CN104267027A

CN104267027A - 一种利用可显色印迹胶体薄膜检测目标物的方法

Info

Publication number: CN104267027A
Application number: CN201410553372.7A
Authority: CN
Inventors: 孟子晖; 芦薇; 薛敏; 薛飞; 王丰彦; 王秋鸿
Original assignee: Beijing Institute of Technology BIT
Current assignee: Beijing Institute of Technology BIT
Priority date: 2014-10-17
Filing date: 2014-10-17
Publication date: 2015-01-07

Abstract

本发明涉及一种利用可显色印迹胶体薄膜检测目标物的方法，其通过带滚珠的容器将含有待测物的待测溶液涂覆于可显色印迹胶体薄膜上，通过观察可显色印迹胶体薄膜是否变色，从而判定待测物是否包含有目标物。按照本发明的检测目标物的方法能够彻底摆脱实验室环境限制以及昂贵的时间、物力、人力成本，实现检测人员、场地随意性，并得到特异性强、灵敏度高的裸眼定性/定量，实时检测结果。

Description

一种利用可显色印迹胶体薄膜检测目标物的方法

技术领域

本发明涉及一种利用可显色印迹胶体薄膜检测目标物的方法，属于分析化学领域。

背景技术

因对环境、人体及公共安全均的损害，对于以2,4,6-三硝基甲苯(TNT)为代表的芳香环类硝基化合物；以雌酮为代表的内分泌干扰物类；以甲氟膦酸异丙酯(沙林)、O-1,2,2-三甲基丙基甲氟膦酸酯(梭曼)为代表的含磷神经毒物类的检测方法，相关研究历史悠久，种类多样。以TNT为例，如被应用多年的高效液相色谱法，以及近些年出现的悬臂微传感器等，都达到了很好的测量效果。但是，这些方法所用仪器昂贵，体积笨重，对检测环境要求苛刻，所用试剂纯度要求高，检测响应时间长，需要高昂的仪器购置、保养费用，同时需要对测量、维护人员进行必要的专业培训，投入一定的时间及资金成本。

光子晶体是指具有光子带隙特性的人造周期性电介质结构，具有波长选择功能，可以有选择的反射某个波长的光，被广泛地应用于生物化学传感器中。当这个波段恰好处于可见光范围，即可使该光子晶体结构产生特定的颜色。当这种结构可发生规律性的变化时，如组成光子晶体的微球体积随着检测物的浓度增高而逐渐增大，即产生浓度依赖性溶胀，进而光子晶体的结构色也会产生规律的改变，并以此完成定量/定性测量。然而，光子晶体的低选择性却成为了其限制因素。于是，人们尝试将其与分子印迹技术相结合分子，以得到具有高选择性，高灵敏度，应用范围广的便携智能光学传感器。分子印迹是指在聚合物内制备模板形状空穴，使之对模板分子具有记忆功能以实现特异性分子识别的技术。同时，结合了这两种技术的光学传感器，其敏感度可受如离子强度、pH值、有机溶剂与水的比例等诸多因素得以提高，通过此种方法合成的可显色印迹胶体薄膜可用于检测相应的目标物，但是由于其使用环境受限于实验室，无法实现户外实时测量，实用价值很低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用可显色印迹胶体薄膜检测目标物的方法，该方法能够彻底摆脱实验室环境限制以及昂贵的时间、物力、人力成本，实现检测人员、场地随意性，并得到特异性强、灵敏度高的裸眼定性/定量，实时检测结果。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用可显色印迹胶体薄膜检测目标物的方法，包含如下步骤：

