CN1892223B - 一种胶体金半定量法的快速免疫诊断试纸条 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种胶体金半定量免疫诊断试纸条的制作和装配方法。该试纸条利用免疫层析原理,可迅速目检出纳米胶体金标记物和样品结合后的颜色,并通过测试区与平行参比区的颜色对比的强弱来判定检测的半定量结果,具有反应迅速,可迅速判定样品中待测物的有无及其含量高低的特性。
Description
技术领域 本发明涉及一种快速半定量检测病原物(抗体或抗原)的纳米胶体金试纸,还涉及到该试纸的设计和装配组织方式。
背景技术
现有用于免疫诊断的试纸条(test strip)在免疫诊断试剂中最为方便和快捷,根据诊断类别,可分为传染性疾病、内分泌、肿瘤、药物检测等。但目前的这些试纸条从结果判断的方法学来看主要以胶体金定性检测为主,检测结果只能判定病原物的有无而不能判定其含量是否高于某种诊断标准。实际应用中,判断某种待检出物的含量多少对于临床诊断来说更具参考价值。对于需要检测传染疾病病原的感染程度、内分泌的失调与否、肿瘤标志物是否高于正常水平及违禁药物摄取量是否超标来说,定性类的胶体金免疫诊断试纸无法提供量化的检测结果。
发明内容
本发明的目的是为了克服当前免疫诊断的试纸条在实际推广使用中存在的不足和缺陷,提供一种不需要特定仪器设备辅助的、能迅速判定检测结果并能对检测结果进行半定量水平检测(高于或等于或低于标准对比样品的浓度)的免疫诊断试纸,同时提供该试纸的制作和装配方法。
半定量法的胶体金快速免疫诊断试纸条的制作和装配方法:该试纸条分为4个部分,包括了探样区,标记物结合区,对比检测区,吸水区。所有反应均在层析介质上完成,层析介质可以是硝酸纤维膜(NC膜)、醋酸纤维膜、玻璃纤维膜。支持物采用等宽度PVC塑料板。整个检测系统用胶固定在PVC板上,该板伸出部分作为检测使用时的手柄。检测膜中间被挖掉了一窄条,将检测区分为对称的两个部分,使得两条检测线彼此不连接。一个作为样品检验,另一个作为标准浓度显色对照,并兼作质控条带。
该试纸的制备装配方法包括以下步骤:(1)选择所标记蛋白最适纳米金颗粒大小(5nm-40nm)。(2)将所需金标记蛋白测定最适蛋白标记量。(3)大量制备所选粒度的纳米金蛋白溶胶。(4)裁剪层析膜(硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜或玻璃纤维素膜)成规定大小,中间作一窄缝,要求平行于膜侧边,缝距两边等距。(5)固定膜于PVC板,固定海绵吸水端,固定探样区海绵吸水垫。(6)点样在膜的检测区和对比质控区。(7)最后将加入金标蛋白的吸水海绵装配上PVC板。
本发明的积极意义和效果在于:生产简单,成本低,在原有的金标记体外免疫诊断方法上进一步实现了对临床检测更有意义的半定量检测。检测全过程在10分钟内判定结果,可以方便的实现家庭检测和现场检测。具有特异性高,检测程序简单,结果准确可靠。操作人员无需专业培训,按说明书指导即可得到半定量的检测结果。
具体实施例一
(1)购买甲胎蛋白(AFP)免疫小鼠,分别得到抗AFP的鼠源性特异单克隆抗体McAb2B和McAb3H。(2)选择McAb2B作为金标记抗体,使用柠檬酸钠还原法制备并测定其最适标记纳米金颗粒大小为5nm,9500rpm/min转速离心20分钟,制备储液。将5nm胶体金和标记单抗进行蛋白最适量测定,PH9.0硼酸盐缓冲液将标记单抗做5-50Ug/ml的梯度液,加入金储液后再加入10%NaCl作稳定实验,5分钟后离心静止测OD580nm,得光密度稳定时得蛋白浓度为17ug/ml。制备好后,加入PEG作成胶体金稳定液。(3)将标记好的金标抗体McAb2B用1cm宽1.5cm长0.08cm厚度的无菌吸水海绵吸附作成金标记物垫,4℃黑暗环境,氮气缓慢吹干待用。(4)选取无菌硝酸纤维素薄膜,裁剪成1cm宽,5cm长的矩形条,中间作1mm窄缝,要求平行于膜侧边,缝距两边等距,缝长15mm。检测区条带距膜探样端2.2cm,处于窄缝中间位置。检测带喷涂30ug/ml的McAb3H,半定量质控带涂10ug/ml甲胎蛋白,两条带长0.2cm,宽0.05cm。4℃黑暗环境过夜,5%BSA封闭10小时,CO2缓慢吹干。(5)裁剪同硝酸纤维膜宽度的洁净PVC塑料板,要求在吸水端多2cm作为检测用手柄,在对应硝酸纤维膜探样区外多延伸1.2cm用强力双面胶将处理好的硝酸纤维素膜固定在PVC板上。硝酸纤维素膜吸水区用固定等宽1.5cm长0.25cm厚度的无菌吸水海绵。探样区固定1cm长等宽高级滤纸,距固定硝酸纤维膜0.2cm。中间用制备好的金标记物垫按Z型方式压在滤纸和硝酸纤维膜下面。搭在硝酸纤维膜上面的用胶贴牢。整个过程要求避免其它蛋白的沾染。即制备成了半定量检测人甲胎蛋白的试纸条。铝箔袋密封4℃度干燥保存备用。
