CN102353710A

CN102353710A - 一种胆固醇分子印迹膜传感电极检测血液胆固醇的用途

Info

Publication number: CN102353710A
Application number: CN2011101908532A
Authority: CN
Inventors: 赵晓联; 周智慧; 朱秋劲; 王捷; 毛飞君
Original assignee: WUXI JINKUN BIOLOGICAL ENGINEERING Co Ltd
Current assignee: WUXI JINKUN BIOLOGICAL ENGINEERING Co Ltd
Priority date: 2011-07-08
Filing date: 2011-07-08
Publication date: 2012-02-15
Anticipated expiration: 2031-07-08
Also published as: CN102353710B

Abstract

一种胆固醇分子印迹膜传感电极的用途，用于检测血液中的胆固醇含量，具体检测步骤为：（1）血液样本处理：如果血液样本为人体在空腹时采取的血液，则在室温下静置，然后进行离心处理，分离出血清；如果血液样本为血浆，则用肝素或EDTA（乙二胺四乙酸）进行抗凝；（2）取步骤（1）得到的血液样本滴加到胆固醇分子印迹膜传感电极上，然后将该胆固醇分子印迹膜传感电极插入电流型传感器，测定并记录读数。本胆固醇分子印迹膜传感电极在检测血液中的胆固醇含量时，具有成本低、灵敏度高、分析速度快、可以缩减取样量、避免繁琐的血液样品预处理等优点。

Description

一种胆固醇分子印迹膜传感电极检测血液胆固醇的用途

技术领域

本发明涉及测定血液中胆固醇的含量，具体涉及使用胆固醇分子印迹膜传感电极来检测血液中胆固醇的含量。

背景技术

胆固醇在人体内具有重要的生理作用，它在形成胆酸、构成细胞膜重要成分、合成参与机体内各种物质代谢的激素等方面有着重要的作用与功能，但当其过量时便会导致高胆固醇血症，对机体产生不利影响。现代研究发现，动脉粥样硬化、静脉血栓形成与高胆固醇血症有密切的相关性；高胆固醇还会对人体的骨质健康产生不良影响，大量摄入胆固醇会导致牙和牙龈间的沟隙会扩大，防止细菌进入沟隙的细胞会失去功能，细菌进入沟隙导致牙周病，牙周病严重者，最终导致牙齿脱落。

常用的检查血液中胆固醇的方法有色谱法、试剂法、胆固醇酶感应电极法等。色谱法是检测生物样品中胆固醇含量的标准方法，但是其对低浓度的生化分子成分检测结果具有不稳定性；试剂法在配置用于测定胆固醇含量的试剂时，需要加入繁多的缓冲液、防腐剂、显色剂、催化剂、稳定剂等，配置过程复杂，试剂反应需要时间在24小时左右；胆固醇酶感应电极法中，需要添加合适的表面活性剂，使酶与胆固醇分子充分接触，否则将得不到准确的结果。

目前利用分子印迹技术发展出很多新型的固相萃取、膜分离、免疫分析、抗体模拟、色谱固定器、仿生物传感器、催化剂、合成酶等方法。分子印迹技术是指通过分子印迹聚合物对印迹分子（或称模板分子）的“记忆”效应达到分子识别的目的。在形成分子印迹聚合物时，分子印迹聚合物内部形成了许多空穴，而且空穴之间有通道相连，通道的直径与空穴的大小相近，因此通道能起到拦截非模板分子的作用。在分子印迹聚合物的复合层内，只有尺寸较小的模板分子可以通过通道，与空穴内的作用点位相互作用被识别，而结构不同的其他分子难以通过内部通道，因而不被识别。利用分子印迹复合膜分离层的这一特性，模板分子可以源源不断地从膜一侧转移到另一侧，而非模板分子则不会通过膜。

由于分子印迹聚合物对模板分子的识别具有专一性，而且稳定性能好，因此其膜适合作为灵敏度较高的传感器，但是由于分子印迹膜的制备存在很多技术难点，如需要针对不同的模板分子寻找合适的功能单体；由于制备出来的膜有脆性，需要合适的交联剂来进行固化；需要要选择合适的洗脱剂，不仅要能洗去模板分子，还要能保持膜内空穴形态等，目前其实际应用还受到了很大限制。