(1)将预制检测溶液放入容器中，所述容器的开口处通过密封螺纹连接有可自由滚动的滚珠；

(2)检测时，将待测物放入存储有预制检测溶液放入容器中，形成待测溶液；

(3)所述容器的滚珠与所述可显色印迹胶体薄膜表面接触，通过滚动滚珠将待测溶液涂覆于可显色印迹胶体薄膜上；

(4)待待测溶液自然挥发后，观察可显色印迹胶体薄膜的变色情况，从而判定待测物是否包含有目标物。

如果变色，则待测物中包含有目标物，如果可显色印迹胶体薄膜颜色不变，或达不到相应变色幅度，则不含目标物。

优选的是，如上所述的利用可显色印迹胶体薄膜检测目标物的方法中，所述目标物为芳香类硝基化合物、内分泌干扰物或含磷神经毒物类；更优选的是，目标物为2,4,6-三硝基甲苯(TNT)、雌酮、甲氟膦酸异丙酯(沙林)或O-1,2,2-三甲基丙基甲氟膦酸酯(梭曼)。

优选的是，如上所述容器具有瓶盖，所述瓶盖与瓶身、走珠部分与瓶身分别通过螺纹连接，优点是使得容器具有密封性，以保证待测溶液在一段时间内不会挥发。优选的是，如上所述的容器，其瓶身具有可变形性，所述瓶身的材质可为聚对苯二甲酸乙二酯纯(PET)，高密度聚乙烯(HDPE)或聚碳酸酯(PC)。具有可变形性的瓶身的优点是方便待测溶液通过手动挤压瓶身的方式流出。

如上所述的预制检测溶液为有机溶剂(如甲醇/乙腈)-水无机盐溶液，或纯有机溶剂(如四氯化碳)，或纯水/无机盐溶液，所用溶剂种类、配比需要根据待测物加以确定。

优选的是，如上所述的可显色印迹胶体薄膜采用溶剂挥发垂直自组装方式制备得到，利用此种方法制备得到的可显色印迹胶体薄膜具有高灵敏度和高选择性。具体制备方法包含如下步骤：

(1)模板印迹胶体小球的制备

将目标物模板分子与酰胺类或丙烯酸类功能单体，以1:3～1:10的摩尔比例，溶于与与总反应体系体积比例为1:6～1:30，已除阻凝剂的甲基丙烯酸酯类单体中，超声20min，倒入85ml去离子水中，在氮气保护下搅拌加热至75～85℃，再加入与单体摩尔比例为1:40～1:150的过硫酸钾溶液，恒温搅拌35～55min，具体的时间、温度、反应物比例视具体检测要求及模板分子性质，综合考量后确定。将所得聚合物依次用甲醇-乙酸(v/v，6/4～8/2)溶液、甲醇、去离子水依次洗涤数次，离心、去除上层清液并重新超声分散洗剂，以除去模板分子模板及其它未反应完的试剂用以制备模板印迹胶体小球。其中，具体加入功能单体的种类、用量以及甲基丙烯酸甲酯单体的用量，以根据需印迹的模板分子种类与用量进行调整；同时，单体用量还决定了聚合物小球的粒径大小，即印迹胶体阵列的起始结构色，故其也可根据需要进行调整。当单体用量小时，所得聚合物小球粒径较小，结构色靠近蓝色区域；随着单体用量加大，小球体积增大，结构色由蓝依次转为青、绿、黄、橙、红、紫。此外，若模板本身带有可印迹位点较多，如硝基，则可适量降低功能单体的用量。可见光，即人眼可感知波长大约在390-700nm之间，而正常视力的人眼对波长约为555nm的电磁波最为敏感。因为这种电磁波处于绿光区，所以可通过控制单体量，进而控制胶体微球粒径，最优化起始结构色为绿色，以得到更好的检测效果。甲醇-乙酸的比例视具体模板分子性质而定。使用有机溶剂洗脱模板时，要以不破坏甲基丙烯酸甲酯小球为原则来确定具体的清洗次数、时间、离心时间及离心转速。若用量或时间过少，则可能会造成大量模板残留，反之则易使球体塑化；

(2)印迹胶体小球的自组装

以盖玻片为基片，将其浸泡到浓H₂SO₄-H₂O₂(v/v,7/3)溶液中进行亲水化处理，用去离子水洗净吹干，直至盖玻片表面可自然铺展为均匀水膜，再将之垂直架于玻璃缸上，加入0.1～0.4％(w/w)分子印迹胶体小球溶液，并置于培养箱中，在20～40℃、湿度30～70％的恒温恒湿条件下使溶液匀速挥发。在此过程中，小球通过表面张力缓慢地自组装于基片上，进而获得具有良好机械强度的分子印迹胶体阵列。其中，所用聚合物溶液的浓度要依据小球的粒径进行适当的调整，而温度和湿度也要对聚合物溶液浓度以及溶液体积加以权衡，以得到合适的液体挥发速度，从而控制页面匀速下降随之得到高质量的自组装胶体阵列；

