencias. En este contexto, los algoritmos de Needleman y Wunsch o Smith y Waterman dan resultados particularmente fiables. Para llevar a cabo las alineaciones de secuencias, se usarán el programa PileUp (J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151-153) o los programas Gap y BestFit [Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970)) y Smith y Waterman (Adv. Appl. Math. 2; 482-489 (1981))], que son parte del paquete de programa informático GCG [Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991)]. Los valores de identidad de secuencia mencionados anteriormente en porcentaje (%) se determinarán, preferentemente, usando el programa GAP sobre la región de secuencia completa con los siguientes ajustes: Peso de hueco: 50, peso de longitud: 3, emparejamiento promedio: 10.000 y emparejamiento erróneo promedio: 0.000, que, a menos que se especifique de otro modo, siempre se usarán como ajustes estándar para alineaciones de secuencia.

Un polipéptido que comprende un fragmento de cualquiera de las secuencias polipeptídicas mencionadas anteriormente, en un modo de realización, también se engloba como polipéptido. El fragmento será un polipéptido que todavía tiene la capacidad de ser un compuesto de captura o un compuesto detector como se especifica anteriormente. En consecuencia, el polipéptido puede comprender o consistir en los dominios del polipéptido que confieren dicha actividad biológica. Un fragmento como se quiere decir en el presente documento, preferentemente, comprende al menos 50, al menos 100, al menos 250 o al menos 500 residuos aminoacídicos consecutivos de una cualquiera de las secuencias de aminoácidos mencionadas anteriormente que comprenden al menos 20, al menos 30, al menos 50, al menos 80, al menos 100 o al menos 150 aminoácidos consecutivos de una cualquiera de las secuencias de aminoácidos mencionadas anteriormente.

Los polipéptidos consisten esencialmente en las secuencias de aminoácidos mencionadas anteriormente o bien comprenden las secuencias de aminoácidos mencionadas anteriormente. Por tanto, también pueden contener otras secuencias polipeptídicas además. Específicamente, los polipéptidos pueden ser proteínas de fusión en las que un compañero de la proteína de fusión es un polipéptido como se menciona anteriormente. Dichas proteínas de fusión pueden comprender como parte adicional otras enzimas de las vías de biosíntesis de ácidos grasos o lípidos, polipéptidos para el seguimiento de la expresión (por ejemplo, proteínas fluorescentes verdes, amarillas, azules o rojas, fosfatasa alcalina y similares) o las denominadas "marcas" que pueden servir como marcador detectable o como medida auxiliar para propósitos de purificación o para unir dichos polipéptidos a una superficie sólida. Las marcas para los diferentes propósitos son bien conocidas en la técnica y comprenden marcas FLAG, marcas 6-histidina, marcas MYC, biotina y similares.

Sin embargo, también se prevé que el analito sea un compuesto de bajo peso molecular determinable por la formación de complejos con un compuesto de captura, incluyendo, por ejemplo, tiroxina (T4), triyodotironina (T3), ácido fólico, proteína de unión al ácido fólico, vitamina B12, factor intrínseco y similares.

Como se usa en el presente documento, el término "compuesto de captura" se refiere a una molécula química que se une, directa o indirectamente, al analito como se especifica en el presente documento anteriormente, y se une a una superficie sólida o se adapta para unirse a una superficie sólida.

De acuerdo con la presente divulgación, el compuesto de captura es una molécula orgánica, en otro modo de realización, una macromolécula biológica como se especifica en el presente documento anteriormente, por ejemplo, un polipéptido como se especifica en el presente documento anteriormente. En un modo de realización, el compuesto de captura se une indirectamente al analito con afinidad suficiente para permitir la detección del complejo que comprende analito y compuesto de captura; es decir, en dicho caso, el compuesto de captura es un ligando indirecto. El término "unión indirecta", como se usa en el presente documento, se refiere a una unión en la que el ligando no está en contacto directamente con el analito, sino en contacto con una molécula química que se une al analito, en un modo de realización se une específicamente al analito, en el que, en un modo de realización, dicha molécula que se une al analito es una molécula que se une directamente al analito, es decir, es un ligando directo. En consecuencia, en un modo de realización, el analito, una molécula química que se une al analito y el ligando indirecto forman un complejo con las propiedades como se indica anteriormente, en particular con las constantes de disociación como se indica. Como se entenderá por el experto en la técnica, la definición del término "competir en la unión" se aplica mutatis mutandis a los ligandos indirectos, es decir, los ligandos indirectos, en un modo de realización, tienen la propiedad de no poder unirse a dicha molécula que se une al analito al mismo tiempo. En otro modo de realización, el compuesto de captura se une directamente al analito con afinidad suficiente para permitir la detección del complejo analito/compuesto de captura, como se especifica en el presente documento anteriormente. En consecuencia, en un modo de realización, el compuesto de captura es un ligando directo.

De acuerdo con la presente invención, se proporcionan al menos un primer y un segundo compuesto de captura, en el que dichos primer y segundo compuestos de captura son compuestos de captura no idénticos. Como se usa en el presente documento, el término compuestos de captura "no idénticos" se refiere a dos o más especies de moléculas de compuestos de captura mensurablemente diferentes en al menos una propiedad química y/o física. Típicamente, dicha al menos una propiedad química y/o física no es un indicador y no es una propiedad relacionada con la unión de dicho compuesto de captura a una superficie sólida. Las propiedades típicas son la secuencia de aminoácidos, la glucosilación, el plegamiento tridimensional y/o la conformación, y la longitud de la cadena de polipéptidos. Sin embargo, también se contemplan por la presente invención diferencias en la concentración y/o identidad de impurezas en dos preparaciones del mismo compuesto de captura. En consecuencia, en la presente invención, un segundo compuesto de captura se deriva o se puede derivar de un primer compuesto de captura por al menos uno de (i) introducir al menos un intercambio de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de dicho primer compuesto de captura, (ii) producir dicho segundo compuesto de captura en un fondo celular diferente en comparación con dicho primer compuesto de captura, (iii) eliminar o prevenir la glucosilación de dicho segundo compuesto de captura en comparación con dicho primer compuesto de captura, (iv) purificar dicho segundo compuesto de captura por diferentes medios en comparación con dicho primer compuesto de captura, (v) desnaturalizar y/o replegar dicho segundo compuesto de captura en condiciones diferentes en comparación con dicho primer compuesto de captura, y (vi) almacenar dicho segundo compuesto de captura en condiciones diferentes en comparación con dicho primer compuesto de captura. En un modo de realización, dichos primer y segundo compuestos de captura son anticuerpos que reconocen esencialmente el mismo epítopo y dicho segundo compuesto de captura es una variante de un anticuerpo que es el primer compuesto de captura. En otro modo de realización, al menos uno de dichos primer y segundo compuestos de captura no es un anticuerpo. En otro modo de realización, dichos primer y segundo compuestos de captura no son anticuerpos.

