JP2008539424A - フック効果領域内の検出機能を有するアッセイ装置 - Google Patents

Abstract

【課題】「フック効果」領域内の検体濃度を判断する改良技術を提供する。
【解決手段】試験サンプル内の検体の存在又は量を検出するためのラテラルフローアッセイ装置。装置は、複数の区分を利用し、その１つは、試験サンプル中の検体が「フック効果」領域内にあるか否かのインジケータとして働く。この指示に基づいて、測定した信号強度を検体の濃度又は濃度の範囲に相関させるための技術を選択することができる。例えば、試験サンプルが「フック効果」領域の外側にあると判断された時には、検体濃度は、用量反応曲線の一部分を用いて判断することができる。一方、試験サンプルが「フック効果」濃度内にあると判断された時には、検体濃度は、用量反応曲線の別の部分を用いて判断することができる。代替的に、サンプルは、単純に、アッセイを再度行うために希釈することができる。本発明者は、このような検出技術により、あらゆる濃度で存在する検体を簡単、迅速、かつ正確に検出することができることを発見した。
【選択図】図１

Description

本発明は、「フック効果」領域内の検体濃度を判断する改良技術に関する。

試験サンプルに存在すると考えられる検体の存在及び／又は濃度を判断するためのフロースルーアッセイには、様々な分析手順及び装置が一般的に用いられる。例えば、イムノアッセイは、生物体に対して病原性又は異質である抗原の存在に反応して抗体が生成される免疫系の機構を利用する。これらの抗体及び抗原、すなわち、免疫反応物質は、互いに結合することができ、それによって生物学的サンプル中のその特定の抗原の存在又は濃度を判断するのに用いることができる高度に特異的な反応機構をもたらす。

検体を分析的に検出することができるように、検出可能な成分でラベル付けした免疫反応物質を用いるいくつかの公知のイムノアッセイ方法が存在する。例えば、「サンドイッチ型」アッセイ形式は、一般的に、試験サンプルを検体に対する特異的結合メンバ（例えば、抗体）に接合した検出プローブと混合し、検体と接合プローブの間に錯体を形成する段階を伴っている。これらの錯体は、次に、検出区間内に不動化された受容材料（例えば、抗体）に接触させられる。検体／プローブ接合錯体と不動化された受容材料との間に結合が起こり、それによって検体の存在を示すように検出可能である「サンドイッチ」錯体を局在化する。この技術を用いて、定量的又は半定量的な結果を得ることができる。このようなサンドイッチ型アッセイの一部の例は、Ｇｒｕｂｂ他に付与された米国特許第４，１６８，１４６号及びＴｏｍ他に付与された第４，３６６，２４１号に説明されている。代替的な技術は、「競合型」アッセイである。競合的アッセイでは、一般的に、ラベル付けされたプローブが、検体と同一か又はその類似物である分子と接合される。すなわち、ラベル付けされたプローブは、利用可能な受容材料を求めて関連の検体と競合する。競合的アッセイは、典型的には、ハプテンのような検体の検出に用いられ、各ハプテンは１価であり、１つの抗体分子とのみ結合することができる。競合的イムノアッセイ装置の例は、Ｄｅｕｔｓｃｈ他に付与された米国特許第４，２３５，６０１号、Ｌｉｏｔｔａに付与された第４，４４２，２０４号、及びＢｕｅｃｈｌｅｒ他に付与された第５，２０８，５３５号に説明されている。

これらの装置で達成される恩典にも関わらず、多くの従来のラテラルフローアッセイは、比較的高い検体濃度に露出された時に有意な不正確性に直面する。例えば、検体が高濃度で存在する場合には、試験サンプル中の検体の実質的な部分が過剰に残され、それによって接合プローブと錯体を形成しない場合がある。従って、検出区間に到達すると、錯体化していない検体は、結合部位を求めて錯体化した検体と競合する。錯体化していない検体は、プローブでラベル付けされていないので、それを検出することはできない。その結果、有意な数の結合部位が、錯体化していない検体により占有される場合には、アッセイは、「偽陰性」を示すことがある。この問題は、一般的に「フック効果」又は「免疫阻止帯」と呼ばれる。

イムノアッセイの「フック効果」を低減するための様々な技術が提案されている。例えば、Ｋｕｏ他に付与された米国特許第６，１８３，９７２号は、検体を含有することが疑われる試験流体が毛管現象によって通過して流れることができる多孔性材料のストリップを説明している。このストリップは、検体の第１のエピトープに対して特異的な不動化された抗体が不動化されている少なくとも２つの個別の捕捉領域を有する。検出可能なラベルを有し、検体の第２のエピトープに対して特異的な抗体も用いられる。十分な濃度で存在する時には、検体は、不動化抗体が検体の第１のエピトープに結合するのを部分的に遮断する。すなわち、不動化抗体、検体、及びラベル付けした抗体のサンドイッチが、捕捉領域に形成される。個別の捕捉領域の各々のラベル付け抗体の放出信号は、従って、検体の濃度に固有の信号のパターンをもたらす。信号の組を数学的に組み合わせて、不動化抗体と検体の第１のエピトープとの間の結合の遮断を除外する単調な用量反応曲線を生成する。
しかし、正確であるが単純で費用効果のある方法で「フック効果」領域内の検体濃度を判断する改良技術に対する必要性が依然として存在する。

米国特許第４，１６８，１４６号 米国特許第４，３６６，２４１号 米国特許第４，２３５，６０１号 米国特許第４，４４２，２０４号 米国特許第５，２０８，５３５号 米国特許第６，１８３，９７２号 米国特許第６，４３６，６５１号 米国特許第５，０７５，０７７号 米国特許第５，６７０，３８１号 米国特許第５，２５２，４５９号 米国特許第６，２６１，７７９号 米国特許第６，５８５，９３９号 米国特許第４，６１４，７２３号 米国特許第５，４６４，７４１号 米国特許第５，５１８，８８３号 米国特許第５，９２２，５３７号 米国特許第６，００４，５３０号 米国特許第６，５８２，９３０号 米国特許第６，６１３，５８３号 米国特許第６，４６８，７４１号 米国特許第６，４４４，４２３号 米国特許第６，３６２，０１１号 米国特許第５，７３１，１４７号 米国特許第５，５９１，５８１号 米国特許第６，０３０，８４０号 米国特許第５，５８５，２７９号 米国特許第５，５７３，９０９号 米国特許第６，２４２，２６８号 米国特許第５，６３７，５０９号 米国特許公開第２００３／０１３９８８６号 米国特許出願公開第２００３／０１２４７３９号 米国特許第３，７００，６２３号 米国特許第３，７７２，０７６号 米国特許第４，５３７，６５７号 米国特許第５，３９５，７５４号 米国特許第６，１９４，２２０号 米国特許出願公開第２００３／０１１９２０２号 米国特許出願公開第２００４／００４３５０２号 Ｌｏｖｇｒｅｎ，Ｔ．他著「Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．」、第４２巻、１１９６から１２０１頁（１９９６年） Ｙｕａｎ，Ｊ．及びＭａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｋ．著「Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．」、第７０巻、５９６から６０１頁（１９９８年）

本発明の一実施形態により、試験サンプル内の検体の存在又は量を検出するためのラテラルフローアッセイ装置を開示する。ラテラルフローアッセイ装置は、接合した検出プローブと連通する多孔性膜を含む。検体は、接合検出プローブと錯体を形成することができる。多孔性膜は、第１の受容材料が内部に不動化されている検出区間を形成し、第１の受容材料は、接合検出プローブと錯体化されているか又はいないかに関わらず、検体と優先的に結合するように構成される。多孔性膜はまた、検出区間の下流に位置して第２の受容材料が内部に不動化されている指示区間も形成する。第２の受容材料は、錯体化されていない接合検出プローブと優先的に結合するように構成される。検出区間及び指示区間は、測定可能信号を生成することができる。測定可能指示信号の強度は、試験サンプル内の検体の濃度がフック効果領域内であるか否かを判断する参考基準に比較可能である。参考基準は、検体の飽和濃度での又はその付近での指示信号の強度又は強度の範囲を示している。

試験サンプル内の検体を定量的又は半定量的に検出する方法を開示する。本方法は、試験サンプルをラテラルフロー装置の多孔性膜に接触させる段階を含む。多孔性膜は、接合検出プローブと連通しており、更に、検出区間と検出区間の下流に位置する指示区間とを形成する。本方法は、検出区間で生成される検出信号の強度及び指示区間で生成される指示信号の強度を測定する段階を含む。本方法は、検体の既知の飽和濃度での又はその付近での指示信号の強度又は強度の範囲を表す参考基準に測定指示信号強度を比較する段階を更に含む。
本発明の他の特徴及び態様をより詳細に以下に説明する。
当業者に向けた本発明のその最良のモードを含む完全かつ権限付与した開示内容を本明細書の残りの部分で添付の図面を参照してより具体的に説明する。
本明細書及び図面中の参照文字の反復使用は、本発明の同じか又は類似の特徴又は要素を表すものとする。

定義
本明細書で用いる場合、「検体」という用語は、一般的に、検出する物質を意味する。例えば、検体には、抗原物質、ハプテン、抗体、及びその組合せを含むことができる。検体には、以下に限定されるものではないが、毒素、有機化合物、タンパク質、ペプチド、微生物、アミノ酸、核酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、薬物（治療目的で投与されるもの、並びに違法な目的で投与されるものを含む）、薬物中間物又は副産物、細菌、ウイルス粒子、及び以上の物質のあらゆる代謝物又は抗体が含まれる。一部の検体の特定の例には、フェリチン；クレアチニンキナーゼＭＢ（ＣＫ−ＭＢ）；ジゴキシン；フェニトイン；フェノバルビタール；カルバマゼピン；バンコマイシン；ゲンタマイシン；テオフィリン；バルプロ酸；キニジン；黄体形成ホルモン（ＬＨ）；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）；エストラジオール、プロゲステロン；Ｃ反応性タンパク質；リポカリン；ＩｇＥ抗体；サイトカイン；ビタミンＢ２ミクログロブリン；糖化ヘモグロビン（ＧＩｙ．Ｈｂ）；コルチゾール；ジギトキシン；Ｎ−アセチルプロカインアミド（ＮＡＰＡ）；プロカインアミド；風疹−ＩｇＧ及び風疹ＩｇＭのような風疹に対する抗体；トキソプラズマ症ＩｇＧ（Ｔｏｘｏ−ｌｇＧ）及びトキソプラズマ症ＩｇＭ（Ｔｏｘｏ−ｌｇＭ）のようなトキソプラズマ症に対する抗体；テストステロン；サリチレート；アセトアミノフェン；Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）；抗Ｂ型肝炎コア抗原ＩｇＧ及びＩｇＭ（抗ＨＢＣ）のようなＢ型肝炎コア抗原に対する抗体；ヒト免疫不全ウイルス１型及び２型（ＨＩＶ１型及び２型）；ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型及び２型（ＨＴＬＶ）；肝炎Ｂｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）；Ｂ型肝炎ｅ抗原（抗ＨＢｅ）に対する抗体；インフルエンザウイルス；甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）；チロキシン（Ｔ４）；トータルトリヨードチロニン（トータルＴ３）；フリートリヨードチロニン（フリーＴ３）；ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）；リポタンパク質、コレステロール、及びトリグリセリド；及びαフェトプロテイン（ＡＦＰ）が含まれる。乱用薬物及び規制物質には、以下に限定されるものではないが、アンフェタミン；メタンフェタミン；アモバルビタール、セコバルビタール、ペントバルビタール、フェノバルビタール、及びバルビタールのようなバルビツレート；リブリウム及びバリウムのようなベンゾジアゼピン；ハシシュ及びマリファナのようなカンナビノイド；コカイン；フェンタニール；ＬＳＤ；メタカロン；ヘロイン、モルヒネ、コデイン、ヒドロモルフォン、ヒドロコドン、メサドン、オキシコドン、オキシモルホン及びアヘンのようなオピエート；フェンシクリジン；及びプロポキシフェンが含まれる。他の可能な検体は、Ｅｖｅｒｈａｒｔ他に付与された米国特許第６，４３６，６５１号、及びＴｏｍ他に付与された第４，３６６，２４１号に説明されていると考えられる。

