WO2013125855A1 - 신규한 항원의 검출방법 및 그를 이용한 장치 - Google Patents

신규한 항원의 검출방법 및 그를 이용한 장치 Download PDF

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WO2013125855A1
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signal
reaction
standard
region
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정찬일
이창섭
황정구
정종식
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주식회사 나노엔텍
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    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer

Definitions

  • the present invention relates to a novel antigen detection method and an apparatus using the same.
  • An immunoassay is mainly used as a measuring method of the existing antigen.
  • immunoassays are usually used to test items of tumor markers.
  • An immunoassay is a test using an antigen antibody reaction, which can measure a desired substance using an antibody that selectively binds to a substance to be measured.
  • the types and principles of representative immunoassays are as follows. The method used by each institution and the specific reaction conditions may be slightly different, but the basic principle is almost the same.
  • Particle immunoassay uses agglutination, which is caused by the binding of an antigen to an antibody, usually by attaching the antigen or antibody to red blood cells, latex, or gelatin. Reaction measures the expression of the humility.
  • the measurement of the coagulation can measure the degree of light absorption by turidimetry or the degree of light scattering by nephelometry.
  • Enzyme immunoassay measures the binding of antigens to antibodies using enzyme react ions. Usually, the enzyme is attached to the antibody that binds to the substance to be measured, and the antigen antibody reaction occurs. Subsequently, the reaction reaction occurs when a substrate is added to the bound enzyme. Common enzymes include alkaline phosphatase, horseradish peroxidase, and beta-galactosidase. The product of the enzyme reaction is usually a colored substance, which is measured by a spectrophotometer.
  • Radioimmunoassays measure the binding of antigens to antibodies using radioisotopes.
  • Radioisotopes are substances that are physically unstable and change naturally into stable substances, causing radioactive decay, and emit radiation in the process.
  • Antibodies are reacted by attaching radioisotopes to the same substance as the substance to be measured or by attaching radioisotopes to the antibody reacting with the substance to be measured. After the reaction, the amount of radiation from the reactant can be measured to calculate the desired concentration of the substance.
  • Radioisotopes include 125 1, 131 1, 3 ⁇ 4, 14 C, and 32 P.
  • Radioimmunoassays have been widely used in the past, but there is a risk of using radioactive materials, and their use is decreasing as methods such as chemiluminescence immunoassays are developed.
  • Fluorescence immunoassay measures the binding of antigen to antibody using fluorescence.
  • Fluorescent reflection refers to a reaction in which a fluorescent material absorbs light of a specific wavelength so that molecules of the fluorescent material are excited and returned to their original state to emit light of a wavelength different from that of the absorbed light.
  • an antigen-antibody reaction is caused by attaching a fluorescent substance to the same substance as the substance to be measured or by attaching a fluorescent substance to the antibody reacting with the substance to be measured.
  • chemiluminescence immunoassay measures the binding of antigens to antibodies using chemi luminescence.
  • a chemiluminescence reaction is a phenomenon in which a chemiluminescent substance emits light when it is excited and returns to the ground state, and differs from fluorescence in that the energy that excites molecules is not a light but a 5 chemical reaction.
  • chemoluminescent material is attached to the same substance as the substance to be measured, or chemoluminescent substance is attached to the antibody which reacts to the substance to be measured to generate an antigen antibody reaction. After the reaction takes place, the necessary chemical reaction is generated, and then the degree of emitted light emission is measured and measured therefrom.
  • the antigen detection method to be used in the present invention is based on the fluorescence immunoassay method. In the conventional fluorescence immunoassay method, antigen measurement values vary according to the concentration and reaction temperature of the sample, and thus the reproducibility and reliability of the data are increased.
  • the present inventors can establish an on-site diagnosis based on fluorescence immunoassay using antigen-antibody reaction, and establish an antigen detection system irrespective of analyte concentration and reaction resistance.
  • the present inventors made diligent research efforts to develop a novel method for detecting antigens. As a result, the present inventors, unlike the method for detecting antigens that specifically bind to only 30 test zones by allowing different detection antibodies to bind to the conventional test zone and the reference zone,
  • the same detection antibody is bound to the test zone and the reference zone, and thus a method for more accurately detecting the presence and amount of antigen has been developed.
  • the detection method of the present invention compared to the conventional antigen detection method, by controlling the flow (flow) and reaction time of the analysis sample to improve the reaction sensitivity, and minimize the effect of the concentration of the sample or the reaction reaction temperature data The present invention was completed by confirming that safety, reliability and reproducibility were improved. It is therefore an object of the present invention to provide a novel antigen detection method.
  • Another object of the present invention is to provide a novel antigen detection apparatus.
  • Other objects and advantages of the present invention will become apparent from the following detailed description, claims and drawings. [Measures of problem]
  • the present invention provides a method for detecting antigen in an assay sample comprising the following steps:
  • step (b) contacting the capture antibody that specifically binds to the antigen to be detected with the product of step (a);
  • the present inventors earnestly research to develop a novel method for detecting antigens. I tried. As a result, the present inventors attempt to detect in the standard region, unlike the method for detecting antigens that specifically bind only to the test region by allowing different detection antibodies to bind to the conventional test zone and the reference zone. By combining a reference substance containing the same epitope as the antigen, the same detection antibody binds to the test zone and the reference zone, thereby more accurately detecting the presence and amount of the antigen. We have developed a method for this.