De acuerdo con la presente invención, se proporcionan al menos un primer y un segundo compuesto de captura, en el que dichos compuestos de captura compiten en la unión a dicho analito. Como se usa en el presente documento, el término que indica que dos compuestos "compiten en la unión" a un analito se refiere a la propiedad de las moléculas de dichos compuestos de no poder unirse esencialmente al mismo sitio de unión de dicho analito al mismo tiempo. Por tanto, típicamente, en caso de que dos compuestos de captura compitan en la unión a un analito y en caso de que dicho analito tenga un sitio de unión para dichos compuestos de captura, en cada punto en el tiempo, solo una molécula de dichos compuestos de captura se puede unir a dicho analito. Se entenderá por el experto en la técnica que lo anterior se aplica mutatis mutandis en caso de que el analito tenga dos o más sitios de unión para los compuestos de captura. El experto en la técnica conoce cómo determinar la competencia en la unión. En un modo de realización, la competencia en la unión a un analito es la unión a la misma o esencialmente a la misma subestructura de dicho analito. En otro modo de realización, en caso de que el analito sea un polipéptido, el epítopo unido por un primer compuesto de captura y el epítopo unido por un segundo compuesto de captura tienen al menos 3 aminoácidos, en un modo de realización, 3 aminoácidos contiguos, del analito en común. Típicamente, en dicho caso, el epítopo unido por un primer compuesto de captura y el epítopo unido por un segundo compuesto de captura tienen al menos 4, 5, 6 o 7 aminoácidos del analito en común.

En un modo de realización, el primer y segundo compuesto de captura no compiten en la unión a un compuesto interferente. El término "compuesto interferente", como se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto que disminuye la especificidad de un inmunoensayo. En un modo de realización, el compuesto interferente es un compuesto que se une a un compuesto de captura de la presente invención que no es el analito.

En un modo de realización, el primer y el segundo compuesto de captura se usan en una proporción de 1:5 a 5:1, típicamente de 1:2 a 2:1, aproximadamente de 1:1, o 1:1. En otro modo de realización, se usan tres compuestos de captura en una proporción de aproximadamente 2:1:1, 1:2:1 o 1:1:2, aproximadamente de 1:1:1 o 1:1:1. Por tanto, en un modo de realización, el primer y el segundo compuesto de captura y potencialmente presentes otros compuestos de captura, están presentes en la mezcla de reacción en aproximadamente la misma cantidad, en otro modo de realización, en la misma cantidad.

Los procedimientos de unión de moléculas biológicas, típicamente polipéptidos, a superficies sólidas son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, unión por interacción hidrófoba, biotinilación y unión por medio de estreptavidina inmovilizada, unión covalente, interacción anticuerpo-antígeno y similares, o una combinación de estas interacciones, por ejemplo, interacción anticuerpo-antígeno entre un anticuerpo y un polipéptido de un patógeno, en la que dicho anticuerpo está biotinilado y unido a una superficie sólida por medio de estreptavidina inmovilizada. En consecuencia, el compuesto de captura también puede ser preferentemente un complejo de captura. En un modo de realización, el compuesto de captura es el compuesto de un complejo de captura que se une directamente al analito. El experto en la técnica conoce cómo unir un compuesto de captura o complejo a una superficie sólida, dependiendo de la superficie sólida seleccionada. En un modo de realización, el compuesto de captura es un polipéptido vírico, por ejemplo, un polipéptido de la cápside vírico. En un modo de realización, dicho compuesto de captura es un polipéptido de la cápside del virus de la hepatitis, en un modo de realización, un polipéptido de la cápside del virus de la hepatitis B (HB), por ejemplo, un antígeno del núcleo deHB (HBc) o un antígeno HBe. Sin embargo, también se prevé que el compuesto de captura sea un anticuerpo.

El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, incluye anticuerpos monoclonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpo, siempre que presenten la actividad de unión deseada como se especifica en otra parte en el presente documento. En un modo de realización, un anticuerpo no es un anticuerpo comprendido en un antisuero, típicamente no es un anticuerpo policlonal o un suero policlonal. En consecuencia, en un modo de realización, un anticuerpo es un anticuerpo comprendido en una mezcla en la que al menos un 80 %, en un modo de realización al menos un 90 %, en otro modo de realización, al menos un 95 % de las moléculas de anticuerpo comprendidas en dicha mezcla son al menos un compuesto de captura o al menos un compuesto detector de la presente invención. En un modo de realización, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En un modo de realización, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa o un fragmento de anticuerpo.

Dependiendo de las secuencias de aminoácidos de los dominios constantes de sus cadenas pesadas, los anticuerpos (inmunoglobulinas) se pueden asignar a clases diferentes. Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas se pueden dividir además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Las estructuras de subunidades y configuraciones tridimensionales de las clases diferentes de inmunoglobulinas son bien conocidas y se describen en general en, por ejemplo, Abbas et al., Cellular and Mol. Immunology, 4.a ed., W.B. Saunders, Co. (2000). Un anticuerpo puede ser parte de una molécula de fusión más grande, formada por asociación covalente o no covalente del anticuerpo con una o más de otras proteínas o péptidos.

Los términos "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo completo" se usan en el presente documento de manera intercambiable para referirse a un anticuerpo en su forma sustancialmente intacta, no a fragmentos de anticuerpo como se define a continuación. Los términos se refieren en particular a un anticuerpo con cadenas pesadas que contienen una región Fc. Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, en un modo de realización, que comprende la región de unión a antígeno del mismo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo monocatenario; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. La digestión con papaína de anticuerpos produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, llamados fragmentos "Fab", cada uno con un único sitio de unión a antígeno, y un fragmento "Fc" residual, con un nombre que refleja su capacidad de cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de combinación con antígeno y todavía se puede reticular con el antígeno. "Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de unión a antígeno completo. En un modo de realización, una especie de Fv bicatenario consiste en un dímero de un dominio variable de la cadena pesada y uno de la ligera en asociación estrecha no covalente. En una especie de Fv monocatenario (scFv), un dominio variable de la cadena pesada y uno de la ligera se pueden enlazar covalentemente por un conector peptídico flexible de modo que las cadenas ligera y pesada se puedan asociar en una estructura "dimérica" análoga a la de una especie de Fv bicatenario. Es en esta configuración en la que las tres regiones hipervariables (HVR) de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión a antígeno. Conjuntamente, las seis HVR confieren especificidad de unión a antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solo tres HVR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque con una afinidad menor que el sitio de unión completo. El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno, fragmentos que comprenden un dominio variable de la cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de la cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL). Al usar un conector que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios se fuerzan a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos pueden ser bivalentes o biespecíficos. Los diacuerpos se describen con más detalle, por ejemplo, en los documentos EP 0404 097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134; y Hollinger et al., PNAS USA 90 (1993) 6444-6448. También se describen triacuerpos y tetracuerpos en Hudson et al., Nat. Med. 9 (2003)129-134.