本明細書で用いる場合、「試験サンプル」という用語は、一般的に、検体を含有することが疑われる生物学的材料を意味する。試験サンプルは、血液、間質液、唾液、眼水晶体液、脳脊髄液、汗、尿、乳汁、腹水、粘液、鼻汁、痰、滑液、腹腔液、膣液、月経、羊水、及び精液などを含む生理液のようなあらゆる生物学的供給源由来とすることができる。生理液以外に、環境又は食糧生産のアッセイを行うために水及び食品などのような他の液体サンプルを用いることもできる。更に、検体を含有すると考えられる固体材料も試験サンプルとして用いることができる。試験サンプルは、生物学的供給源から得られたまま直接用いることができ、又はサンプルの特性を修正する前処理の後に用いることができる。例えば、このような前処理は、血液から血漿を調製する段階、及び粘性流体を希釈する段階などを含むことができる。前処理の方法はまた、濾過、沈殿、希釈、蒸留、混合、濃縮、妨害成分の不活化、試薬の付加、溶解などを伴う場合がある。更に、固体試験サンプルを修正して液体媒体を形成するか又は検体を放出することも有益である場合がある。

詳細説明
ここで、１つ又はそれよりも多くの実施例を以下のように示す本発明の様々な実施形態の詳細を参照する。各実施例は、本発明の説明のために挙げたものであり、本発明を制限するものではない。実際、本発明には、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく様々な修正及び変形を作ることができることは、当業者には明らかであろう。例えば、一実施形態の一部として示すか又は説明する特徴を別の実施形態に用いて更に別の実施形態をもたらすことができる。従って、本発明は、特許請求の範囲及びその均等物の範囲に含まれるこのような修正及び変形を含むものとする。

一般的に、本発明は、試験サンプル内の検体の存在又は量を判断するためのラテラルフローアッセイ装置に関する。装置は、複数の区分を用いるが、その１つは、試験サンプル中の検体が「フック効果」領域に含まれるか否かのインジケータとして働く。この指示に基づいて、測定した信号強度を検体濃度又は濃度の範囲に対して相関させるための技術を選択することができる。例えば、試験サンプルが「フック効果」領域から外れると判断される場合には、検体濃度は、用量反応曲線の一部を用いて判断することができる。一方、試験サンプルが「フック効果」濃度に含まれると判断される場合には、検体濃度は、用量反応曲線の別の部分を用いて判断することができる。代替的に、サンプルは、アッセイを再度行うために単に希釈することができる。本発明者は、このような検出技術で、あらゆる濃度で存在している検体を簡単、迅速、かつ正確に検出することができることを発見した。

例えば、図１を参照し、本発明により形成することができるラテラルフローアッセイ装置２０の一実施形態をこれからより詳細に以下に説明する。図示のように、装置２０は、任意的に硬質の支持材料２１で支持される多孔性膜２３を含む。一般的に、多孔性膜２３は、試験サンプルが通過することができる様々な材料のいずれかで形成することができる。例えば、多孔性膜２３を形成するのに用いられる材料には、以下に限定されるものではないが、天然、合成、又は合成的に修飾された天然からの材料、例えば、多糖類（例えば、紙のようなセルロース材料及び酢酸セルロース及びニトロセルロースのようなセルロース誘導体）；ポリエーテルスルホン；ポリエチレン；ナイロン；ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）；ポリエステル；ポリプロピレン；シリカ；塩化ビニル、塩化ビニル−プロピレンコポリマー、及び塩化ビニル−ビニルアセテートコポリマーのようなポリマーの多孔性ポリマー母体中に均一に分散された非活性化アルミナ、珪藻土、ＭｇＳＯ₄、又は他の無機の微粉化材料のような無機材料；天然由来（例えば、綿）及び合成（例えば、ナイロン又はレーヨン）の両方の布；シリカゲル、アガロース、デキストラン、及びゼラチンのような多孔性ゲル；及びポリアクリルアミドのようなポリマーフィルムなどを含むことができる。１つの特定的な実施形態では、膜２３は、ニトロセルロース、ポリエーテルスルホン材料で形成される。「ニトロセルロース」という用語は、セルロースの硝酸エステルを意味し、これは、ニトロセルロース単独とすることができ、又は硝酸と、１から７の炭素原子を有する脂肪族カルボン酸のような他の酸との混合エステルとすることができることを理解すべきである。

多孔性膜２３の大きさ及び形状は、当業者には容易に理解されるように、一般的に様々とすることができる。例えば、多孔性膜ストリップの長さは、約１０から約１００ミリメートルとすることができ、一部の実施形態では、約２０から約８０ミリメートル、一部の実施形態では、約４０から約６０ミリメートルとすることができる。更に、膜ストリップの幅も、約０．５から約２０ミリメートルの範囲とすることができ、一部の実施形態では、約１から約１５ミリメートル、一部の実施形態では、約２から約１０ミリメートルの範囲とすることができる。同様に、膜ストリップの厚みは、一般的に、透過に基づいて検出することが可能になるほど十分小さい。例えば、膜ストリップの厚みは、約５００マイクロメートル未満とすることができ、一部の実施形態では、約２５０マイクロメートル未満、一部の実施形態では、約１５０マイクロメートル未満とすることができる。

上述のように、支持体２１は、多孔性膜２３を担持する。例えば、支持体２１は、図１に示すように多孔性膜２３に直接隣接して位置決めすることができ、又は多孔性膜２３と支持体２１の間に１つ又はそれよりも多くの中間層を位置決めすることもできる。とにかく、支持体２１は、一般的に、多孔性膜２３を担持することができるあらゆる材料で形成することができる。支持体２１は、透明又は光学的散乱性（例えば、半透明）材料のような光を伝達することができる材料で形成することができる。更に、一般的に、支持体２１は、膜２３を通って流れる流体が支持体２１を通って漏れないように液体不透過性であることも望ましい。支持体に適切な材料の例には、以下に限定されるものではないが、ガラス；ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエステル（例えば、「Ｍｙｌａｒ（登録商標）」フィルム）、ポリブタジエン、ポリ塩化ビニル、ポリアミド、ポリカーボネート、エポキシド、メタクリレート、及びポリメラミンのようなポリマー材料などが含まれる。多孔性膜２３に十分な構造的支持を与えるために、支持体２１は、一般的に、特定の最小厚みを有するように選択される。同様に、支持体２１の厚みは、一般的に、その光学特性に悪影響を及ぼすほど大きくはない。従って、例えば、支持体２１の厚みは、約１００から約５，０００マイクロメートルの範囲とすることができ、一部の実施形態では、約１５０から約２，０００マイクロメートル、一部の実施形態では、約２５０から約１，０００マイクロメートルの範囲とすることができる。例えば、厚みが約１２５マイクロメートルの適切な膜ストリップの１つは、マサチューセッツ州ベッドフォード所在の「Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．」から「ＳＨＦ１８０ＵＢ２５」という名称で得ることができる。

当業技術で公知のように、多孔性膜２３は、支持体２１上に流し込むことができ、得られる積層体は、望ましい大きさ及び形状にダイス切断することができる。代替的に、多孔性膜２３は、単に、例えば、接着剤で支持体２１に積層することができる。一部の実施形態では、ニトロセルロース又はナイロンの多孔性膜が「Ｍｙｌａｒ（登録商標）」フィルムに接着される。感圧接着剤のような接着剤を用いて、多孔性膜を「Ｍｙｌａｒ（登録商標）」フィルムに結合する。この種類の積層体構造は、マサチューセッツ州ベッドフォード所在の「Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．」から市販されていると考えられている。適切な積層体アッセイ装置構造の更に別の例は、Ｄｕｒｌｅｙ，ＩＩＩ他に付与された米国特許第５，０７５，０７７号に説明されており、これは、本明細書において全ての目的に対してその全内容が引用により組み込まれている。
更に、装置２０は、吸収性パッド（２８）を含むことができる。吸収性パッド２８は、一般的に、多孔性膜２３全体を通して移行した流体を受け取る。当業技術で公知のように、吸収性パッド２８は、膜２３を通る毛管作用及び流体の流れを促進するのを助けることができる。

試験サンプル内の検体の検出を開始するために、ユーザは、試験サンプルを多孔性膜２３の一部分に直接付加することができ、その後、これは、それを通って図１の矢印「Ｌ」で示される方向に移動することができる。代替的に、試験サンプルは、最初に、多孔性膜２３と流体連通したサンプルパッド（図示せず）に付加することができる。サンプルパッドを形成するのに用いることができる一部の適切な材料には、以下に限定されるものではないが、ニトロセルロース、セルロース、多孔性ポリエチレンパッド、及びガラス繊維濾紙が含まれる。必要に応じて、サンプルパッドは、それに拡散的又は非拡散的に付着する１つ又はそれよりも多くのアッセイ前処理試薬を含むこともできる。

図示の実施形態では、試験サンプルは、サンプルパッド（図示せず）からサンプルパッドの一端と連通するように配置された接合パッド２２まで進む。接合パッド２２は、試験サンプルが通過することができる材料で形成される。例えば、一実施形態では、接合パッド２２は、ガラス繊維で形成される。１つの接合パッド２２のみを示しているが、本発明には、複数の接合パッドを用いることができることを理解すべきである。

試験サンプル中の検体の存在又は不在を容易に正確に検出することを可能にするために、装置２０の様々な位置に所定の量の検出プローブが付加される。一般的に、視覚的に又は計測装置により検出可能な信号を生成することができるあらゆる物質を検出プローブとして用いることができる。適切な検出可能な物質には、例えば、発光化合物（例えば、蛍光、燐光等）；放射性化合物；可視化合物（例えば、有色色素又は金等の金属物質）；信号生成物質を含むリポソーム又は他の小胞；及び酵素及び／又は基質などを含むことができる。他の適切な検出可能物質は、Ｊｏｕ他に付与された米国特許第５，６７０，３８１号及びＴａｒｃｈａ他に付与された第５，２５２，４５９号に説明されていると考えられ、これらは、本明細書において全ての目的に対してその全内容が引用により組み込まれている。検出可能物質が有色の場合には、理想的な電磁放射は、相補的波長の光である。例えば、青色検出プローブは、赤色光を強く吸収する。

一部の実施形態では、検出可能物質は、光学的に検出可能な信号を生成する発光化合物とすることができる。例えば、適切な蛍光分子には、以下に限定されるものではないが、蛍光色素、ユウロピウムキレート、フィコビリタンパク質、ローダミン、及びその誘導体及び類似物を含むことができる。他の適切な燐光化合物は、一般的に「量子ドット」と呼ばれる半導体ナノ結晶である。例えば、このようなナノ結晶は、ＸをＳｅ、Ｔｅ、及びＳなどとして、式ＣｄＸのコアを含むことができる。ナノ結晶はまた、ＹをＣｄ又はＺｎ、ＺをＳ又はＳｅとして、式ＹＺの上に重なるシェルで不動態化することができる。更に、適切な半導体ナノ結晶の他の例は、Ｂａｒｂｅｒａ−Ｇｕｉｌｌｅｍ他に付与された米国特許第６，２６１，７７９号及びＤａｐｐｒｉｃｈに付与された第６，５８５，９３９号にも説明されていると考えられ、これらは、本明細書において全ての目的に対してその全内容が引用により組み込まれている。