发明内容

针对上述技术问题，本发明利用胆固醇分子印迹膜传感电极检测血液中的胆固醇含量。本胆固醇分子印迹膜传感电极在检测血液中的胆固醇含量时，具有成本低、灵敏度高、分析速度快、可以缩减取样量、避免繁琐的血液样品预处理等优点。

本发明的技术方案如下：

一种胆固醇分子印迹膜传感电极的用途，用于检测血液中的胆固醇含量，具体检测步骤为：

（1）血液样本处理：如果血液样本为人体在空腹采取的血液，则在室温下静置，然后进行离心处理，分离出血清；如果血液样本为血浆，则用肝素或EDTA（乙二胺四乙酸）进行抗凝；

（2）取步骤（1）得到的血液样本滴加到胆固醇分子印迹膜传感电极上，然后将该胆固醇分子印迹膜传感电极插入电流型传感器，测定并记录读数；

所述胆固醇分子印迹膜传感电极，由下述制备步骤得到：

（1）取绝缘电极基片，涂覆分离的工作电极和对电极，所述工作电极为圆形，对电极为环绕工作电极的半圆环形；

（2）在所述绝缘电极基片上对应步骤（1）的工作电极和对电极，用导电浆分别印制依次连接的工作电极连线和接线端子以及对电极连线和接线端子；

（3）在所述工作电极连线以及对电极连线表面涂覆一层绝缘层；在所述工作电极以及对电极的表面涂覆一层胆固醇分子印迹膜；

（4）所述胆固醇分子印迹膜的制备方法如下：

A、称取胆固醇模板分子与功能单体溶于有机溶剂中，经过超声波震荡使其混合均匀，再向其中加入交联剂，经过超声波震荡使其混合均匀，然后向其中加入引发剂和粘合剂，经过超声波震荡使其混合均匀，最后向该溶液中通入氮气除氧，将所得溶液密封待用；

B、将步骤A所得的溶液滴加到工作电极和对电极表面，盖玻片压盖，在365nm紫外光照射下进行聚合反应，合成含有胆固醇模板分子的薄膜；

C、将步骤B所得的承载胆固醇模板分子薄膜的电极用洗脱液进行洗脱，使胆固醇模板分子除去，直到最后一次洗脱液中检测不到胆固醇模板分子存在，得到胆固醇分子印迹膜，将制备好的电极保存在双蒸水中备用；

上述步骤中各种试剂的添加量为：胆固醇模板分子为0.9~1.2mmol，有机溶剂为90~120ml，功能单体为5.8~6.1mmol，交联剂为34~36mmol，引发剂为25~35mg，粘合剂0.04~0.056ml；将步骤A所得的溶液滴加到工作电极和对电极表面时，滴加的溶液体积为8~15ul，所形成的胆固醇分子印迹膜为圆形，其直径为5~6mm，厚度为80~100um；

所述电极基片的材质为聚碳酸酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯中的一种，其形状为片材或卷材；工作电极连线以及对电极连线表面涂覆的绝缘层的材质为聚氯乙烯；功能单体为甲基丙烯酸、甲基丙烯酰胺、丙烯酰胺中的一种；有机溶剂为氯仿和甲苯的混合溶液，氯仿和甲苯的体积比为1:5~9；交联剂为二甲基丙烯酸乙二醇酯；引发剂为偶氮二异丁腈；粘合剂为水性聚氨酯；洗脱液为氯仿和乙酸的混合溶液，氯仿和乙酸的体积比为1:0.2~0.3。

其中，将血液样本滴加到胆固醇分子印迹膜传感电极上检测时，滴加的血液样本体积为8~15ul；如果血液样本为人体在空腹时采取的血液，则在室温下静置的时间为20~30min；采用EDTA（乙二胺四乙酸）进行血浆抗凝时，EDTA的浓度为1mg/mL。