El término "anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones, por ejemplo, mutaciones naturales, que pueden estar presentes en cantidades menores. Por tanto, el modificador "monoclonal" indica que el carácter del anticuerpo no es una mezcla de distintos anticuerpos. En determinados modos de realización, dicho anticuerpo monoclonal incluye típicamente un anticuerpo que comprende una secuencia polipeptídica que se une a un analito, en el que la secuencia polipeptídica de unión a analito se obtuvo por un procedimiento que incluye la selección de una única secuencia polipeptídica de unión a analito de una pluralidad de secuencias polipeptídicas. Por ejemplo, el procedimiento de selección puede ser la selección de un clon único de una pluralidad de clones, tales como un grupo de clones de hibridoma, clones de fagos o clones de ADN recombinante. Se debe entender que una secuencia de unión a diana seleccionada se puede alterar adicionalmente, por ejemplo, para mejorar la afinidad por la diana, para humanizar la secuencia de unión a diana, para mejorar su producción en el cultivo celular, para reducir su inmunogenicidad in vivo, para crear un anticuerpo multiespecífico, etc., y que un anticuerpo que comprende la secuencia de unión a diana alterada también es un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la presente divulgación. En contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales, que incluyen anticuerpos diferentes dirigidos frente a determinantes diferentes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpo monoclonal se dirige frente a un único determinante en un antígeno. Además de su especificidad, las preparaciones de anticuerpo monoclonal son ventajosas ya que no están contaminadas típicamente por otras inmunoglobulinas.

Como se usa en el presente documento, el término "superficie sólida" se refiere a cualquier superficie sólida adecuada adaptada para unirse al compuesto de captura y adaptada para separarse, por ejemplo, por medios físicos, de una muestra. En un modo de realización, dicha superficie sólida es una superficie de una esfera, en un modo de realización, una microesfera, por ejemplo, una microesfera magnética o paramagnética. En un modo de realización, dicha superficie se adapta para mejorar la unión del compuesto de captura, por ejemplo uniendo, covalente o no covalentemente, moléculas que se unen a una subestructura del compuesto de captura. Las moléculas típicas que se unen a una subestructura del compuesto de captura son, por ejemplo, anticuerpos, estreptavidina, iones de níquel complejados y similares. En otro modo de realización, la superficie sólida se une a dicho compuesto de captura por enlaces covalentes o no covalentes, por ejemplo, por interacción hidrófoba. Por tanto, en un modo de realización, dicha superficie sólida es una superficie de una placa de múltiples conglomerados. En un modo de realización, la superficie de la placa de múltiples conglomerados se pretrata para incrementar la afinidad y/o la capacidad de unión de un compuesto de captura. Los pretratamientos adecuados son conocidos en la técnica.

El término "muestra", como se usa en el presente documento, se refiere a una muestra sospechosa de comprender el analito. En un modo de realización, la muestra es o comprende una muestra de un líquido corporal, una muestra de un tejido o un órgano, o una muestra de líquido de lavado/enjuague o un hisopado o frotis obtenido de una superficie corporal externa o interna. La muestra, en un modo de realización, comprende al menos un analito como se especifica en otra parte en el presente documento. Las muestras de sangre, plasma, suero, orina, saliva o líquido lagrimal se engloban por el procedimiento de la presente invención. Las muestras se pueden obtener por el uso de cepillos, hisopos (de algodón), espátulas, líquidos de enjuague/lavado, dispositivos de biopsia en sacabocados, punción de cavidades con agujas o lancetas, o por instrumentación quirúrgica. Sin embargo, las muestras obtenidas por técnicas bien conocidas incluyendo, en un modo de realización, raspados, hisopados o biopsias del aparato genitourinario, regiones perianales, conducto anal, la cavidad bucal, el tubo aerodigestivo superior y la epidermis también se incluyen como muestras de la presente invención. Se pueden obtener líquidos sin células a partir de los líquidos corporales o los tejidos u órganos por técnicas de lisis tales como homogeneización y/o por técnicas de separación tales como filtración o centrifugación. En un modo de realización, las muestras se obtienen de líquidos corporales conocidos por comprender polipéptidos del virus HB y/o anticuerpos frente a al menos un polipéptido del virus HB, es decir, en un modo de realización, sangre, plasma, suero, saliva o similares. Se debe entender que la muestra se puede procesar adicionalmente para llevar a cabo el procedimiento de la presente invención. En particular, las células se pueden retirar de la muestra por procedimientos y medios conocidos en la técnica. Además, al menos un analito se puede extraer y/o purificar de la muestra por procedimientos y medios conocidos en la técnica. Por tanto, el término muestra también se puede referir a preparaciones que comprenden o sospechosas de comprender al menos un analito, diluido, enriquecido, purificado y/o extraído de una muestra.

En un modo de realización, el procedimiento de la presente invención es un inmunoensayo competitivo. En consecuencia, el procedimiento comprende además mezclar un especificador con una muestra. En un modo de realización, el procedimiento de la presente invención es un inmunoensayo competitivo heterogéneo y comprende determinar indirectamente la cantidad de complejos formados entre un analito y dos compuestos de captura no idénticos determinando la cantidad de complejos formados entre dicho especificador y dichos compuestos de captura no idénticos.

El término "poner en contacto" como se usa en el contexto de los procedimientos de la presente invención se entiende por el experto en la técnica. En un modo de realización, el término se refiere a poner un compuesto en contacto físico con una muestra o con otro compuesto y de este modo, por ejemplo, permitir que la muestra y el compuesto interactúen.

El término "especificador" es conocido por el experto en la técnica y se refiere a un compuesto que compite con un analito por la unión a los compuestos de captura, enlazados a un indicador. Típicamente, el especificador es estructuralmente similar al analito. Típicamente, el especificador comprende la subestructura del analito unido por los compuestos de captura, enlazados a un indicador. En un modo de realización, el especificador es un compuesto que comprende el analito y un indicador como elementos estructurales, o el especificador consiste en el analito enlazado covalentemente a un indicador.

El término "indicador", como se usa en el presente documento, es un compuesto adaptado para hacer que la presencia de una molécula o complejo que comprende dicho indicador sea detectable. Típicamente, el indicador tiene una propiedad detectable, típicamente una propiedad óptica y/o enzimática. Sin embargo, también se prevé que dicha propiedad detectable sea la propiedad de emitir radioactividad.