更に、適切な燐光化合物には、ルテニウム、オスミウム、レニウム、イリジウム、ロジウム、プラチナ、インジウム、パラジウム、モリブデン、テクネチウム、銅、鉄、クロム、タングステン、及び亜鉛などのような１つ又はそれよりも多くの金属の金属錯体を含むことができる。特に好ましいものは、ルテニウム、レニウム、オスミウム、プラチナ、及びパラジウムである。金属錯体は、水性又は非水性の環境で錯体の溶解度を高める１つ又はそれよりも多くの配位子を含むことができる。例えば、配位子の適切な一部の例には、以下に限定されるものではないが、ピリジン；ピラジン；イソニコチンアミド；イミダゾール；ビピリジン；ターピリジン；フェナントロリン；ジピリドフェナジン；ポルフィリン、ポルフィン、及びその誘導体が含まれる。このような配位子は、例えば、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、置換アラルキル、カルボキシレート、カルボキサルデヒド、カルボキサミド、シアノ、アミノ、ヒドロキシ、イミノ、ヒドロキシカルボニル、アミノカルボニル、アミジン、グアニジン、ウレイド、イオウ含有基、リン含有基、及びＮ−ヒドロキシ−スクシンイミドのカルボキシレートエステルで置換することができる。

ポルフィリン及びポルフィン金属錯体は、メチレンブリッジと共に連結し、金属が内部空洞をキレートした環状構造を形成するピロール基を有する。これらの分子の多くは、室温、適切な溶媒中（例えば、水中）、及び酸素のない環境で強い燐光特性を示す。燐光特性を示すことができる一部の適切なポルフィリン錯体には、以下に限定されるものではないが、プラチナ（ＩＩ）コプロポルフィリン−Ｉ及びＩＩＩ、パラジウム（ＩＩ）コプロポルフィリン、ルテニウムコプロポルフィリン、亜鉛（ｌｌ）−コプロポルフィリン−Ｉ、及びその誘導体等が含まれる。同様に、燐光特性を示すことができる一部の適切なポルフィン錯体には、以下に限定されるものではないが、プラチナ（ｌｌ）テトラ−メソ−フルオロフェニルポルフィン及びパラジウム（ｌｌ）テトラ−メソ−フルオロフェニルポルフィンが含まれる。更に他の適切なポルフィリン及び／又はポルフィン錯体は、Ｓｃｈｍｉｄｔ他に付与された米国特許第４，６１４，７２３号；Ｈｅｎｄｒｉｘに付与された第５，４６４，７４１号：Ｓｏｉｎｉに付与された第５，５１８，８８３号；Ｅｗａｒｔ他に付与された第５，９２２，５３７号；Ｓａｇｎｅｒ他に付与された第６，００４，５３０号；及びＰｏｎｏｍａｒｅｖ他に付与された第６，５８２，９３０号に説明されており、これらは、本明細書において全ての目的に対してその全内容が引用により組み込まれている。

更に、ビピリジン金属錯体を燐光化合物として用いることができる。適切なビピリジン錯体の一部の例には、以下に限定されるものではないが、ビス［（４，４’−カルボメトキシ）−２，２’−ビピリジン］２−［３−（４−メチル−２，２’−ビピリジン−４−イル）プロピル］−１，３−ジオキソランルテニウム（ＩＩ）；ビス（２，２’ビピリジン）［４−（ブタン−１−アール）−４’−メチル−２，２’−ビピリジン］ルテニウム（ＩＩ）；ビス（２，２’−ビピリジン）［４−（４’−メチル−２，２’−ビピリジン−４’−イル）−酪酸］ルテニウム（ＩＩ）；トリス（２，２’ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）；（２，２’−ビピリジン）［ビス−ビス（１，２−ジフェニルホスフィノ）エチレン］２−［３−（４−メチル−２，２’−ビピリジン−４’−イル）プロピル］−１，３−ジオキソランオスミウム（ＩＩ）；ビス（２，２’−ビピリジン）［４−（４’−メチル−２，２’−ビピリジン）−ブチルアミン］ルテニウム（ＩＩ）；ビス（２，２’−ビピリジン）［１−ブロモ−４（４’−メチル−２，２’−ビピリジン−４−イル）ブタン］ルテニウム（ＩＩ）；ビス（２，２’−ビピリジン）マレイミドヘキサン酸、及び４−メチル−２，２’−ビピリジン−４’−ブチルアミドルテニウム（ＩＩ）等が含まれる。燐光特性を示すことができる更に他の適切な金属錯体は、Ｒｉｃｈｔｅｒ他に付与された米国特許第６，６１３，５８３号；Ｍａｓｓｅｖ他に付与された第６，４６８，７４１号；Ｍｅａｄｅ他に付与された第６，４４４，４２３号；Ｍａｓｓｅｖ他に付与された第６，３６２，０１１号；Ｂａｒｄ他に付与された第５，７３１，１４７号；及びＭａｓｓｅｖ他に付与された第５，５９１，５８１号に説明されていると考えられ、これらは、本明細書において全ての目的に対してその全内容が引用により組み込まれている。

場合によっては、発光化合物は、比較的長い発光寿命を有することができ、比較的大きな「ストークスシフト」を有することができる。「ストークスシフト」という用語は、一般的に、発光放射のスペクトル線又は帯域が励起線又は帯域よりも長い発光波長に変位することであると定義される。ストークスシフトが比較的大きければ、発光化合物の励起波長は、その発光波長から遠くに離れたままとすることができ、励起波長と発光波長の間に大きな差があると、発光信号から反射励起放射を消失させるのが容易になるので望ましい。更に、ストークスシフトが大きいと、サンプル中の発光分子からの干渉及び／又は一部の体液（例えば、血液）に存在するタンパク質又はコロイドによる光散乱が最低になる。更に、ストークスシフトが大きいと、背景干渉を消失させるための高価で高精度のフィルタの必要性も最小になる。例えば、一部の実施形態では、発光化合物のストークスシフトは、約５０ナノメートルよりも大きく、一部の実施形態では、約１００ナノメートルよりも大きく、一部の実施形態では、約１００から約３５０ナノメートルである。

例えば、ストークスシフトの大きな例示的な燐光化合物には、サマリウム（Ｓｍ（ＩＩＩ））、ジスプロシウム（Ｄｙ（ＩＩＩ））、ユウロピウム（Ｅｕ（ＩＩＩ））、及びテルビウム（Ｔｂ（ＩＩＩ））のランタニドキレートが含まれる。このようなキレートは、実質的に短い波長でキレートを励起した後、強く赤方シフトした挟帯域で長寿命の発光を示すことができる。一般的に、キレートは、分子のランタニドの近くに位置する発色団があるために、強い紫外線励起区間を有する。発色団により励起された後、励起エネルギは、励起発色団からランタニドに移行することができる。この後、ランタニドの特徴である蛍光発光が起こる。例えば、ユウロピウムキレートのストークスシフトは、蛍光色素が僅かに約２８ナノメートルであるのに比較して、約２５０から約３５０ナノメートルである。更に、ユウロピウムキレートの蛍光は長寿命であり、この寿命は、他の蛍光ラベルが約１から約１００ナノ秒であるのに比較して、約１００から約１０００マイクロ秒である。更に、これらのキレートは、挟発光スペクトルを有し、一般的に、帯域幅は、約５０％発光で約１０ナノメートル未満である。適切なユウロピウムキレートの１つは、Ｎ−（ｐ−イソチオシアナトベンジル）−ジエチレントリアミンテトラ酢酸−Ｅｕ⁺³である。

更に、水溶液又は懸濁液中で不活性かつ安定であり、本質的に蛍光性であるランタニドキレートを本発明に用いて、水溶液又は懸濁液中で溶解性が制限され、かつ急冷の問題を有するキレートを保護するのに用いられることが多いミセル形成試薬の必要性をなくすことができる。このようなキレートの一例は、４−［２−（４−イソチオシアナトフェニル）エチニル］−２，６−ビス（［Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）アミノ］メチル）−ピリジンである［参照：Ｌｏｖｇｒｅｎ，Ｔ．他著「Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．」、第４２巻、１１９６から１２０１頁（１９９６年）］。更に、一部のランタニドキレートは、例外的に高いＳＮ比を示している。例えば、１つのこのようなキレートは、４座β−ジケトネート−ユウロピウムキレートである［参照：Ｙｕａｎ，Ｊ．及びＭａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｋ．著「Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．」、第７０巻、５９６から６０１頁（１９９８年）］。上述の蛍光ラベルに加えて、本発明に用いるのに適切な他のラベルは、Ｍｕｌｌｉｎａｘ他に付与された米国特許第６，０３０，８４０号；Ｄａｖｉｄｓｏｎに付与された第５，５８５，２７９号；Ｓｉｎｇｅｒ他に付与された第５，５７３，９０９号；Ｗｉｅｄｅｒ他に付与された第６，２４２，２６８号：及びＨｅｍｍｉｌａ他に付与された第５，６３７，５０９号に説明されていると考えられ、これらは、本明細書において全ての目的に対してその全内容が引用により組み込まれている。

上述のような検出可能な物質は、単独で用いることができ、又は粒子（時に「ビーズ」又は「マイクロビーズ」と呼ばれる）と共に用いることができる。例えば、核、マイコプラズマ、プラスミド、プラスチド、哺乳類細胞（例えば、赤血球ゴースト）、単細胞微生物（例えば、細菌）、多糖類（例えば、アガロース）などのような天然からの粒子を用いることができる。更に、合成粒子を用いることができる。例えば、一実施形態では、蛍光又は有色色素でラベル付けされたラテックス微小粒子が用いられる。本発明には、あらゆる合成粒子を用いることができるが、粒子は、一般的に、ポリスチレン、ブタジエンスチレン、スチレンアクリル−ビニルターポリマー、ポリメチルメタクリレート、ポリエチルメタクリレート、スチレン−無水マレイン酸コポリマー、ポリビニルアセテート、ポリビニルピリジン、ポリジビニルベンゼン、ポリブチレンテレフタレート、アクリロニトリル、ビニルクロリド−アクリレートなど、又はそのアルデヒド、カルボキシル、アミノ、ヒドロキシル、又はヒドラジド誘導体で形成される。他の適切な粒子は、Ｊｏｕ他に付与された米国特許第５，６７０，３８１号；Ｔａｒｃｈａ他に付与された第５，２５２，４５９号；及びＢｏｄｚｉｎ他に付与された米国特許公開第２００３／０１３９８８６号に説明されていると考えられ、これらは、本明細書において全ての目的に対してその全内容が引用により組み込まれている。適切な蛍光粒子の市販の例には、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．」により商品名「ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅ」（レッド５８０／６０５）及び「ＴｒａｎｓｆｌｕｏＳｐｈｅｒｅ」（５４３／６２０）で販売される蛍光カルボキシル化微小球、並びにこれも「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．」で販売される「Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ」及び５−及び６−カルボキシテトラメチルローダミンが含まれる。更に、適切な着色ラテックス微小粒子の市販の例には、「Ｂａｎｇ’ｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｉｎｃ．」から販売されるカルボキシル化ラテックスビーズも含まれる。更に、本発明には、金属粒子（例えば、金粒子）を用いることができる。

用いる場合には、粒子の形状は、一般的に様々とすることができる。例えば、１つの特定的な実施形態では、粒子の形状は球形である。しかし、本発明には、平板、ロッド、円板、バー、管、不規則な形状などのような他の形状も考えられていることを理解すべきである。更に、粒子の大きさも様々とすることができる。例えば、粒子の平均の大きさ（例えば、直径）は、約０．１ナノメートルから約１００ミクロンの範囲とすることができ、一部の実施形態では、約１ナノメートルから約１０ミクロン、一部の実施形態では、約１０から約１００ナノメートルの範囲とすることができる。