  • the reaction sensitivity is improved by adjusting the flow and reaction time of analyte compared to the conventional antigen detection method, and the data by minimizing the influence by the concentration of the analyte or the detection reaction temperature It has been confirmed that the safety, reliability and reproducibility are improved.
  • the antigen detection method is a method for measuring the presence and amount of the antigen present in the assay sample, the inventors of the present invention in the conventional antigen detection method when the sample is human plasma, i) a reference material bound to the standard region It cannot be a human-derived peptide or a substance that can be bound thereto, and thus there is a limitation in selecting a standard. Also, different antigens can be bound to a test zone and a reference zone so that the antigen of each antibody can be bound. The detection result may vary depending on the affinity of the sample. Hi) When the sample is high in concentration, regardless of the saturation of the detection antibody bound to the test region, the detection antibody in the standard region continues to be standard.
  • the ratio of signal intensity in the measurement signal / standard area of the test area is not constant because it is bound to the area, and iv) basically using antigen-antibody reaction. Accordingly, the present inventors have made efforts to develop a method for detecting antigens to improve the above-mentioned effects.
  • a label that generates a detectable signal is bound and the assay sample is contacted with a detection antibody that specifically binds to the antigen.
  • Analytical samples from which the method of the present invention can be used are from any mammal. It includes, but is not limited to, derived organic materials and artificially synthesized organic molecules.
  • the assay sample is preferably whole blood, plasma, serum, body fluid or cell culture supernatant.
  • the organic molecules refer to molecules having a covalent bond between carbon, nitrogen, oxygen and / or sulfur atoms.
  • the organic molecules may be selected from small sized molecules such as carbon monoxide to complex large site molecules such as polymers, or the organic molecules may be glycoside molecules.
  • the term “antigen” includes all molecules that can be detected using the methods of the present invention.
  • the antigens are small molecules present in the body, such as drugs, toxins, autoantibodies, autoantigens, ! ⁇ , proteins, carbohydrates, nucleic acids and other molecules.
  • Antigens that may be present in the serum of a subject are not limited to drugs, for example barbiturates
  • TCA tricyclic antidepressants
  • digitalis cancer-related antigens (eg, antigens associated with breast, testicular, brain, liver, large intestine, pancreas, stomach or lung cancer), viral antigens (eg, HIV, Antigens associated with influenza or other viruses), bacterial antigens (eg systemic bacterial infections), hormones (eg thyroid hormones (TSH)),
  • cancer-related antigens eg, antigens associated with breast, testicular, brain, liver, large intestine, pancreas, stomach or lung cancer
  • viral antigens eg, HIV, Antigens associated with influenza or other viruses
  • bacterial antigens eg systemic bacterial infections
  • hormones eg thyroid hormones (TSH)
  • Human growth hormone progesterone, testosterone, chorionic gonadotropin (hCG), plasma proteins (e.g. fibrin degradation products (FDP), C-antifungal proteins (CRP), cancer embryonic antigens (CEA), ⁇ - Fetoprotein (AFP), cancer embryonic protein), protozoal antigens, plaque antigens, hapten (e.g., angiotensin I, vasopressin, somatostatin, atrial sodium diuretic hormone)
  • plasma proteins e.g. fibrin degradation products (FDP), C-antifungal proteins (CRP), cancer embryonic antigens (CEA), ⁇ - Fetoprotein (AFP), cancer embryonic protein
  • FDP fibrin degradation products
  • CRP C-antifungal proteins
  • CEA cancer embryonic antigens
  • AFP ⁇ - Fetoprotein
  • cancer embryonic protein protozoal antigens
  • plaque antigens e.g., angiotensin I, vasopressin, somatostatin, atrial
  • natriuretic hormone 25 natriuretic hormone, endoserine, luteinizing hormone secretion hormone (LHRH), cassin (kassinin) or other peptides), steroids (eg cortisol) and cytokines (eg interleukin-1, interferon ⁇ , interferon) - ⁇ , interferon interleukin-2, interleukin-4, interleukin-6 interleukin-7, interleukin-12, interleukin-15, ⁇ 7, CD28 or other
  • immunoglobulin superfamily (IgSF) members are immunoglobulin superfamily (IgSF) members.
  • hepatitis A virus hepatitis B virus, hepatitis C virus, influenza, varcella, adenovirus, herpes simplex virus type I, herpes simplex virus type II, rinderpest, rhinovirus echovirus, Rotavirus, Respiratory syncytial virus, Papillomavirus Papovavirus, Cytomegalovirus, Echinovirus, Arbovirus Hantavirus, Coxsackievirus, Mumpsvirus, Measles virus Rubella virus, Poliovirus, Human immunodeficiency virus type I Human immunodeficiency virus type ⁇ , Picornavirus family, Enterovirus togavirus (e.g.