El término "propiedad óptica", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier propiedad que se pueda detectar por un instrumento óptico. Específicamente, la propiedad ópticamente determinable puede ser o puede comprender al menos una propiedad seleccionada del grupo que consiste en: una propiedad de reflexión, una propiedad de transmisión, una propiedad de emisión, una propiedad de dispersión, una propiedad de fluorescencia, una propiedad de fosforescencia, una propiedad de difracción y una propiedad de polarización. Otras propiedades ópticas previstas por la presente invención son color, fluorescencia, luminiscencia o refracción. En un modo de realización, una propiedad ópticamente determinable como se denomina en el presente documento se refiere a una propiedad de un compuesto químico que se puede detectar ópticamente, tal como absorción de luz, emisión de luz, remisión de luz o propiedades asociadas con las mismas. Se entenderá que detectar una propiedad ópticamente determinable como se usa en el presente documento engloba la detección de la presencia de una propiedad que no era detectable antes, la detección de la ausencia de una propiedad que se ha detectado antes y la detección de cambios cuantitativos de una propiedad, es decir, la detección del cambio de la intensidad de señal que se correlaciona con el grado del cambio de la al menos una propiedad óptica. Se entiende que el término "propiedad ópticamente determinable", en un modo de realización, también se refiere a electroquimioluminiscencia, que también es conocida como quimioluminiscencia electrogenerada.

El término "propiedad enzimática", como se usa en el presente documento, se refiere a una propiedad de un indicador de producir un producto detectable a partir de un sustrato por medio de catálisis biológica. En consecuencia, una propiedad enzimática se confiere típicamente por la presencia de un polipéptido que tiene dicha propiedad enzimática en dicho indicador. Típicamente, la propiedad enzimática es al menos una actividad enzimática seleccionada del grupo que consiste en: actividad fosfatasa (por ejemplo, en fosfatasa alcalina), actividad peroxidasa (por ejemplo, en peroxidasa de rábano picante) y actividad glucosidasa (por ejemplo, en betagalactosidasa). Los sustratos típicos para actividades enzimáticas son bien conocidos en la técnica. Típicamente, dicha actividad enzimática produce un producto que tiene una propiedad óptica determinable como se especifica en el presente documento anteriormente, o/y dicha actividad enzimática produce un producto que es determinable por un instrumento eléctrico.

En una divulgación, el procedimiento es un ensayo de tipo sándwich de doble antígeno ("DAGS"). En consecuencia, el procedimiento comprende además detectar complejos formados entre dicho analito y dicho compuesto de captura (i) poniendo en contacto dichos complejos con al menos un compuesto detector y (ii) determinando la cantidad de complejos ternarios que comprenden dicho analito, dichos compuestos de captura y dichos compuestos detectores.

En la divulgación de un ensayo DAGS, se usa un compuesto detector. El término "compuesto detector", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula química que se une, directa o indirectamente, al analito de la presente invención como se especifica anteriormente en el presente documento, y enlazada a un indicador como se especifica en otra parte en el presente documento. En una divulgación, el compuesto detector no se une a una superficie sólida y no se adapta para unirse a una superficie sólida. Como se entenderá por el experto en la técnica, el compuesto detector también puede ser un compuesto detector indirecto, es decir, un compuesto detector que no se pone en contacto directamente con el analito, como se especifica en el presente documento anteriormente para el ligando. En una divulgación, el compuesto detector es un compuesto detector directo. En consecuencia, en una divulgación, las definiciones proporcionadas anteriormente para los compuestos de captura en la medida en que no se relacionen con la unión de los compuestos a una superficie sólida, se aplican mutatis mutandis a los compuestos detectores.

Como apreciará el experto en la técnica, el término "específico" se usa para indicar que otros compuestos, típicamente biomoléculas, presentes en una muestra no se unen significativamente a un ligando (compuesto de captura o compuesto detector); como se entenderá por el experto en la técnica, esto no excluye la unión de compuestos químicos a regiones del compuesto de captura o molécula de compuesto detector no implicada en la interacción con el analito, el especificador o la marca que sirve como resto funcional que modera la unión a una fase sólida.

Además, la presente divulgación se refiere a un procedimiento para mejorar la especificidad

(i) de un inmunoensayo indirecto para determinar un analito, que comprende reemplazar al menos un 10 %, en un modo de realización, al menos un 25 %, en otro modo de realización, al menos un 40 %, en otro modo de realización, al menos un 45 %, en otro modo de realización, aproximadamente un 50 % de un compuesto de captura por un compuesto de captura no idéntico, en el que el compuesto de captura reemplazado compite en la unión a dicho analito con el compuesto de captura introducido; o

(ii) de un inmunoensayo de tipo sándwich de doble antígeno para determinar un analito,

que comprende reemplazar al menos un 50 %, en un modo de realización, al menos un 75 %, en otro modo de realización, al menos un 90 %, en otro modo de realización, aproximadamente un 100 % de un compuesto de captura por un compuesto de captura no idéntico, en el que el compuesto de captura reemplazado compite en la unión a dicho analito con el compuesto de captura introducido y en el que dicho al menos un compuesto de captura y al menos un compuesto detector son ligandos no idénticos de dicho analito, o

que comprende reemplazar al menos un 50 %, en un modo de realización, al menos un 75 %, en otro modo de realización, al menos un 90 %, en otro modo de realización, aproximadamente un 100 % de un compuesto detector por un compuesto detector no idéntico, en el que el compuesto detector reemplazado compite en la unión a dicho analito con el compuesto detector introducido. o de un compuesto detector y en el que dicho al menos un compuesto de captura y al menos un compuesto detector son ligandos no idénticos de dicho analito.

Típicamente, la fracción de compuesto de captura o compuesto detector reemplazado se seleccionará de modo que se pueda esperar teóricamente un efecto medible del reemplazo. Como se entenderá por un experto en la técnica, la expectativa de un efecto medible dependerá del número de ligandos no idénticos usados para el reemplazo. Por ejemplo, si en el ensayo después de la mejora se usan tres compuestos de captura en lugar de uno, es preferente que, por ejemplo, se reemplace un 66 % del compuesto de captura inicial. Como regla general, se prevé que la fracción de un compuesto de captura o compuesto detector dado sea (100 %/n) ± 50 %, con n = (número de compuestos de captura o compuestos detectores no idénticos usados en un ensayo). En otro modo de realización, se usa una fracción de (100 %/n) ± 20 %. Como se entenderá por el experto en la técnica, la suma de las fracciones usadas sumará hasta un 100 %. Por tanto, en un modo de realización, la fracción de compuesto de captura o compuesto detector reemplazado es de desde un 10 % a un 90 %, en un modo de realización, de desde un 25 % a un 75 %, en otro modo de realización, de desde un 40 % a un 60 %, en otro modo de realización, de aproximadamente un 50 %.