場合によっては、検体に更に容易に結合することができるように何らかの方式で検出プローブを修飾することが望ましいこともある。そのような場合には、検出プローブは、それに結合して接合プローブを形成する特異的結合メンバで修飾することができる。特異的結合メンバは、一般的に、特異的結合対、すなわち、分子の１つが化学的及び／又は物理的に第２の分子に結合する２つの異なる分子のメンバを意味する。例えば、免疫反応性の特異的結合メンバには、組換え型ＤＮＡ法又はペプチド合成によって形成されるものを含む抗原、ハプテン、アプタマー、抗体（１次又は２次）、及びその錯体を含むことができる。抗体は、単クローン又は多クローン抗体、組換え型タンパク質又はその混合物又は断片、並びに抗体及び他の特異的結合メンバの混合物とすることができる。このような抗体の調製及び特異的結合メンバとして用いるその適合性の詳細は当業者には公知である。他のよく用いられる特異的結合対には、以下に限定されるものではないが、ビオチン及びアビジン（又はその誘導体）、ビオチン及びストレプトアビジン、炭水化物及びレクチン、相補的ヌクレオチド配列（ターゲット核酸配列を検出するためのＤＮＡハイブリッド形成アッセイに用いられるプローブ及び捕捉核酸配列を含む）、組換え法で形成されたものを含む相補的ペプチド配列、エフェクター及びレセプター分子、ホルモン及びホルモン結合タンパク質、酵素補助因子及び酵素、及び酵素阻害剤及び酵素等が含まれる。更に、特異的結合対には、元の特異的結合メンバに類似するメンバを含むことができる。例えば、検体と共通の少なくとも１つのエピトープを有する限り、検体の誘導体又は断片（すなわち、「類似物」）を用いることができる。

特異的結合メンバは、一般的に、様々な公知の技術のいずれかを用いて検出プローブに取り付けることができる。例えば、特異的結合メンバの検出プローブ（例えば、粒子）への共有結合は、カルボン酸、アミノ、アルデヒド、ブロモアセチル、ヨードアセチル、チオール、エポキシ及び他の反応性又は結合基、並びにそれでタンパク質結合反応を行うことができる残留フリーラジカル及びラジカルカチオンを用いて達成することができる。更に、検出プローブの表面は、比較的高表面濃度の極性基を含むことができるので、官能化コモノマーとして表面官能基を組み込むことができる。更に、検出プローブは、合成後にポリ（チオフェノール）等で官能化されることが多いが、検出プローブは、更に修飾することを必要とすることなくタンパク質と直接共有結合することができる。例えば、一実施形態では、接合の第１の段階は、カルボジイミドを用いてプローブ表面のカルボン酸基を活性化する段階である。第２の段階では、活性化カルボン酸基が抗体のアミノ基と反応してアミド結合を形成する。活性化及び／又は抗体連結は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（例えば、ｐＨ７．２）又は２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）（例えば、ｐＨ５．３）のような緩衝液中で行うことができる。得られる検出プローブは、次に、例えば、エタノールアミンと接触させて、全ての残りの活性化部位を遮蔽することができる。全体的に、この工程では、抗体が共有的にプローブに付着した接合検出プローブが形成される。本発明には、共有結合以外に、物理的吸着のような他の付着技術を用いることができる。

再び図１を参照すると、多孔性膜２３は、アッセイを行うように構成された様々な区分を形成する。例えば、多孔性膜２３は、第１の受容材料を含有する検出区間３１を形成する。第１の受容材料は、多孔性膜２３上に不動化されており、かつ上述の特異的結合メンバと同じ材料から選択することができ、これには、例えば、抗原；ハプテン；タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、又はタンパク質Ａ／Ｇのような抗体結合タンパク質；ニュートラアビジン（脱グリコシル化アビジン誘導体）、アビジン（高カチオン性６６，０００ダルトン糖タンパク質）、ストレプトアビジン（非グリコシル化５２，８００ダルトンタンパク質）、又はキャプトアビジン（ニトロ化アビジン誘導体）；１次又は２次抗体、及びその誘導体又は断片が含まれる。一実施形態では、例えば、第１の受容材料は、試験サンプル内の抗原に対して特異的な抗体である。第１の受容材料は、検体と接合検出プローブの間に形成される錯体に対する静止結合部位として働く。より詳細には、抗体、抗原などのような検体は、一般的に、２つ又はそれよりも多くの結合部位（例えば、エピトープ）を有する。検出区間３１に到達すると、これらの結合部位の１つは、接合プローブの特異的結合メンバにより占有される。しかし、検体の遊離結合部位は、不動化された第１の受容材料に結合することができる。不動化された受容材料に結合されると、錯体化したプローブは、新しい三重のサンドイッチ錯体を形成する。

更に、アッセイ装置２０は、検出区間３１の下流に位置決めされた指示区間３５も収容する。指示区間３５は、多孔性膜２３上に不動化された第２の受容材料を含有する。第２の受容材料は、接合検出プローブのための静止結合部位として働く。指示区間３５内で望ましい結合を達成するために、第２の受容材料は、検体に錯体化された検出プローブと錯体化されていないものとの間を区別することができることが一般的に望ましい。例えば、一実施形態では、第２の受容材料には、検体分子、又はその誘導体又は断片（すなわち、類似物）のような少なくとも１つのエピトープを検体と共通に有する分子が含まれ、検体と錯体化していない場合には、抗体接合体に対して特異的に結合することを可能にする。

代替的に、第２の受容材料は、検体分子でもその類似体でもないが、それでも錯体化されていない接合検出プローブと優先的に結合することができる生物学的材料を含むことができる。一実施形態では、例えば、第１の受容材料は、抗ＣＲＰＩｇＧ₁のような単クローン抗体とすることができる。検出プローブには、第１の受容材料の単クローン抗体と異なる抗ＣＲＰＩｇＧ₂のような単クローン抗体が接合される。この特定的な実施形態では、第２の受容材料は、Ｆ_c断片に対して吸着されており、従って、ＩｇＧのＦ_ab部分としか反応しないヤギ抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ’）₂のような２次抗体とすることができる。従って、検体が存在しない場合には、２次抗体は、抗ＣＲＰＩｇＧ₂単クローン抗体の遊離「Ｆ_ab」結合ドメインに結合することができる。しかし、試験サンプル中に抗原が存在する場合には、それは、まず抗ＣＲＰＩｇＧ₂単クローン抗体の「Ｆ_ab」結合ドメインと錯体化する。抗原が存在すると、「Ｆ_ab」結合ドメインは、次に２次抗体と結合するのに利用できなくなる。従って、指示区間３５内の２次抗体は、錯体化されていない検出プローブと優先的に結合することができる。

検出区間３１及び任意的な指示区間３５により正確な結果を得ることができるが、実際の試験条件下で試験サンプル内の検体の相対濃度を判断するのは時に困難である。従って、アッセイ装置２０には、較正区間３２を含むこともできる。この実施形態では、較正区間３２は、多孔性膜２３上に形成され、検出区間３１及び指示区間３５の下流に位置決めされる。代替的に、較正区間３２は、検出区間３１及び／又は任意的な指示区間３５の上流に位置決めすることができる。

較正区間３２には、膜２３の長さを通過するあらゆる較正プローブに結合することができる第３の受容材料が設けられる。用いる場合には、較正プローブは、検出プローブに用いられる検出可能物質と同じか又は異なる検出可能物質を含むことができる。更に、較正プローブには、上述のような特異的結合メンバを接合することができる。例えば、一実施形態では、ビオチニル化較正プローブを用いることができる。一般的には、較正プローブは、検出区間３１及び指示区間３５で第１又は第２の受容材料に結合しないように選択される。較正区間３２の第３の受容材料は、検出区間３１又は指示区間３５に用いられる受容材料と同じか又は異なるものとすることができる。例えば、一実施形態では、第３の受容材料は、抗原、ハプテン、抗体結合タンパク質（例えば、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、又はタンパク質Ａ／Ｇ）、ニュートラアビジン、アビジン、ストレプトアビジン、キャプトアビジン、１次又は２次抗体、又はその錯体のような生物学的受容材料である。更に、較正区間３２の第３の受容材料（例えば、多価電解質）には、Ｓｏｎｇ他に付与された米国特許出願公開第２００３／０１２４７３９号に説明されているような様々な非生物学的材料を用いることが望ましい場合があり、この特許出願は、本明細書において全ての目的に対してその全内容が引用により組み込まれている。

用いる場合には、多価電解質は、正味の正又は負の電荷、並びにほぼ中性の正味の電荷を有することができる。例えば、正味の正の電荷を有する多価電解質の適切な一部の例には、以下に限定されるものではないが、ポリリシン（ミズーリ州セントルイス所在の「Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．」から市販されている）、ポリエチレンイミン；ポリ（ジメチルアミン−コ−エピクロロヒドリン）のようなエピクロロヒドリン官能性ポリアミン及び／又はポリアミドアミン；ポリジアリルジメチル−アンモニウムクロリド；及び四級アンモニウム水溶性モノマーでグラフトされたセルロースコポリマー又はセルロース誘導体のようなカチオン性セルロース誘導体などが含まれる。１つの特定的な実施形態では、四級アンモニウム水溶性モノマーを含有するセルロース誘導体である「ＣｅｌＱｕａｔ（登録商標）ＳＣ−２３０Ｍ」又は「Ｈ−１００」（「Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔａｒｃｈ ＆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｉｎｃ．」から入手可能）を用いることができる。更に、正味の負の電荷を有する多価電解質の適切な一部の例には、以下に限定されるものではないが、ポリ（エチレン−コ−メタクリル酸、ナトリウム塩）などのようなポリアクリル酸が含まれる。更に、両親媒性多価電解質（すなわち、極性及び非極性部分を有する）のような他の多価電解質を用いることができることも理解すべきである。例えば、適切な両親媒性多価電解質の一部の例には、以下に限定されるものではないが、ポリ（スチリル−ｂ−Ｎ−メチル２−ビニルピリジニウムヨージド）及びポリ（スチリル−ｂ−アクリル酸）が含まれ、その両方は、カナダのドーバル所在の「Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｏｕｒｃｅ，Ｉｎｃ．」から入手可能である。

一般的に、あらゆる多価電解質を用いることができるが、特定の用途に選択される多価電解質は、検出プローブ、較正プローブ、多孔性膜等の性質に応じて様々とすることができる。より詳細には、多価電解質の分散された電荷により、反対の電荷を有する物質に結合することができる。従って、例えば、正味の正の電荷を有する多価電解質は、負に荷電したプローブに結合させるのに備えるとよいことが多く、正味の負の電荷を有する多価電解質は、正に荷電したプローブに結合させるのに備えるとよいことが多い。従って、このような場合には、これらの分子間のイオン相互作用は、較正区間３２内に必要な結合を発生させる。それにも関わらず、イオン相互作用が較正区間３２内に望ましい結合を達成するのに主に用いられるとはいえ、多価電解質は、同様の電荷を有するプローブに結合することができる。

多価電解質は、プローブに結合するように設計されているために、一般的に、多価電解質は、実質的に非拡散的に多孔性膜２３の表面に不動化されることが望ましい。そうでなければ、プローブは、ユーザに容易に検出されることにはならない。従って、多価電解質は、多孔性膜２３の母体内に実質的に拡散しないように多孔性膜２３に付加することができる。より詳細には、多価電解質は、一般的に、多孔性膜２３の表面に存在する官能基とイオン及び／又は共有結合を形成し、それに不動化したままになるようにする。必ずしも必要ではないが、多価電解質をそれに更に永久的に不動化するために、多価電解質と多孔性膜２３の間に共有結合を形成することが望ましい場合がある。例えば、一実施形態では、多価電解質を形成するのに用いられるモノマーは、最初に溶液に形成されて、次に、直接多孔性膜２３に付加される。この溶液は、様々な溶媒（例えば、有機溶媒、水等）を用いて形成することができる。付加された状態で、熱、電子ビーム放射、及びフリーラジカル重合などを用いてモノマーの重合が開始される。場合によっては、モノマーが重合すると、それは、多孔性膜２３のある一定の官能基と共有結合を形成し、それによって得られる多価電解質をその上に不動化する。例えば、一実施形態では、エチレンイミンモノマーは、一部の多孔性膜（例えば、ニトロセルロース）の表面に存在するカルボキシル基と共有結合を形成することができる。