(3)印迹胶体阵列的固化

将胶带粘于该分子印迹胶体阵列上，将粘有分子印迹胶体阵列的胶带从盖玻片上揭下。所选取胶带本身在有机溶剂检测环境下有一定的稳定性，且本身颜色、材质不得干扰检测结果；

(4)可显色印迹胶体薄膜的预处理

根据每次实际测量需要的大小进行剪裁，并浸没于盛有去离子水的容器中，测量时从其中直接取出晾干使用即可。

本发明的有益效果：

(1)本发明中使用的容器小巧，方便携带，内置待测溶液，真正实现了随身携带理想检测环境，从而克服了传统测量方式的实验室局限性，具有现场检测，实用性高，检测地点随意性等优点；

(2)相较于喷涂法，本方法对溶液的粘度等没有限制，并不会对目标物以外的环境产生污染，相较于其他涂覆行为(如刷子、棉签等)，避免了工具对可显色印迹胶体薄膜的破坏，并使得待检测物更加充分、柔和地与可显色印迹胶体薄膜接触；此外，容器开口处的滚珠设计，使得待测溶液能够均匀的涂覆于可显色印迹胶体薄膜，产生稳定均一的测量结果；。

(3)该检测方法仅需加入待检测物，再进行涂覆，因而无需专业人员培训，无需专业知识背景，实现了检测人员随意性；

(4)检测结果响应时间短，仅需数分钟，具有实时检测性；

(5)该可显色印迹胶体薄膜稳定性好，存储时间长达两年以上，可根据测量具体需要进行大小调整，随时取用

(6)所得胶体小球及所制备的可显色印迹胶体薄膜成本低廉，制备周期短，实验结果无需精密、昂贵仪器进行辅助评价，免去了昂贵的时间、物资、人力成本；

(7)该检测方法对目标物覆盖范围广，可根据具体需要进行制备，材料选择性高，灵敏度高，实现了高特异性低浓度检测，应用灵活性强；

(8)结果具有裸眼检测性，对目标物的浓度及种类均可通过裸眼检测结果进行判断，方便快捷，可同时完成定性及定量检测。

附图说明

图1为本发明所使用的容器的一优选结构示意图；

其中，1-瓶盖；2-滚珠；3-密封螺纹；4-瓶身。

具体实施方式

实施例1

利用可显色印迹胶体薄膜检测TNT的方法：

(1)可显色印迹胶体薄膜的制备：选用丙烯酰胺作为功能单体，取模板分子(TNT)0.17mM，功能单体1mM溶于7ml已除阻凝剂的甲基丙烯酸酯类单体中，超声20min，倒入85ml离子水中，在氮气保护下搅拌加热至80℃，再加入0.74mM溶于5ml去离子水的过硫酸钾溶液，恒温搅拌45min，将所得聚合物依次用甲醇-乙酸(v/v，8/2)溶液、甲醇、去离子水依次洗涤数次，离心、去除上层清液并重新超声分散洗剂，从而得到洗脱模板后的印迹胶体小球。对其进行自组装时，取用0.25％(w/w)的溶液，置于培养箱中，在30℃、湿度50％的恒温恒湿条件下使溶液匀速挥发并用胶带固定所得的胶体阵列即为可显色印迹胶体薄膜。

(2)预制检测溶液的制备：甲醇-水(v/v,6/4)，取磷酸二氢钾-氢氧化钾配置缓冲液，该比例下最佳离子浓度为50mmol/L，最佳pH值为7，然后将其放入如图1所示的带滚珠的容器内存放。