Además, la presente divulgación se refiere a un kit para detectar un analito en una muestra, que comprende (i) al menos dos compuestos de captura no idénticos para dicho analito, en el que dichos compuestos de captura compiten en la unión a dicho analito; o

(ii) al menos dos compuestos detectores no idénticos para dicho analito, en el que dichos compuestos detectores compiten en la unión a dicho analito.

En un modo de realización adicional, la invención se refiere a un kit para detectar un analito en una muestra de acuerdo con la reivindicación 8. Además, la divulgación se refiere a un kit para detectar un analito en una muestra, que comprende

(i) al menos dos compuestos de captura no idénticos para dicho analito, en el que dichos compuestos de captura compiten en la unión a dicho analito, y

(ii) un especificador, en el que dicho especificador compite en la unión a dichos compuestos de captura con dicho analito.

El término "kit", como se usa en el presente documento, se refiere a una colección de los compuestos, medios o reactivos mencionados anteriormente que se pueden o no envasar conjuntamente. Los componentes del kit pueden estar comprendidos por viales separados (es decir, como un kit de partes separadas) o proporcionados en un único vial. Además, se debe entender que el kit de la presente invención se va a usar para practicar los procedimientos mencionados en el presente documento anteriormente. Se prevé, en un modo de realización, que todos los componentes se proporcionen de manera lista para usar para practicar los procedimientos mencionados anteriormente. Además, el kit, en un modo de realización, contiene instrucciones para llevar a cabo dichos procedimientos. Las instrucciones se pueden proporcionar por un manual de usuario en formato impreso o electrónico. Por ejemplo, el manual puede comprender instrucciones para interpretar los resultados obtenidos cuando se llevan a cabo los procedimientos mencionados anteriormente usando el kit de la presente invención. En un modo de realización, el kit para detectar un analito en una muestra, que comprende al menos dos compuestos de captura no idénticos comprende además al menos dos compuestos detectores no idénticos, en el que dichos compuestos detectores compiten en la unión a dicho analito, y en el que dichos compuestos de captura no compiten con dichos compuestos detectores en la unión a dicho analito. En otro modo de realización, el kit comprende además un soporte sólido para inmovilizar dichos compuestos de captura o para inmovilizar un analito.

En un modo de realización, de desde 2 a 10 compuestos de captura para dicho analito, en un modo de realización de desde 2 a 5 compuestos de captura para dicho analito, en un modo de realización de desde 2 a 4 compuestos de captura, en un modo de realización de desde 2 a 3 compuestos de captura para dicho analito están comprendidos en dicho kit. En otro modo de realización, de desde 2 a 10 compuestos detectores para dicho analito, en un modo de realización de desde 2 a 5 compuestos detectores para dicho analito, en un modo de realización de desde 2 a 4 compuestos detectores, en un modo de realización de desde 2 a 3 compuestos detectores para dicho analito están comprendidos en dicho kit.

Además, la presente invención se refiere a un dispositivo para determinar un analito en una muestra de acuerdo con la reivindicación 10. Además, la divulgación se refiere a un dispositivo para determinar un analito en una muestra, que comprende

(i) al menos dos compuestos de captura no idénticos para dicho analito, en el que dichos compuestos de captura compiten en la unión a dicho analito; o

(ii) al menos dos compuestos detectores no idénticos para dicho analito, en el que dichos compuestos detectores compiten en la unión a dicho analito, y opcionalmente medios para determinar una propiedad óptica y/o enzimática de un indicador comprendido en dichos compuestos detectores.

El término "dispositivo", como se usa en el presente documento, se refiere a un sistema de medios que comprenden al menos los medios mencionados anteriormente conectados funcionalmente entre sí para permitir la determinación. Los medios típicos para determinar las cantidades de un analito y los medios para llevar a cabo la determinación se divulgan anteriormente en relación con los procedimientos de la invención. Cómo unir los medios de manera funcional dependerá del tipo de medios incluidos en el dispositivo. En un modo de realización, los medios están comprendidos por un único dispositivo. En consecuencia, dicho dispositivo puede incluir (i) una unidad de análisis para la medición de la cantidad del analito en una muestra aplicada y (ii) una unidad de ordenador para procesar los datos resultantes para la evaluación. Los medios típicos para la detección se divulgan en relación con modos de realización relativos al procedimiento de la invención anterior. En dicho caso, los medios están conectados funcionalmente ya que el usuario del sistema reúne el resultado de la determinación de la propiedad óptica y/o electroquímicamente determinable de un indicador y la del analito debido a las instrucciones e interpretaciones dadas en un manual, o dichas instrucciones e interpretaciones están comprendidas en un código de programa ejecutable comprendido en el dispositivo, de modo que, como resultado de la determinación, se emite al usuario una cantidad o concentración de analito en la muestra aplicada. El experto en la técnica se dará cuenta de cómo conectar los medios sin más. Los dispositivos típicos son los que se pueden aplicar sin el conocimiento particular de un técnico especializado, por ejemplo, tiras reactivas o dispositivos electrónicos que simplemente requieren la carga con una muestra. Los resultados se pueden dar como salida de datos brutos que necesitan interpretación por un técnico. En un modo de realización, sin embargo, la salida del dispositivo se procesa, es decir, se evalúan los datos brutos, de los que su interpretación no requiere un técnico. Otros dispositivos típicos comprenden las unidades/dispositivos de análisis (por ejemplo, biosensores, matrices, soportes sólidos acoplados a ligandos que reconocen específicamente el péptido, dispositivos de resonancia de plasmón superficial, espectrómetros de RMN, espectrómetros de masa, etc.) o unidades/dispositivos de evaluación mencionados anteriormente de acuerdo con el procedimiento de la invención.

En un modo de realización, de desde 2 a 10 compuestos de captura para dicho analito, en un modo de realización de desde 2 a 5 compuestos de captura para dicho analito, en un modo de realización de desde 2 a 4 compuestos de captura, en un modo de realización de desde 2 a 3 compuestos de captura para dicho analito están comprendidos en dicho dispositivo. En otro modo de realización, de desde 2 a 10 compuestos detectores para dicho analito, en un modo de realización de desde 2 a 5 compuestos detectores para dicho analito, en un modo de realización de desde 2 a 4 compuestos detectores, en un modo de realización de desde 2 a 3 compuestos detectores para dicho analito están comprendidos en dicho dispositivo.