  • the bacterial antigens include various known bacterial antigens and include, for example, Mycobacteria rickettsia, Mycoplasma, Neisseria sp., Legionella, Vibrio cholerae. , Streptococci, Corynebacteria diphtheriae, Clostridium tetani, Bordetel la pertussis, Haemophi lus spp., Chlamydia spp. Antigens associated with enterotoxigenic Escherichia coli or antigens produced by the bacteria, including but not limited to.
  • the protozoan antigens include a variety of known protozoan antigens and include, for example, antigens associated with Plasmodia, Eimeria, Leishmania or Trypanosoma, or antigens produced from such protozoa. Including but not limited to.
  • the cancer-related antigens include various known cancer related antigens and include, for example, survivin, cyclin Dl, Her2 / neu, K-ras, chymotrypsinogen, XIAPOi—linked inhibitor of apoptosis protein, basic fibroblast growth factor (bFGF), epidermal growth factor (EGF) receptor, carcinogenic antigen (CEA), prostate specific antigen (PSA), ⁇ -fetoprotein, ⁇ -2-microglobulin, bladder cancer antigen ( ⁇ ), chromogranin A, neuron-specific enolase, S-100 protein, ⁇ -90 protein, tissue peptide antigen ( ⁇ ) and human villi But not limited to sex gonadotropin (hCG).
  • the cancer associated antigen is a prostate specific antigen.
  • antigens of the present invention include contaminants, toxins, toxic chemicals, forensic substances or the like.
  • the antigen is a drug, toxin, autoantibody, autoantigen, protein, carbohydrate ⁇ nucleic acid or cancer related antigen, more preferably cancer related antigen.
  • the method of the present invention utilizes two types of antibodies, detection antibodies and capture antibodies.
  • detection antibody means an antibody capable of binding to the antigen or standard captured by the capture antibody.
  • capture antibody refers to an antibody capable of binding to the antigen to be detected in the assay sample.
  • Antibodies usable in the methods of the present invention are for detecting antigens in an assay sample and include epitopes of nucleotide sequences that specifically bind to antigens in the assay sample.
  • Antibodies as used herein include antibody fragments (eg F (ab ') 2, Fab', Fab, Fv) as well as whole antibodies capable of binding to epitopes, antigens or antigen fragments to be detected.
  • the antibody used in the present invention is a polyclonal or monoclonal antibody, preferably a monoclonal antibody.
  • Antibodies to such antigens are commonly known in the art, such as fusion methods (Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6: 511-519 (1976)), recombinant DNA methods (US Pat. No. 4,816). , 56) or phage antibody library method (Clackson et al, Nature, 352: 624-628 (1991) and Marks et al, J. Mol. Biol., 222: 58, 1-597 (1991)). Can be. General procedures for antibody preparation are described in Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. , Boca Raton, Florida, 1984; and Col igan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley / Greene, NY, 1991, which are incorporated herein by reference.
  • the detection antibody is bound to a label that generates a detectable signal.
  • signal means a detectable parameter, which includes the flow of optical, electrical or magnetic parameters, fluorescence emission, infrared radiation, ultraviolet radiation, chemiluminescence, light reflection and also the degree of absorption of the signal.
  • Labels that generate detectable signalols include chemicals (eg, biotin), enzymes (alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, horse radish peroxidase and cytokine ⁇ 450), radioactive substances (eg, 14 C, 125 I, 3 ⁇ 4, 32 P and 3 3 ⁇ 4), phosphors (eg fluorescein), luminescent materials, chemi luminescent and fluorescence resonance energy transfer (FRET), including but not limited to No.
  • phosphors eg fluorescein
  • luminescent materials eg chemi luminescent and fluorescence resonance energy transfer (FRET), including but not limited to No.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • a variety of labeling and labeling methods are described in Ed Harlow and David Lane, Using Ant i Bodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999.
  • a fluorescent material is used as a label to generate a detectable signal. Is used.
  • the label may be observed with different fluorescence signals depending on the wavelength emitted, preferably the label is bound to the capture antibody or standard in the form of binding to the detection antibody.
  • the label may include a variety of known fluorescent materials, for example, fluorosane and its derivatives, rhodamine and its derivatives, phycoerythrin, lucifer yellow, B-phytoerythroline, 9 ′ acridine isothiocia Nate, Lucifer Yellow VS, 4-acetamido-4'-isothio-cyanatostilben-2, 2'-disulfonic acid, diethylamino-3- (4 1 -isothiocyatophenyl)- 4-Methylcoumarin, Succinimidyl-pyrenebutyrate, 4-acetamido-4'-isothiocyanatostilbene-2,2'-disulfonic acid derivative, LC TM -Red 640, LC TM -Red 705
  • the signal emitted by the label bound to the antigen-specific detection antibody is measured as a fluorescence signal, and the presence or absence and amount of the antigen to be detected by measuring both signals of the test region and the standard region, respectively. can confirm.
  • the detection and capture antibodies have an affinity that specifically binds to the antigen and do not react with any other reagents used in the methods of the invention.
  • step (a) is contacted with a capture antibody that specifically binds to the antigen to be detected. That is, the result of step (a) is bound to the antigen-specific capture antibody or standard in the test zone or reference zone.