別の実施形態では、多価電解質は、多孔性膜２３に付加する前に形成することができる。必要に応じて、多価電解質は、最初に、有機溶媒、及び水などを用いて溶液に形成することができる。その後、多価電解質溶液を直接多孔性膜２３に付加し、その後乾燥させる。乾燥すると、多価電解質は、多価電解質と反対の電荷を有する多孔性膜２３の表面に存在するある一定の官能基とイオン結合を形成することができる。例えば、一実施形態では、正に荷電したポリエチレンイミンは、一部の多孔性膜（例えば、ニトロセルロース）の表面上に存在する負に荷電したカルボキシル基とイオン結合を形成することができる。

更に、多価電解質は、様々な公知の技術を用いて多孔性膜２３に架橋させることができる。例えば、一部の実施形態では、エピクロロヒドリン官能化ポリアミン及び／又はポリアミドアミンは、架橋可能な正に荷電した多価電解質として用いることができる。これらの材料の例は、本明細書において全ての目的に対してその全内容が引用により組み込まれている、Ｋｅｉｍに付与された米国特許第３，７００，６２３号及びＫｅｉｍに付与された第３，７７２，０７６号、Ｋｅｉｍに付与された第４，５３７，６５７号に説明されており、デラウェア州ウィルミントン所在の「Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｉｎｃ．」から「Ｋｙｍｅｎｅ（登録商標）」という商品名で販売されていると考えられる。例えば、「Ｋｙｍｅｎｅ（登録商標）４５０」及び「２０６４」は、ある一定の種類の多孔性膜（例えば、ニトロセルロース）上に存在するカルボキシル基と共有結合を形成し、硬化される時にその膜のポリマー主鎖と架橋することができるエポキシド環及び四級アンモニウム基を含有するエピクロロヒドリン官能化ポリアミン及び／又はポリアミドアミン化合物である。一部の実施形態では、架橋温度は、約５０℃から約１２０℃の範囲とすることができ、架橋時間は、約１０から約６００秒の範囲とすることができる。

多孔性膜２３上に多価電解質を非拡散的に不動化する様々な技術を上述したが、本発明には、多価電解質化合物を非拡散的に不動化するためのあらゆる他の技術を用いることができることを理解すべきである。実際、上述の方法は、本発明に用いることができる技術の例示的な実施例としてしか意図されない。例えば、一部の実施形態では、このような多価電解質が多孔性膜２３の母体に拡散するのを実質的に阻止することができるある一定の成分を多価電解質溶液に加えることができる。

検出区間３１、指示区間３５、及び較正区間３２の各々には、あらゆる数の個別の検出領域を設けて、試験サンプル中の１つ又はそれよりも多くの検体の濃度を更に良好に判断することを可能にすることができる。各領域は、同じ受容材料を収容することができ、又は異なる受容材料を含有することもできる。例えば、区分は、２つ又はそれよりも多くの個別の領域（例えば、線、ドット等）を含むことができる。この領域は、アッセイ装置２０を通る試験サンプルの流れに実質的に垂直な方向の線の形で配置することができる。同様に、一部の実施形態では、この領域は、アッセイ装置２０を通る試験サンプルの流れに実質的に平行な方向の線の形で配置することができる。

場合によっては、膜２３は、アッセイが適切に行われているという信号をユーザに与える対照区間（図示せず）を形成することができる。例えば、対照区間（図示せず）は、一般的に、プローブ又はプローブ上に不動化された受容材料と化学的及び／又は物理的結合を形成することができる不動化受容材料を収容することができる。このような受容材料の一部の例には、以下に限定されるものではないが、抗原、ハプテン、抗体、タンパク質Ａ又はＧ、アビジン、ストレプトアビジン、２次抗体、及びその錯体が含まれる。更に、対照区間受容材料に様々な非生物学的材料を用いることが望ましい場合がある。例えば、一部の実施形態では、対照区間受容材料には、非捕捉プローブに結合することができる上述のような多価電解質を含むことができる。対照区間の受容材料は、プローブにのみ特異的であるので、検体が存在するか否かに関係なく信号が形成される。対照区間は、膜２３に沿うあらゆる場所に位置決めすることができるが、好ましくは、検出区間３１及び指示区間３５の下流に位置決めされる。

装置構成の様々な実施形態を上述したが、本発明の装置は、一般的に、望ましいあらゆる構成を用いることができ、上述の構成要素の全てを含む必要がないことを理解すべきである。例えば、様々な他の装置構成は、Ｌａｍｂｏｔｔｅ他に付与された米国特許第５，３９５，７５４号；Ｊｏｕ他に付与された第５，６７０，３８１号；及びＭａｌｉｃｋ他に付与された第６，１９４，２２０号に説明されており、これらは、本明細書において全ての目的に対してその全内容が引用により組み込まれている。

アッセイ装置２０の特定の構成に関係なく、指示区間３５及び検出区間３１は、連係して機能し、検体の検出精度を改善する。図３から図４を参照し、抗原が過剰な濃度で存在することを検出する方法の１つの特定的な実施形態を今からより詳細に以下に説明する。最初に、図３に示すように、抗原Ａを含む試験サンプルをサンプルパッド（図示せず）に付加すると、それは、接合パッド２２まで方向「Ｌ」に進み、そこで検体Ａは、抗体を接合した検出プローブ４１及びビオチンで接合（すなわち、「ビオチニル化」）した較正プローブ４３と混合される。図３に示す実施形態では、抗原Ａは、接合検出プローブ４１に結合して検体／接合プローブ錯体４９を形成する。抗原Ａの一部は、接合検出プローブ４１が限定的にしか利用可能でないために遊離のままである。図４に示すように、遊離抗原Ａ及び錯体４９は、次に、その内部に抗体５１が不動化されている検出区間３１に進む。遊離抗原Ａ及び錯体４９は、不動化抗体５１に対して競合する。あらゆる残りの抗原Ａ及び錯体４９は、抗原Ａの性質と同じ分子Ａ^*が内部に固定された指示区間３５に進む。しかし、抗原Ａ及び錯体４９は、分子Ａ^*に結合するための部位を持たないために、一般的に、吸収パッド２８に到達するまで指示区間３５を通過する。最後に、ビオチニル化較正プローブ４３は、検出区間３１及び指示区間３５の両方を通って進み、較正区間３２内に固定されたストレプトアビジン（図示せず）に結合する。検出区間３１及び上述の指示区間３５で捕捉されたあらゆる検出プローブ４１により生成される信号の強度を次に測定することができる。更に、較正区間３２で較正プローブ４３により生成される信号の強度も測定することができ、これは、一般的に、あらゆる検体濃度に対して一定に保たれる必要がある。

必要に応じて、一部の実施形態では、光学読取装置を用いてプローブの強度を測定することができる。光学読取装置の実際の構成及び構造は、当業者には容易に理解されるように、一般的に様々とすることができる。例えば、用いることができる光学的検出技術には、以下に限定されるものではないが、発光（例えば、蛍光、燐光等）、吸光度（例えば、蛍光又は非蛍光）、回折等が含まれる。１つの適切な反射分光光度計は、例えば、Ｋａｙｌｏｒ他に付与された米国特許出願公開第２００３／０１１９２０２号に説明されており、これは、本明細書において全ての目的に対してその全内容が引用により組み込まれている。別の実施形態では、蛍光を示すプローブの存在を検出するのに反射モード蛍光分光光度計を用いることができる。適切な蛍光分光光度計及び関連する検出技術は、例えば、Ｓｏｎｇ他に付与された米国特許出願公開第２００４／００４３５０２号に説明されており、これは本明細書において全ての目的に対してその全内容が引用により組み込まれている。同様に、検出プローブの存在を検出するのに送信モード検出システムを用いることができる。

一般的に、光学読取装置は、電磁放射を放出することができる照明源と、信号（例えば、透過又は反射光、放出された蛍光又は燐光等）を記録することができる検出器とを収容する。照明源は、可視又は近可視範囲（例えば、赤外線又は紫外線）の光のような電磁放射を供給することができる当業技術で公知のあらゆる装置とすることができる。例えば、本発明で用いることができる適切な照明源には、以下に限定されるものではないが、発光ダイオード（ＬＥＤ）、フラッシュランプ、冷陰極蛍光ランプ、及びエレクトロルミネセントランプ等が含まれる。照明は、多重化及び／又は平行化することができる。場合によっては、照明は、パルス化してあらゆる背景干渉を低減することができる。更に、照明は、連続とすることができ、又は複数の照明ビームが多重化される（例えば、パルス化ビームをＣＷビームで多重化する）ように連続波（ＣＷ）及びパルス化照明を組み合わせて、ＣＷ供給源により誘起される信号とパルス化供給源により誘起される信号との間の信号の区別を可能にすることができる。例えば、一部の実施形態では、ＬＥＤ（例えば、アルミニウムガリウムヒ素化合物赤色ダイオード、リン化ガリウム緑色ダイオード、ガリウムヒ素リン緑色ダイオード、又は窒化インジウムガリウム紫／青色／紫外線（ＵＶ）ダイオード）をパルス化照明源として用いる。本発明に用いるのに適する適切な「ＵＶ ＬＥＤ」励起ダイオードの市販の一例は、「Ｍｏｄｅｌ ＮＳＨＵ５５ＯＥ」（Ｎｉｃｈｉａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）であり、これは、順方向電流が１０ミリアンペア（３．５から３．９ボルト）でビーム内に光パワー７５０から１０００マイクロワットを放出し、半値全幅１０度、ピーク波長３７０から３７５ナノメートル、及びスペクトル半値幅１２ナノメートルである。

場合によっては、照明源は、アッセイ装置を拡散的に照らすことができる。例えば、複数の点光源（例えば、ＬＥＤ）のアレイを単純に用いて、比較的拡散的に照らすことができる。比較的廉価に拡散照明をもたらすことができる別の特に望ましい照明源は、エレクトロルミネセンス（ＥＬ）装置である。ＥＬ装置は、一般的に、電極間に挟まれた蛍光物質（例えば、燐光体粒子）を用いるコンデンサ構造であり、その少なくとも１つは透明であり、光が流出することができる。電極間に電圧を掛けると、蛍光物質内に電界の変化が起こり、それによって光が放出される。

検出器は、一般的に、信号を感知することができる当業技術で公知のあらゆる装置とすることができる。例えば、検出器は、空間識別するように構成された電子撮像検出器とすることができる。このような電子撮像センサの一部の例には、高速線形電荷結合装置（ＣＣＤ）、電荷注入装置（ＣＩＤ）、及び相補形金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）装置等が含まれる。例えば、このような画像検出器は、一般的に電子光センサの２次元のアレイであるが、例えば、走査画像に用いるもののような単一の線の検出器ピクセル又は光センサを含む線形撮像検出器（例えば、線形ＣＣＤ検出器）を用いることができる。各アレイは、「アドレス」と呼ばれることもある既知の固有の位置の組を含む。画像検出器内の各アドレスは、区域（例えば、一般的に箱又は矩形の形状の区域）を覆うセンサにより占有される。この区域は、一般的に、「ピクセル」又はピクセル区域と呼ばれる。例えば、検出器ピクセルは、ＣＣＤ、ＣＩＤ、又はＣＭＯＳセンサとすることができ、又は光を検出又は測定するあらゆる他の装置又はセンサとすることができる。検出器ピクセルの大きさは、幅広く変動させることができ、かつ場合によっては、直径又は長さは、０．２マイクロメートル程の小ささにすることができる。

他の実施形態では、検出器は、空間識別機能のない光センサとすることができる。例えば、このような光センサの例には、光電子倍増管装置、及びアバランシェフォトダイオード又はシリコンフォトダイオードのようなフォトダイオードなどを含むことができる。シリコンフォトダイオードは、廉価で感度がよく、高速作動させることができ（立ち上がり時間が短く／帯域幅が高い）、殆どの他の半導体技術及びモノリシック回路網に容易に組み込まれるという点で有利なこともある。更に、シリコンフォトダイオードは、物理的に小さく、それによって膜ベースの装置と用いるためのシステムに容易に組み込むことができる。シリコンフォトダイオードを用いる場合には、放出信号の波長範囲は、４００から１１００ナノメートルであるその感度の範囲内とすることができる。