在检测前将试纸连包装拿出,室温放置5分钟左右。取出试纸,将探样区浸于样品溶液中,液面不要过探样区。2-5秒后拿出,水平放置在干净操作台上。6-10分钟内即可肉眼见到结果。如果样品检测带和半定量带均出现红色,证明检测阳性。检测带颜色高于半定量带表明样品中存在的人甲胎蛋白高于10ug/ml水平。颜色差异不大则样品中存在的人甲胎蛋白接近于10ug/ml水平。如果检测带颜色低于半定量带则表面样品中存在的人甲胎蛋白低于10ug/ml水平。如果检测带没有看到红色而半定量带看见红色说明待测样品没有检出规定水平上(10ug/ml)的人肝细胞肝癌标志物甲胎蛋白,试纸条装置质量完好。如果检测带没有看到红色而半定量带也没有看见红色说明试纸条装置失效,已经不能用于检测。
具体实施例二
(1)购买甲三型流感病毒特异抗原神经氨酸酶(NA)和血凝素蛋白免疫小鼠,分保得到抗两种抗原的鼠源性特异单克隆抗体IgG1和IgG2。(2)选择IgG1作为金标记抗体,使用柠檬酸钠还原法制备并测定其最适标记纳米金颗粒大小为15nm,7300rpm/min转速离心20分钟,制备储液。将15nm胶体金和标记单抗进行蛋白最适量测定,PH9.0硼酸盐缓冲液将标记单抗作5-50Ug/ml的梯度,加入金储液后再加入10%NaCl作稳定实验,5分钟后离心静止测OD580nm,得光密度稳定时得蛋白浓度为10ug/ml。制备好后,加入PEG作成胶体金稳定液。(3)将标记好的金标抗体IgG1用1cm宽1.5cm长0.08cm厚度的无菌吸水海绵吸付作成金标记物垫,4℃黑暗环境,氮气缓慢吹干待用。(4)选取无菌玻璃纤维膜,裁剪成1cm宽,5cm长的矩形条,中间作0.8-1mm窄缝,要求平行于膜侧边,缝距两边等距,缝长10-15mm。检测区条带距膜探样端2.2cm,处于窄缝中间位置。检测带喷涂30ug/ml的IgG2,半定量质控带涂20ug/ml甲三型流感病毒裂解液(已经用甲醛溶液灭活甲三型流感病毒),两条带长0.2cm,宽0.05cm。4℃黑暗环境过夜,5%BSA封闭10小时,CO2缓慢吹干。(5)裁剪同玻璃纤维膜宽度的洁净PVC塑料板,要求在吸水端多2cm作为检测用手柄,在对应玻璃纤维膜探样区外多延伸1.2cm用强力双面胶将处理好的玻璃纤维膜固定在PVC板上。玻璃纤维膜吸水区用固定等宽1.5cm长0.25cm厚度的无菌吸水海绵。探样区固定1cm长等宽高级滤纸,距固定玻璃纤维膜0.2cm。中间用制备好的金标记物垫按Z型方式压在滤纸和玻璃纤维膜下面。搭在玻璃纤维膜上面的用胶贴牢。整个过程要求避免其它蛋白的沾染。即制备成了半定量检测人甲三型流感病毒的试纸条。铝箔袋密封4℃度干燥保存备用。
在检测前将试纸连包装拿出,室温放置5分钟左右。取出试纸,将探样区浸于样品溶液中,液面不要过探样区。2-5秒后拿出,水平放置在干净操作台上。6-10分钟内即可肉眼见到结果。如果样品检测带和半定量带均出现红色,证明检测阳性。检测带颜色高于半定量带表明样品中存在的甲三型流感病毒含量高于20ug/ml水平。颜色差异不大则样品中存在的甲三型流感病毒含量接近于20ug/ml水平。如果检测带颜色低于半定量带则表面样品中存在的甲三型流感病毒含量低于20ug/ml水平。如果检测带没有看到红色而半定量带看见红色说明待测样品没有检出规定水平上(20ug/ml)含量的甲三型流感病毒,试纸条装置质量完好。如果检测带没有看到红色而半定量带也没有看见红色说明试纸条装置失效,已经不能用于检测。
具体实施例三