  • the term "capture antibody” is as described above in step (a).
  • the capture antibody is bound to the surface of the solid substrate, the capture antibody is present on the surface of the substrate of one semi-barrel container in which a continuous flow of the counter acupuncture is carried out, It is a microchip having.
  • solid substrate may be used in the same sense as a solid support or a solid phase, and means a non-liquid material.
  • the solid substrate may preferably be formed in the microchannel and may be present, for example, as a membrane, part of a capillary or as small diameter beads flowed / glued into the microchannel.
  • Known materials of this type include polystyrene and hydrocarbon polymers such as polypropylene, glass, metals, and gels.
  • the solid substrates may include dipsticks, microtiter plates, particles (such as beads), affinity columns and immunonobles. Lot membranes (eg, polyvinylidene fluoride membranes). See, eg, US Pat. Nos. 5,143,825, 5,374, 530, 4, 908,305, and 5,498,551.
  • the microchannel of the microchip comprises a test zone and a reference zone.
  • the capture antibody is coupled to a surface of the test region, and the standard is coupled to the standard region.
  • test zone refers to a compartment included in the microchannel of the microchip, wherein the capture antibody is bound to the surface of the test zone, and the capture antibody is the antigen to be detected and the antigen thereof.
  • the term “reference zone” refers to a compartment included in the microchannel of the microchip, and a reference substance is bound to the surface of the reference region, and the antigen to be detected is detected in the reference substance.
  • the term “standard” means a substance to which the detection antibody can bind, and according to a preferred embodiment of the present invention, the standard is the same substance as the antigen or of the antigen including the epitope. It is a fragment.
  • the antibody, antigen or standard can be attached to a solid substrate by physical adsorption or chemical adhesion. Physical adsorption is carried out by reaction between the solid phase material and the antibody or antigen in the appropriate supernatant.
  • the complete solution include phosphate buffer, tris-hydrochloride buffer, and carbonate complete solution.
  • the reaction is carried out by mixing and maintaining the complete layer at 4-37 ° C., especially at room temperature for a certain time. Chemical attachment is feasible by using the carbodiimide method in the peptide attachment method.
  • chemistries include 2, such as glutaraldehyde or cyanuric chloride ("peptide synthesis", Maruzen, 1975 or “enzyme immunoassay Gyozo Shupan,” protein nucleic acid enzymes ", Special Issue 31, 1987). Is the method performed with the crosslinking reagent.
  • the analytical sample is applied to the microchip and the applied analyte is in contact with the test area and the standard area through a flow formed in the microchannel.
  • the analytical sample may sequentially contact the test region and the standard region, or may sequentially contact the standard region and the test region.
  • the detection method of the present invention provides an analysis sample to the detection antibody. Although it is expressed as contacting the capture antibody after contact, this is for convenience of the description, the detection method of the present invention i) if the process is reversed, i.e. contacting the sample with the capture antibody preferentially And then contacting the reaction product of the analyte and capture antibody with the detection antibody and ii) simultaneously contacting the analyte with the detection antibody and capture antibody.
  • a label which, after contacting a detection antibody with the result of step (a), generates a detectable signal to a reference substance comprising an epitope to which the detection antibody specifically binds and bound to a solid substrate surface Contact the detection antibody to which is bound.
  • epitope refers to an antigenic determinant site of an antigen to which an antibody binds
  • the standard may include one or more kinds of epitopes or may include one or more of the same epitopes.
  • the epitope to which the detection antibody binds is preferably selected from a sequence that can be found only once on a standard. Step (0): Signal Measurement
  • the presence and amount of the antigen is determined according to the amount of the signal, and the term "amount" is a physical parameter, provided that the sensitivity of the signal is contained within a certain level that can be measured. The degree to which the intensity of the signal is increased, decreased or maintained. For example, if the increase of the signal is increased by 10 units and the measurement sensitivity of the signal is within the range of 1 unit, the signal amount can be measured. The amount of the signal can be expressed in any unit.
  • the step (a)-(d), or the step (b)-(d) may be carried out in a microchip equipped with a microchannel, and the signal analysis starts the reaction provided by the microchannel. This is done by measuring the signal in the zone, test zone, standard zone and reaction termination zone. The error rate (%) can be calculated from the signals of the reaction area and the reaction area. If the error rate is 20% or more, the analysis is repeated to increase the reliability of the test area and standard area signals.
  • error rate is used because the analytical results of the signal may be different because of the inconsistent viscosity or flow of the analyte, and the analytical result of the signal may be different due to the immaturity of the experimenter performing the analysis. This value is measured to minimize the error caused and to obtain the reliability of the data.
  • banung start area and “banung end area” are sections included in the microchannel of the microchip, and are part of a section (0-900) obtained by dividing the signal measurement area in the microchannel by a predetermined interval.
  • the reaction start region and the reaction termination region may be variable according to the type of antigen.
  • the reaction zone is the region of 180-370 of the entire "0-900" range, the semi-ung end region corresponds to the compartment of 700-880 (See FIG. 1).
  • the signal measurement area in the microchannel is composed of reaction start area, test area, standard area and reaction end area.