(3)检测：向容器内加入待测物，轻摇后得到待测溶液，将滚珠在上述制备得到的可显色印迹胶体薄膜表面反复滚动，使其待测液体涂覆于可显色印迹胶体薄膜上，待溶液自然挥发后，根据可显色印迹胶体薄膜显色情况加以判定。以蓝色为起始结构色时，若检测结果为为绿色，则TNT浓度为～5mM；若检测结果为黄色，则TNT浓度为～8mM。若是待测物不是TNT，则可显色印迹胶体薄膜颜色不变。

其中，如图1所示的带滚珠的容器，其包含有瓶盖1、滚珠2、密封螺纹3和瓶身4，所述容器瓶盖1及瓶身4采用塑料(PET/PC/HPDE)、耐酸钢或玻璃材质，滚珠2采用耐酸钢材质。滚珠2位于容器开口处，其通过密封螺纹3与容器开口处连接；所述容器的瓶身4与瓶盖1同样通过密封螺纹连接以保证瓶身4内置预制检测溶液不会因为挥发而发生配比改变。测量时，将待测物加入该容器，以45°角置于可显色印迹胶体薄膜上，反复滚动，使液体涂覆于可显色印迹胶体薄膜上，静置数分钟等待检测结果即可。

实施例2

利用可显色印迹胶体薄膜检测2,4-DNT的方法：

(1)可显色印迹胶体薄膜的制备：选用丙烯酸作为功能单体，取模板分子0.34mM，功能单体1mM溶于5ml已除阻凝剂的甲基丙烯酸酯类单体中，超声20min，倒入85ml离子水中，在氮气保护下搅拌加热至85℃，再加入0.74mM溶于5ml去离子水的过硫酸钾溶液，恒温搅拌40min，将所得聚合物依次用甲醇-乙酸(v/v，8/2)溶液、甲醇、去离子水依次洗涤数次，离心、去除上层清液并重新超声分散洗剂，从而得到洗脱模板后的印迹胶体小球。对其进行自组装时，取用0.25％(w/w)的溶液，置于培养箱中，在35℃、湿度60％的恒温恒湿条件下使溶液匀速挥发并用胶带固定所得的胶体阵列即为可显色印迹胶体薄膜。

(2)预制检测溶液的制备：甲醇-水(v/v,7/3)，取磷酸二氢钾-氢氧化钾配置缓冲液，该比例下最佳离子浓度为60mmol/L，最佳pH值为6。

(3)检测:检测时，向容器内加入待测物，轻摇后得到待测溶液，将滚珠在上述制备得到的可显色印迹胶体薄膜表面反复滚动，使其待测液体涂覆于可显色印迹胶体薄膜上，待溶液自然挥发后，根据可显色印迹胶体薄膜显色情况加以判定。

实施例3

利用可显色印迹胶体薄膜检测4-MNT的方法：

(1)可显色印迹胶体薄膜的制备：选用丙烯酰胺作为功能单体，取模板分子0.17mM，功能单体1mM溶于3ml已除阻凝剂的甲基丙烯酸酯类单体中，超声20min，倒入85ml离子水中，在氮气保护下搅拌加热至85℃，再加入0.74mM溶于5ml去离子水的过硫酸钾溶液，恒温搅拌55min，将所得聚合物依次用甲醇-乙酸(v/v，7/3)溶液、甲醇、去离子水依次洗涤数次，离心、去除上层清液并重新超声分散洗剂，从而得到洗脱模板后的印迹胶体小球。对其进行自组装时，取用0.4％(w/w)的溶液，置于培养箱中，在40℃、湿度70％的恒温恒湿条件下使溶液匀速挥发并用胶带固定所得的胶体阵列即为可显色印迹胶体薄膜。

(2)预制检测溶液的制备：甲醇-水(v/v,7/3)，取磷酸二氢钾-氢氧化钾配置缓冲液，该比例下最佳离子浓度为60mmol/L。

(3)检测：向容器内加入待测物，轻摇后得到待测溶液，将滚珠在上述制备得到的可显色印迹胶体薄膜表面反复滚动，使其待测液体涂覆于可显色印迹胶体薄膜上，待溶液自然挥发后，根据可显色印迹胶体薄膜显色情况加以判定。