一般的には、本発明により検体の存在又は濃度の定量的又は半定量的な検出を行うことができる。例えば、上述のように、検体の量は、検出区間３１及び指示区間３５に捕捉されたプローブにより生成される信号の強度、及び任意的に較正区間３２での強度信号を用いて、定量的又は半定量的に判断することができる。図２には、異なる信号強度を用いて検体濃度を判断する機能がグラフで示されている。信号強度は、必ずしも示す関係に従う必要はなく、この関係は、例示的な目的でのみ挙げたものであることを理解すべきである。この点に関して、図２は、指示区間３５及び検出区間３１の両方に対する図３及び図４の検出プローブの信号強度の関係を示している。単に説明のためであるが、図２は、較正信号強度を含まない。しかし、上述のように、較正信号強度を用いて結果を較正することができる。例えば、Ｉ_d対Ｉ_cの比率を検体濃度に対してプロットし、上述の用量反応曲線を生成することができる。

図２に示すように、試験サンプル中に抗原Ａが存在しない場合には、指示区間３５内の検出プローブ４１の全てが抗原Ａ^*に結合し、指示信号強度（Ｉ₀）の最大値を生成する。検出区間３１は、信号を生成しない。濃度が増大すると、抗原Ａは、接合検出プローブ４１と錯体４９を形成し始める。錯体４９は、検出区間３１で抗体５１と結合することができるエピトープを有する。それによって指示信号強度「Ｉ₀」が減少することになり、検出区間３１で検出信号強度「Ｉ_d」も生成されることになる。抗原Ａの濃度が利用可能な接合検出プローブ４１の量を超えるまで指示信号強度「Ｉ₀」の強度は減少し続け、検出信号の強度「Ｉ_d」は増大し続ける。これは、検体の「飽和濃度」として公知である。遊離検体Ａ及び錯体４９は、飽和濃度で、検出区間３１の結合部位に対して競合し始める。従って、検出信号の強度「Ｉ_d」は、その最大値に達する。この値は、検出プローブ４１の量が、検出区間３１での利用可能な抗体５１の量に対応するように選択されるために、一般的に既知である。抗原濃度が更に増大すると、検出信号強度「Ｉ_d」は、検出区間３１内の遊離の非ラベル抗原Ａが増大するために、減少し始める。更に、検体飽和濃度又はその付近では、全ての検出プローブ４１が検体Ａと錯体化し、その後、検出区間３１内の抗体５１に結合するために、指示信号強度は理論的に検出されないことになる。しかし、実際には、少数の検出プローブ４１が指示区間３５内の抗原Ａ^*に結合することができるために、比較的低い指示信号強度「Ｉ₀」が依然として生成される。

本発明によれば、図２の用量反応曲線の様々な領域を選択的に用いて、測定した検出信号強度を検体濃度に変換することができる。例えば、曲線の「領域Ａ」は、検体濃度「Ａ₀」と「Ａ₁」の間に形成される。この領域では、検出信号強度は、検体濃度とほぼ直線の関係を有する。従って、図２の「領域Ａ」を用いて、測定した検出信号強度「Ｉ_d」を実際の検体濃度に正確に変換することができる。同様に、曲線の「領域Ｃ」は、検体濃度「Ａ₂」と「Ａ₃」の間に形成される。ここでもまた、この領域では、検出信号強度は、検体濃度とほぼ直線の関係を有する。従って、図２の「領域Ｃ」は、測定した検出信号強度「Ｉ_d」を実際の検体濃度に正確に変換するのに用いることができる。検体濃度「Ａ₁」と「Ａ₂」の間に形成される検出曲線の「領域Ｂ」は、比較的一定であり、従って、検体濃度に対する正確な関係を得ることが時に困難である。従って、定量的な結果が望ましい場合には、ユーザは、次の試験サンプルを希釈し、次に、アッセイを再度行うことができる。代替的に、指示信号強度を単独で又は検出信号強度と組み合わせて用いて定量的な結果を与えることができる。半定量的な結果を望むだけの場合には、検体濃度は、単に、検体濃度「Ａ₁」及び「Ａ₂」の範囲の間に含まれるということができる。

図２の用量反応曲線のどの領域が特定の試験サンプルに最も適するかを判断するために、検体濃度が「フック効果」領域に含まれるか否かを最初に判断することが一般的に望ましい。この点に関して、測定した信号強度「Ｉ₀」は、検体の既知の飽和濃度に対して予め求めた参考基準に比較することができる。「参考基準」は、単一の強度値とすることができ、又はある一定の誤差範囲内で飽和濃度に対応すると考えられている範囲を含むことができる。値の範囲の上限及び下限は、同じ既知の検体飽和濃度に対して複数試験を行う時に指示信号強度が変動する範囲に基づいて選択することができる。例えば、図２では、参考基準は、それぞれ、検体濃度「Ａ₁」及び「Ａ₂」に対応する強度値「Ｉ₁」及び「Ｉ₂」の間に定めることができる。参考基準よりも大きい（例えば、「Ｉ₁」の上限よりも大きい）測定した信号強度「Ｉ₀」は、検体濃度が「フック効果」領域の外側にあるというインジケータとして働き、参考基準と同じか又はそれ未満（例えば、上限「Ｉ₁」未満）の測定した信号強度「Ｉ₀」は、検体濃度が「フック効果」領域内であるというインジケータとして働く。

図５を参照すると、例えば、検体濃度が「フック効果」領域内であるか否かを判断する方法１００の一実施形態が示されている。方法１００の入力値として、測定した検出信号強度「Ｉ_d」、測定した指示信号強度「Ｉ₀」、及び参考基準の上限Ｉ₁及び下限Ｉ２を含むいくつかの変数を用いる。方法１００の第１の段階は、測定した信号強度「Ｉ₀」が上限「Ｉ₁」よりも大きいか否かを判断する段階である。そうである場合には、検体濃度は、「フック効果」領域の外側にあり、用量反応曲線の「領域Ａ」を用いて、測定した検出信号強度「Ｉ_d」を検体濃度に変換することができる。測定した信号強度「Ｉ₀」が上限「Ｉ₁」よりも小さい場合には、方法１００の次の段階は、検体濃度が飽和濃度又はその付近であるか否か、又は飽和濃度を大幅に超えるか否かを判断する段階である。従って、方法１００は、測定した信号強度「Ｉ₀」が、下限「Ｉ₂」よりも小さいか否かを判断し、そうである場合には、用量反応曲線の「領域Ｃ」を用いて、測定した検出信号強度「ｌ_d」を検体濃度に変換することができる。測定した信号強度「Ｉ₀」が下限「Ｉ₂」よりも大きいが上限「Ｉ₁」よりも小さい（すなわち、参考基準と同じ）場合には、方法１００の最後の段階は、半定量的又は定量的な結果が望ましいか否かを判断する段階である。定量的な結果が望ましい場合には、方法１００は、ユーザに、次の試験サンプルを希釈してからアッセイを再び行うように指示する。代替的に、測定した指示信号強度「Ｉ₀」は、単独で用いることができ、又は検出信号強度「Ｉ_d」と組み合わせて用いて定量的な結果を得ることができる。例えば、図２に示すように、指示曲線は、検出信号曲線の「領域Ｂ」内で比較的直線である。従って、この領域内では、指示曲線により、正確な検出の結果を得ることができる。更に、半定量的結果しか望まない場合には、方法１００は、単に、検体濃度が図２に示されている検体濃度「Ａ₁」及び「Ａ₂」の範囲に含まれることを示している。

上述のような相関方法は、自動的及び／又は手動的に行うことができる。例えば、マイクロプロセッサを任意的に用いて望ましい相関技術を自動的に選択し、検出器からの測定値を定量的又は半定量的に検体の濃度を示す結果に変換することができる。マイクロプロセッサは、ユーザに最近の数回の結果を思い出させる記憶機能を含むことができる。当業者は、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、フラッシュメモリカード、デジタルビデオディスク、及びベルヌーイカートリッジなどのようなあらゆる適切なコンピュータ可読記憶装置を用いることができることを認めるであろう。必要に応じて、結果は、液晶（ＬＣＤ）又はＬＥＤディスプレイを用いてユーザに伝えることができる。
本発明は、以下の実施例を参照すると、更に良好に理解することができるであろう。

ラテラルフローアッセイ装置を形成する機能を明らかにする。長さがほぼ３０センチメートルのニトロセルロース多孔性膜（「Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｉｎｃ．」製の「ＨＦ １２０」）を支持カードに積層した。Ｃ反応性タンパク質に対する単クローン抗体を多孔性膜に不動化し、検出区間を形成した。抗体は、「ＢｉｏｓＰａｃｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．」から入手し（カタログ番号Ａ５８０４０１３６Ｐ）、濃度は、１ミリグラム／ミリリットルであった。ＣＲＰ抗原は、多孔性膜に不動化されて指示区間を形成した。抗原は、ニューハンプシャー州キングストン所在の「Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｉｎｃ．」から入手し、濃度は、２．７８ミリグラム／ミリリットルであった。「Ｇｏｌｄｌｉｎｅ（登録商標）」（「Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｂｉｏｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ」から入手したポリリシン溶液）を膜に縞状に配置し、対照区間を形成した。指示区間は、検出区間と対照区間の間に位置決めした。セルロース吸上げパッド（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏ．）を膜の一端（対照区間に近い方）に積層した。膜サンプルは、次に、温度３７℃で１時間乾燥させた。

ＣＲＰに対する単クローン抗体を接合した金粒子１８０マイクロリットル（「ＢｉｏｓＰａｃｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．」、カタログ番号Ａ５８１１０２２８Ｐ）、ショ糖水（２０％）３７５マイクロリットル、及び水９４５マイクロリットルを混合することによって粒子懸濁液を形成した。金粒子は、粒径４０ナノメートル、光学密度５６であり、「Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｂｉｏｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ」から得られた。２５センチメートル長のガラス繊維接合パッド（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏ．）上に懸濁液を負荷した。ガラス繊維パッドは、３７℃で２時間乾燥させ、接合パッドを形成した。次に、接合パッドを多孔性膜の他端（検出区間に近い方）に積層した。更に、セルロース吸上げパッド（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏ．）サンプルパッドを接合パッド上に積層した。積層した完全なカードを次に裁断し、４ミリメートル幅のラテラルフローアッセイ装置にした。

２．２３ミリグラム／ミリリットルのヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）を用いて対照区間を形成することを除き、実施例１に説明するようにラテラルフロー装置を形成した。

ラテラルフローアッセイ装置を形成する機能を明らかにする。長さがほぼ３０センチメートルのニトロセルロース多孔性膜（「Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｉｎｃ．」製の「ＨＦ １２０」）を支持カードに積層した。Ｃ反応性タンパク質に対する単クローン抗体（「ＢｉｏｓＰａｃｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．」、カタログ番号Ａ５８０４０１３６Ｐ）の０．１％トレハロース水溶液を多孔性膜に不動化し、検出区間を形成した。ＣＲＰ抗原は、多孔性膜に不動化して指示区間を形成した。抗原は、ニューハンプシャー州キングストン所在の「Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｉｎｃ．」から入手し、濃度は、２．７８ミリグラム／ミリリットルであった。ヤギ抗アルカリフォスファターゼ（２．５ミリグラム／ミリリットル、マサチューセッツ州コンコード所在の「Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．」から入手）を膜に縞状に配置し、較正区間を形成した。指示区間は、検出区間と較正区間の間に位置決めした。セルロース吸上げパッド（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏ．）を膜の一端（対照区間に近い方）に積層した。膜サンプルは、次に、温度３７℃で１時間乾燥させた。

ラビット抗ヤギＩｇＧを接合した金粒子１６０マイクロリットル、ＣＲＰ単クローン抗体を接合した金粒子１６０マイクロリットル（「ＢｉｏｓＰａｃｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．」、カタログ番号Ａ５８１１０２２８Ｐ）、ショ糖水（２０％）３７５マイクロリットル、及び水７８５マイクロリットルを混合して粒子懸濁液を形成した。ラビット抗ヤギＩｇＧを接合した金粒子は、粒径１０ナノメートルであり、ミズーリ州セントルイス所在の「Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．」から得られた。ＣＲＰ単クローン抗体を接合した金粒子は、粒径４０ナノメートルであり、「Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｂｉｏｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ」から得られた。２５センチメートル長のガラス繊維接合パッド（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏ．）上に懸濁液を負荷した。ガラス繊維パッドは、３７℃で２時間乾燥させ、接合パッドを形成した。接合パッドを多孔性膜の他端（検出区間に近い方）に積層した。更に、セルロース吸上げパッド（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏ．）サンプルパッドを接合パッド上に積層した。積層した完全なカードを次に裁断し、４ミリメートル幅のラテラルフローアッセイ装置にした。

実施例１のラテラルフローアッセイ装置を用いて検体の存在及び量を検出する機能を明らかにする。１１個のアッセイ装置を試験した。Ｃ反応性タンパク質をＴＢＳ緩衝液に入れたもの１２０マイクロリットルを各装置のサンプルパッドに付加した。異なる濃度、すなわち、０；１０；５０；２００；５００；１，０００；２，０００；５，０００；２０，０００；１００，０００；及び５００，０００ナノグラム／ミリリットルのＣＲＰを試験した。装置は、３０分間自然に発現させた。各装置の各区分の色強度は、反射率ベースの分光光度計を用いて測定した。各区分での強度を表１にまとめている。

図６では、ＣＲＰ濃度に対して強度をプロットした。図示のように、指示区間は、ＣＲＰ濃度が「フック効果」領域内に含まれるか否かを予想することができる。

実施例２のラテラルフローアッセイ装置を用いて検体の存在及び量を検出する機能を明らかにする。１１個のアッセイ装置を試験した。Ｃ反応性タンパク質をＴＢＳ緩衝液に入れたもの１２０マイクロリットルを各装置のサンプルパッドに付加した。異なる濃度、すなわち、０；１０；５０；２００；５００；１，０００；２，０００；５，０００；２０，０００；１００，０００；及び５００，０００ナノグラム／ミリリットルのＣＲＰを試験した。装置は、３０分間自然に発現させた。各装置の各区分の色強度は、反射率ベースの分光光度計を用いて測定した。各区分での強度を表２にまとめている。

図７では、ＣＲＰ濃度に対して強度をプロットした。図示のように、指示区間は、ＣＲＰ濃度が「フック効果」領域内に含まれるか否かを予想することができる。

実施例３のラテラルフローアッセイ装置を用いて検体の存在及び量を検出する機能を明らかにする。１１個のアッセイ装置を試験した。Ｃ反応性タンパク質をＴＢＳ緩衝液に入れたもの１２０マイクロリットルを各装置のサンプルパッドに付加した。異なる濃度、すなわち、０；１０；５０；２００；５００；１，０００；２，０００；５，０００；２０，０００；１００，０００；及び５００，０００ナノグラム／ミリリットルのＣＲＰを試験した。装置は、３０分間自然に発現させた。各装置の各区分の色強度は、反射率ベースの分光光度計を用いて測定した。各区分での強度を表３にまとめている。

図８では、ＣＲＰ濃度に対して強度をプロットした。図示のように、指示区間は、ＣＲＰ濃度が「フック効果」領域内に含まれるか否かを予想することができる。

アッセイ装置の検出感度を変動させる機能を明らかにする。最初に、ＣＲＰに対する単クローン抗体で接合した金粒子（「ＢｉｏｓＰａｃｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．」、カタログ番号Ａ５８１１０２２８Ｐ）を２ミリモルの「Ｂｏｒａｘ」（ｐＨ７．２）を用いて光学的密度が１０である濃度まで希釈することによって粒子懸濁液を形成した。金粒子の粒径は、４０ナノメートルであった。懸濁液は、「Ｋｉｎｅｍａｔｉｃ １６００」試薬分取モジュール（カリフォルニア州トウェインハート所在の「Ｋｉｎｅｍａｔｉｃ Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．」）を用い、２５マイクロリットル／秒（５μｌ／ｃｍ、５ｃｍ／ｓ）の割合で３４ミリメートル長のガラス繊維接合パッド（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏ．）上にスプレーした。ガラス繊維パッドは、室温、相対湿度２０％未満で一晩乾燥させた。

接合パッドは、次に、長さがほぼ３０センチメートルのニトロセルロース多孔性膜（「Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｉｎｃ．」製の「ＨＦ １８０」）の端部に積層した。Ｃ反応性タンパク質に対する単クローン抗体（「ＢｉｏｓＰａｃｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．」、カタログ番号Ａ５８１１０２２８Ｐ）は、ＰＢＳ緩衝液を用いて濃度０．２及び０．３ミリグラム／ミリリットルまで希釈した。更に、ＣＲＰ抗原は、ニューハンプシャー州キングダム所在の「Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｉｎｃ．」からも入手し、ＴＢＳ緩衝液で濃度３．４ミリグラム／ミリリットルまで希釈した。試薬は、「Ｋｉｎｅｍａｔｉｃ １６００」試薬分取モジュール（カリフォルニア州トウェインハート所在の「Ｋｉｎｅｍａｔｉｃ Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．」）を用いて５マイクロリットル／秒（１μＬ／ｃｍ、５ｃｍ／ｓ）の割合で多孔性膜に縞状に配置した。不動化した単クローン抗体は、膜の縁部から１０ミリメートルに位置決めされた検出区間を形成した。不動化したＣＲＰ抗原は、膜の外縁から１０ミリメートルで検出区間から５ミリメートル下流に位置決めされた指示区間を形成した。「ＣＦ６」セルロース／ガラス吸上げパッド（英国ミドルセックス所在の「Ｗｈａｔｍａｎ ｐｌｃ」）を幅２０ミリメートルに切断してニトロセルロース膜に積層した。積層したカードは、次に、切断して４ｍｍ幅の完全なラテラルフロー・ディップスティックにした。

得られたアッセイ装置は、ハウジング（１４のディップスティックを保持する）に入れ、容積式ピペットを用いて、ワシントン州シアトル所在の「Ｋａｍｉｙａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏ．」から得られる１マイクロリットルの較正ＣＲＰ血清（０から４８０マイクログラム／ミリリットル）と共に手作業で縞状にした。血清のこの縞は、「ＧＦ ３３」パッドの縁部から１２ｍｍの地点に配置した。アッセイ装置は、試験ストリップに沿う血清を洗浄又は「追跡」するために、血清を付加した地点よりも上流に１１０マイクロリットルのＰＢＳ緩衝液（２％「ＴＷＥＥＮ ２０」によりｐＨ７．２）を付加することによって試験した。装置は、３０分間自然に発現させた。各装置の各区分の色強度は、０が無色、１１が最高の色強度を表す０から１１の範囲を用いて視覚的スケール（Ｒａｎｎスケール）を用いて判断した。各区分の強度を表４及び表５にまとめている。

上に示すように、検出区間に用いられる抗体の濃度は変動し、異なる検出感度をもたらす場合がある。このようにして、抗体濃度は、試験条件に良好に対応すると考えられる感度の範囲に用量反応曲線を生成するように選択的に制御することができる。例えば、抗体濃度は、より高い検体濃度で用量反応曲線の直線領域が存在するように調節することができる。

アッセイ装置の検出感度を変動させる機能を明らかにする。最初に、ＣＲＰに対する単クローン抗体で接合した金粒子（「ＢｉｏｓＰａｃｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．」、カタログ番号Ａ５８１１０２２８Ｐ）を２ミリモルの「Ｂｏｒａｘ」（ｐＨ７．２）を用いて光学的密度が５，８、１０、１２，１５，１８、又は２０の濃度まで希釈することにより粒子懸濁液を形成した。金粒子の粒径は、４０ナノメートルであった。懸濁液は、「Ｋｉｎｅｍａｔｉｃ １６００」試薬分取モジュール（カリフォルニア州トウェインハート所在の「Ｋｉｎｅｍａｔｉｃ Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．」）を用い、２５マイクロリットル／秒（５μｌ／ｃｍ、５ｃｍ／ｓ）の割合で３４ミリメートル長のガラス繊維接合パッド（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏ．）上にスプレーした。ガラス繊維パッドは、室温、相対湿度２０％未満で一晩乾燥させた。

接合パッドは、次に、長さがほぼ３０センチメートルのニトロセルロース多孔性膜（「Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｉｎｃ．」製の「ＨＦ １８０」）の端部に積層した。Ｃ反応性タンパク質に対する単クローン抗体（「ＢｉｏｓＰａｃｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．」、カタログ番号Ａ５８１１０２２８Ｐ）は、ＰＢＳ緩衝液で濃度０．１ミリグラム／ミリリットルまで希釈した。更に、ＣＲＰ抗原は、ニューハンプシャー州キングダム所在の「Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｉｎｃ．」からも入手し、ＴＢＳ緩衝液で濃度３．４ミリグラム／ミリリットルまで希釈した。試薬は、「Ｋｉｎｅｍａｔｉｃ １６００」試薬分取モジュール（カリフォルニア州トウェインハート所在の「Ｋｉｎｅｍａｔｉｃ Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．」）を用いて５マイクロリットル／秒（１μＬ／ｃｍ、５ｃｍ／ｓ）の割合で多孔性膜上に縞状に配置した。不動化した単クローン抗体は、膜の縁部から１０ミリメートルに位置決めされた検出区間を形成した。不動化したＣＲＰ抗原は、膜の外縁から１０ミリメートルで検出区間から５ミリメートル下流に位置決めされた指示区間を形成した。「ＣＦ６」セルロース／ガラス吸上げパッド（英国ミドルセックス所在の「Ｗｈａｔｍａｎ ｐｌｃ」）を幅２０ミリメートルに切断してニトロセルロース膜に積層した。積層したカードは、次に、切断して４ｍｍ幅の完全なラテラルフロー・ディップスティックにした。

得られたアッセイ装置をハウジング（１４のディップスティックを保持する）に入れ、容積式ピペットを用いて、ワシントン州シアトル所在の「Ｋａｍｉｙａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏ．」から得られる１マイクロリットルの較正ＣＲＰ血清（０から４８０マイクログラム／ミリリットル）と共に縞状にした。血清のこの縞は、「ＧＦ ３３」パッドの縁部から１２ｍｍの地点に配置した。アッセイ装置は、試験ストリップに沿う血清を洗浄又は「追跡」するために、血清を付加した地点よりも上流に１１０マイクロリットルのＰＢＳ緩衝液（２％「ＴＷＥＥＮ ２０」によりｐＨ７．２）を付加することによって試験した。装置は、３０分間自然に発現させた。各装置の各区分の色強度は、上述の「Ｒａｎｎ」スケールを用いて測定した。結果は、図９から図１０に示している。

図９に示すように、抗体反応曲線（検出区間）及び信号強度（例えば、「Ｒａｎｎ」値）は、（光学的密度により反映されるように）接合粒子濃度を変化させることによって変動させることができる。同様に、図１０に示すように、接合粒子濃度を変化させることによってＣＲＰ反応曲線（指示区間）及び信号強度も変動させることができる。すなわち、図示のように、接合粒子の濃度は、試験条件により良好に対応すると考えられるある一定の感受性範囲内で用量反応曲線を発生させるように選択的に制御することができる。

アッセイ装置の検出感度を変動させる機能を明らかにする。初期実験のために、半スティックアッセイ装置を作った。抗体原液を「ＰＢＳ ０／０」中に希釈して０．１及び０．５ミリグラム／ミリリットル濃度とすることにより、ＣＲＰに対する単クローン抗体（「ＢｉｏｓＰａｃｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．」、カタログ番号Ａ５８１１０２２８Ｐ）の２つの溶液を調製した。各溶液は、次に、長さがほぼ３０センチメートルの別々のニトロセルロース膜（「Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｉｎｃ．」製の「ＨＦ １２０」）上に縞状に配置した。溶液は、「Ｋｉｎｅｍａｔｉｃ １６００」試薬分取モジュール（カリフォルニア州トウェインハート所在の「Ｋｉｎｅｍａｔｉｃ Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．」）を用い、５マイクロリットル／秒（１μｌ／ｃｍ分取率、５ｃｍ／ｓベッド速度）の割合で縞状に配置した。ＣＲＰ溶液（ニューハンプシャー州Ｋｉｎｇｓｔｏｎ所在の「Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｉｎｃ．」）を「ＰＢＳ ０／０」（ｐＨ７．２）中に０．５ｍｇ／ｍＬまで希釈し、これも、「Ｋｉｎｅｍａｔｉｃ １６００」を用いてカードに縞状に配置した。カードは、３７℃で１時間放置して乾燥させ、２０ミリメートル幅のセルロース繊維吸上げ材（「Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ」製「ＣＦＳＰ２０３０００」）と積層した。「Ｋｉｎｅｍａｔｉｃ ２３６０」スリッタ（カリフォルニア州トウェインハート所在の「Ｋｉｎｅｍａｔｉｃ Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．」）を用いてカードを４ミリメートル幅のストリップに切断し、４ミリメートル幅の半ラテラルフロー・ディップスティック（半スティック）をもたらした。

試験するために、ＣＲＰに対する単クローン抗体（「ＢｉｏｓＰａｃｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．」、カタログ番号Ａ５８１１０２２８Ｐ）と予め接合した様々な大きさの金粒子の粒子懸濁液を用いた。この実施例で検討する大きさは、４０及び６０ナノメートル直径の金粒子接合体であった。粒子接合体は、「ＴＢＳ １／０／１」中に、試験するのに望ましい光学密度（ＯＤ）、すなわち、ＯＤ１及びＯＤ２．５まで希釈した。「Ｓｃｉｐａｃ」からのＣＲＰ基準は、等しい容積の金接合体と混合した状態で０から２０マイクログラム／ミリリットルＣＲＰの試験範囲をもたらすように、「ＰＢＳ ０／０」中に０から４０マイクログラム／ミリリットルの濃度範囲まで希釈した。２０マイクロリットルのＣＲＰ溶液及び２０マイクロリットルの金接合体懸濁液を９６穴プレートに加えた。半スティックサンプルを次に穴に入れ、試験を１５分実行させた後に、得られた試験線の視覚的採点が行われた。各装置の色強度の視覚的採点は、０（試験線に可視的な色がない）から１１（試験線に非常に強度の高い色がある）までの範囲の「Ｒａｎｎスケール」を用いて行った。

結果は、図１１から図１５に示している。例えば、図１１から図１２に示すように、検出区間での抗体濃度が０．５ｍｇ／ｍｌは、ＣＲＰ濃度が０．２から２０マイクログラム／ミリリットルの間の指示区間での信号なしか又は微かな信号（すなわち、Ｒａｎｎ＝１）のいずれかをもたらした。抗体濃度が０．１ｍｇ／ｍｌ（図１３から図１４）まで減少すると、ＣＲＰ線（指示区間）信号強度は増大し、浅いＣＲＰ曲線が生じた。更に、金接合体濃度を光学密度２．５まで増大させることにより、抗体及びＣＲＰ線の両方の信号強度が増大した（図１５）。更に、抗体信号がそのピークに到達する点に近づくと（例えば、「フック効果」点で）ＣＲＰ線も減少し始める。
本発明をその特定的な実施形態に関して詳細に説明したが、当業者が、以上の事項を理解すれば、これらの実施形態に対する代替物、実施形態の変形、及び実施形態に対する均等物を容易に考えることができることは認められるであろう。従って、本発明の範囲は、特許請求の範囲及びそのあらゆる均等物の範囲として判断されるべきである。

本発明のラテラルフローアッセイ装置の一実施形態の斜視図である。 本発明の一実施形態による検出及び指示区間に対する検体濃度と信号強度の間の関係のグラフである。 アッセイを行う前に本発明の一実施形態に用いられる機構の概略図である。 アッセイ完了後の図３の実施形態を示す図である。 検体濃度が「フック効果」領域内にあるか否かを判断し、検体濃度を半定量的又は定量的に判断する方法の一実施形態を示す図である。 信号強度がＣＲＰ濃度に対してプロットされた実施例４の用量反応曲線である。 信号強度がＣＲＰ濃度に対してプロットされた実施例５の用量反応曲線である。 信号強度がＣＲＰ濃度に対してプロットされた実施例６の用量反応曲線である。 検出区間により生ずる強度（すなわち、「Ｒａｎｎ」スコア）をＣＲＰ濃度に対してプロットした実施例８の各接合粒子濃度に対する用量反応曲線である。 指示区間により生ずる強度（すなわち、「Ｒａｎｎ」スコア）をＣＲＰ濃度に対してプロットした実施例８の各接合粒子濃度に対する用量反応曲線である。 金粒子の大きさ４０ナノメートル、接合光学密度１．０、抗体線濃度０．５ミリグラム／ミリリットル、及びＣＲＰ線濃度０．５ミリグラム／ミリリットルに対して、検出区間及び指示区間の「Ｒａｎｎ」スコアをＣＲＰ濃度に対してプロットした実施例９の用量反応曲線である。 金粒子の大きさ６０ナノメートル、接合光学密度１．０、抗体線濃度０．５ミリグラム／ミリリットル、及びＣＲＰ線濃度０．５ミリグラム／ミリリットルに対して、検出区間及び指示区間の「Ｒａｎｎ」スコアをＣＲＰ濃度に対してプロットした実施例９の用量反応曲線である。 金粒子の大きさ４０ナノメートル、接合光学密度１．０、抗体線濃度０．１ミリグラム／ミリリットル、及びＣＲＰ線濃度０．５ミリグラム／ミリリットルに対して、検出区間及び指示区間の「Ｒａｎｎ」スコアをＣＲＰ濃度に対してプロットした実施例９の用量反応曲線である。 金粒子の大きさ６０ナノメートル、接合光学密度１．０、抗体線濃度０．５ミリグラム／ミリリットル、及びＣＲＰ線濃度０．５ミリグラム／ミリリットルに対して、検出区間及び指示区間の「Ｒａｎｎ」スコアをＣＲＰ濃度に対してプロットした実施例９の用量反応曲線である。 金粒子の大きさ４０ナノメートル、接合光学密度２．５、抗体線濃度０．１ミリグラム／ミリリットル、及びＣＲＰ線濃度０．５ミリグラム／ミリリットルに対して、検出区間及び指示区間の「Ｒａｎｎ」スコアをＣＲＰ濃度に対してプロットした実施例９の用量反応曲線である。

符号の説明

２０ ラテラルフローアッセイ装置
２３ 多孔性膜
３１ 検出区間
３２ 較正区間
３５ 指示区間

Claims (20)

1. 試験サンプル内の検体の存在又は量を検出するためのラテラルフローアッセイ装置であって、
   検体が錯体を共に形成することができる接合した検出プローブに連通した多孔性膜、
   を含み、
   前記多孔性膜は、
   前記接合検出プローブと錯体化されているか否かに関わらず前記検体と優先的に結合するように構成された第１の受容材料が内部に不動化され、かつ測定可能検出信号を生成することができる検出区間と、
   前記検出区間の下流に位置し、錯体化していない接合検出プローブと優先的に結合するように構成された第２の受容材料が内部に不動化され、かつ測定可能指示信号を生成することができる指示区間と、
   を形成し、
   前記測定可能指示信号の強度は、試験サンプル内の前記検体の濃度がフック効果領域内であるか否かを判断するために、該検体の飽和濃度又はその付近での該指示信号の強度又は強度の範囲を表す参考基準と比較可能である、
   ことを特徴とする装置。
2. 前記第２の受容材料は、前記検体と共通の少なくとも１つのエピトープを有することを特徴とする請求項１に記載のラテラルフローアッセイ装置。
3. 前記第２の受容材料は、抗原又はその類似物を含むことを特徴とする請求項１又は請求項２に記載のラテラルフローアッセイ装置。
4. 前記検体は、Ｃ反応性タンパク質であることを特徴とする請求項３に記載のラテラルフローアッセイ装置。
5. 前記第１の受容材料は、抗体又はその類似物を含むことを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか１項に記載のラテラルフローアッセイ装置。
6. 前記多孔性膜は、更に、較正信号を生成することができる較正区間を形成することを特徴とする請求項１から請求項５のいずれか１項に記載のラテラルフローアッセイ装置。
7. 前記検体の前記濃度は、前記検出信号の前記強度から少なくとも部分的に判断されることを特徴とする請求項１から請求項６のいずれか１項に記載のラテラルフローアッセイ装置。
8. 前記検体の前記濃度は、前記指示信号の前記強度から少なくとも部分的に判断されることを特徴とする請求項１から請求項７のいずれか１項に記載のラテラルフローアッセイ装置。
9. 試験サンプル内の検体を定量的又は半定量的に検出する方法であって、
   ｉ）接合した検出プローブと連通し、更に、検出区間と該検出区間の下流に位置する指示区間とを形成する、ラテラルフロー装置の多孔性膜に、試験サンプルを接触させる段階と、
   ｉｉ）前記検出区間で生成された検出信号の強度及び前記指示区間で生成された指示信号の強度を測定する段階と、
   ｉｉｉ）検体の飽和濃度又はその付近での前記指示信号の強度又は強度の範囲を表す参考基準に前記測定した指示信号強度を比較する段階と、
   を含むことを特徴とする方法。
10. 前記測定指示信号強度が前記参考基準未満、それよりも大きい、又はそれと同じか否かに基づいて前記測定検出信号強度を検体濃度又は濃度の範囲に変換するための技術を選択する段階を更に含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
11. 既知の検体濃度に対して検出信号強度をプロットすることによって用量反応曲線を発生させる段階を更に含むことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
12. 前記試験サンプル中の前記検体の前記濃度は、前記測定指示信号強度が前記参考基準よりも大きい時には、前記用量反応曲線の第１の領域を用いて判断されることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
13. 前記用量反応曲線の前記検出信号強度は、前記第１の領域内では検体濃度に対してほぼ直線的関係を有することを特徴とする請求項１２に記載の方法。
14. 前記試験サンプル中の前記検体の前記濃度は、前記測定指示信号強度が前記参考基準未満である時には、前記用量反応曲線の第２の領域を用いて判断されることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
15. 前記用量反応曲線の前記検出信号強度は、前記第２の領域内では検体濃度に対してほぼ直線的関係を有することを特徴とする請求項１４に記載の方法。
16. 前記検体の前記濃度が内部に含まれる範囲をもたらす前記用量反応曲線の第３の領域が、前記測定指示信号強度が前記参考基準と同じ時に用いられることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
17. 前記指示信号強度は、前記第３の領域内では検体濃度に対してほぼ直線的関係を有することを特徴とする請求項１６に記載の方法。
18. 前記用量反応曲線に対するある一定の感受性範囲を達成するのを助けるために、該用量反応曲線を発生させるのに用いられる受容材料及び／又は接合検出プローブの濃度を選択的に制御する段階を更に含むことを特徴とする請求項１１から請求項１７のいずれか１項に記載の方法。
19. 較正信号強度がまた、前記用量反応曲線を発生させるのに用いられることを特徴とする請求項１１から請求項１８のいずれか１項に記載の方法。
20. 第２の試験サンプルが、前記測定指示信号強度が前記参考基準とほぼ同じである時には、前記多孔性膜と接触させるために希釈されることを特徴とする請求項１０に記載の方法。

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