Además, la presente divulgación se refiere a una composición que comprende (i) al menos dos compuestos de captura no idénticos para un analito indicativo de enfermedad, en la que dichos compuestos de captura compiten en la unión a dicho analito; o (ii) al menos dos compuestos detectores no idénticos para un analito indicativo de enfermedad, en la que dichos compuestos detectores compiten en la unión a dicho analito; para su uso en el diagnóstico.

El término "composición", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier composición formulada en forma sólida, líquida o gaseosa. Dicha composición comprende los compuestos de la divulgación, opcionalmente conjuntamente con compuestos auxiliares adecuados tales como diluyentes o vehículos o ingredientes adicionales. Los diluyentes y/o vehículos adecuados dependen del propósito para el cual se va a usar la composición y de los otros ingredientes. El experto en la técnica puede determinar dichos diluyentes y/o vehículos adecuados sin más. En un modo de realización, la composición para su uso en el diagnóstico que comprende al menos dos compuestos de captura no idénticos comprende además al menos dos compuestos detectores no idénticos, en la que dichos compuestos detectores compiten en la unión a dicho analito, y en la que dichos compuestos de captura no compiten con dichos compuestos detectores en la unión a dicho analito.

El término "diagnóstico", como se usa en el presente documento, se refiere a una evaluación de la probabilidad de acuerdo con la cual un sujeto padece o padecerá una enfermedad o afección. Como se entenderá por los expertos en la técnica, dicha evaluación normalmente no pretende ser correcta para un 100 % de los sujetos que se van a diagnosticar. Sin embargo, el término requiere que se pueda diagnosticar correctamente que una parte estadísticamente significativa de los sujetos padecen la enfermedad o afección. Se puede determinar sin más si una parte es estadísticamente significativa por el experto en la técnica usando diversas herramientas de evaluación estadística bien conocidas, por ejemplo, determinación de intervalos de confianza, determinación del valor de p, prueba de la t de Student, prueba de Mann-Whitney, etc. Se encuentran detalles en Dowdy y Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, Nueva York 1983. Los intervalos de confianza preferentes son de al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 %. Los valores de p son, preferentemente, 0,1,0,05, 0,01,0,005 o 0,0001. Preferentemente, la probabilidad prevista por la presente invención permite que el diagnóstico sea correcto para al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 % o al menos un 90 % de los sujetos de una cohorte o población dada. Las condiciones típicas que se van a diagnosticar son, por ejemplo, el estado de fecundidad o el embarazo. Las enfermedades típicas que se van a diagnosticar son, por ejemplo, infección actual o previa con un patógeno, por ejemplo, un virus, hiper o hipotiroidismo, carencia vitamínica y similares.

Además, la presente invención se refiere al uso de acuerdo con la reivindicación 11. Además, la divulgación se refiere al uso de una composición que comprende (i) un primer y un segundo compuesto de captura, en la que dichos primer y segundo compuestos de captura son compuestos de captura no idénticos, y en la que dichos compuestos de captura compiten en la unión a dicho analito, o (ii) un primer y un segundo compuesto detector, en la que dichos primer y segundo compuestos detectores son compuestos detectores no idénticos, y en la que dichos compuestos detectores compiten en la unión a dicho analito; para determinar un analito en una muestra.

Breve descripción de las figuras

Otros rasgos característicos y modos de realización opcionales de la invención se divulgarán con más detalle en la posterior descripción de modos de realización, en un modo de realización, conjuntamente con las reivindicaciones dependientes. En las mismas, los rasgos característicos opcionales respectivos se pueden lograr de forma aislada así como en cualquier combinación factible arbitraria, como se dará cuenta el experto en la técnica. Los modos de realización se representan esquemáticamente en las figuras. En las mismas, los números de referencia idénticos en estas figuras se refieren a elementos idénticos o funcionalmente comparables.

En las figuras:

Figura 1 indica esquemáticamente el principio de la presente invención como se aplica a un ensayo competitivo;

a: analito, s: especificador, c1: compuesto de captura 1, c2: compuesto de captura 2, i1: agente interferente 1, i2: agente interferente 2. A) En ausencia del analito, el especificador se une al compuesto de captura 1. B) En presencia del analito, el analito se une al compuesto de captura 1 y evita que el especificador se una al compuesto de captura 1. C) En presencia del agente interferente 1, que tiene afinidad por el compuesto de captura 1 (pero no por el compuesto de captura 2), el agente interferente 1 se une al compuesto de captura 1, evitando por tanto que el especificador se una. D) En presencia del agente interferente 2, que tiene afinidad por el compuesto de captura 2 (pero no por el compuesto de captura 1), el agente interferente 2 no se une al compuesto de captura 1, permitiendo por tanto que el especificador se una al compuesto de captura 1. A la inversa, E) el agente interferente 1, que tiene afinidad por el compuesto de captura 1 (pero no por el compuesto de captura 2), no se une al compuesto de captura 2, permitiendo por tanto que el especificador se una al compuesto de captura 2; y F) el agente interferente 2 sí se une al compuesto de captura 2, evitando por tanto que el especificador se una. (G) y H)) en caso de que el compuesto de captura 1 y 2 se usen, por ejemplo, en una proporción 1:1, la reducción de la señal falsa inducida por el agente interferente 1 o el agente interferente 2 se reducirá a aproximadamente un 50 %.

Figura 2 muestra esquemáticamente el principio de la prueba de una prueba competitiva para anticuerpos antiantígeno del núcleo de hepatitis (HBc). HBc: antígeno del núcleo de hepatitis B; a-HBc: anticuerpo anti-antígeno HBc; el anticuerpo a-HBc no conjugado representado con una circunferencia doble es un anticuerpo potencialmente presente en una muestra de un paciente, los anticuerpos conjugados representados con una circunferencia única son anticuerpos a-HBc añadidos durante el ensayo; la conjugación es con Ru: complejo de rutenio, o bien bio: biotina; estrep.: recubrimiento de estreptavidina de un soporte sólido. A) en ausencia del analito (anticuerpo a-HBc), los anticuerpos a-HBc tanto conjugados con Ru como conjugados con bio se pueden unir a1HBc añadido a la mezcla de ensayo. Por medio de la interacción bio-estrep., el complejo se une a un soporte sólido y, después del lavado, se puede medir una señal generada de la conjugación con Ru. B) en presencia del analito (anticuerpo a-HBc), se evita que el anticuerpo a-HBc-bio y el anticuerpo conjugado con Ru se unan al HBc añadido a la mezcla de ensayo, evitando por tanto la unión de un complejo al soporte sólido. En consecuencia, después del lavado, no se puede generar ninguna señal del complejo de Ru, puesto que se eliminará por lavado. en la fig. 2, HBc así como el conjugado a-HBc-bio son parte del complejo del compuesto de captura.