(1)购买葡萄球菌蛋白A(SPA)纯品测定蛋白含量(2)使用柠檬酸钠还原法测定所用SPA的最适标记纳米金颗粒大小为40nm,2000rpm/min转速离心30分钟,制备储液。将40nm胶体金和SPA进行蛋白最适量测定,PH9.0硼酸盐缓冲液将标记SPA作5-50Ug/ml的梯度,加入金储液后加入10%NaCl作稳定实验,5分钟后离心静止测OD580nm,得光密度稳定时得SPA蛋白浓度为4.6ug/ml。制备好后,加入PEG作成胶体金稳定液。(3)将标记好的金标SPA用1cm宽1.5cm长0.08cm厚度的无菌吸水海绵吸付作成金标记物垫,4℃黑暗环境,氮气缓慢吹干待用。(4)选取无菌醋酸纤维素薄膜,裁剪成1cm宽,5cm长的矩形条,中间作0.8-1mm窄缝,要求平行于膜侧边,缝距两边等距,缝长10-15mm。检测区条带距膜探样端2.2cm,处于窄缝中间位置。检测带喷涂30ug/ml的HCMV特异性膜抗原(如gp52等),半定量质控带涂13.5ug/ml人血清IgG,两条带长0.2cm,宽0.05cm。4℃黑暗环境过夜,5%BSA封闭10小时,CO2缓慢吹干。(5)裁剪同醋酸纤维膜宽度的洁净PVC塑料板,要求在吸水端多2cm作为检测用手柄,在对应醋酸纤维膜探样区外多延伸1.2cm用强力双面胶将处理好的醋酸纤维素膜固定在PVC板上。醋酸纤维素膜吸水区用固定等宽1.5cm长0.25cm厚度的无菌吸水海绵。探样区固定1cm长等宽高级滤纸,距固定醋酸纤维膜0.2cm。中间用制备好的金标记物垫按Z型方式压在滤纸和醋酸纤维膜下面。搭在醋酸纤维膜上面的用胶贴牢。整个过程要求避免其它蛋白的沾染。即制备成了半定量检测人巨细胞病毒(HCMV)的试纸条。铝箔袋密封4℃度干燥保存备用。
在检测前将试纸连包装拿出,室温放置5分钟左右。取出试纸,将探样区浸于样品溶液中,液面不要过探样区。2-5秒后拿出,水平放置在干净操作台上。6-10分钟内即可肉眼见到结果。如果样品检测带和半定量带均出现红色,证明检测阳性。检测带颜色高于半定量带表明样品中存在的抗巨细胞病毒的多抗体高于13.5ug/ml水平。颜色差异不大则样品中存在的抗巨细胞病毒的多抗体接近于13.5ug/ml水平。如果检测带颜色低于半定量带则表面样品中存在的抗巨细胞病毒的多抗体低于13.5ug/ml水平。如果检测带没有看到红色而半定量带看见红色说明待测样品没有检出抗巨细胞病毒的多抗体,试纸条装置质量完好。如果检测带没有看到红色而半定量带也没有看见红色说明试纸条装置失效,已经不能用于检测。
附图说明:
附图为一种胶体金半定量法的快速免疫诊断试纸条正视图(左图)、侧视图(右图)。
Claims (5)
1.一种胶体金半定量法的快速免疫诊断试纸条,该试纸条分为4个部分,包括了探样区,标记物结合区,对比检测区,吸水区,所有反应均在层析介质上完成,层析介质是硝酸纤维膜、醋酸纤维膜、玻璃纤维膜,支持物采用等宽度固体支持板,整个检测系统用胶固定在固体支持板上,金标记物垫作为标记物结合区,其特征在于该板伸出部分作为检测使用时的手柄,检测膜中间被挖掉了一窄条,窄条平行于试纸条侧边,将检测区分为对称的两个部分,使得两条检测线彼此不连接,一个是检验带,作为样品检验,另一个是半定量带,作为标准浓度显色对照,并兼作质控条带。
2.根据权利要求1所述的一种胶体金半定量法的快速免疫诊断试纸条,其特征在于制作包括以下步骤:(1)试纸条的切割装配方式为选取无菌层析介质薄膜,裁剪成矩形长条,中间作一窄缝,要求窄缝平行于膜侧边,缝距两边等距,缝长长于检测条带点样宽度,检测区条带处于窄缝中间位置,(2)金标记物垫制备方式为用等试纸条宽度的无菌吸水薄海绵吸附做成金标记物垫,(3)半定量带同时又作为质控带的设计方式为检测带喷涂能与金标物特异结合的蛋白,半定量质控带涂参照用蛋白。
3.根据权利要求1至2中任意一项所述的一种胶体金半定量法的快速免疫诊断试纸条,其特征在于检测方式分为两种类型:(1)包被抗体检测抗原,半定量条带为包被一定参考浓度的抗原物质,该抗原物质能特异结合胶体金标记的抗体;(2)包被抗原检测抗体,半定量条带为一定参考浓度的抗体物质,该抗体物质能特异结合胶体金标记的SPA。
4.根据权利要求3所述的一种胶体金半定量法的快速免疫诊断试纸条,其特征在于用于标记抗原或抗体的胶体金颗粒大小在5nm-40nm之间。
5.根据权利要求1至4中任意一项所述的一种胶体金半定量法的快速免疫诊断试纸条,其特征在于所使用金标记物垫是由吸水海绵来制作并通过Z型的方式搭连探样区和检测区。
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