  • the signal amount is calculated as follows.
  • the horizontal axis is represented by the division (0-900) divided by the signal measurement area within the microchannel, and the vertical axis is represented by the amount (intensity) of the fluorescent signal.
  • Standard area fluorescence signal -n ° ( ⁇ -Xb)
  • Xb fluorescence signal average value of at least 50 points of microchannels 0-900)
  • Xrc fluorescence signal at the center point of the standard region
  • the fluorescence signal at the reaction starting region is the mean value of the signal at each point from Xtc- (Xrc-Xtc) -30 to Xtc- (Xrc-Xtc) +30.
  • the fluorescence signal in the end region is the signal average value at each point from Xrc + (Xrc-Xtc) -30 to Xrc + (Xrc-Xtc) +30.
  • Equation 5 The error rate is calculated as follows. Equation 5
  • Error rate (%) [1 (signal of reaction start region-signal of reaction end region)
  • the analysis of the measured signal is performed in step (b By calculating the ratio of the intensity of the signal generated from the label of the product of (c) and the product of (c).
  • Conventional antigen detection methods bind a substance (capture antibody in the present invention) that specifically binds to an antigen to be detected in a test zone, and a human-derived antigen binds to a reference zone.
  • a number of foreign substances were combined to measure the signal generated in each area, and the signal in the standard area was used as a value to calibrate the signal in the test area. Even with samples of the same concentration, differences in sample viscosity cause the velocity (reflection velocity) of the sample to flow into the microchannel, causing the signal in the test region to be blocked.
  • “Substantially” means that it is not affected at all by the difference in viscosity of the sample, and also when it is affected by the viscosity of the sample but is so weak that it cannot be affected by the difference in viscosity of the sample. to be.
  • the ratio value of the signal intensity in the test region and the standard region is maintained almost constant as ⁇ 2.0, despite the difference in viscosity of the sample, which substantially affects the difference in viscosity of the sample. Means not receiving.
  • the method for example, when the analytical sample is human serum, i) the reference material bound to the standard region cannot be a peptide derived from human or a substance which can be bound thereto, and thus there is a limitation in selecting a standard material.
  • the reference material bound to the standard region cannot be a peptide derived from human or a substance which can be bound thereto, and thus there is a limitation in selecting a standard material.
  • the ratio value of the intensity of the signal generated from the label of the product of step (b) and the product of step (C) is linearly proportional to the concentration of the sample of step (a).
  • the ratio value of the intensity of the signal resulting from the labeling of the product of step (b) and the product of step (c) substantially affects the change in temperature at which the method is carried out. Do not receive.
  • the term "substantially” is intended to include cases that are not affected by temperature changes at all, and are affected by temperature, but may be so small that they cannot be affected by temperature changes.
  • the ratio value of the signal intensity in the test area and the standard area is maintained almost constant as ⁇ 0.17 despite the change in temperature, which indicates that the ratio value of the signal intensity is not substantially affected by the temperature change. it means .
  • the ratio value of the intensity of the signal generated from the label of the product of step (b) and the product of step (c) is the same in the temperature range of 10-30 ° C. in which the method is carried out. Indicates a value.
  • the antigen can be quantitatively detected even in a sample containing a high concentration of antigen, for example, an antigen having a concentration of 1800 ng / ml or more.
  • the concentration of PSA antigen can be determined according to the T / R ratio graph measured experimentally in the sample having the PSA concentration in the range of 0.0001-1500 ng / ml, and the PSA concentration is 1500-1800 ng. At concentrations above / ml and 1800 ng / ml, the concentration of antigen can be seen on the extension of the experimentally obtained graph.
  • the concentration of PSA antigen can be determined according to the T / R ratio graph measured experimentally in a sample having a PSA concentration in the range of 0.0001-4500 ng / mL, and the experimentally obtained at the concentration having a PSA concentration of 4500 ng / ml or more.
  • the concentration of the antigen on the extension of the graph can be seen.
  • the present invention provides an apparatus for detecting antigen in an assay sample comprising:
  • test zone formed at one site of the microchannel and having a capture antibody bound to a surface specifically binding to an antigen to be detected
  • the detection device using the method of the present invention is not affected by the affinity of the antibody, the concentration of the analyte, and the detection temperature, so that the amount of the antigen to be detected can be accurately measured and can be easily manipulated without any professional skills. On-site diagnosis of target antigen detection is possible.
  • the antigen detecting apparatus of the present invention uses the above-described antigen detecting method of the present invention, and the contents common between the two are omitted in order to avoid excessive complexity of the present specification.
  • the antigen detection device includes a microchip that accommodates the assay sample and reacts. Receiving analytical sample in the microchip Microchannels are provided, and the microchannels may have various depths.
  • the microchip capable of receiving an assay sample may include one or more microchannels, and the microchannels may be combined with capture antibodies and standards for detecting different antigens.
  • the microchannel includes a reaction zone start zone, a standard zone, and a reaction zone end. Preferably, each of the zones is located in the order of the reaction zone start, the test zone, the standard zone, and the reaction zone.
  • the detection apparatus using the method of the present invention described above is represented as performing the reaction of the analyte sample, the capture antibody and the detection antibody, and the reaction of the reference material and the detection antibody as each step, but this is for convenience of description.
  • the antigen detection apparatus of the present invention can measure the presence and amount of antigen only by dispensing an assay sample on a microchip. Therefore, the microchip preferably includes i) reagents, standards and capture antibodies, or ⁇ ) reagents, standards, and detection antibodies combined with signal emission labels, which are used in the antigen detection method. After dropping an assay sample in a microchannel, the microchip is mounted in the apparatus according to the present invention, and the presence and amount of the detected antigen are automatically measured. Therefore, it is easy to use and suitable for on-site diagnosis, so it can be easily used by not only experts but also ordinary people.
  • the microchannel may include an inlet for injecting an analyte, and when the analyte is introduced into the microchannel through the inlet, the microchannel detects an antigen to be detected through the microchannel or the amount of antigen. In order to measure the reaction, the reaction may be performed.
  • a labeling reaction of an analytical sample using a fluorescent substance or the like or a specific reaction of an analytical sample using an antigen-antibody reaction to detect an antigen to be detected may be performed. It can be done in a microchannel. That is, by using the antigen-antibody specific reaction of the protein, only the desired antigen can be selectively identified through various detection means such as a sensor later.
  • the labeled analyte passes through the microchannel, whereby One cross section is exposed to the optical sensor, which may be used to detect a fluorescence signal.
  • test region is formed in one portion of the microchannel and is designed such that a capture antibody specifically binding to the antigen to be detected is bound to the surface.
  • the reference region is formed in a portion of the microchannel and is designed such that a reference substance including an epitope to which the detection antibody specifically binds is bound to the surface.
  • the device may further include a detection antibody that binds a label that generates a detectable signal and specifically binds to the antigen.
  • the apparatus may further include measuring means for measuring a signal generated from the label, or the apparatus may measure the ratio of the intensity of the signal measured in the test region and the standard region. It may further include an analysis means for calculating.
  • the measuring means refers to a component of the device through which a signal generated from the label bound to the detection antibody passes, and includes, for example, an optical component.
  • the measuring means passes the fluorescent signal to the signal analyzing means, and partially converts the fluorescent signal into an electrical signal.
  • the measuring means may exist integrally with the device according to the invention or may exist as an independent device.
  • the analyzing means may be used in the same sense as a signal processor, and means a component of an apparatus capable of partially modifying a signal measured in the test area and the standard area or correcting a measured value of the signal. do.
  • the analyzing means may simultaneously operate with the optical element and convert the fluorescent signal into an electrical signal.
  • the method and apparatus of the present invention can be used in a variety of ways, such as the presence of benign and malignant prostate cancer cells using prostate specifie antigens (PSAs) as tumor markers when detecting prostate cancer-associated antigens. Clinical judgment of recurrence, risk, and metastasis of prostate cancer is possible, and the disease progress can be reported promptly.
  • the method of the present invention can be used to evaluate the efficacy of a drug used in the treatment of prostate cancer.
  • the present invention relates to a novel antigen detection method and an antigen detection apparatus using the same.
  • the antigen detection method of the present invention is different from the conventional method for detecting an antigen that specifically binds a substance having different epitopes to a test zone and a reference zone. By binding a reference substance containing the same epitope as the antigen to be detected to the region, the presence and amount of the antigen can be detected more accurately.
  • the detection method of the present invention can control the flow and the reaction time of the sample compared to the conventional antigen detection method to improve the reaction response, the effect of the concentration of the sample or the reaction reaction temperature Minimizes data safety, reliability and reproducibility.
  • the antigen detection method and detection apparatus of the present invention can be easily manipulated without specialized technology, so that the presence and amount of the detection antigen in the analytical sample can be immediately identified by on-site diagnosis.
  • the horizontal axis represents the division of the signal measurement area in the microchannel by a predetermined interval, and the vertical axis represents the numerical value of the fluorescence signal intensity.
  • Figure 2a is a conventional antigen detection method using the rabbit IgG standard system, (i) test area and standard area signal strength according to the concentration of the sample and (ii) test area / standard area signal strength according to the concentration of the sample The ratio values of are plotted respectively.
  • Figure 2b is a test area according to the concentration of analyte sample (i) test area and standard area signal intensity and (ii) test area according to the concentration of analyte using a prostate specific antigen (PSA) standard system using the method of the present invention / The ratio values of the signal intensity of the standard area are shown in graphs.
  • PSA prostate specific antigen
  • Figure 3a is a graph using the rabbit IgG standard system, (i) test area and standard area signal strength according to the measurement temperature and (ii) test area / standard area signal strength ratio value according to the measurement temperature.
  • FIG. 3B shows the test and standard zone signal intensities according to the measured temperature using the prostate specific antigen (PSA) standard system .
  • PSA prostate specific antigen
  • Figure 4 is a test area according to the measurement temperature and standard region signal intensity according to the measurement temperature (i) using the existing antigen detection method (Rabbit-Goat ant i -Rabbit system) (Fig. 4a) and (ii) the test region / The ratio values of the signal intensity of the standard region (Fig. 4b) are respectively shown in the graph.
  • FIG. 5 shows the test area and standard area signal intensity according to the measurement temperature (FIG. 5A) and (ii) the test area / standard according to the measurement temperature using a conventional antigen detection method (Taq-Mouse anti-Taq system).
  • the ratio values of the area signal strengths (Fig. 5b) are respectively shown in the graph.
  • FIG. 6 shows the test and standard region signal intensities (FIG. 6A) and (ii) measurement temperature according to the measurement temperature using the antigen detection method (PSA-Mouse ant i-PSA system) using the method of the present invention.
  • the ratio of the test area / standard area signal strengths according to the present invention (Fig. 6b) is shown in a graph.
  • FIG. 7 is a graph showing ratio values of test area / standard area signal intensity according to measurement temperature using an antigen detection method of Biosite.
  • FIG 8 is a graph showing the ratio of test area / standard area signal intensity according to the concentration of analyte, using a prostate specific antigen (PSA) standard system using the method of the present invention.
  • PSA prostate specific antigen
  • FIG. 9 is a ratio of test area / standard area signal intensity of a high concentration assay sample using a prostate specific antigen (PSA) standard system and a conventional antigen detection method (Rabbit—Goat ant i-Rabbit system) using the method of the present invention. Each value is graphed.
  • PSA prostate specific antigen
  • Rabbit—Goat ant i-Rabbit system conventional antigen detection method
  • the blood sample used in the present invention was a blood sample of a patient referred to the Department of Diagnostic Laboratory Medicine, Ansan Hospital, Korea University. The patient group was randomly selected.
  • the amount of antigen in the patient sample was measured using a detection device using the method of the present invention.
  • the patient group was a prostate cancer patient, and the amount of PSA present in the serum of the patient was measured using prostate specific antigen (PSA) as a tumor marker.
  • PSA prostate specific antigen
  • Prostate specific antigen is a single chain 33 kDa glycoprotein, usually produced by human prostate epithelium, present at a concentration of 0.5 to 2.0 rag / in human semen.
  • Prostate-specific antigens are synthesized in epithelial cells of the prostate It is a proteolytic enzyme that is rarely expressed in tissues other than the prostate and is a useful tumor marker for screening prostate cancer.
  • Prostate-specific antigens are specific to prostate tissue but not tumor-specific and can increase in prostate hyperplasia, prostatitis, prostate infarction, and can be useful for screening prostate cancer as well as for determining recurrence after surgery.
  • Xrc fluorescent signal at center point of standard area
  • Xb fluorescence signal average value of at least 50 points among the positions of the microchannels 0-900
  • 0-900 refers to a partition obtained by dividing the signal measurement region in the microchannel by a predetermined interval.
  • the signal of patient B was high when compared only by the signal intensity, but the ratio of signal intensity in the test area and the standard area was calculated, respectively, and the amount of prostate specific antigen in the samples of both patients was analyzed to be the same.
  • the standard deviation (CV,%) value that can occur in the ratio value of the signal strength of each test region and the standard region was calculated (Table 2).
  • One of the assay samples was selected and the same assay sample was dispensed into five cartridges, respectively, and then analyzed.
  • the purpose of the antigen detection method of the present invention is to adjust the flow of the analytical sample, and to adjust the reaction time to remove the disadvantages seen in the flow reaction to increase the reaction sensitivity as much as possible, experiments related to whether this object is achieved . That is, an error rate analysis was performed to verify whether the signal measurement value measured by the antigen detection method of the present invention is valid, and the method of calculating the error rate is expressed by Equation 3 to Equation 5.
  • Xn Fluorescent Signal at n
  • Xrc fluorescence signal at center point of standard area ⁇ signal of start area-end of return area 100
  • Xrc fluorescence signal at center point of standard area ⁇ signal of start area-end of return area 100
  • the cartridges 1 to 5 signals in the reaction zone and the reaction zone were measured, and error rates were calculated from the reaction zone and the reaction zone (Table 3 and FIG. 1). Reference).
  • the resolution of the measurement result in the case where the analyte was high concentration was compared.
  • the prostate specific antigen detection experiment was performed as follows.
  • a highly concentrated patient sample in a nonlinear section was selected and measured using a detection device using the present invention.
  • Sample to the sample injection (inlet) region of the chip lipoprotein lipase is not present or exists always 3 ⁇ 4 o ⁇ glass-hyeolpyo-1-plasma-30 eu / a-trembling of ⁇
  • the chip was inserted into the antigen detection device according to the present invention. After about 40 seconds, the presence of prostate specific antigen in the sample was quantitatively displayed on the display of the detector, and the signal intensity values of the test area and the standard area were displayed.
  • the detection experiment of PSA was performed using the detection method of this invention as follows.
  • Example 2-1 The same experimental method as Example 2-1 was carried out, and the same sample was used.
  • the PSA detection experiment was performed as follows.
  • the detection experiment of PSA was performed using the detection method of this invention as follows.
  • Example 3-1 The same experimental method as Example 3-1 was used and the same sample was used.
  • Example 3-1 The same experimental method as Example 3-1 was used, and the same sample was used.