本发明的检测机理为：以目标分子胆固醇为模板，与功能单体接触并通过诱发聚合反应，围绕模板形成聚合物，洗脱胆固醇模板分子后，聚合物内部分布着大量胆固醇模板分子的印迹“空穴”，其在空间结构、结合位点等方面高度匹配胆固醇模板分子。用胆固醇分子印迹聚合物膜作为敏感材料，对待测样品进行检测，待测样品中的胆固醇分子能够与这种“空穴”结合，从而改变分子印迹膜的电化学性质，造成分子印迹膜的电导率增大、过膜电流增加。通过将覆盖有胆固醇分子印迹膜的电极与电流型传感器相连接，可以快速、灵敏的检测出样品中是否含有胆固醇分子。

本发明有益的技术效果在于：

（1）本胆固醇分子印迹膜传感电极采用二甲基丙烯酸乙二醇酯、氯仿和甲苯的混合溶液等亲水性溶剂作交联剂和有机溶剂，降低了分子印迹膜制备及使用过程中对溶剂的要求，所制备的聚合物可直接测试含水溶剂，扩大了材料的应用范围；

（2）本胆固醇分子印迹膜传感电极在胆固醇分子印迹膜的制备过程中加入了粘合剂水性聚氨酯，增加了分子印迹膜的柔韧性，防止了在聚合过程中分子印迹膜出现裂痕的现象，并使所制备的分子印迹膜内部的空穴分布均匀，十分有利于检测效果的提高；

（3）本胆固醇分子印迹膜传感电极通过丝网印刷技术与分子印迹聚合技术相结合获得胆固醇传感器，实现了微型化和集成化，适合于现场检测，并能避免繁琐的样品预处理过程，对于不同样品，只需替换附有胆固醇分子印迹膜的丝网印刷电极即可，通过它可以很快地检测出血液样本中胆固醇的含量，具有成本低、使用寿命长、重现性良好和特异性识别能力强等优点。

附图说明

图1为本胆固醇分子印迹膜传感电极的平面结构示意图，图中：1、电极基片；2、接线端子；3、电极连线；4、工作电极；5、对电极；6、绝缘层；7、胆固醇分子印迹膜。

图2为本胆固醇分子印迹膜传感电极的侧视图，图中：1、电极基片；6、绝缘层；7、胆固醇分子印迹膜。

图3为使用本发明进行检测时电信号的处理流程图。

具体实施方法

下面结合附图对本发明的实施例作详细说明，本发明的保护范围不限于下述实施例。

实施例1：

（一）制备电极。

如图1和图2所示，取绝缘电极基片1，采用采用丝网印刷技术，用导电银浆涂覆分离的工作电极4和对电极5，所述工作电极4为圆形，对电极5为环绕工作电极4的半圆环形；在所述绝缘电极基片1上对应工作电极4和对电极5，分别印制依次连接的工作电极连3和接线端子2以及对电极连线3和接线端子2；在所述工作电极连线3以及对电极连线3表面涂覆一层绝缘层6。

其中，电极基片1的长度为38mm、宽10mm、厚0.5mm；

接线端子2的长度为10mm、宽为1mm；

电极连线3的长度为20mm、宽为1mm；

两条平行电极连线3之间的间距为3mm；

工作电极4为直径1mm的实心圆形；

对电极5的外直径为4mm、内直径为2mm。

在上述制备好的电极基片的工作电极4和对电极5表面涂覆一层胆固醇分子印迹膜7，所述胆固醇分子印迹膜7的制备方法如下：

A、称取1mmol（0.386g）胆固醇模板分子与6mmol（0.516g）甲基丙烯酸功能单体溶于100ml体积比为1:7的氯仿和甲苯混合溶液中，经过超声波震荡10分钟使其混合均匀，再向其中加入35mmol（6.937g）二甲基丙烯酸乙二醇酯交联剂，经过超声波震荡15使其混合均匀，然后向其中加入0.03g偶氮二异丁氰引发剂和0.05ml水性聚氨酯粘合剂，经过超声波震荡20分钟使其混合均匀，然后向该溶液中通入氮气除氧5分钟，将所得溶液密封待用；