实施例4

利用可显色印迹胶体薄膜检测雌酮的方法：

(1)可显色印迹胶体薄膜的制备：选用丙烯酰胺作为功能单体，取模板分子0.2mM，功能单体2mM溶于9ml已除阻凝剂的甲基丙烯酸酯类单体中，超声20min，倒入85ml离子水中，在氮气保护下搅拌加热至80℃，再加入0.74mM溶于5ml去离子水的过硫酸钾溶液，恒温搅拌35min，将所得聚合物依次用甲醇-乙酸(v/v，8/2)溶液、甲醇、去离子水依次洗涤数次，离心、去除上层清液并重新超声分散洗剂，从而得到洗脱模板后的印迹胶体小球。对其进行自组装时，取用0.2％(w/w)的溶液，置于培养箱中，在30℃、湿度50％的恒温恒湿条件下使溶液匀速挥发并用胶带固定所得的胶体阵列即为可显色印迹胶体薄膜表面。

(2)预制检测溶液的制备：甲醇-水(v/v,65/35)的弱酸性溶液，取磷酸二氢钾-氢氧化钾配置缓冲液，该比例下最佳离子浓度为40mmol/L。

实施例5

利用可显色印迹胶体薄膜检测β-雌二醇的方法：

(1)可显色印迹胶体薄膜的制备：选用丙烯酰胺作为功能单体，取模板分子0.25mM，功能单体1.5mM溶于13ml已除阻凝剂的甲基丙烯酸酯类单体中，超声20min，倒入85ml离子水中，在氮气保护下搅拌加热至75℃，再加入0.8mM溶于5ml去离子水的过硫酸钾溶液，恒温搅拌40min，将所得聚合物依次用甲醇-乙酸(v/v，8/2)溶液、甲醇、去离子水依次洗涤数次，离心、去除上层清液并重新超声分散洗剂，从而得到洗脱模板后的印迹胶体小球。对其进行自组装时，取用0.1％(w/w)的溶液，置于培养箱中，在20℃、湿度30％的恒温恒湿条件下使溶液匀速挥发并用胶带固定所得的胶体阵列即为可显色印迹胶体薄膜。

(2)预制检测溶液的制备：甲醇-水(v/v,65/35)，取磷酸二氢钾-氢氧化钾配置缓冲液，该比例下最佳离子浓度为40mmol/L，最佳pH值为6。

(3)向容器内加入待测物，轻摇后得到待测溶液，将滚珠在上述制备得到的可显色印迹胶体薄膜表面反复滚动，使其待测液体涂覆于可显色印迹胶体薄膜上，待溶液自然挥发后，根据可显色印迹胶体薄膜显色情况加以判定。

实施例6

利用可显色印迹胶体薄膜检测硝基酚的方法：

(1)可显色印迹胶体薄膜的制备：选用丙烯酰胺作为功能单体，取模板分子0.5mM，功能单体1.5mM溶于10ml已除阻凝剂的甲基丙烯酸酯类单体中，超声20min，倒入85ml离子水中，在氮气保护下搅拌加热至80℃，再加入0.74mM溶于5ml去离子水的过硫酸钾溶液，恒温搅拌45min，将所得聚合物依次用甲醇-乙酸(v/v，8/2)溶液、甲醇、去离子水依次洗涤数次，离心、去除上层清液并重新超声分散洗剂，从而得到洗脱模板后的印迹胶体小球。对其进行自组装时，取用0.1％(w/w)的溶液，置于培养箱中，在30℃、湿度50％的恒温恒湿条件下使溶液匀速挥发并用胶带固定所得的胶体阵列即为可显色印迹胶体薄膜。

(2)预制检测溶液的制备：纯水，取磷酸二氢钾-氢氧化钾配置缓冲液，该比例下最佳离子浓度为30mmol/L，最佳pH值为6。

(3)检测：轻摇后得到待测溶液，将滚珠在上述制备得到的可显色印迹胶体薄膜表面反复滚动，使其待测液体涂覆于可显色印迹胶体薄膜上，待溶液自然挥发后，根据可显色印迹胶体薄膜显色情况加以判定。