Figura 3 indica esquemáticamente el principio de la presente invención como se aplica a un formato de tipo sándwich de doble antígeno (DAGS). a: analito, d: compuesto detector, c1: compuesto de captura 1, c2: compuesto de captura 2, i1: agente interferente 1, i2: agente interferente 2. A) en ausencia de analito, ningún analito se une al compuesto de captura 1 (o 2) fijado en un soporte sólido y, por tanto, el compuesto detector se separará por lavado en etapas de lavado. B) en presencia del analito, por ejemplo, un anticuerpo, el analito se une al compuesto de captura 1 y al compuesto detector, mediando por tanto la unión del compuesto detector a la superficie sólida. C) en presencia del agente interferente 1, que se une al compuesto de captura 1 y al compuesto detector, pero no al compuesto de captura 2, el compuesto detector se fija al soporte sólido por medio de la interacción con el agente interferente 1. D) en presencia del agente interferente 2, que se une al compuesto de captura 2 y al compuesto detector, pero no al compuesto de captura 1, el compuesto detector no se fija al soporte sólido por medio del agente interferente 1. A la inversa, E) en presencia del agente interferente 1, el compuesto detector no se fija al soporte sólido por medio de la interacción con el agente interferente 2; y F) en presencia del agente interferente 2, el compuesto detector se fijará al soporte sólido por medio del compuesto de captura 2. (G) y H)) en caso de que el compuesto de captura 1 y 2 se usen, por ejemplo, en una proporción 1:1, el incremento de la señal falsa inducida por el agente interferente 1 o el agente interferente 2 se reducirá a aproximadamente un 50 %. Se podría trazar mutatis mutandis un esquema para el uso de dos compuestos detectores no idénticos.

Descripción detallada de los modos de realización:

Ejemplo 1

Clonación y purificación del antígeno del núcleo de hepatitis B recombinante

El gen sintético que codifica el antígeno del núcleo de hepatitis B (HBcAg) se adquirió de Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Alemania). En base al plásmido de expresión pET24a de Novagen (Madison, WI, EE. UU.) se realizaron las siguientes etapas de clonación. El vector se digirió con BamH1 y Xho1 y se insertó un casete que comprendía el HBcAg. Se secuenció el inserto del plásmido resultante y se descubrió que codificaba la proteína deseada. La secuencia de aminoácidos de la proteína resultante se muestra en el protocolo de secuencias de la presente invención. El HBcAg recombinante no contenía una marca de hexahistidina C terminal.

El HBcAg recombinante se purificó de acuerdo con el siguiente protocolo. Se cultivaron células de E. coli BL21 (DE3) que albergaban el plásmido de expresión en medio LB más canamicina (30 pg/ml) a una DO600 de 1, y se indujo la sobreexpresión citosólica añadiendo isopropil-p-D-tiogalactósido (IPTG) hasta una concentración final de 1 mM a una temperatura de cultivo de 37 0C. 4 horas después de la inducción, se recogieron las células por centrifugación (20 min a 5000 x g), se congelaron y se almacenaron a -20 0C. Para la lisis celular, se resuspendió el sedimento congelado en fosfato de sodio 25 mM, pH 8,5, MgCl26 mM, 10 U/ml de Benzonase®, 1 comprimido de Complete® y 1 comprimido de Complete® sin EDTA por 50 ml de tampón (cóctel inhibidor de proteasas) y se lisó la suspensión resultante por homogeneización a alta presión. Se centrifugó el lisado bruto y se precipitó e1HBcAg en el sobrenadante con sulfato de amonio (35 % p/v). Después de centrifugación adicional, se resuspendió el precipitado y se dializó frente a un tampón fosfato seguido de una etapa de calentamiento (700C durante 30 minutos). Después de centrifugación, se aplicó el sobrenadante claro sobre una columna Toyopearl DEAE 650-11 (de Tosoh Bioscience) preequilibrada en fosfato de potasio 25 mM, pH 7. A continuación, se eluyó la proteína aplicando un gradiente hasta una concentración de cloruro de potasio de 500 mM. Finalmente, se sometió la proteína a cromatografía de exclusión por tamaño (S400) y se agruparon las fracciones que contenían proteína.

Ejemplo 2

Inmunoensayo para detectar anticuerpos anti-HBc en un formato de prueba competitiva

Se analizaron muestras de suero de un panel de donantes de sangre sanos en un ECLIA (inmunoensayo de electroquimioluminiscencia) anti-HBc competitivo para detectar la presencia de anticuerpos anti-HBc en analizadores automáticos Cobas e® (Roche Diagnostics GmbH). Cobas e® y Elecsys® son marcas registradas del grupo Roche. Las muestras dieron negativas para anti-HBc con al menos un ensayo anti-HBc marcado con CE que es diferente del ensayo anti-HBc Elecsys® y que está disponible comercialmente.

En el ensayo, el suero se hace reaccionar con HBc. Después de la adición de anticuerpos biotinilados y anticuerpos marcados con complejo de rutenio (Tris(2,2'-bipiridil)rutenio(II); (Ru(bpy)32+), ambos específicos para HBcAg, conjuntamente con micropartículas recubiertas de estreptavidina, se ocuparon los sitios de unión todavía libres en los antígenos HBc. Todo el complejo se une a la fase sólida por medio de la interacción de biotina y estreptavidina. Después de eliminar las sustancias no unidas, se aplica un voltaje al electrodo e induce una emisión quimioluminiscente a 620 nm después de la excitación en un electrodo de platino que se mide por un fotomultiplicador.

Los valores medidos altos indican la unión de anticuerpos biotinilados y anticuerpos marcados con complejo de rutenio añadidos y, por tanto, ausencia de anticuerpos anti-HBc en la muestra. En presencia de anticuerpos anti-HBc en la muestra, estos anticuerpos compiten con ambos tipos de anticuerpos específicos del ensayo para la unión al antígeno HBcAG, lo que da lugar a una emisión de luz reducida a 620 nm después de la excitación en un electrodo de platino. La salida de señal está en unidades de luz arbitrarias.

En consecuencia, las muestras que tienen un valor medido de mayor que el índice de corte de 1,0 se consideran no reactivas, mientras que las muestras que tienen un valor medido menor que o igual al índice de corte de 1,0 se consideran reactivas.

En base al formato de ensayo anti-HBc Elecsys® competitivo, se sometieron a prueba tres configuraciones de HBcAg diferentes. "HBcAg X" se refiere a un antígeno que comprende la SEQ ID NO:2; "HBcAg Y" se refiere a un antígeno que comprende la SEQ ID NO:1. Solo se modificó la configuración del antígeno, todos los demás reactivos y condiciones permanecieron sin cambios. Los resultados de las muestras positivas (infectadas) verdaderas no se vieron afectados al aplicar una combinación HBcAg X e Y como primer y segundo compuesto de captura (datos no mostrados). La tabla 1 se refiere solo a los resultados positivos discrepantes (=falsos) del panel de muestra. Las tres configuraciones diferentes fueron como sigue:

A) HBcAg X se usa como diana en el ensayo anti-HBc competitivo.