B、将步骤A所得的溶液滴加10ul到工作电极4和对电极5表面，盖玻片压盖，在365nm紫外光距离18cm照射聚合15分钟，重复两次，形成含有胆固醇模板分子的薄膜；

C、将步骤B所得的承载胆固醇模板分子薄膜的电极用体积比为1:0.25的氯仿-乙酸混合溶液在索氏提取器中提取16小时，室温超声波震荡后离心收集上清液，反复洗脱胆固醇模板分子，直到最后一次上清液中检测不到胆固醇模板分子存在，将制备好的电极保存在双蒸水中备用。

其中，分子印迹膜片7为直径5mm的圆形，厚度为90um。

（二）制备血液样品。

将空腹采取的血液样本1ml，在室温下放置30min后，进行离心处理，分离出血清，将血清置于洁净试管中加盖保存。

（三）检测样品。

取10ul经上述处理得到的血液样品（血清）滴加到本分子印迹膜传感电极上，然后将其插入电流型传感器，测定并记录读数。针对于同一样品，更换分子印迹膜传感电极条，连续检测5次，以所得的平均值作为检测值。

检测的工作原理如图3所示：电极基上的分子印迹膜内的特异性空穴选择性的与血液样品中的胆固醇分子结合，造成分子印迹膜电化学性质变化，导致恒电位激励下的电流发生变化，电流信号经电流-电压转换器转化为电压信号并放大，再经模数转换器转化为数字信号，经单片机分析处理后，数据在存储器中保存记录并可随时提取，同时胆固醇浓度直接从液晶显示电路读出，数据可通过USB接口传输到计算机做长期储存。

本方法在检测血液样品时，线性范围介于100mg/dl~400mg/dl之间，即血液样品中胆固醇浓度在100mg/dl ~400mg/dl之间时，检测结果较为准确。其中单位dl为分升，即1L/10。

（四）检测结果。

一般情况下，成人的总胆固醇含量的正常值为2.86~5.98mmol/L，儿童的总胆固醇含量的正常值为3.12~5.20mmol/L。胆固醇的分子式为C₂₇H₄₆O，分子量为386.66，根据1mg/dl=1mmol/L×386.66mg/10，可以换算出成人的总胆固醇正常值为111~231 mg/dl，儿童的总胆固醇的正常值为121~201mg/dl。

在本实施例中，5次检测得到的样品血液样品中胆固醇的平均含量为185mg/dl，5次检测的相对标准偏差为5.1%，可以看出本胆固醇分子印迹膜传感电极检测的重复性良好。

把制备好的胆固醇分子印迹膜传感电极在-4℃条件下保存在双蒸水中，经过两个月之后重新检测相同的血液样品，检测结果表明两次检测结果的相对标准偏差小于3.2%，由此可见本胆固醇分子印迹膜传感电极用于检测血液的胆固醇含量时具有良好的重复性和稳定性。

Claims

1.一种胆固醇分子印迹膜传感电极的用途，其特征在于：用于检测血液中的胆固醇含量，具体检测步骤为：

（1）血液样本处理：如果血液样本为人体在空腹时采取的血液，则在室温下静置，然后进行离心处理，分离出血清；如果血液样本为血浆，则用肝素或EDTA（乙二胺四乙酸）进行抗凝；

所述胆固醇分子印迹膜传感电极，由下述制备步骤得到：

（4）所述胆固醇分子印迹膜的制备方法如下：

2.根据权利要求1所述的一种胆固醇分子印迹膜传感电极的用途，其特征在于将血液样本滴加到胆固醇分子印迹膜传感电极上检测时，滴加的血液样本体积为8~15ul。

3.根据权利要求1所述的一种胆固醇分子印迹膜传感电极的用途，其特征在于如果血液样本为人体在空腹时采取的血液，则在室温下静置的时间为20~30min。

4.根据权利要求1所述的一种胆固醇分子印迹膜传感电极的用途，其特征在于采用EDTA（乙二胺四乙酸）进行血浆抗凝时，EDTA的浓度为1mg/mL。