实施例7

利用可显色印迹胶体薄膜检测沙林的方法：

(1)可显色印迹胶体薄膜的制备：选用丙烯酰胺作为功能单体，取模板分子0.5mM，功能单体1.5mM溶于10ml已除阻凝剂的甲基丙烯酸酯类单体中，超声20min，倒入85ml离子水中，在氮气保护下搅拌加热至80℃，再加入0.74mM溶于5ml去离子水的过硫酸钾溶液，恒温搅拌45min，将所得聚合物依次用甲醇-乙酸(v/v，8/2)溶液、甲醇、去离子水依次洗涤数次，离心、去除上层清液并重新超声分散洗剂，从而得到洗脱模板后的印迹胶体小球。对其进行自组装时，取用0.25％(w/w)的溶液，置于培养箱中，在30℃、湿度50％的恒温恒湿条件下使溶液匀速挥发并用胶带固定所得的胶体阵列。

(2)预制检测溶液的制备：甲醇-水(v/v,5/95)，加入磷酸二氢钾-氢氧化钾配制缓冲液，该比例下最佳pH值为7～9。

实施例8

利用可显色印迹胶体薄膜检测沙林的方法：

(1)可显色印迹胶体薄膜的制备：选用丙烯酰胺作为功能单体，取模板分子0.5mM，功能单体1.5mM溶于10ml已除阻凝剂的甲基丙烯酸酯类单体中，超声20min，倒入85ml离子水中，在氮气保护下搅拌加热至80℃，再加入0.74mM溶于5ml去离子水的过硫酸钾溶液，恒温搅拌45min，将所得聚合物依次用甲醇-乙酸(v/v，8/2)溶液、甲醇、去离子水依次洗涤数次，离心、去除上层清液并重新超声分散洗剂，从而得到洗脱模板后的印迹胶体小球。对其进行自组装时，取用0.25％(w/w)的溶液，置于培养箱中，在30℃、湿度50％的恒温恒湿条件下使溶液匀速挥发并用胶带固定所得的胶体阵列即可显色印迹胶体薄膜表面。

(2)预制检测溶液的制备：甲醇-水(v/v,30/70)，加入磷酸二氢钾-氢氧化钾配制缓冲液，该比例下最佳pH值为7～9。

对实施例1～8中反应体系可适度放大或缩小。所述可显色印迹胶体薄膜，均采用普通透明胶带加以固定。若使起始结构色为蓝色，随着目标物浓度的增加，胶体印迹阵列薄膜结构色可依照蓝、青、蓝绿、绿、黄、橙、红、紫这一顺序进行变化；若起始结构色非蓝色，则变化色阶减少但规律不变。该检测限可达毫摩数量级，响应时间数分钟，且该裸眼检测结果具有良好的选择性，即使对目标物的同类物质有所响应，其程度也具有极大差别。由此，本发明通过涂覆这一方式，完成了高选择性、高灵敏度、实时现场裸眼检测。

以上所述仅为本发明的的优选实施例，并不能限定本发明，可以肯定的是凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种利用可显色印迹胶体薄膜检测目标物的方法，包含如下步骤：

(1)将预制检测溶液放入容器中，所述容器开口处通过密封螺纹连接可自由滚动的滚珠；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述目标物为芳香类硝基化合物、内分泌干扰物或含磷神经毒物类。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述芳香类硝基化合物为2,4,6-三硝基甲苯、2,4-二硝基甲苯、2,6-二硝基甲苯、邻硝基甲苯、对硝基甲苯或间硝基甲苯。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述内分泌干扰物为雌酮、对硝基酚或β-雌二醇。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述内分泌干扰物为甲氟膦酸异丙酯或O-1,2,2-三甲基丙基甲氟膦酸酯。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述容器带有瓶盖，所述瓶盖与瓶身之间通过密封螺纹连接。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述容器，其瓶身具有可变形性。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述可显色印迹胶体薄膜采用溶剂挥发垂直自组装方式制备得到。