B) HBcAg Y (ligeramente diferente de HBcAg X) se usa como diana en el ensayo anti-HBc competitivo.

C) Una combinación de HBcAg X y HBcAg Y se usan conjuntamente como diana en el ensayo anti-HBc competitivo La tabla 1 muestra los resultados de un ECLIA (inmunoensayo de electroquimioluminiscencia) anti-HBc competitivo. Se usaron sueros disponibles comercialmente (Cruz Roja de Baviera) negativos para anticuerpos frente al antígeno HBc como muestras. La tabla 1 enumera solo aquellos resultados con hallazgos discrepantes. HBcAG diferentes mostraron patrones individuales de resultados anti-HBc positivos discrepantes. Cuando se usaron dos preparaciones diferentes de antígeno HBc (HBcAG), 11 muestras dieron positivos (falsos) (reactivas) cuando se usó HBcAG X, 7 muestras dieron positivos (falsos) solo cuando se usó el segundo HBcAG Y, y 2 muestras dieron positivos (falsos) tanto con HBcAG X como con HBcAG Y. Por el contrario, cuando se usó una mezcla 1:1 de ambos antígenos, es decir, HBcAG X y HBcAG Y, solo 5 de estas 18 muestras dieron positivos, disminuyendo el número de pruebas positivas falsas en más de 3 veces. En detalle, el número de muestras que dieron positivos falsos usando HBcAGX solo, se redujo de 11 a 3 y el número de muestras que dieron positivos falsos usando HBcAGY solo, se redujo de 9 a 5 cuando se usó dicha mezcla 1:1 de ambos antígenos (HBcAG X y HBcAG Y). Como se esperaba, las dos muestras dieron positivos falsos con ambos antígenos (muestras n.° 2942 y 3657), también dieron positivos falsos con la mezcla.

Como consecuencia, la especificidad de este inmunoensayo competitivo se incrementó cuando al menos dos antígenos HBc ligeramente diferentes se aplicaron como una mezcla.

Al aplicar el principio de usar dos primer y segundo compuestos de captura ligeramente diferentes para un analito en un procedimiento en base a un formato de prueba competitivo, la especificidad se puede incrementar considerablemente, es decir, se pueden evitar resultados positivos falsos en un grado considerable.

Tabla 1: resultados de un ECLIA (inmunoensayo de electroquimioluminiscencia) anti-HBc competitivo, COI: índice de corte

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para determinar un analito en una muestra sospechosa de comprender dicho analito, que comprende

a) poner en contacto con dicha muestra al menos un primer y un segundo compuesto de captura para dicho analito, en el que dichos primer y segundo compuestos de captura son compuestos de captura no idénticos mensurablemente diferentes en al menos una propiedad química y/o física, en el que dichos compuestos de captura compiten en la unión a dicho analito, y en el que dichos compuestos de captura son polipéptidos;

b) poner en contacto dichos compuestos de captura en contacto con dicha muestra con un especificador enlazado a un indicador, en el que dicho especificador compite en la unión a dichos compuestos de captura con dicho analito; c) determinar la cantidad de complejos que comprenden dicho especificador y un compuesto de captura; y d) determinar dicho analito en una muestra en base al resultado de la etapa c),

en el que dicho segundo compuesto de captura se deriva o se puede derivar de dicho primer compuesto de captura por al menos uno de:

(i) introducir al menos un intercambio de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de dicho primer compuesto de captura,

(ii) producir dicho segundo compuesto de captura en un fondo celular diferente en comparación con dicho primer compuesto de captura,

(iii) eliminar o prevenir la glucosilación de dicho segundo compuesto de captura en comparación con dicho primer compuesto de captura,

(iv) purificar dicho segundo compuesto de captura por diferentes medios y/o por un procedimiento diferente en comparación con dicho primer compuesto de captura,

(v) desnaturalizar y/o replegar dicho segundo compuesto de captura en diferentes condiciones en comparación con dicho primer compuesto de captura, y

(vi) almacenar dicho segundo compuesto de captura en diferentes condiciones en comparación con dicho primer compuesto de captura.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la competencia en la unión a una molécula es la unión esencialmente a la misma o a la misma subestructura de dicha molécula.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que dichos compuestos de captura no idénticos son antígeno del núcleo de HB (HBc).

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho primer compuesto de captura es el antígeno HBc que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO:1 y en el que dicho segundo compuesto de captura es el antígeno HBc que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO:2.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho analito es un anticuerpo frente a un antígeno vírico.

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la etapa a) comprende poner en contacto con dicha muestra de desde 2 a 3 compuestos de captura para dicho analito.

7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la estructura química en dichos compuestos de captura que se unen a dicho analito es idéntica en todos de dichos compuestos de captura no idénticos.

8. Un kit para detectar un analito en una muestra, que comprende

(I) al menos dos compuestos de captura no idénticos mensurablemente diferentes en al menos una propiedad química y/o física, en el que dichos compuestos de captura compiten en la unión a dicho analito, en el que dichos compuestos de captura son polipéptidos, y en el que dicho segundo compuesto de captura se deriva o se puede derivar de dicho primer compuesto de captura por al menos uno de:

(vi) almacenar dicho segundo compuesto de captura en diferentes condiciones en comparación con dicho primer compuesto de captura; y

(II) un especificador enlazado a un indicador, en el que dicho especificador compite en la unión a dichos compuestos de captura con dicho analito.

9. El kit de la reivindicación 8, que comprende además un soporte sólido para inmovilizar dichos compuestos de captura o constituyentes de dicha muestra que comprende al menos dicho analito.

10. Un dispositivo para determinar un analito en una muestra que incluye (i) una unidad de análisis para la medición de la cantidad de dicho analito en dicha muestra y una (ii) unidad de ordenador para procesar los datos resultantes para la evaluación, comprendiendo dicho dispositivo

11. El uso de (i) una composición que comprende un primer y un segundo compuesto de captura y (ii) un especificador enlazado a un indicador, en la que dichos primer y segundo compuestos de captura son compuestos de captura no idénticos mensurablemente diferentes en al menos una propiedad química y/o física, en la que dichos compuestos de captura compiten en la unión a un analito, en la que dichos compuestos de captura son polipéptidos, y en la que dicho especificador compite en la unión a dichos compuestos de captura con dicho analito; para determinar un analito en dicha muestra,

en la que dicho segundo compuesto de captura se deriva o se puede derivar de dicho primer compuesto de captura por al menos uno de: