KR20080012852A

KR20080012852A - 후크 효과 영역 내에서 검출 능력을 갖는 분석 측정 기구

Info

Publication number: KR20080012852A
Application number: KR1020077024659A
Authority: KR
Inventors: 쉬에동 송; 폴 크리스토퍼
Original assignee: 킴벌리-클라크 월드와이드, 인크.
Priority date: 2005-04-29
Filing date: 2006-02-28
Publication date: 2008-02-12
Also published as: EP1875242B1; US20060246601A1; JP2008539424A; CN101326440B; CN101326440A; MX2007013522A; US7439079B2; WO2006118647A1; KR101288296B1; EP1875242A1

Abstract

시험 샘플 내의 분석물질의 존재 유무 또는 양을 검출하기 위한 측방 유동 분석 측정 기구가 제공된다. 이 기구는 다수의 대역을 이용하고, 그 중 하나는 시험 샘플 중의 분석물질이 "후크 효과" 영역 내에 있는지의 여부를 알리는 지시자 기능을 한다. 이 지시를 토대로 하여, 측정된 신호 세기를 분석물질 농도 또는 농도 범위와 상관시키기 위한 기술을 선택할 수 있다. 예를 들어, 시험 샘플이 "후크 효과" 영역 밖에 있는 것으로 결정될 때는 분석물질 농도를 용량 반응 곡선의 한 부분을 이용해서 결정할 수 있다. 다른 한편, 시험 샘플이 "후크 효과" 농도 내에 있는 것으로 결정될 때는, 분석물질 농도를 용량 반응 곡선의 다른 한 부분을 이용해서 결정할 수 있다. 별법으로, 분석 측정을 재수행하기 위해 샘플을 간단히 희석할 수 있다. 본 발명은 이러한 검출 기술이 분석물질이 어떤 농도로 존재하든 존재하는 분석물질을 간단하고 빠르고 정확하게 검출할 수 있다는 것을 발견하였다.

측방 유동 분석 측정 기구

Description

후크 효과 영역 내에서 검출 능력을 갖는 분석 측정 기구{ASSAY DEVICES HAVING DETECTION CAPABILITIES WITHIN THE HOOK EFFECT REGION}

시험 샘플 내에 존재할 수 있는 분석물질의 존재 유무 및/또는 농도를 결정하기 위한 유통(flow-through) 분석 측정에 다양한 분석 절차 및 기구가 흔히 이용된다. 예를 들어, 면역 분석 측정은 유기체에 대해 병원성이거나 또는 외래성인 항원의 존재에 대응하여 항체가 생성되는 면역 시스템의 메카니즘을 이용한다. 이들 항체 및 항원, 즉 면역반응체는 서로 결합할 수 있고, 따라서 생물학적 샘플 내의 특정 항원의 존재 유무 또는 농도를 결정하는 데 이용될 수 있는 고도로 특이적인 반응 메카니즘을 일으킨다.

분석물질이 분석적으로 검출될 수 있도록 검출가능 성분으로 표지된 면역반응체를 사용하는 몇 가지 잘 알려진 면역 분석 측정 방법이 있다. 예를 들어, "샌드위치형" 분석 측정 포맷은 전형적으로 시험 샘플을 분석물질에 대해 특이적인 결합 구성원(예: 항체)과 접합된 검출 프로브와 혼합해서 분석물질과 접합된 프로브 사이에 복합체를 형성하는 것을 포함한다. 이어서, 이들 복합체를 검출 대역 내에 고정화된 수용 물질(예: 항체)과 접촉하도록 둔다. 분석물질/프로브 접합 복합체와 고정화된 수용 물질 사이에 결합이 일어나고, 이렇게 하여 분석물질의 존재를 알리는 검출될 수 있는 "샌드위치" 복합체를 국지화한다. 이 기술은 정량적 또는 반정량적 결과를 얻는 데 이용될 수 있다. 이러한 샌드위치형 분석 측정의 몇몇 예는 그러브(Grubb) 등의 미국 특허 4,168,146 및 톰(Tom) 등의 미국 특허 4,366,241에 기술되어 있다. 다른 대안적인 기술은 "경쟁형 분석 측정"이다. 경쟁 분석 측정에서는, 표지된 프로브를 분석물질과 동일한 분자 또는 분석물질의 유사체와 접합시킨다. 따라서, 표지된 프로브가 이용가능 수용 물질을 차지하려고 관심 대상 분석물질과 경쟁한다. 경쟁 분석 측정은 전형적으로 각 합텐이 1가이고 오직 1 개의 항체 분자와 결합할 수 있는 합텐과 같은 분석물질의 검출에 이용된다. 경쟁 면역 분석 측정 기구의 예는 듀치(Deutsch) 등의 미국 특허 4,235,601, 리오타(Liotta)의 미국 특허 4,442,204 및 부에칠러(Buechler) 등의 미국 특허 5,208,535에 기술되어 있다.

이들 기구로부터 얻어지는 이익에도 불구하고, 많은 통상의 측방 유동 분석 측정은 상대적으로 높은 분석물질 농도에 노출될 때는 상당한 부정확도와 부닥치게 된다. 예를 들어, 분석물질이 고농도로 존재할 때, 시험 샘플에 분석물질의 실질적 부분이 과량으로 남을 수 있고, 따라서 접합된 프로브와 복합체를 형성하지 않는다. 따라서, 검출 대역에 이르렀을 때, 복합체화되지 않은 분석물질들이 결합 부위를 차지하려고 복합체화된 분석물질과 경쟁한다. 복합체화되지 않은 분석물질은 프로브로 표지되지 않기 때문에, 그것은 검출될 수 없다. 따라서, 결합 부위 중 상당한 수를 복합체화되지 않은 분석물질이 차지하는 경우, 그 분석 측정은 "가음성"을 나타낼 수 있다. 이 문제는 흔히 "후크 효과" 또는 "프로존"(prozone)이라고 불린다.

면역 분석 측정에서 "후크 효과"를 감소시키기 위한 다양한 기술이 제안되어 왔다. 예를 들어 쿠오(Kuo) 등의 미국 특허 6,183,972에서는 분석물질을 함유하는 것으로 의심되는 시험 유체가 모세관 작용에 의해 통해서 유동할 수 있는 다공성 물질의 스트립을 기술한다. 이 스트립은 분석물질의 제 1 에피톱에 대해 특이적인 고정화된 항체가 고정화되는 2 개 이상의 다른 포획 영역을 갖는다. 또한, 검출가능 표지를 가지며 분석물질의 제 2 에피톱에 대해 특이적인 항체도 사용된다. 충분한 농도로 존재할 때, 분석물질은 고정화된 항체와 분석물질의 제 1 에피톱의 결합을 부분적으로 차단한다. 따라서, 고정화된 항체, 분석물질 및 표지된 항체로 된 샌드위치가 포획 영역에서 형성된다. 따라서, 다른 포획 영역 각각에서의 표지된 항체의 방출된 신호가 분석물질의 농도에 대해 고유한 신호 패턴을 제공한다. 이 신호 세트를 수학적으로 조합함으로써, 고정화된 항체와 분석물질의 제 1 에피톱 간의 결합 차단을 제외하는 단조로운 용량 반응 곡선을 작성한다.

그러나, 정확하면서도 간단하고 비용효과적인 방식으로 "후크 효과" 영역 내의 분석 물질 농도를 결정하는 개선된 기술이 여전히 필요하다.

발명의 요약

본 발명의 한 실시태양에 따르면, 시험 샘플 내의 분석물질의 존재 유무 또는 양을 검출하기 위한 측방 유동 분석 측정 기구가 게재된다. 측방 유동 분석 측정 기구는 접합된 검출 프로브와 소통이 이루어지는 다공성 막을 포함한다. 분석물질은 접합된 검출 프로브와 복합체를 형성할 수 있다. 다공성 막은 제 1 수용 물질이 내부에 고정화된 검출 대역을 한정하고, 제 1 수용 물질은 접합된 검출 프 로브와 복합체화되든 복합체화되지 않든 여하간에 분석물질과 우선적으로 결합하도록 구성된다. 또한, 다공성 막은 검출 대역으로부터 하류에 위치하고 제 2 수용 물질이 내부에 고정화된 지시 대역을 한정한다. 제 2 수용 물질은 복합체화되지 않은 접합된 검출 프로브에 우선적으로 결합하도록 구성된다. 검출 대역 및 지시 대역은 측정가능 신호를 생성할 수 있다. 측정가능 지시 신호의 세기를 참조 표준값과 비교해서 시험 샘플 내의 분석물질의 농도가 후크 효과 영역 내인지의 여부를 결정할 수 있다. 참조 표준값은 분석물질의 포화 농도에서 또는 그 부근에서의 지시 신호의 세기 또는 세기 범위를 나타낸다.

시험 샘플 내의 분석물질을 정량적 또는 반정량적으로 검출하는 방법이 게재되어 있다. 이 방법은 시험 샘플을 측방 유동 기구의 다공성 막과 접촉시키는 것을 포함한다. 다공성 막은 접합된 검출 프로브와 소통이 이루어지고, 추가로 검출 대역 및 검출 대역의 하류에 위치하는 지시 대역을 한정한다. 이 방법은 검출 대역에서 생성된 검출 신호의 세기 및 지시 대역에서 생성된 지시 신호의 세기를 측정하는 것을 포함한다. 이 방법은 측정된 지시 신호 세기를 분석물질의 기지의 포화 농도에서 또는 그 부근에서의 지시 신호의 세기 또는 세기 범위를 나타내는 참조 표준값과 비교하는 것을 포함한다.

본 발명의 다른 특징 및 양상은 이하에서 더 상세하게 논의한다.

당업계 통상의 기술을 가진 자를 겨냥한 본 발명의 가장 좋은 방식을 포함하여 본 발명에 대한 충분하고 권능적인 게재 내용이 첨부된 도면을 참고로 하는 명 세서의 나머지 부분에 더 구체적으로 나타나 있다.

도 1은 본 발명의 측방 유동 분석 측정 기구의 한 실시태양의 투시도.

도 2는 본 발명의 한 실시태양에 따르는 검출 대역 및 지시 대역의 분석물질 농도와 신호 세기 사이의 관계를 나타내는 그래프.

도 3은 분석 측정을 수행하기 전의 본 발명의 한 실시태양에 이용되는 메카니즘을 도시한 개략도.

도 4는 분석 측정 완료 후의 도 3의 실시태양을 도시하는 개략도.

도 5는 분석물질 농도가 "후크 효과" 영역 내에 있는지의 여부를 결정하고 분석물질의 농도를 반정량적 또는 정량적으로 결정하는 방법의 한 실시태양을 나타내는 도면.

도 6은 신호 세기를 CRP 농도에 대해 플롯팅한 실시예 4의 용량 반응 곡선.

도 7은 신호 세기를 CRP 농도에 대해 플롯팅한 실시예 5의 용량 반응 곡선.

도 8은 신호 세기를 CRP 농도에 대해 플롯팅한 실시예 6의 용량 반응 곡선.

도 9는 검출 대역에서 생성된 세기(즉, 랜 스코어(Rann score))를 CRP 농도에 대해 플롯팅한 실시예 8의 각 접합 입자 농도의 용량 반응 곡선.

도 10은 지시 대역에서 생성된 세기(즉, 랜 스코어)를 CRP 농도에 대해 플롯팅한 실시예 8의 각 접합 입자 농도의 용량 반응 곡선.

도 11은 금 입자 크기 40 nm, 접합체 광학 밀도 1.0, 항체 라인 농도 0.5 mg/ml 및 CRP 라인 농도 0.5 mg/ml의 경우에 대해서 검출 대역 및 지시 대역의 랜 스코어를 CRP 농도에 대해 플롯팅한 실시예 9의 용량 반응 곡선.

도 12는 금 입자 크기 60 nm, 접합체 광학 밀도 1.0, 항체 라인 농도 0.5 mg/ml 및 CRP 라인 농도 0.5 mg/ml의 경우에 대해서 검출 대역 및 지시 대역의 랜 스코어를 CRP 농도에 대해 플롯팅한 실시예 9의 용량 반응 곡선.

도 13은 금 입자 크기 40 nm, 접합체 광학 밀도 1.0, 항체 라인 농도 0.1 mg/ml 및 CRP 라인 농도 0.5 mg/ml의 경우에 대해서 검출 대역 및 지시 대역의 랜 스코어를 CRP 농도에 대해 플롯팅한 실시예 9의 용량 반응 곡선.

도 14는 금 입자 크기 60 nm, 접합체 광학 밀도 1.0, 항체 라인 농도 0.5 mg/ml 및 CRP 라인 농도 0.5 mg/ml의 경우에 대해서 검출 대역 및 지시 대역의 랜 스코어를 CRP 농도에 대해 플롯팅한 실시예 9의 용량 반응 곡선.

도 15는 금 입자 크기 40 nm, 접합체 광학 밀도 2.5, 항체 라인 농도 0.1 mg/ml 및 CRP 라인 농도 0.5 mg/ml의 경우에 대해서 검출 대역 및 지시 대역의 랜 스코어를 CRP 농도에 대해 플롯팅한 실시예 9의 용량 반응 곡선.

본 명세서 및 도면에서 참조 부호의 반복 사용은 본 발명의 동일 또는 유사 특징 또는 요소를 나타내는 것을 의도한다.

표적인 실시태양에 대한 상세한 설명

정의

본원에서 사용되는 "분석물질"이라는 용어는 일반적으로 검출될 물질을 의미한다. 예를 들어, 분석물질은 항원 물질, 합텐, 항체 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 분석물질은 독소, 유기 화합물, 단백질, 펩티드, 미생물, 아미노산, 핵산, 호르몬, 스테로이드, 비타민, 약물(치료 목적으로 투여되는 것 뿐만 아니라 불법적인 목적으로 투여되는 것들도 포함함), 약물 중간체 또는 부산물, 박테리아, 바이러스 입자, 및 상기 물질 어느 것이든 그의 대사산물 또는 그에 대한 항체를 포함하지만, 이들에 제한되지는 않는다. 몇몇 분석물질의 특이적인 예는 페리틴, 크레아티닌 키나제 MB(CK-MB), 디곡신, 페니토인, 페노바르비톨, 카르밤아제핀, 반코마이신, 젠타마이신, 테오필린, 발프로산, 퀴니딘, 황체 형성 호르몬(LH), 여포 자극 호르몬 (FSH), 에스트라디올, 프로게스테론, C-반응성 단백질, 리포칼린, IgE 항체, 사이토킨, 비타민 B2 마이크로글로블린, 당화 헤모글로빈(Gly. Hb), 코르티졸, 디지톡신, N-아세틸프로카인아미드(NAPA), 프로카인아미드, 루벨라에 대한 항체, 예를 들어 루벨라-IgG 및 루벨라 IgM, 톡소포자충증에 대한 항체, 예를 들어 톡소포자충증 IgG (Toxo-IgG) 및 톡소포자충증 IgM (Toxo-IgM), 테스토스테론, 살리실레이트, 아세트아미노펜, B형 간염 바이러스 표면 항원(HBsAg), B형 간염 중심 항원에 대한 항체, 예를 들어 항-B형 간염 중심 항원 IgG 및 IgM(Anti-HBC), 사람 면역 결핍 바이러스 1 및 2 (HIV 1 및 2), 사람 T-세포 백혈병 바이러스 1 및 2 (HTLV), B형 간염 e항원(HBeAg), B형 간염 e항원에 대한 항체(Anti-HBe), 인플루엔자 바이러스, 갑상선 자극 호르몬(TSH), 티록신(T4), 총 트리요오도티로닌(Total T3), 유리 트리요오도티로닌(Free T3), 암배아 항원 (CEA), 지단백질, 콜레스테롤 및 트리글리세리드 및 알파 태아 단백질(AFP)을 포함하지만, 이들에 제한되지는 않는다. 남용 약물 및 통제된 물질은 암페타민; 메탐페타민; 바르비투레이트, 예를 들어 아모바르비탈, 세코바르비탈, 펜토바르비탈, 페노바르비탈 및 바르비탈; 벤조디아제핀, 예를 들어 리브륨 및 발륨; 카나비노이드, 예를 들어 해시시 및 마리화나; 코카인; 펜타닐; LSD; 메타쿠알론; 아편제, 예를 들어 헤로인, 몰핀, 코데인, 히드로모르폰, 히드로코돈, 메타돈, 옥시코돈, 옥시모르폰 및 아편; 펜시클리딘 및 프로폭시헨을 포함하지만, 이들로 제한하려는 의도는 없다. 다른 가능성 있는 분석물질은 에버하르트(Everhart) 등의 미국 특허 6,436,651 및 톰(Tom) 등의 미국 특허 4,366,241에 기술되어 있다.

본원에서 사용되는 "시험 샘플"이라는 용어는 일반적으로 분석물질을 함유하는 것으로 의심되는 생물학적 물질을 의미한다. 시험 샘플은 혈액, 간질액, 타액, 접안 렌즈 유체, 뇌척수액, 땀, 소변, 젖, 복수, 점액, 비강 유체(nasal fluid), 객혈, 관절혈액, 복강액, 질액, 월경분비물, 양수, 정액 및 기타 등등을 포함하여 생리적 유체와 같은 어떠한 생물학적 공급원으로부터도 유래될 수 있다. 생리학적 유체 이외에, 환경 또는 식품 제조 분석 측정을 수행하기 위해 물, 식품 및 기타 등등과 같은 다른 액체 샘플도 이용될 수 있다. 추가로, 분석물질을 함유하는 것으로 의심되는 고체 물질이 시험 샘플로 사용될 수 있다. 시험 샘플은 생물학적 공급원으로부터 얻은 대로 직접 사용할 수 있거나, 또는 샘플의 특성을 개질하는 사전 처리 후에 사용할 수 있다. 예를 들어, 이러한 사전 처리는 혈액으로부터 혈장 준비, 점성 유체 희석 및 기타 등등을 포함할 수 있다. 또한, 사전 처리 방법은 여과, 침전, 희석, 증류, 혼합, 농축, 간섭 성분의 불활성화, 시약 첨가, 용해(lysis) 등을 포함할 수 있다. 게다가, 또한, 액체 매질을 형성하거나 또는 분석물질을 방출하기 위해 고체 시험 샘플을 변형하는 것도 유익할 수 있다.

상세한 설명

이제, 본 발명의 다양한 실시태양을 상세히 언급할 것이고, 그들의 하나 이상의 예가 아래에 나타나 있다. 각 예는 본 발명을 제한하는 것이 아니라 본 발명을 설명하기 위해 제공된 것이다. 사실상, 당업계 숙련자에게는 본 발명의 범위 또는 정신에서 벗어남이 없이 본 발명에 다양한 변형 및 변화를 가할 수 있다는 것이 명백할 것이다. 예를 들어, 한 실시태양의 부분으로서 예시되거나 또는 기술된 특징들은 다른 한 실시태양에 이용되어 추가의 한 실시태양을 만들 수 있다. 따라서, 본 발명은 첨부된 특허 청구의 범위 및 그의 균등물 내에 있는 이러한 변형 및 변화를 포함하는 것을 의도한다.

일반적으로, 본 발명은 시험 샘플 내의 분석물질의 존재 유무 또는 양을 검출하기 위한 측방 유동 분석 측정 기구에 관한 것이다. 이 기구는 다수의 대역을 이용하고, 그 중 하나가 시험 샘플 내의 분석물질이 "후크 효과" 영역 내에 있는지의 여부에 관한 지시자로서 기능을 한다. 이 지시를 토대로, 측정된 신호 세기를 분석물질 농도 또는 농도범위와 상관시키는 기술을 선택할 수 있다. 예를 들어, 시험 샘플이 "후크 효과" 영역 밖에 있다고 결정될 때는, 분석물질 농도를 용량 반응 곡선의 한 부분을 이용해서 결정할 수 있다. 다른 한편, 시험 샘플이 "후크 효과" 농도 내에 있다고 결정될 때는, 분석물질 농도를 용량 반응 곡선의 다른 한 부분을 이용해서 결정할 수 있다. 별법으로, 샘플은 분석 측정을 재수행하기 위해 간단히 희석할 수 있다. 본 발명자들은 이러한 검출 기술이 분석물질이 어떠한 농도로 존재하든 분석물질을 간단하고 빠르고 정확하게 검출할 수 있다는 것을 발견하였다.

이제, 예를 들어, 도 1를 참고로 하여, 본 발명에 따라 형성될 수 있는 측방 유동 분석 측정 기구 (20)의 한 실시태양을 더 상세하게 기술할 것이다. 나타낸 바와 같이, 기구 (20)은 강직성 지지 물질 (21)에 의해 임의로 지지된 다공성 막 (23)을 함유한다. 일반적으로, 다공성 막 (23)은 시험 샘플이 통과할 수 있는 어떠한 다양한 물질로도 제조될 수 있다. 예를 들어, 다공성 막 (23)을 형성하는 데 이용되는 물질은 천연, 합성, 또는 합성에 의해 변형된 천연 발생 물질, 예를 들어 폴리사카라이드(예: 셀룰로오스 물질, 예를 들어 종이 및 셀룰로오스 유도체, 예를 들어 셀룰로오스 아세테이트 및 니트로셀룰로오스); 폴리에테르 술폰; 폴리에틸렌; 나일론; 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF); 폴리에스테르; 폴리프로필렌; 실리카; 비닐 클로라이드, 비닐 클로라이드-프로필렌 공중합체 및 비닐 클로라이드-비닐 아세테이트 공중합체와 같은 중합체와 함께 다공성 중합체 매트릭스에 균일하게 분산된 무기 물질, 예를 들어 불활성화된 알루미나, 규조토, MgSO₄, 또는 다른 무기 미분 물질; 자연 발생(예: 면) 및 합성(예: 나일론 또는 레이온) 천; 다공성 겔, 예를 들어 실리카겔, 아가로스, 덱스트란 및 젤라틴; 중합체 필름, 예를 들어 폴리아크릴아미드; 및 기타 등등을 포함할 수 있지만, 이들에 제한되지는 않는다. 특별한 한 실시태양에서, 다공성 막 (23)은 니트로셀룰로오스 및/또는 폴리에테르 술폰 물질로부터 형성된다. "니트로셀룰로오스"라는 용어는 니트로셀룰로오스 단독일 수 있는 셀룰로오스의 질산 에스테르, 또는 질산 및 다른 산, 예를 들어 탄소원자 수 1 내지 7의 지방족 카르복실산의 혼합 에스테르를 의미한다는 것을 이해해야 한다.

다공성 막 (23)의 크기 및 모양은 당업계 숙련자들이 쉽게 인식하는 바와 같이 일반적으로 다양할 수 있다. 예를 들어, 다공성 막 스트립의 길이는 약 10 내지 약 100 mm, 몇몇 실시태양에서는 약 20 내지 약 80 mm, 몇몇 실시태양에서는 약 40 내지 약 60 mm일 수 있다. 또한, 막 스트립의 폭은 약 0.5 내지 약 20 mm, 몇몇 실시태양에서는 약 1 내지 약 15 mm, 몇몇 실시태양에서는 약 2 내지 약 10 mm의 범위일 수 있다. 마찬가지로, 막 스트립의 두께는 일반적으로 투과 기반 검출을 허용하기에 충분할 정도로 작다. 예를 들어, 막 스트립의 두께는 약 500 ㎛ 미만, 몇몇 실시태양에서는 약 250 ㎛ 미만, 몇몇 실시태양에서는 약 150 ㎛ 미만일 수 있다.

상기한 바와 같이, 지지체 (21)은 다공성 막 (23)을 운반한다. 예를 들어, 지지체 (21)은 도 1에 나타낸 바와 같이 다공성 막 (23)에 바로 인접해서 위치할 수 있거나, 또는 1 개 이상의 개재 층이 다공성 막 (23)과 지지체 (21) 사이에 위치할 수 있다. 어느 경우이든 상관없이, 지지체 (21)은 일반적으로 다공성 막 (23)을 운반할 수 있는 어떠한 물질로도 형성될 수 있다. 지지체 (21)은 빛에 대해 투과성인 물질, 예를 들어 투명하거나 또는 광학적으로 확산성인(예: 반투명) 물질로부터 형성될 수 있다. 또, 일반적으로 지지체 (21)은 막 (23)을 통해 유동하는 유체가 지지체 (21)을 통해 누출되지 않도록 액체 불투과성인 것이 요망된다. 지지체를 위한 적당한 물질의 예는 유리; 중합체 물질, 예를 들어 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르(예: 마일러(등록상표)(Mylar®) 필름), 폴리부타디엔, 폴리비닐클로라이드, 폴리아미드, 폴리카르보네이트, 에폭시드, 메타크릴레이트 및 폴리멜라민; 및 기타 등등을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 다공성 막 (23)에 충분한 구조적 뒷받침을 제공하기 위해, 지지체 (21)은 일반적으로 일정한 최소 두께를 갖도록 선택된다. 마찬가지로, 지지체 (21)의 두께는 전형적으로 그의 광학 성질에 악영향을 미칠 정도로 크지는 않다. 따라서, 예를 들어, 지지체 (21)은 약 100 내지 약 5,000 ㎛, 몇몇 실시태양에서는 약 150 내지 약 2,000 ㎛, 몇몇 실시태양에서는 약 250 내지 약 1,000 ㎛ 범위의 두께를 가질 수 있다. 예를 들어, 약 125 ㎛의 두께를 갖는 적당한 막 스트립은 밀리포어 코프(Millipore Corp.)(미국 매사추세츠주 베드포드)로부터 "SHF180UB25"라는 상표명으로 얻을 수 있다.

당업계에 잘 알려진 바와 같이, 다공성 막 (23)은 지지체 (21) 상에 캐스팅될 수 있고, 이 경우에는 얻어진 라미네이트를 요망되는 크기 및 모양으로 다이 컷팅할 수 있다. 별법으로, 다공성 막 (23)은 예를 들어 접착제를 이용해서 지지체 (21)과 간단히 적층시킬 수 있다. 몇몇 실시태양에서는, 니트로셀룰로오스 또는 나일론 다공성 막이 마일러(등록상표) 필름에 고착된다. 막을 마일러(등록상표) 필름에 결합시키는 데는 감압 접착제와 같은 접착제가 사용된다. 이러한 유형의 라미네이트 구조는 밀리포어 코프.(미국 매사추세츠주 베드포드)로부터 상업적으로 입수가능한 것으로 믿어진다. 적당한 라미네이트 분석 측정 기구 구조의 다른 예는 덜리 3세(Durley, III) 등의 미국 특허 5,075,077에 기술되어 있고, 이 문헌은 전체를 모든 목적으로 본원에 참고로 혼입한다.

또, 기구 (20)은 흡수 패드 (28)을 함유할 수도 있다. 흡수 패드 (28)은 일반적으로 전체 다공성 막 (23)을 통해 이동하는 유체를 받아들인다. 당업계에 잘 알려진 바와 같이, 흡수 패드 (28)은 막 (23)을 통한 모세관 작용 및 유체 유동을 촉진하는 데 도움을 줄 수 있다.

시험 샘플 내의 분석물질 검출을 개시하기 위해, 사용자는 시험 샘플을 다공성 막 (23)의 일부에 직접 적용할 수 있고, 이어서 그를 통해 시험 샘플이 도 1에 화살표 "L"로 나타낸 방향으로 이동할 수 있다. 별법으로, 시험 샘플을 먼저 다공성 막 (23)과 유체 소통이 이루어지는 샘플 패드 (나타내지 않음)에 적용할 수 있다. 샘플 패드를 형성하는 데 사용될 수 있는 몇몇 적당한 물질은 니트로셀룰로오스, 셀룰로오스, 다공성 폴리에틸렌 패드 및 유리 섬유 필터 종이를 포함하지만, 이들에 제한되는 것은 아니다. 요망되는 경우, 또한 샘플 패드는 거기에 확산적 또는 비확산적으로 부착된 1 개 이상의 분석 측정 사전처리 시약을 함유할 수 있다.

도시된 실시태양에서, 시험 샘플은 샘플 패드(나타내지 않음)로부터 샘플 패드의 한쪽 말단과 소통이 이루어지게 놓인 접합 패드 (22)로 이동한다. 접합 패드 (22)는 시험 샘플이 통과할 수 있는 물질로부터 형성된다. 예를 들어, 한 실시태양에서, 접합 패드 (22)는 유리 섬유로부터 형성된다. 오직 1 개의 접합 패드 (22)만 나타내었지만, 본 발명에서는 또한 다수의 접합 패드도 사용할 수 있다는 것을 이해해야 한다.

시험 샘플 내의 분석물질의 존재 또는 부재에 대한 정확한 검출을 촉진하기 위해, 예정된 양의 검출 프로브를 기구 (20)의 다양한 위치에 적용한다. 일반적으로 시각에 의해 또는 기기로 검출될 수 있는 신호를 생성할 수 있는 어떠한 물질이라도 검출 프로브로 사용될 수 있다. 적당한 검출가능 물질은 예를 들어 발광 화합물(예: 형광, 인광 등); 방사활성 화합물; 시각에 호소하는 화합물(예: 착색된 염료 또는 금속 물질, 예를 들어 금); 리포좀, 또는 신호 생성 물질을 함유하는 다른 소포; 효소 및/또는 기질 및 기타 등등을 포함할 수 있다. 다른 적당한 검출가능 물질은 조우(Jou) 등의 미국 특허 5,670,381 및 타르카(Tarcha) 등의 미국 특허 5,252,459에 기술되어 있고, 이들 문헌은 전체를 모든 목적으로 본원에 참고로 혼입한다. 검출가능 물질이 착색된 경우, 이상적인 전자기 복사선은 상보적인 파장을 갖는 빛이다. 예를 들어, 청색 검출 프로브는 적색 빛을 강력하게 흡수한다.

몇몇 실시태양에서, 검출가능 물질은 광학적으로 검출가능한 신호를 생성하는 발광 화합물일 수 있다. 예를 들어, 적당한 형광 분자는 플루오레세인, 유로퓸 킬레이트, 피코빌리프로테인, 로다민, 및 이들의 유도체 및 유사체를 포함할 수 있지만, 이들에 제한되는 것은 아니다. 다른 적당한 형광 화합물은 "양자점"이라고 흔히 불리는 반도체 나노 결정이다. 예를 들어, 이러한 나노 결정은 화학식 CdX(여기서, X는 Se, Te, S 및 기타 등등임)의 핵을 함유할 수 있다. 또한, 나노 결정은 그 위를 덮는 화학식 YZ(여기서, Y는 Cd 또는 Zn이고, Z는 S 또는 Se임)의 껍질로 패시베이션(passivation)될 수 있다. 또한, 적당한 반도체 나노 결정의 다른 예는 바버라-귈렘(Barbera-Guillem) 등의 미국 특허 6,261,779 및 다프리치(Dapprich)의 미국 특허 6,585,939에 기술되어 있고, 이들 문헌은 전체를 모든 목적으로 본원에 참고로 혼입한다.

게다가, 적당한 인광 화합물은 1 개 이상의 금속, 예를 들어 루테늄, 오스뮴, 레늄, 이리듐, 로듐, 백금, 인듐, 팔라듐, 몰리브덴, 테크네튬, 구리, 철, 크롬, 텅스텐, 아연 및 기타 등등의 금속 착물을 포함할 수 있다. 루테늄, 레늄, 오스뮴, 백금 및 팔라듐이 특히 바람직하다. 금속 착물은 수성 또는 비수성 환경에서 착물의 용해도를 촉진하는 1 개 이상의 리간드를 함유할 수 있다. 예를 들어, 리간드의 몇몇 적당한 예는 피리딘, 피라진, 이소니코틴아미드, 이미다졸, 비피리딘(bipyridine), 테르피리딘, 펜안트롤린, 디피리도펜아진, 포르피린, 포르핀, 및 이들의 유도체를 포함하지만, 이들에 제한되는 것은 아니다. 이러한 리간드는 예를 들어 알킬, 치환 알킬, 아릴, 치환 아릴, 아랄킬, 치환 아랄킬, 카르복실레이트, 카르복스알데히드, 카르복스아미드, 시아노, 아미노, 히드록시, 이미노, 히드록시카르보닐, 아미노카르보닐, 아미딘, 구아니디늄, 우레이드, 황 함유 기, 인 함유 기, 및 N-히드록시숙신이미드의 카르복실레이트 에스테르일 수 있다.

포르피린 및 포르핀 금속 착물은 메틸렌 브리지와 함께 커플링되어 금속 킬레이트화 내부 공동(cavity)을 갖는 시클릭 구조를 형성하는 피롤기를 갖는다. 이들 분자 중 많은 분자가 적당한 용매(예: 물) 및 무산소 환경에서 실온에서 강한 인광 성질을 나타낸다. 인광 성질을 나타낼 수 있는 몇몇 적당한 포르피린 착물은 백금(II) 코프로포르피린-I 및 III, 팔라듐(II) 코프로포르피린, 루테늄 코프로포르피린, 아연(II)-코프로포르피린-I, 그의 유도체 및 기타 등등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 마찬가지로, 인광 성질을 나타낼 수 있는 몇몇 적당한 포르핀 착물은 백금(II) 테트라-메소-플루오로페닐포르핀 및 팔라듐(II) 테트라-메소-플루오로페닐포르핀을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 다른 적당한 포르피린 및/또는 포르핀 착물은 쉬미트(Schmidt) 등의 미국 특허 4,614,723, 헨드릭스(Hendrix) 등의 미국 특허 5,464,741, 소이니(Soini)의 미국 특허 5,518,883, 에워트(Ewart) 등의 미국 특허 5,922,537, 새그너(Sagner) 등의 미국 특허 6,004,530, 및 포노마레브(Ponomarev) 등의 미국 특허 6,582,930에 기술되어 있고, 이들 문헌은 전체를 모든 목적으로 본원에 참고로 혼입한다.

또한, 비피리딘 금속 착물도 인광 화합물로서 이용될 수 있다. 적당한 비피리딘 착물의 몇 가지 예는 비스[(4,4'-카르보메톡시)-2,2'-비피리딘] 2-[3-(4-메틸-2,2'-비피리딘-4-일)프로필]-1,3-디옥솔란 루테늄(II), 비스(2,2'-비피리딘)[4-(부탄-1-알)-4'-메틸-2,2'-비피리딘]루테늄(II), 비스(2,2'-비피리딘)[4-(4'-메틸-2,2'-비피리딘-4'-일)-부티르산]루테늄(II), 트리스(2,2'-비피리딘)루테늄(II), (2,2'-비피리딘)[비스-비스(1,2-디페닐포스피노)에틸렌] 2-[3-(4-메틸-2,2'-비피리딘-4'-일)프로필]-1,3-디옥솔란 오스뮴(II), 비스(2,2'-비피리딘)[4-(4'-메틸-2,2'-비피리딘)-부틸아민]루테늄(II), 비스(2,2'-비피리딘)[1-브로모-4(4'-메틸-2,2'-비피리딘-4-일)부탄]루테늄(II), 비스(2,2'-비피리딘)말레이미도헥산산, 4-메틸-2,2'-비피리딘-4'-부틸아미드 루테늄(II) 및 기타 등등을 포함하지만, 이들에 제한되지는 않는다. 인광 성질을 나타낼 수 있는 다른 적당한 금속 착물은 리취터(Richter) 등의 미국 특허 6,613,583, 매세이(Massey) 등의 미국 특허 6,468,741, 미드(Meade) 등의 미국 특허 6,444,423, 매세이 등의 미국 특허 6,362,011, 바드(Bard) 등의 미국 특허 5,731,147 및 매세이 등의 미국 특허 5,591,581에 기술되어 있고, 이들 문헌은 전체를 본원에 참고로 혼입한다.

몇몇 경우, 발광 화합물은 상대적으로 긴 방출 수명을 가질 수 있고, 상대적으로 큰 "스토크스 편이"(Stokes shift)를 가질 수 있다. "스토크스 편이"라는 용어는 일반적으로 발광 복사선의 스펙트럼 선 또는 밴드가 여기 선 또는 밴드보다 더 긴 방출 파장으로 이동하는 것으로 정의된다. 상대적으로 큰 스토크스 편이는 발광 화합물의 여기 파장이 그의 방출 파장으로부터 멀리 떨어져 있는 것을 허용하고, 이것은 여기 파장과 방출 파장 사이의 큰 차로 인해 반사된 여기 복사선을 방출된 신호로부터 제거하기가 더 쉬워지기 때문에 바람직하다. 게다가, 큰 스토크스 편이는 또한 샘플 중의 발광 분자로부터의 간섭 및/또는 일부 체액(예: 혈액)과 함께 존재하는 단백질 또는 콜로이드로 인한 빛 산란을 최소화한다. 게다가, 큰 스토크스 편이는 또한 배경 간섭을 제거하기 위한 값비싼 고정밀 필터에 대한 요건을 최소화한다. 예를 들어, 몇몇 실시태양에서, 발광 화합물은 약 50 nm 초과, 몇몇 실시태양에서는 약 100 nm 초과, 몇몇 실시태양에서는 약 100 내지 약 350 nm의 스토크스 편이를 갖는다.

예를 들어, 큰 스토크스 편이를 갖는 예시적인 형광 화합물은 사마륨(Sm(III)), 디스프로슘(Dy(III)), 유로퓸(Eu(III)) 및 테르븀(Tb(III))의 란탄족 킬레이트를 포함한다. 이러한 킬레이트는 실질적으로 더 짧은 파장에서 킬레이트 여기 후 강하게 적색 편이되고 좁은 밴드를 가지고 긴 수명을 갖는 방출을 나타낸다. 전형적으로, 킬레이트는 분자 내에서 란탄족에 가까이 위치한 발색단 때문에 강한 자외선 여기 밴드를 갖는다. 발색단에 의한 여기 후, 여기 에너지가 여기된 발색단으로부터 란탄족으로 옮겨질 수 있다. 이에 뒤따라서 란탄족의 형광 방출 특성이 일어난다. 예를 들어, 플루오레세인의 경우 스토크스 편이가 불과 약 28 nm인 것에 비해 유로퓸 킬레이트는 약 250 내지 약 350 nm의 스토크스 편이를 갖는다. 유로퓸 킬레이트의 형광의 수명은, 다른 형광 라벨의 경우 약 1 내지 약 100 나노초인 것에 비해, 약 100 내지 약 1000 마이크로초로 길다. 추가로, 이들 킬레이트는 좁은 방출 스펙트럼을 가지고, 전형적으로 약 50% 방출에서 약 10 nm 미만의 밴드 폭을 갖는다. 적당한 유로퓸 킬레이트는 N-(p-이소티오시아나토벤질)-디에틸렌 트리아민 테트라아세트산-Eu⁺³이다.

게다가, 수용액 또는 수현탁액에서 제한된 용해도 및 켄칭 문제를 갖는 킬레이트를 보호하기 위해 종종 사용되는 마이셀 형성 시약의 필요성을 부인하기 위해 본 발명에서는 불활성이고 안정하며 수용액 또는 수현탁액에서 고유적으로 형광성인 란탄족 킬레이트가 이용될 수 있다. 이러한 킬레이트의 한 예는 4-[2-(4-이소티오시아네이토페닐)에티닐]-2,6-비스([N,N-비스(카르복시메틸)아미노]메틸)-피리딘[참조: 러브그렌, 티.(Lovgren, T.) 등; Clin. Chem. 42, 1196-1201 (1996)]이다. 몇 가지 란탄족 킬레이트도 또한 예상 밖으로 높은 신호 대 노이즈 비를 나타낸다. 예를 들어, 이러한 킬레이트 중 하나는 네자리 β-디케토네이트-유로퓸 킬레이트[참조: 유안, 제이.(Yuan, J.) 및 매츄모토, 케이.(Matsumoto, K.); Anal. Chem. 70, 596-601 (1998)]이다. 상기한 형광 라벨 이외에도, 본 발명에 사용하기에 적당한 다른 라벨은 물리낵스(Mullinax) 등의 미국 특허 6,030,840; 데이비드슨(Davidson)의 미국 특허 5,585,279; 싱거(Singer) 등의 미국 특허 5,573,909; 위에더(Wieder) 등의 미국 특허 6,242,268; 및 헤밀라(Hemmila) 등의 미국 특허 5,637,509에 기술되어 있고, 이들 문헌은 전체를 모든 목적으로 본원에 참고로 혼입한다.

상기한 것과 같은 검출 가능 물질은 단독으로 또는 입자(때때로, "비드" 또는 "마이크로비드"라고 부름)와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 자연 발생 입자, 예를 들어 핵, 마이코플라즈마, 플라스미드, 플라스티드, 포유동물 세포(예: 적혈구 고스트), 단세포 미생물(예: 박테리아), 폴리사카라이드(예: 아가로스) 등이 이용될 수 있다. 게다가, 합성 입자도 이용될 수 있다. 예를 들어, 한 실시태양에서는, 형광 또는 착색 염료로 표지된 라텍스 마이크로입자가 이용된다. 본 발명에서는 어떠한 합성 입자라도 사용할 수 있지만, 입자는 전형적으로 폴리스티렌, 부타디엔 스티렌, 스티렌아크릴-비닐 삼원공중합체, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리에틸메타크릴레이트, 스티렌-무수 말레산 공중합체, 폴리비닐 아세테이트, 폴리비닐피리딘, 폴리디비닐벤젠, 폴리부틸렌테레프탈레이트, 아크릴로니트릴, 비닐클로라이드-아크릴레이트 및 기타 등등, 또는 그의 알데히드, 카르복실, 아미노, 히드록실 또는 히드라지드 유도체로부터 형성된다. 다른 적당한 입자는 조우(Jou) 등의 미국 특허 5,670,381, 타르카(Tarcha) 등의 미국 특허 5,252,459, 및 보드진(Bodzin) 등의 미국 특허 공개 2003/0139886에 기술되어 있고, 이들 문헌은 전체를 모든 목적으로 본원에 참고로 혼입한다. 적당한 형광 입자의 상업적으로 입수가능한 예는 몰레큘라 프로브즈, 인크. (Molecular Probes, Inc.)에서 판매하는 상표명 "플루오스피어"(FluoShpere) (레드 580/605) 및 "트랜스플루오스피어" (TransfluoSphere) (543/620), 뿐만 아니라 "텍사스 레드" 및 5- 및 6-카르복실테트라메틸로다민(이들도 또한 몰레큘라 프로브즈, 인크에서 판매함)의 형광 카르복실화 미소구체를 포함한다. 게다가, 적당한 착색 라텍스 마이크로입자의 상업적으로 입수가능한 예는 뱅즈 래보라토리, 인크.(Bang's Laboratory, Inc.)에서 판매하는 카르복실화 라텍스 비드를 포함한다. 또한, 금속 입자(예: 금 입자)도 본 발명에 이용될 수 있다.

입자가 이용될 때, 입자의 모양은 일반적으로 다양할 수 있다. 예를 들어, 한 실시태양에서는 입자 모양이 구형이다. 그러나, 본 발명에서는 또한 플레이트, 로드(rod), 디스크, 바아(bar), 튜브, 불규칙적 모양 등과 같은 다른 모양도 고려된다는 것을 이해해야 한다. 추가로, 입자 크기도 또한 다양할 수 있다. 예를 들어, 입자의 평균 크기(예: 직경)는 약 0.1 nm 내지 약 100 ㎛, 몇몇 실시태양에서는 약 1 nm 내지 약 10 ㎛, 몇몇 실시태양에서는 약 10 내지 약 100 nm 범위일 수 있다.

몇몇 경우에서는, 검출 프로브를 그들이 분석물질과 더 쉽게 결합할 수 있도록 몇몇 방식으로 검출 프로브를 개질하는 것이 요망될 수 있다. 이러한 경우, 검출 프로브는 거기에 부착되어 접합 프로브를 생성하는 일정한 특이적 결합 구성원으로 개질시켜서 접합된 프로브를 생성할 수 있다. 특이적 결합 구성원은 일반적으로 특이적 결합 쌍, 즉 분자들 중 하나가 다른 한 분자와 화학적 및/또는 물리적으로 결합하는 2 개의 상이한 분자로 된 구성원을 의미한다. 예를 들어, 면역반응성 특이적 결합 구성원은 재조합 DNA 방법 또는 펩티드 합성에 의해 형성된 것들을 포함해서 항원, 합텐, 앱타머, 항체(일차 또는 이차) 및 이들의 복합체를 포함할 수 있다. 항체는 단일 클론 항체 또는 다클론 항체, 재조합 단백질 또는 이들의 혼합물(들) 또는 단편(들), 뿐만 아니라 항체 및 다른 특이적 결합 구성원의 혼합물일 수 있다. 이러한 항체의 제조 및 특이적 결합 구성원으로서의 이용 적합성에 관한 상세한 사항은 당업계 숙련자에게 잘 알려져 있다. 다른 흔한 특이적 결합 쌍은 비오틴과 아비딘(또는 그의 유도체), 비오틴과 스트렙타비딘, 탄수화물과 렉틴, 상보적 뉴클레오티드 서열(표적 핵산 서열을 검출하기 위해 DNA 혼성화 분석 측정에 사용되는 프로브 및 포획 핵산 서열을 포함함), 재조합 방법에 의해 형성된 것들을 포함하는 상보적 펩티드 서열, 효과기와 수용체 분자, 호르몬과 호르몬 결합 단백질, 효소 보조인자와 효소, 효소 억제제와 효소, 및 기타 등등을 포함하지만, 이들에 제한되지는 않는다. 게다가, 특이적 결합 쌍은 원래의 특이적 결합 구성원의 유사체인 구성원을 포함할 수 있다. 예를 들어, 분석물질과 공통인 1 개 이상의 에피톱을 갖는 한, 분석물질의 유도체 또는 단편(즉, "유사체")이 이용될 수 있다.

특이적 결합 구성원은 일반적으로 다양한 잘 알려진 기술 중 어느 것을 이용해서도 검출 프로브에 부착될 수 있다. 예를 들어, 검출 프로브(예: 입자)에 대한 특이적 결합 구성원의 공유결합 부착은 카르복실, 아미노, 알데히드, 브로모아세틸, 요오도아세틸, 티올, 에폭시 및 다른 반응성 또는 연결 관능기, 뿐만 아니라 단백질 커플링 반응이 달성될 수 있는 잔류 유리 라디칼 및 라디칼 양이온을 이용해서 달성될 수 있다. 또한, 검출 프로브의 표면이 상대적으로 높은 표면 농도의 극성기를 함유할 수 있기 때문에 표면 관능기가 관능화된 공단량체로서 혼입될 수 있다. 게다가, 검출 프로브는 폴리(티오페놀)처럼 합성 후 관능화되는 경우도 종종 있지만, 추가의 개질을 필요로 하지 않고도 단백질과 직접 공유결합 연결을 할 수도 있다. 예를 들어, 한 실시태양에서, 접합의 제 1 단계는 카르보디이미드를 사용하여 프로브 표면 상의 카르복실기를 활성화하는 것이다. 제 2 단계에서는, 활성화된 카르복실산기가 항체의 아미노기와 반응하여 아미드 결합을 형성한다. 활성화 및/또는 항체 커플링은 완충제, 예를 들어 인산염 완충 염수(PBS)(예: pH 7.2) 또는 2-(N-모르폴리노)에탄 술폰산(MES)(예: pH 5.3)에서 일어날 수 있다. 이어서, 얻은 검출 프로브를 예를 들어 에탄올아민과 접촉시켜서 남아 있는 어떠한 활성화 부위도 차단한다. 종합적으로 볼 때, 이 방법은 항체가 프로브에 공유 결합에 의해 부착된 접합된 검출 프로브를 형성한다. 공유 결합 이외에도 물리적 흡착과 같은 다른 부착 기술도 본 발명에 이용할 수 있다.

다시, 도 1을 참고하면, 다공성 막 (23)은 이 분석 측정을 수행하도록 구성된 다양한 대역을 한정한다. 예를 들어, 다공성 막 (23)은 제 1 수용 물질을 함유하는 검출 대역 (31)을 한정한다. 제 1 수용 물질은 다공성 막 (23) 상에 고정화되고, 예를 들어 항원; 합텐; 항체 결합 단백질, 예를 들어 단백질 A, 단백질 G 또는 단백질 A/G; 뉴트라비딘(탈글리코실화 아비딘 유도체), 아비딘(고도의 양이온성 66,000-달톤 당단백질), 스트렙타비딘(비글리코실화 52,800-달톤 단백질), 또는 캡타비딘(니트로화 아비딘 유도체); 일차 또는 이차 항체 및 그의 유도체 또는 단편을 포함하여 상기한 특이적 결합 구성원과 동일한 물질로부터 선택될 수 있다. 한 실시태양에서, 예를 들어 제 1 수용 물질은 시험 샘플 내의 항원에 대해 특이적인 항체이다. 제 1 수용 물질은 분석물질과 접합된 검출 프로브 사이에 형성된 복합체의 정지 결합 부위로서 기능을 한다. 구체적으로 말하면, 분석물질, 예를 들어 항체, 항원 등은 전형적으로 2 개 이상의 결합 부위(예: 에피톱)을 갖는다. 검출 대역 (31)에 도달할 때, 이들 결합 부위 중 하나는 접합된 프로브의 특이적 결합 구성원이 차지한다. 그러나, 분석물질의 유리 상태 결합 부위는 고정화된 제 1 수용 물질에 결합할 수 있다. 고정화된 수용 물질에 결합할 때, 복합체화된 프로브는 새로운 삼원 샌드위치 복합체를 형성한다.

또한, 분석 측정 기구 (20)은 검출 대역 (31)로부터 하류에 위치하는 지시 대역 (35)를 함유한다. 지시 대역 (35)는 다공성 막 (23) 상에 고정화된 제 2 수용 물질을 함유한다. 제 2 수용 물질은 접합된 검출 프로브를 위한 정지 결합 부위로 기능한다. 지시 대역 (35) 내에서 요망되는 결합을 달성하기 위해, 일반적으로 제 2 수용 물질이 분석물질과 복합체화된 검출 프로브와 복합체화되지 않은 검출 프로브 사이를 구별할 수 있는 것이 요망된다. 예를 들어, 한 실시태양에서는, 제 2 수용 물질이 분석물질과 복합체화되지 않을 때 그것이 항체 접합체와 특이적 결합을 할 수 있도록, 제 2 수용 물질이 분석물질, 예를 들어 분석물질 분자 또는 그의 유도체 또는 단편(예: 유사체)과 공통인 1 개 이상의 에피톱을 갖는 분자를 포함한다.

별법으로, 제 2 수용 물질은 분석 분자 또는 그의 유사체는 아니지만 그럼에도 불구하고 복합체화되지 않은 접합된 검출 프로브에 우선적으로 결합할 수 있는 생물학적 물질을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 예를 들어, 제 1 수용 물질은 단일클론 항체, 예를 들어 항-CRP IgG₁일 수 있다. 검출 프로브는 항-CRP IgG₂와 같은 제 1 수용 물질의 단일클론 항체와 상이한 단일클론 항체와 접합된다. 이 특별한 실시태양에서, 제 2 수용 물질은 F_c 단편에 흡착되어서 오직 IgG의 F_ab 부분과 반응하는 고트 항-휴먼 IgG F(ab')₂와 같은 제 2 항체일 수 있다. 따라서, 분석물질이 존재하지 않을 때, 제 2 항체가 항-CRP IgG₂ 단일 클론 항체의 유리 상태 "F_ab" 결합 도메인에 결합할 수 있다. 그러나, 시험 샘플에 항원이 존재할 때, 그것은 먼저 항-CRP IgG₂ 단일클론 항체의 유리 상태 "F_ab" 결합 도메인과 복합체화된다. 항원의 존재로 "F_ab" 결합 도메인은 뒤따르는 제 2 항체와의 결합에 이용될 수 없게 된다. 이러한 방식에서는, 지시 대역 (35) 내의 제 2 항체가 복합체화되지 않은 검출 프로브와 우선적으로 결합할 수 있다.

검출 대역 (31) 및 지시 대역 (35)는 정확한 결과를 제공하지만, 때로는 실제 시험 조건 하에서 시험 샘플 내의 분석물질의 상대 농도를 결정하는 것이 어렵다. 따라서, 분석 측정 기구 (20)은 검정 대역 (32)를 포함할 수 있다. 이 실시태양에서, 검정 대역 (32)는 막 (23) 상에 형성되고, 검출 대역 (31) 및 지시 대역 (35)로부터 하류에 위치한다. 그러나, 별법으로, 검정 대역 (32)는 또한 검출 대역 (31) 및/또는 임의의 지시 대역 (35)로부터 상류에 위치할 수도 있다.

검정 대역 (32)에는 막 (23)의 길이를 통과하는 어떠한 검정 프로브와도 결합할 수 있는 제 3 수용 물질이 제공된다. 검정 프로브가 이용될 때, 검정 프로브는 검출 프로브에 사용되는 검출가능 물질과 동일하거나 또는 상이한 검출가능 물질을 함유할 수 있다. 게다가, 검정 프로브는 또한 상기한 바와 같이 특이적 결합 구성원과 접합될 수 있다. 예를 들어, 한 실시태양에서는, 비오티닐화된 검정 프로브가 사용될 수 있다. 일반적으로 말하면, 검정 프로브는 그것이 검출 대역 (31) 및 지시 대역 (35)에서 제 1 또는 제 2 수용 물질과 결합하지 않는 방식으로 선택된다. 검정 대역 (32)의 제 3 수용 물질은 검출 대역 (31) 또는 지시 대역 (35)에 사용되는 수용 물질과 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 예를 들어, 한 실시태양에서, 제 3 수용 물질은 항원, 합텐, 항체 결합 단백질(예: 단백질 A, 단백질 G, 또는 단백질 A/G), 뉴트라비딘, 아비딘, 스트렙타비딘, 캡타비딘, 일차 또는 이차 항체 또는 그의 복합체와 같은 생물학적 수용 물질이다. 또한, 송(Song) 등의 미국 특허 출원 공개 2003/0124739에 기술된 바와 같이 검정 대역 (32)의 제 3 수용 물질 (예: 고분자 전해질)에 다양한 비생물학적 물질을 이용하는 것이 요망될 수도 있고, 이 문헌은 전체를 모든 목적으로 본원에 참고로 혼입한다.

고분자 전해질이 이용될 때, 고분자 전해질은 순 양전하 또는 음전하 뿐만 아니라 일반적으로 중성인 순 전하도 가질 수 있다. 예를 들어, 순 양전하를 갖는 고분자 전해질의 적당한 몇몇 예는 폴리리신(시그마-알드리치 케미칼 코., 인크.(Sigma-Aldrich Chemical Co., Inc.)(미국 미주리주 세인트 루이스)로부터 상업적으로 입수가능함), 폴리에틸렌이민, 에피클로로히드린 관능화 폴리아민 및/또는 폴리아미도아민, 예를 들어 폴리(디메틸아민-코-에피클로로히드린); 폴리디알릴디메틸-암모늄 클로라이드; 양이온성 셀룰로오스 유도체, 예를 들어 사급 암모늄 수용성 단량체가 그래프팅된 셀룰로오스 공중합체 또는 셀룰로오스 유도체, 및 기타 등등을 포함하지만, 이들에 제한되지는 않는다. 한 특별한 실시태양에서, 사급 암모늄 수용성 단량체를 함유하는 셀룰로오스 유도체인 셀쿼트(등록상표)(CelQuat®) SC-230M 또는 H-100 (내셔날 스타치 앤드 케미칼, 인크.(National Starch Chemical, Inc.)로부터 입수가능함)이 이용될 수 있다. 게다가, 순 음전하를 갖는 고분자 전해질의 적당한 몇 가지 예는 폴리아크릴산, 예를 들어 폴리(에틸렌-코-메타크릴산, 나트륨염) 및 기타 등등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 양쪽성 고분자 전해질(즉, 극성 및 비극성 부분을 가짐)과 같은 다른 고분자 전해질도 이용될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 예를 들어, 적당한 양쪽성 고분자 전해질의 몇 가지 예는 폴리(스티릴-b-N-메틸 2-비닐 피리듐 요오다이드) 및 폴리(스티릴-b-아크릴산)을 포함하지만, 이들에 제한되지는 않고, 이들 두 물질은 폴리머 소스, 인크.(Polymer Source, Inc.)(캐나다 도르발)로부터 입수가능하다.

일반적으로는 어떠한 고분자 전해질이라도 이용될 수 있지만, 특별한 한 응용을 위해 선택되는 고분자 전해질은 검출 프로브, 검정 프로브, 다공성 막 및 기타 등등의 성질에 의존해서 달라질 수 있다. 특히, 고분자 전해질의 분배된 전하는 그것이 반대 전하를 갖는 물질과 결합하는 것을 허용한다. 따라서, 예를 들어 순 양전하를 갖는 고분자 전해질은 종종 음전하를 띠는 프로브와 더 잘 결합할 수 있고, 반면 순 음전하를 갖는 고분자 전해질은 양전하를 띠는 프로브와 더 잘 결합할 수 있다. 따라서, 이러한 경우, 이들 분자 사이의 이온 상호작용은 검정 대역 (32) 내에서 요구되는 결합이 일어나는 것을 허용한다. 그럼에도 불구하고, 검정 대역 (32)에서 원하는 결합을 얻기 위해 이온 상호작용이 주로 이용되지만, 고분자 전해질은 또한 유사한 전하를 갖는 프로브와 결합할 수도 있다.

고분자 전해질은 프로브와 결합하도록 설계되기 때문에, 전형적으로는 고분자 전해질이 다공성 막 (23)의 표면 상에 실질적으로 비확산적으로 고정화되는 것이 요망된다. 그렇지 않으면, 사용자가 프로브를 쉽게 검출할 수 없을 것이다. 따라서, 고분자 전해질은 그것이 다공성 막 (23)의 매트릭스 내로 실질적으로 확산하지 않는 방식으로 다공성 막 (23)에 적용될 수 있다. 특히, 전형적으로 고분자 전해질은 막 (23)의 표면 상에 존재하는 관능기와 이온 및/또는 공유 결합을 형성하여 거기에 고정된 채로 있게 된다. 요구되는 것은 아니지만, 고분자 전해질을 막 상에 더 영구적으로 고정화시키기 위해서는 고분자 전해질과 다공성 막 (23) 사이에 공유 결합 형성이 요망될 수 있다. 예를 들어, 한 실시태양에서는, 고분자 전해질을 형성하는 데 사용되는 단량체를 먼저 용액으로 형성한 다음, 직접 다공성 막 (23)에 적용한다. 용액을 형성하는 데는 다양한 용매(예: 유기 용매, 물 등)가 사용될 수 있다. 일단 적용되면, 열, 전자 비임 조사, 자유 라디칼 중합 및 기타 등등을 이용해서 단량체의 중합을 개시한다. 몇몇 경우에서는, 단량체가 중합할 때, 그들이 다공성 막 (23)의 일부 관능기와 공유 결합을 형성함으로써, 생성된 고분자 전해질을 그 위에 고정화시킨다. 예를 들어, 한 실시태양에서는, 에틸렌이민 단량체가 몇몇 다공성 막(예: 니트로셀룰로오스)의 표면 상에 존재하는 카르복실기와 공유 결합을 형성한다.

다른 한 실시태양에서는, 고분자 전해질이 다공성 막 (23)에 적용하기 전에 형성될 수 있다. 요망된다면, 고분자 전해질은 먼저 유기 용매, 물 및 기타 등등을 사용하여 용액으로 형성할 수 있다. 이어서, 고분자 전해질 용액을 다공성 막 (23)에 직접 적용한 후 건조시킨다. 건조시, 고분자 전해질은 고분자 전해질에 반대되는 전하를 갖는 다공성 막 (23)의 표면 상에 존재하는 일부 관능기와 이온 결합을 형성할 수 있다. 예를 들어, 한 실시태양에서는, 양전하를 띤 폴리에틸렌이민이 일부 다공성 막(예: 니트로셀룰로오스)의 표면 상에 존재하는 음전하를 띤 카르복실기와 이온 결합을 형성할 수 있다.

추가로, 고분자 전해질은 또한 다양한 잘 알려진 기술을 이용해서 다공성 막 (23)에 가교시킬 수 있다. 예를 들어, 몇몇 실시태양에서는, 에피클로로히드린 관능화 폴리아민 및/또는 폴리아미도아민이 가교가능한 양전하를 띤 고분자 전해질로 사용될 수 있다. 이러한 물질의 예는 케임(Keim)의 미국 특허 3,700,623 및 케임의 미국 특허 3,772,076, 및 케임의 미국 특허 4,537,657에 기술되어 있고, 헤르큘레스, 인크.(Hercules, Inc.)(미국 델라웨어주 윌밍톤)에서 카이멘(등록상표)(Kymene™)이라는 상표명으로 판매하는 것으로 믿어지고, 이들 문헌은 전체를 모든 목적으로 본원에 참고로 혼입한다. 예를 들어, 카이멘(등록상표) 450 및 2064는 몇몇 유형의 다공성 막(예: 니트로셀룰로오스) 상에 존재하는 카르복실기와 공유 결합을 형성하고 경화시 다공성 막의 중합체 골격과 가교할 수 있는 에폭시드 고리 및 사급 암모늄기를 함유하는 에틸클로로히드린 관능화 폴리아민 및/또는 폴리아미도아민 화합물이다. 몇몇 실시태양에서, 가교 온도는 약 50℃ 내지 약 120℃의 범위일 수 있고, 가교 시간은 약 10초 내지 약 600초의 범위일 수 있다.

다공성 막 (23) 상에 고분자 전해질을 비확산적으로 고정화시키는 다양한 기술을 상기하였지만, 고분자 전해질 화합물을 비확산적으로 고정화시키는 다른 어떠한 기술도 본 발명에 이용할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 사실상, 상기한 방법들은 본 발명에 이용될 수 있는 기술들을 오직 예시하는 것을 의도한다. 예를 들어, 몇몇 실시태양에서는, 이러한 고분자 전해질이 막 (23)의 매트릭스 안으로 확산하는 것을 실질적으로 억제할 수 있는 몇몇 성분들을 고분자 전해질 용액에 첨가할 수 있다.

검출 대역 (31), 지시 대역 (35) 및 검정 대역 (32) 각각은 사용자가 시험 샘플 내의 1 개 이상의 분석물질의 농도를 더 잘 결정할 수 있도록 다른 검출 영역을 몇 개라도 제공할 수 있다. 각 영역은 동일한 수용 물질을 함유할 수 있거나, 또는 상이한 수용 물질을 함유할 수 있다. 예를 들어, 대역들은 2 개 이상의 다른 영역(예: 선, 점 등)들을 포함할 수 있다. 영역들은 분석 측정 기구 (20)을 통한 시험 샘플의 유동에 대해 실질적으로 수직인 방향으로 선 형태로 배치될 수 있다. 마찬가지로, 몇몇 실시태양에서는, 그 영역들이 분석 측정 기구 (20)을 통한 시험 샘플의 유동에 대해 실질적으로 평행한 방향으로 선 형태로 배치될 수 있다.

몇몇 경우, 막 (23)은 또한 사용자에게 분석 측정이 적절히 수행되고 있다는 신호를 주는 조절 대역(나타내지 않음)을 한정할 수 있다. 예를 들어, 조절 대역(나타내지 않음)은 일반적으로 프로브와 또는 프로브 상에 고정화된 수용 물질과 화학적 및/또는 물리적 결합을 형성할 수 있는 고정화된 수용 물질을 함유할 수 있다. 이러한 수용 물질의 몇몇 예는 항원, 합텐, 항체, 단백질 A 또는 G, 아비딘, 스트렙타비딘, 이차 항체 및 그의 복합체를 포함하지만, 이들에 제한되지는 않는다. 게다가, 조절 대역 수용 물질에 다양한 비생물학적 물질을 사용하는 것이 또한 요망될 수 있다. 예를 들어, 몇몇 실시태양에서, 조절 대역 수용 물질은 포획되지 않은 프로브와 결합할 수 있는 상기한 바와 같은 고분자 전해질을 포함할 수 있다. 조절 대역의 수용 물질은 프로브에 대해서만 특이적이기 때문에, 분석물질 존재 유무에 상관없이 신호를 생성한다. 조절 대역은 막 (23)을 따라서 어느 곳에라도 위치할 수 있지만, 검출 대역 (31)과 지시 대역 (35)로부터 하류에 위치하는 것이 바람직하다.

기구 형태의 다양한 실시태양을 상기하였지만, 일반적으로 본 발명의 기구는 요망되는 어떠한 형태라도 가질 수 있고, 상기한 모든 성분을 함유할 필요는 없다는 것을 이해해야 한다. 예를 들어, 다양한 다른 기구 형태가 람보트(Lambotte) 등의 미국 특허 5,395,754, 조우(Jou) 등의 미국 특허 5,670,381 및 말릭(Malick) 등의 미국 특허 6,194,220에 기술되어 있고, 이들 문헌은 전체를 모든 목적으로 본원에 참고로 혼입한다.

분석 측정 기구 (20)의 특정 형태와 상관없이, 지시 대역 (35) 및 검출 대역 (31)은 협력적으로 작용하여 분석물질 검출 정확도를 개선한다. 도 3 내지 도 4를 참고로 하여, 이제, 과다한 농도의 항원의 존재 유무를 검출하는 방법의 특별한 한 실시태양을 더 상세히 기술할 것이다. 먼저, 도 3에 나타낸 바와 같이, 항원 A를 함유하는 시험 샘플이 샘플 패드(나타내지 않음)에 적용되어 "L" 방향으로 접합 패드 (22)로 이동하고, 여기서 분석물질 A가 항체와 접합된 검출 프로브 (41) 및 비오틴과 접합된(즉, "비오티닐화된") 검정 프로브 (43)과 혼합한다. 도 3에 도시된 실시태양에서는, 항원 A가 접합된 검출 프로브 (41)과 결합해서 분석물질/접합된 프로브 복합체 (49)를 생성한다. 항원 A의 일부는 접합된 검출 프로브 (41)의 제한된 이용가능성 때문에 유리형 상태로 있다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 이어서, 유리형 항원 A 및 복합체 (49)는 항체 (51)이 내부에 고정화된 검출 대역 (31)로 이동한다. 유리형 항원 A 및 복합체 (49)가 고정화된 항체 (51) 상의 결합 부위를 차지하려고 경쟁한다. 남는 항원 A 및 복합체 (49)는 어느 것이든 항원 A와 성질이 동일한 분자 A*가 내부에 고정화된 지시 대역 (35)로 이동한다. 그러나, 항원 A 및 복합체 (49)는 분자 A*와 결합하기 위한 부위를 가지지 않기 때문에, 일반적으로 그들은 지시 대역 (35)를 통과해서 흡수 패드 (28)에 이를 때까지 이동한다. 마지막으로, 비오티닐화된 검정 프로브 (43)은 검출 대역 (31) 및 지시 대역 (35) 둘 모두를 통과해서 이동하여 검정 대역 (32) 내부에 고정화된 스트렙타비딘(나타내지 않음)과 결합한다. 이어서, 검출 대역 (31) 및 지시 대역 (35)에서 포획된 어떠한 검출 프로브 (41)에 의해서라도 생성된 신호의 세기를 측정할 수 있다. 추가로, 검정 대역 (32)에서 검정 프로브 (43)에 의해 생성된 신호의 세기도 또한 측정할 수 있고, 이것은 일반적으로 어떠한 분석물질 농도에 대해서도 일정하여야 한다.

요망된다면, 몇몇 실시태양에서는 프로브의 세기를 측정하는 데에 광학 판독기를 이용할 수 있다. 광학 판독기의 실제 형태 및 구조는 일반적으로 당업계 숙련자가 쉽게 이해하는 바와 같이 다양할 수 있다. 예를 들어, 이용될 수 있는 광학 검출 기술은 발광(예: 형광, 인광 등), 흡광(예: 형광 또는 비형광), 회절 등을 포함하지만, 이들에 제한되는 것은 아니다. 한가지 적당한 반사분광광도계가 예를 들어 케일러(Kaylor) 등의 미국 특허 출원 공개 2003/0119202에 기술되어 있고, 이 문헌은 전체를 모든 목적으로 본원에 참고로 혼입한다. 다른 한 실시태양에서는, 형광을 나타내는 프로브의 존재를 검출하는 데에 반사 모드 형광분광광도계를 이용할 수 있다. 적당한 형광분광광도계 및 관련 검출 기술이 예를 들어 송 등의 미국 특허 출원 공개 2004/0043502에 기술되어 있고, 이 문헌은 전체를 모든 목적으로 본원에 참고로 혼입한다. 마찬가지로, 투과 모드 검출 시스템도 검출 프로브의 존재를 검출하는 데 이용될 수 있다.

전형적으로, 광학 판독기는 전자기 복사선을 방출할 수 있는 조명원 및 신호(예: 투과된 또는 반사된 빛, 방출된 형광 또는 인광 등)를 기록할 수 있는 검출기를 함유한다. 조명원은 가시 영역 또는 근가시 영역(예: 적외선 또는 자외선)의 빛과 같은 전자기 복사선을 제공할 수 있는 당업계에 잘 알려진 어떠한 소자라도 될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 이용될 수 있는 적당한 조명원은 발광 다이오드(LED), 섬광 램프, 냉음극 형광 램프, 전기발광 램프 및 기타 등등을 포함하지만, 이들에 제한되지는 않는다. 조명은 다중화되거나 또는 시준화될 수 있다. 몇몇 경우에는, 어떠한 배경 간섭도 감소시키기 위해 조명을 펄스화할 수 있다. 게다가, 조명은 연속적이거나, 또는 연속파(CW) 및 펄스화 조명을 조합할 수 있고, 이 경우 다수의 조명 비임이 다중화되어(예를 들어, 펄스화 비임이 CW 비임과 다중화됨), CW 공급원에 의해 유발된 신호 및 펄스화된 공급원에 의해 유발된 신호 사이에 신호 구별을 가능하게 한다. 예를 들어, 몇몇 실시태양에서는, LED(예: 알루미늄 갈륨 아르제나이드 레드 다이오드, 갈륨 포스파이드 그린 다이오드, 갈륨 아르제나이드 포스파이드 그린 다이오드, 또는 인듐 갈륨 니트라이드 바이올렛/블루/자외선(UV) 다이오드)가 펄스화된 조명원으로 사용된다. 본 발명에 사용하기에 적당한 UV LED 여기 다이오드의 상업적으로 입수가능한 한가지 예는 모델 NSHU550E(니치아 코포레이션(Nichia Corporation))이고, 이것은 10 mA의 순방향 전류(3.5 - 3.9 V)로 750 - 1000 마이크로와트의 광파워(optical power)를 반치폭 10 도, 피크 파장 370 - 375 nm 및 스펙트럼 절반폭 12 nm를 갖는 비임으로 방출한다.

몇몇 경우에서, 조명원은 분석 측정 기구에 확산 조명을 제공할 수 있다. 예를 들어, 간단히 다수의 점광원의 어레이(즉, LED)를 이용해서 상대적으로 확산성인 조명을 제공할 수 있다. 상대적으로 저렴하게 확산 조명을 제공할 수 있는 특별히 요망되는 다른 한 조명원은 전기발광(EL) 소자이다. EL 소자는 일반적으로 적어도 하나는 투명하여 빛이 빠져나가는 것을 허용하는 전극들 사이에 삽입된 발광 물질(예: 인 입자)을 이용하는 커패시터 구조이다. 전극을 가로질러 전압을 적용하면 발광 물질 내에 변하는 전기장을 발생하고, 이 때문에 발광 물질이 발광하게 된다.

검출기는 일반적으로 신호를 감지할 수 있는 당업계에 알려진 어떠한 소자라도 될 수 있다. 예를 들어, 검출기는 공간 구별을 하도록 구성된 전자 영상화 검출기일 수 있다. 이러한 전자 영상화 센서의 몇몇 예는 고속 선형 전하결합소자(CCD), 전하 주입 소자(CID), 상보성 금속 산화막 반도체(CMOS) 소자, 및 기타 등등을 포함한다. 예를 들어, 이러한 영상 검출기는 일반적으로 전자 빛 센서의 2차원적 어레이이지만, 예를 들어 영상을 스캐닝하는 데 사용되는 것들과 같은 1 줄의 검출기 화소 또는 빛 센서를 포함하는 선형 영상화 검출기(예: 선형 CCD 검출기)도 이용될 수 있다. 각 어레이는 "어드레스"라고 부를 수도 있는 1 세트의 기지의 고유한 위치를 포함한다. 영상 검출기의 각 어드레스는 한 영역(예: 전형적으로는 상자 또는 직사각형 모양을 갖는 영역)을 맡는 센서가 차지한다. 이 영역은 일반적으로 "화소" 또는 화소 영역이라고 부른다. 예를 들어, 검출기 화소는 CCD, CID 또는 CMOS 센서일 수 있거나, 또는 빛을 검출 또는 측정하는 어떠한 다른 소자 또는 센서라도 될 수 있다. 검출기 화소의 크기는 폭넓게 다양할 수 있고, 몇몇 경우에서는, 0.2 ㎛ 정도로 낮은 직경 또는 길이를 갖는다.

다른 실시태양에서, 검출기는 공간 구별 능력이 결여된 빛 센서일 수 있다. 예를 들어, 이러한 빛 센서의 예는 광전자증배기 소자, 광 다이오드, 예를 들어 어밸런치 광 다이오드 또는 실리콘 광 다이오드 및 기타 등등을 포함할 수 있다. 실리콘 광 다이오드는 저렴하고 민감하고 고속 작업(짧은 상승시간/높은 밴드 폭)을 할 수 있고 대부분의 다른 반도체 기술 및 모놀리식 회로에 쉽게 집적된다는 점에서 때로는 유익하다. 게다가, 실리콘 광 다이오드는 물리적으로 작기 때문에 그들은 막 기반 소자와 함께 사용하기 위한 시스템 안에 쉽게 혼입될 수 있다. 실리콘 광 다이오드가 사용되는 경우에는, 방출된 신호의 파장 범위가 400 내지 1100 nm인 그의 민감도 범위 내에 있을 수 있다.

일반적으로 말하자면, 본 발명에 따라서 분석물질의 존재 유무 또는 농도에 대한 정성적, 정량적 또는 반정량적 결정을 달성할 수 있다. 예를 들어, 상기한 바와 같이, 분석물질의 양은 검출 대역 (31) 및 지시 대역 (35)에서 포획된 프로브에 의해 생성된 신호의 세기를, 임의로 검정 대역 (32)에서의 신호 세기와 함께, 이용함으로써 정량적 또는 반정량적으로 결정할 수 있다. 분석물질 농도를 결정하는 데 상이한 신호 세기들을 이용할 수 있다는 것이 도 2에 그래프로 도시되어 있다. 신호 세기가 도시된 관계를 반드시 따라야 할 필요는 없고, 이 관계는 오직 예시의 목적에서 주어진 것이라는 점을 이해해야 한다. 이 점에서, 도 2는 지시 대역 (35) 및 검출 대역 (31)에 대해 도 3 및 도 4의 검출 프로브의 신호 세기의 관계를 나타낸다. 오직 예시의 목적으로, 도 2는 검정 신호 세기를 포함하지 않는다. 그러나, 위에서 논의한 바와 같이, 검정 신호 세기를 이용해서 결과를 검정할 수 있다. 예를 들어, 분석물질 농도에 대한 I_d 대 I_c 비를 플롯팅하여 용량 반응 곡선을 전개할 수 있다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 시험 샘플 내에 항원 A가 존재하지 않을 때는, 검출 프로브 (41)이 모두 지시 대역 (35) 내의 항원 A*에 결합하여 최대값 지시 신호 세기 ("I_o")를 생성한다. 검출 대역 (31)은 신호를 생성하지 않는다. 항원의 농도가 증가함에 따라 항원 A는 접합된 검출 프로브 (41)과 복합체 (49)를 형성하기 시작한다. 복합체 (49)는 검출 대역 (31)에서 항체 (51)과 결합할 수 있는 에피톱을 갖는다. 이것은 지시 신호 세기 "I_o"의 감소를 일으키고 또한 검출 대역 (31)에서 검출 신호 세기 "I_d"를 생성시킨다. 지시 신호 세기 "I_d"는 계속 감소하고, 검출 신호 세기 "I_d"는 항원 A의 농도가 이용가능한 접합된 검출 프로브 (41)의 양을 초과할 때까지 계속 증가한다. 이것은 분석물질의 "포화 농도"라고 알려져 있다. 포화 농도에서, 유리형 분석물질 A 및 복합체 (49)는 검출 대역 (31)에서 결합 부위를 차지하려고 경쟁하기 시작한다. 따라서, 검출 신호 세기 "I_d"는 그의 최대값에 도달한다. 검출 프로브 (41)의 양이 검출 대역 (31)에서 이용가능 항체 (51)의 양에 상응하도록 선택되기 때문에 일반적으로 이 값은 알려져 있다. 항원 농도가 더 증가할 때, 검출 대역 (31) 내에 유리형의 비표지된 항원 A의 존재량이 단계적으로 증가하기 때문에 검출 신호 세기 "I_d"가 감소하기 시작한다. 게다가, 분석물질 포화 농도에서 또는 그 부근에서는, 검출 프로브 (41) 모두가 분석물질 A와 복합체화되고 이어서 검출 대역 (31) 내에서 항체 (51)과 결합할 것이기 때문에 이론적으로는 지시 신호 세기가 검출되지 않을 것이다. 그러나, 실제로는 적은 수의 검출 프로브 (41)이 지시 대역 (35) 내의 항원 A*와 결합할 수 있어서 상대적으로 낮은 지시 신호 세기 "I_o"가 여전히 생성된다.

본 발명에 따르면, 도 2의 용량 반응 곡선의 여러 영역을 선택적으로 이용해서 측정된 검출 신호 세기를 분석물질 농도로 전환시킬 수 있다. 예를 들어, 분석물질 농도 "A_o"와 "A₁" 사이에 곡선의 "영역 A"가 한정된다. 이 영역에서, 검출 신호 세기는 분석물질 농도와 거의 선형 관계를 갖는다. 따라서, 도 2의 "영역 A"를 이용해서, 측정된 검출 신호 세기 "I_d"를 실제 분석물질 농도로 정확하게 전환시킬 수 있다. 마찬가지로, 분석물질 농도 "A₂"와 "A₃" 사이에 곡선의 "영역 C"가 한정된다. 또한, 이 영역에서 검출 신호 세기는 분석물질 농도와 거의 선형 관계를 갖는다. 따라서, 도 2의 "영역 C"를 이용해서 측정된 검출 신호 세기 "I_d"를 실제 분석물질 농도로 정확하게 전환시킬 수 있다. 분석물질 농도 "A₁"과 "A₂" 사이에 한정된 검출 곡선의 "영역 B"는 상대적으로 일정하고, 이렇기 때문에 분석물질 농도에 대한 정확한 관계를 얻는 것이 때로는 어렵다. 따라서, 정량적 결과가 요망되는 경우이면, 사용자는 후속 시험 샘플을 희석한 후 이 분석 측정을 재수행할 수 있다. 별법으로, 지시 신호 세기를 단독으로 또는 검출 신호 세기와 함께 이용해서 정량적 결과를 제공할 수 있다. 반정량적 결과만 요망되는 경우에는, 분석물질 농도를 분석물질 농도 "A₁"과 "A₂"의 범위 사이에 있다고 간단히 말할 수 있다.

특별한 한 시험 샘플에 대해 도 2의 용량 반응 곡선의 어느 영역이 가장 적합한지를 결정하기 위해서는, 먼저, 분석물질 농도가 "후크 효과" 영역 내에 있는지의 여부를 결정하는 것이 일반적으로 요망된다. 이와 관련해서, 측정된 신호 세기 "I_o"를 분석물질의 기지의 포화 농도에 대해 미리 결정된 참조 표준값과 비교할 수 있다. "참조 표준값"은 신호 세기 값일 수 있거나, 또는 그것은 일정 허용 범위의 오차 내에서 포화 농도에 상응한다고 믿어지는 값들의 범위를 포함할 수 있다. 값의 범위의 상한 및 하한은 지시 신호 세기가 동일한 기지의 분석물질 포화 농도에 대해 수행한 다수의 시험에 걸쳐서 변하는 정도를 토대로 하여 선택할 수 있다. 예를 들어, 도 2에서, 참조 표준값은 분석물질 농도 "A₁" 및 "A₂"에 각각 상응하는 세기 값 "I₁"과 "I₂" 사이에서 정의될 수 있다. 참조 표준값보다 큰(예: 상한 "I₁"보다 큰) 측정된 신호 세기 "I₀"는 분석물질 농도가 "후크 효과" 영역 밖에 있다는 것을 알리는 지시자 기능을 하는 반면, 참조 표준값과 동일하거나 또는 그 보다 작은(예: 상한 "I₁"보다 작은) 측정된 신호 세기 "I₀"는 분석물질 농도가 "후크 효과" 영역 내에 있다는 것을 알리는 지시자 기능을 한다.

도 5를 참고로 하여, 예를 들어, 분석물질 농도가 "후크 효과" 영역 내에 있는지의 여부를 결정하는 방법 (100)의 한 실시태양을 나타낸다. 방법 (100)에서는 측정된 검출 신호 세기 "I_d", 측정된 지시 신호 세기 "I_o", 및 참조 표준값의 상한 I₁ 및 하한 I₂를 포함하여 몇 가지 변수가 입력값으로 사용된다. 이 방법 (100)의 제 1 단계는 측정된 신호 세기 "I_o"가 상한 I₁ 보다 큰지를 결정하는 것이다. 그렇다면, 분석물질 농도가 "후크 효과" 영역 밖에 있고, 용량 반응 곡선의 "영역 A"를 이용해서 측정된 검출 신호 세기 "I_d"를 분석물질 농도로 전환시킬 수 있다. 측정된 신호 세기 "I_o"가 상한 I₁ 보다 작은 경우, 방법 (100)의 다음 단계는 분석물질 농도가 포화 농도 또는 그 부근에 있는지, 또는 그것이 포화 농도보다 훨씬 높은지를 결정하는 것이다. 따라서, 방법 (100)은 측정된 신호 세기 "I_o"가 하한 "I₂"보다 작은지를 결정하고, 그렇다면, 용량 반응 곡선의 "영역 C"를 이용해서, 측정된 검출 신호 세기 "I_d"를 분석물질 농도로 전환시킬 수 있다. 측정된 신호 세기 "I_o"가 하한 "I₂"보다 크고 상한 I₁ 보다 작은 경우(즉, 참조 표준값과 동일함), 방법 (100)의 최종 단계는 반정량적 또는 정량적 결과가 요망되는지의 여부를 결정하는 것이다. 정량적 결과가 요망되는 경우이면, 방법 (100)은 사용자가 후속 시험 샘플을 희석한 후 이 분석 측정을 재수행하라고 지시한다. 별법으로, 측정된 지시 신호 세기 "I_o"는 또한 단독으로 또는 검출 신호 세기 "I_d"와 함께 이용해서 정량적 결과를 제공할 수 있다. 예를 들어, 도 2에 나타낸 바와 같이, 지시 곡선은 검출 신호 곡선의 "영역 B" 내에서는 상대적으로 선형이다. 따라서, 이 영역 내에서, 지시 곡선은 정확한 검출 결과를 제공할 수 있다. 게다가, 반정량적 결과만 요망되는 경우이면, 이 방법 (100)은 단순히 분석물질 농도가 도 2에 나타낸 분석물질 농도 "A₁"과 "A₂"의 범위 내에 있다는 것을 가리킨다.

상기한 바와 같은 상관법은 자동으로 및/또는 수작업으로 수행할 수 있다. 예를 들어, 임의로 마이크로프로세서를 이용해서 요망되는 상관 기술을 자동으로 선택해서 검출기로부터의 측정값을 분석물질의 농도를 정량적 또는 반정량적으로 가리키는 결과로 전환할 수 있다. 마이크로프로세서는 사용자에게 마지막 수 개의 결과를 기억시킬 수 있는 메모리 능력을 포함한다. 당업계 숙련자들은 적당한 컴퓨터 판독가능 메모리 소자, 예를 들어 RAM, ROM, EPROM, EEPROM, 플래쉬 메모리 카드, 디지털 비디오 디스크, 버노울리(Bernoulli) 카트리지 및 기타 등등을 이용할 수 있음을 인식할 것이다. 요망되는 경우, 그 결과는 액정(LCD) 또는 LED 디스플레이를 이용해서 사용자에게 전송될 것이다.

하기 실시예를 참고로 하면 본 발명을 더 잘 이해할 수 있다.

실시예 1

측방 유동 분석 측정 기구를 형성할 수 있음을 입증하였다. 약 30 cm 길이를 갖는 니트로셀룰로오스 다공성 막 (HF 120, 밀리포어, 인크.(Millipore, Inc.))을 지지 카드 상에 적층시켰다. C-반응성 단백질의 단일 클론 항체를 다공성 막 상에 고정화하여 검출 대역을 형성하였다. 이 항체는 바이오스퍼시픽, 인크.(BiosPacific, Inc.)(카탈로그 #A58040136P)로부터 얻었고, 1 mg/ml 농도를 가졌다. CRP 항원을 다공성 막 상에 고정화하여 지시 대역을 형성하였다. 항원은 바이오제네시스 인크.(Biogenesis, Inc.)(미국 뉴햄프셔주 킹스톤)로부터 얻었고, 2.78 mg/ml 농도를 가졌다. 골드라인(등록상표)(Goldline™)(브리티시 바이오셀 인터내셔날(British Biocell International)로부터 얻은 폴리리신 용액)을 막 상에 스트라이핑(stripin)하여 조절 대역을 형성하였다. 지시 대역은 검출 대역과 조절 대역 사이에 위치시켰다. 셀룰로오스 위킹 패드(밀리포어 코.)를 막의 한쪽 말단 (조절 대역에 더 가까움)과 적층시켰다. 이어서, 막 샘플을 37 ℃ 온도에서 1 시간 동안 건조시켰다.

CRP의 단일 클론 항체(바이오스퍼시픽, 인크., 카탈로그 #A58110228P)와 접합된 금 입자 180 ㎕, 물 중의 수크로스(20%) 375 ㎕, 및 물 945 ㎕를 혼합하여 입자 현탁액을 형성하였다. 금 입자는 입자 크기가 40 nm이고 광학 밀도가 56이며, 브리티쉬 바이오셀 인터내셔날로부터 얻었다. 현탁액을 25 cm 길이의 유리 섬유 접합 패드(밀리포어 코.) 상에 로딩하였다. 유리 섬유 패드를 37 ℃에서 2 시간 동안 건조시켜서 접합 패드를 생성하였다. 이어서, 접합 패드를 다공성 막의 다른 한쪽 말단(검출 대역에 더 가까움) 상에 적층하였다. 셀룰로오스 위킹 패드(밀리포어 코.) 샘플 패드를 접합 패드 상에 추가로 적층시켰다. 이어서, 적층된 완전 카드를 절단하여 4 mm 폭 측방 유동 분석 측정 기구를 형성하였다.

실시예 2

조절 대역을 형성하는 데에 고트 항-마우스 IgG(F_c) 2.23 mg/ml를 사용하였다는 점을 제외하고는 실시예 1에 기술된 바대로 측방 유동 기구를 형성하였다.

실시예 3

측방 유동 분석 측정 기구를 형성할 수 있음을 입증하였다. 약 30 cm 길이를 갖는 니트로셀룰로오스 다공성 막 (HF 120, 밀리포어, 인크.)을 지지 카드 상에 적층시켰다. 0.1 % 트레할로스 수용액 중의 C-반응성 단백질의 단일 클론 항체(바이오스퍼시픽, 인크.; 카탈로그 #A58040136P)를 다공성 막 상에 고정화하여 검출 대역을 형성하였다. CRP 항원을 다공성 막 상에 고정화시켜 지시 대역을 형성하였다. 이 항원은 바이오제네시스 인크.(미국 뉴햄프셔주 킹스톤)로부터 얻었고, 2.78 mg/ml의 농도를 가졌다. 고트 항-알칼리성 포스파타제 (2.5 mg/ml, 피츠제럴드 인더스트리즈 인터내셔날, 인크.(Fitzgerald Industries International, Inc.; 미국 매사추세츠주 콘코드)로부터 입수가능함)를 막 상에 스트라이핑하여 조절 대역을 형성하였다. 지시 대역은 검출 대역과 조절 대역 사이에 위치시켰다. 셀룰로오스 위킹 패드(밀리포어 코.)를 막의 한쪽 말단(조절 대역에 더 가까움)과 적층시켰다. 이어서, 막 샘플을 37 ℃의 온도에서 1 시간 동안 건조시켰다.

CRP 단일 클론 항체(바이오스퍼시픽, 인크., 카탈로그 #A58110228P)와 접합된 금 입자 160 ㎕, 물 중의 수크로스(20%) 375 ㎕, 및 물 785 ㎕를 혼합하여 입자 현탁액을 형성하였다. 토끼 항-고트 IgG와 접합된 금 입자는 10 nm의 입자 크기를 가졌고, 시그마-알드리치, 인크.(미국 미주리주 세인트 루이스)로부터 얻었다. CRP 단일 클론 항체와 접합된 금 입자는 40 nm의 입자 크기를 가졌고, 브리티시 바이오셀 인터내셔날로부터 얻었다. 현탁액을 20 cm 길이의 유리 섬유 접합 패드(밀리포어 코.) 상에 로딩하였다. 유리 섬유 패드를 37 ℃에서 2 시간 동안 건조시켜서 접합 패드를 생성하였다. 이어서, 접합 패드를 다공성 막의 다른 한쪽 말단(검출 대역에 더 가까움) 상에 적층하였다. 셀룰로오스 위킹 패드(밀리포어 코.) 샘플 패드를 접합 패드 상에 추가로 적층시켰다. 이어서, 적층된 완전 카드를 절단하여 4 mm 폭 측방 유동 분석 측정 기구를 형성하였다.

실시예 4

실시예 1의 측방 유동 분석 측정 기구를 이용해서 분석물질의 존재 유무 및 양을 결정할 수 있음을 입증하였다. 11 개의 분석 측정 기구를 시험하였다. TBS 완충제 중의 C 반응성 단백질 120 ㎕를 각 기구의 샘플 패드에 적용하였다. 상이한 농도의 CRP를 시험하였다: 즉, 0, 10, 50, 200, 500, 1,000, 2,000, 5,000, 20,000, 100,000, 및 500,000 ng/ml. 분석 측정 기구를 30 분 동안 전개하도록 두었다. 각 기구의 각 대역의 색상 세기를 반사 기반 분광광도계를 이용해서 측정하였다. 각 대역에서의 세기를 표 1에 요약하였다.

도 6에 이 세기를 CRP 농도에 대해 플롯팅하였다. 나타낸 바와 같이, 지시 대역은 CRP 농도가 "후크 효과" 영역 내에 있는지의 여부를 예상할 수 있다.

실시예 5

실시예 2의 측방 유동 분석 측정 기구를 이용해서 분석물질의 존재 유무 및 양을 결정할 수 있음을 입증하였다. 11 개의 분석 측정 기구를 시험하였다. TBS 완충제 중의 C 반응성 단백질 120 ㎕를 각 기구의 샘플 패드에 적용하였다. 상이한 농도의 CRP를 시험하였다: 즉, 0, 10, 50, 200, 500, 1,000, 2,000, 5,000, 20,000, 100,000, 및 500,000 ng/ml. 분석 측정 기구를 30분 동안 전개하도록 두었다. 각 기구의 각 대역의 색상 세기를 반사 기반 분광광도계를 이용해서 측정하였다. 각 대역에서의 세기를 표 2에 요약하였다.

도 7에 이 세기를 CRP 농도에 대해 플롯팅하였다. 나타낸 바와 같이, 지시 대역은 CRP 농도가 "후크 효과" 영역 내에 있는지의 여부를 예상할 수 있다.

실시예 6

실시예 3의 측방 유동 분석 측정 기구를 이용해서 분석물질의 존재 유무 및 양을 결정할 수 있음을 입증하였다. 11 개의 분석 측정 기구를 시험하였다. TBS 완충제 중의 C 반응성 단백질 120 ㎕를 각 기구의 샘플 패드에 적용하였다. 상이한 농도의 CRP를 시험하였다: 즉, 0, 10, 50, 200, 500, 1,000, 2,000, 5,000, 20,000, 100,000, 및 500,000 ng/ml. 분석 측정 기구를 30분 동안 전개하도록 두었다. 각 기구의 각 대역의 색상 세기를 반사 기반 분광광도계를 이용해서 측정하였다. 각 대역에서의 세기를 표 3에 요약하였다.

도 8에 이 세기를 CRP 농도에 대해 플롯팅하였다. 나타낸 바와 같이, 지시 대역은 CRP 농도가 "후크 효과" 영역 내에 있는지의 여부를 예상할 수 있다.

실시예 7

분석 측정 기구의 검출 민감도를 변화시킬 수 있음을 입증하였다. 먼저, CRP 단일 클론 항체(바이오스퍼시픽, 인크., 카탈로그 #A58110228P)와 접합된 금 입자를 2 mM 보랙스(pH 7.2) 중에서 광학 밀도가 10이 되는 농도로 희석시킴으로써 입자 현탁액을 형성하였다. 금 입자는 40 nm의 입자 크기를 가졌다. "키네매틱 1600" 시약 분주 모듈(키네매틱 오토메이션, 인크., 미국 캘리포니아주 트웨인 하르트)을 이용해서 현탁액을 25 ㎕/초(5 ㎕/cm, 5 cm/초)의 속도로 34 mm 길이의 유리 섬유 접합 패드 (밀리포어, 코.) 상에 분무하였다. 유리 섬유 패드를 실온 및 20% 미만의 상대습도에서 하룻밤 동안 건조하도록 두었다.

이어서, 접합 패드를 약 30 cm 길이를 갖는 니트로셀룰로오스 다공성 막 (HF 180, 밀리포어, 인크.)의 한쪽 말단 상에 적층시켰다. C-반응성 단백질의 단일 클론 항체 (바이오스퍼시픽, 인크., 카탈로그 #A58110228P)를 PBS 완충제 중에 0.2 및 0.3 mg/ml 농도가 되도록 희석시켰다. 또한, CRP 항원은 바이오제네시스 인크.(Biogenesis, Inc.)(미국 뉴햄프셔주 킹스톤)로부터 얻었고, TBS 완충제 중에 3.4 mg/ml 농도가 되도록 희석시켰다. "키네매틱 1600" 시약 디스펜싱 모듈(키네매틱 오토메이션, 인크., 미국 캘리포니아주 트웨인 하르트)을 이용하여 시약을 5 ㎕/초 (1 ㎕/cm, 5 cm/초)의 속도로 다공성 막 상에 스트라이핑하였다. 고정화된 단일 클론 항체는 막의 가장자리로부터 10 mm 거리를 두고 위치하는 검출 대역을 형성하였다. 고정화된 CRP 항원은 막의 다른 가장자리로부터 10 mm, 검출 대역으로부터 하류에 5 mm 거리를 두고 위치하는 지시 대역을 형성하였다. CF6 셀룰로오스/유리 위킹 패드(와트만 피엘씨(Whatman plc), 영국 미들섹스)를 20 mm 폭으로 절단하고 니트로셀룰로오스 막에 적층시켰다. 이어서, 적층된 카드를 절단하여 4 mm 폭 완전 측방 유동 딥스틱을 얻었다.

이렇게 하여 얻은 분석 측정 기구를 하우징(14 개의 딥스틱을 포함함)에 놓고, 카미야 바이오메디칼 코.(Kamiya Biomedical Co,)(미국 워싱톤주 시애틀)로부터 얻은 검정된 CRP 혈청(0 내지 480 ㎍/ml) 1 ㎕를 직접 치환 방식 피펫(positive displacement pipette)을 이용해서 손으로 스트라이핑하였다. 혈청의 스트라이프는 GF 33 패드의 가장자리로부터 12 mm 거리를 둔 지점에 놓았다. 시험 스트립을 따라서 혈청을 씻어내리기 위해 또는 "쫓아내기 위해" 혈청 적용 지점으로부터 상류에 110 ㎕ PBS 완충제 (pH 7.2, 2% 트윈 20)를 적용함으로써 분석 측정 기구를 시험하였다. 이 기구를 30 분 동안 전개하도록 두었다. 각 기구 상의 각 대역의 색상 세기를 0 - 11 범위(여기서, 0은 색상이 없음을 나타내고, 11은 가장 강력한 색상을 나타냄)의 시각적 스케일("랜 스케일")을 이용해서 결정하였다. 각 대역의 세기를 표 4 및 5에 요약하였다.

위에서 알 수 있는 바와 같이, 검출 대역에 사용되는 항체의 농도를 변화시켜서 상이한 검출 민감도를 제공할 수 있다. 이러한 방식에서는, 항체 농도를 선택적으로 조절해서, 시험 조건에 더 잘 상응한다고 믿어지는 민감도 범위 내에서 용량 반응 곡선을 생성할 수 있다. 예를 들어, 용량 반응 곡선의 선형 영역이 더 높은 분석물질 농도에서 존재하도록 항체 농도를 조정할 수 있다.

실시예 8

분석 측정 기구의 검출 민감도를 변화시킬 수 있음을 입증하였다. 먼저, CRP의 단일 클론 항체(바이오스퍼시픽, 인크., 카탈로그 #A58110228P)와 접합된 금 입자를 2 mM 보랙스(pH 7.2) 중에서 광학 밀도가 5, 8, 10, 12, 15, 18 또는 20이 되는 농도로 희석시킴으로써 입자 현탁액을 형성하였다. 금 입자는 40 nm의 입자 크기를 가졌다. "키네매틱 1600" 시약 디스펜싱 모듈(키네매틱 오토메이션, 인크., 미국 캘리포니아주 트웨인 하르트)을 이용해서 현탁액을 25 ㎕/초(5 ㎕/cm, 5 cm/초)의 속도로 34 mm 길이의 유리 섬유 접합 패드 (밀리포어, 코.) 상에 분무하였다. 유리 섬유 패드를 실온 및 20% 미만의 상대습도에서 하룻밤 동안 건조하도록 두었다.

이어서, 접합 패드를 약 30 cm 길이를 갖는 니트로셀룰로오스 다공성 막 (HF 180, 밀리포어, 인크.)의 한쪽 말단 상에 적층시켰다. C-반응성 단백질의 단일 클론 항체 (바이오스퍼시픽, 인크., 카탈로그 #A58110228P)를 PBS 완충제 중에 0.1 mg/ml 농도가 되도록 희석시켰다. 또한, CRP 항원은 바이오제네시스 인크.(미국 뉴햄프셔주 킹스톤)로부터 얻었고, TBS 완충제 중에 3.4 mg/ml 농도가 되도록 희석시켰다. "키네매틱 1600" 시약 디스펜싱 모듈(키네매틱 오토메이션, 인크., 미국 캘리포니아주 트웨인 하르트)을 이용하여 시약을 5 ㎕/초 (1 ㎕/cm, 5 cm/초)의 속도로 다공성 막 상에 스트라이핑하였다. 고정화된 단일 클론 항체는 막의 가장자리로부터 10 mm 거리를 두고 위치하는 검출 대역을 형성하였다. 고정화된 CRP 항원은 막의 다른 가장자리로부터 10 mm, 검출 대역으로부터 하류에 5 mm 거리를 두고 위치하는 지시 대역을 형성하였다. CF6 셀룰로오스/유리 위킹 패드(와트만 피엘씨, 영국 미들섹스)를 20 mm 폭으로 절단하고 니트로셀룰로오스 막에 적층시켰다. 이어서, 적층된 카드를 절단하여 4 mm 폭 완전 측방 유동 딥스틱을 얻었다.

이렇게 하여 얻은 분석 측정 기구를 하우징(14 개의 딥스틱을 포함함)에 놓고, 카미야 바이오메디칼 코.(미국 워싱톤주 시애틀)로부터 얻은 검정된 CRP 혈청(0 내지 480 ㎍/ml) 1 ㎕를 직접 치환 방식 피펫을 이용해서 손으로 스트라이핑하였다. 혈청의 스트라이프는 GF 33 패드의 가장자리로부터 12 mm 거리를 둔 지점에 놓았다. 시험 스트립을 따라서 혈청을 씻어내리기 위해 또는 "쫓아내기 위해" 혈청 적용 지점으로부터 상류에 110 ㎕ PBS 완충제 (pH 7.2, 2% 트윈 20)를 적용함으로써 분석 측정 기구를 시험하였다. 이 기구를 30 분 동안 전개하도록 두었다. 각 기구 상의 각 대역의 색상 세기를 상기한 "랜" 스케일을 이용해서 측정하였다. 그 결과를 도 9 - 도 10에 요약하였다.

도 9에 나타낸 바와 같이, 항체 반응 곡선("검출 대역") 및 신호 세기(예: "랜" 값)는 접합 입자 농도(광학 밀도에 의해 반영됨)를 변경시킴으로써 변화시킬 수 있다. 마찬가지로, 도 10에 나타낸 바와 같이, CRP 반응 곡선("지시 대역") 및 신호 세기도 또한 접합 입자 농도를 변경시킴으로써 변화시킬 수 있다. 따라서, 지시된 바와 같이, 접합 입자의 농도를 선택적으로 조절하여, 시험 조건에 더 잘 상응한다고 믿어지는 민감도 범위 내에서 용량 반응 곡선을 얻을 수 있다.

실시예 9

분석 측정 기구의 검출 민감도를 변화시킬 수 있음을 입증하였다. 초기 실험을 위해 하프 스틱 분석 측정 기구를 만들었다. PBS 0/0에 항체 원액을 0.1 mg/ml 및 0.5 mg/ml 농도가 되도록 희석시킴으로써 CRP 단일 클론 항체(바이오스퍼시픽, 인크., 카탈로그 #A58110228P)의 용액을 2 개 제조하였다. 이어서, 각 용액을 약 30 cm의 길이를 갖는 분리된 니트로셀룰로오스 막(HF 120, 밀리포어, 인크.) 상에 스트라이핑하였다. 용액을 "키네매틱 1600" 시약 디스펜싱 모듈(키네매틱 오토메이션, 인크., 미국 캘리포니아주 트웨인 하르트)을 이용해서 5 ㎕/초 (1 ㎕/cm 분주 속도, 5 cm/초 베드 속도)로 스트라이핑하였다. 또한, PBS 0/0 (pH 7.2) 중에 0.5 mg/mL로 희석시킨 CRP의 용액(바이오제네시스, 인크., 미국 뉴햄프셔주 킹스톤)을 키네매틱 1600을 사용하여 카드 상에 스트라이핑하였다. 카드를 37 ℃에서 1 시간 동안 건조하도록 두고, 20 mm 폭 셀룰로오스 섬유 위크 (wick)(밀리포어 CFSP203000)와 적층시켰다. "키네매틱 2360" 슬릿터(키네매틱 오토메이션, 인크., 미국 캘리포니아주 트웨인 하르트)를 이용해서 카드를 4 mm 폭 스트립으로 절단하여, 4 mm 폭 하프 측방 유동 딥스틱("하프 스틱")을 얻었다.

시험을 위해, CRP의 단일 클론 항체(바이오스퍼시픽, 인크., 카탈로그 #A58110228P)와 이미 접합된 다양한 크기의 금 입자의 입자 현탁액을 사용하였다. 이 실시예에서 연구된 크기는 40 및 60 nm 직경 금 입자 접합체이었다. 시험을 위해 입자 접합체를 TBS 1/0/1에 요망되는 광학 밀도 (OD), 즉 OD 1 및 OD 2.5가 되도록 희석시켰다. 사이팩(Scipac)으로부터의 CRP 표준물을 PBS 0/0에서 0 - 40 ㎍/ml 농도 범위가 되도록 희석시켰고, 이렇게 함으로써 동일 부피의 금 접합체와 혼합하면, 시험 범위인 0 내지 20 ㎍/ml의 CRP를 생성할 것이다. 20 ㎕의 CRP 용액 및 20 ㎕의 금 접합체 현탁액을 96-웰 플레이트에 첨가하였다. 이어서, 하프 스틱 샘플을 웰에 놓고, 시험이 15 분 동안 수행되도록 한 후, 얻은 시험 라인들을 시각에 의해 점수를 매겼다. 각 기구 상의 각 대역의 색상 세기를 시각에 의해 점수 매기는 것은 0(시험 라인에 눈에 보이는 색상이 없음)에서부터 11(시험 라인에 매우 강력한 색상이 보임)까지의 범위의 "랜 스케일"을 이용하여 수행하였다.

그 결과를 도 11 - 도 15에 나타내었다. 도 11 - 도 12에 나타낸 바와 같이, 예를 들어, 검출 대역에서 0.5 mg/ml의 항체 농도는 0.2 내지 20 ㎍/ml의 CRP 농도 사이의 지시 대역에서 신호를 생성하지 않거나 또는 희미한 신호를 생성하였다. 항체 농도를 0.1 mg/ml로 감소시키면(도 13 - 도 14) CRP 라인("지시 대역") 신호 세기가 증가하였고 더 얕은 CRP 곡선을 생성하였다. 게다가, 금 접합체 농도를 광학 밀도 2.5로 증가시킴으로써, 항체 및 CRP 라인 둘 모두 신호 세기가 증가하였다(도 15). 또한, CRP 라인은 항체 신호가 그의 피크에 도달하는 지점 부근에서(예: "후크 효과" 지점에서) 쇠퇴하기 시작하였다.

본 발명을 그의 특이한 실시태양들에 관해서 상세히 기술하였지만, 당업계 숙련자는 상기 내용을 이해하면 이들 실시태양에 대한 변경, 변화 및 균등물을 쉽게 생각해낼 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 본 발명의 범위는 첨부된 특허 청구의 범위 및 그의 균등물의 범위로 평가되어야 한다.

Claims

접합된 검출 프로브와 소통이 이루어지는 다공성 막

을 포함하고, 분석물질이 상기 접합된 검출 프로브와 복합체(complex)를 형성할 수 있고, 상기 다공성 막이 분석물질이 접합된 검출 프로브와 복합체화되든 복합체화되지 않든 여하간에 분석물질과 우선적으로 결합하도록 구성된 제 1 수용 물질이 내부에 고정되고 측정가능한 검출 신호를 생성할 수 있는 검출 대역 및 검출 대역으로부터 하류에 위치하고 복합체화되지 않은 접합된 검출 프로브와 우선적으로 결합하도록 구성된 제 2 수용 물질이 내부에 고정되고 측정가능한 지시 신호를 생성할 수 있는 지시 대역을 한정하고,

상기 측정가능한 지시 신호의 세기를 분석물질의 포화 농도에서 또는 그 부근에서의 지시 신호의 세기 또는 세기 범위를 나타내는 참조 표준값과 비교해서 시험 샘플 내의 분석물질의 농도가 후크 효과 영역 내에 있는지의 여부를 결정할 수 있는 것인, 시험 샘플 내의 분석물질의 존재 유무 또는 양을 검출하기 위한 측방 유동 분석 측정 기구.
제 1 항에 있어서, 제 2 수용 물질이 분석물질과 공통인 1 개 이상의 에피톱을 갖는 측방 유동 분석 측정 기구.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 제 2 수용 물질이 항원 또는 그의 유사체를 포함하는 측방 유동 분석 측정 기구.
제 3 항에 있어서, 분석물질이 C-반응성 단백질인 측방 유동 분석 측정 기구.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 수용 물질이 항체 또는 그의 유사체를 포함하는 측방 유동 분석 측정 기구.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 다공성 막이 검정 신호를 생성할 수 있는 검정 대역을 추가로 한정하는 측방 유동 분석 측정 기구.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 분석물질의 농도가 검출 신호의 세기로부터 적어도 부분적으로 결정되는 측방 유동 분석 측정 기구.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 분석물질의 농도가 지시 신호의 세기로부터 적어도 부분적으로 결정되는 측방 유동 분석 측정 기구.
i) 접합된 검출 프로브와 소통이 이루어지고 검출 대역 및 검출 대역으로부터 하류에 위치하는 지시 대역을 추가로 한정하는 측방 유동 기구의 다공성 막과 시험 샘플을 접촉시키고,

ii) 검출 대역에서 생성된 검출 신호의 세기 및 지시 대역에서 생성된 지시 신호의 세기를 측정하고,

iii) 측정된 지시 신호 세기를 분석물질의 포화 농도에서 또는 그 부근에서의 지시 신호의 세기 또는 세기 범위를 나타내는 참조 표준값과 비교하는

것을 포함하는 시험 샘플 내의 분석물질을 정량적 또는 반정량적으로 검출하는 방법.
제 9 항에 있어서, 측정된 지시 신호 세기가 참조 표준값보다 작은지, 큰지 또는 동일한지를 토대로 하여 측정된 검출 신호 세기를 분석물질 농도 또는 농도 범위로 전환시키는 기술을 선택하는 것을 더 포함하는 방법.
제 10 항에 있어서, 검출 신호 세기를 기지의 분석물질 농도에 대해 플롯팅함으로써 용량 반응 곡선을 생성하는 것을 더 포함하는 방법.
제 11 항에 있어서, 측정된 지시 신호 세기가 참조 표준값보다 클 때는 시험 샘플 중의 분석물질의 농도가 용량 반응 곡선의 제 1 영역을 이용해서 결정되는 방법.
제 12 항에 있어서, 용량 반응 곡선의 검출 신호 세기가 제 1 영역 내에서 분석물질 농도와 거의 선형 관계를 갖는 방법.
제 11 항에 있어서, 측정된 지시 신호 세기가 참조 표준값보다 작을 때는 시험 샘플 중의 분석물질의 농도가 용량 반응 곡선의 제 2 영역을 이용해서 결정되는 방법.
제 14 항에 있어서, 용량 반응 곡선의 검출 신호 세기가 제 2 영역 내에서 분석물질 농도와 거의 선형 관계를 갖는 방법.
제 11 항에 있어서, 측정된 지시 신호 세기가 참조 표준값과 동일할 때는 용량 반응 곡선의 제 3 영역이 이용되고, 상기 제 3 영역은 분석물질 농도가 포함되는 범위를 제공하는 것인 방법.
제 16 항에 있어서, 지시 신호 세기가 제 3 영역 내에서 분석물질 농도와 거의 선형 관계를 갖는 방법.
제 11 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 용량 반응 곡선에 대해 일정한 민감도 범위를 달성하는 것을 돕기 위해, 용량 반응 곡선을 생성하는 데 사용되는 수용 물질 및/또는 접합된 검출 프로브의 농도를 선택적으로 조절하는 것을 더 포함하는 방법.
제 11 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 용량 반응 곡선을 생성하는 데 검정 신호 세기도 이용되는 방법.
제 10 항에 있어서, 측정된 지시 신호 세기가 참조 표준값과 거의 동일할 때는 다공성 막과의 접촉을 위해 제 2 시험 샘플이 희석되는 방법.