  • the signals of the test zone and the standard zone were measured at three temperatures, respectively, and the representation values were calculated to represent them on the graph.
  • the expression value is calculated as follows. Draw a standard concentration graph using a reference substance for each concentration that reacts specifically to the test area. The function that fills this graph is input to the code chip of the detection device used in the present invention. As a result, the signal coming out of the test area allowed the expression value of the concentration to be calculated to be calculated. (Table 4 and Table 5). As a result, Rabbit IgG standard system (Figs. 4A and 4B, 33% variation in temperature), Taq IgG standard system (Figs. 5A and 5B, variation coefficient in temperature 36.9%) and When using the biosite detection method (Fig.
  • Table 6 shows the results of measuring the ratio of test area / standard area signal intensity according to the concentration of analyte using a prostate specific antigen (PSA) standard system using the method of the present invention.

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Abstract

본 발명은 다음의 단계를 포함하는 분석시료 내 항원의 검출방법에 관한 것이다: (a) 검출가능한 시그널을 발생시키는 표지가 결합되어 있고 상기 항원에 특이적으로 결합하는 검출항체와 분석시료를 접촉시키는 단계; (b) 검출하고자 하는 항원에 특이적으로 결합하는 포획항체를 상기 단계 (a)의 결과물에 접촉시키는 단계; (c) 상기 검출항체가 특이적으로 결합하는 에피토프를 포함하며 고상 기질 표면에 결합되어 있는 표준물질(reference substance)에 상기 검출가능한 시그널을 발생시키는 표지가 결합되어 있는 검출항체를 접촉시키는 단계; (d) 상기 단계 (b)의 결과물 및 (c)의 결과물의 표지로부터 발생되는 시그널을 측정하는 단계; 및 (e) 상기 측정된 시그널을 분석하여 상기 분석시료 내 항원의 존재 여부 또는 양을 결정하는 단계. 본 발명의 항원 검출방법은 종래의 항원 검출방법에 비해 분석시료의 유동(flow) 및 반응시간을 조절할 수 있어 반응감도가 향상되었고, 분석시료의 농도 또는 검출반응 온도에 의한 영향을 최소화하여 데이터의 안전성, 신뢰도 및 재현성이 우수하다. 또한 본 발명의 항원 검출방법 및 검출장치는 전문적인 기술 없이도 쉽게 조작이 가능하여 분석시료 내 검출항원의 존재유무 및 양을 현장진단으로 즉시 파악할 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
신규한 항원의 검출방법 및 그를 이용한 장치
[기술분야】
본 발명은 신규한 항원의 검출방법 및 그를 이용한 장치에 관한 것이다. 【배경기술】
복잡한 시료 중의 분석 대상 (예컨대， 항원)을 신속하고 간단하게 측정할 뿐만 아니라， 측정값의 신뢰도가 높은 항원 검출방법 개발의 중요성이 커지고 있다. 예를 들면, 병원의 웅급 상황에 있어서 임상 진단의 요점은 미숙련된 기사가 복잡한 화학적 또는 면역 화학적 분석방법을 실시하여 환자의 상태를 신속， 정확하게 측정하는 것이다. 이 검사는 통상 임상 화학자로서 훈련을 받고 있지 않은.병원의 스랩 또는 간호사에 의해 실시된다. 혈액시료를 병원의 검사실에 이송하고 분석을 실시하고 있는 현재의 임상 진단 시스템은 신속한 검사결과가 요구되는 경우에는 부적당하다. 따라서 분석 켤과가 단시간 내에 가능하고, 병원의 진단 시스템에 있어 검사를 실시하는 직원 및 장치가 상기 요구에 적합한 측정 방법이 요구된다.
기존의 항원의 측정 방법으로서 면역 검사 (immunoassay)가 주로 이용된다. 특히 종양표지자의 항목들을 검사하는 데는 대개 면역 검사 (immunoassay)가 이용된다. 면역 검사는 항원항체 반웅을 이용한 검사로， 측정하고자 하는 물질에 선택적으로 결합하는 항체를 이용해서 원하는 물질을 측정할 수 있다. 대표적인 면역 검사의 종류와 원리는 다음과 같다. 기관별로 사용하는 방법과 구체적인 반웅 조건은 약간 차이가 있을 수도 있으나 기본 원리는 거의 동일하다.
웅집법 (particle immunoassay)은 항원과 항체의 결합에 의해 웅집 반웅 (agglutination)이 나타나는 것을 이용한다, 대개 적혈구나 라텍스 (latex), 젤라틴 (gelatin) 등에 항원이나 항체를 부착시켜 이 입자가 반웅하면 웅집을 나타내는 것을 측정한다. 웅집 측정은 빛의 흡수 정도를 흔탁 측정법 (turidimetry)으로 측정하거나 빛의 산란 정도를 비탁법 (nephelometry)로 측정할 수 있다.
효소 면역 측정법 (enzyme immunoassay, EIA)은 항원과 항체의 결합을 효소 반응 (enzyme react ion)을 이용하여 측정한다. 대개 측정하고자 하는 물질에 결합하는 항체에 효소를 미리 부착시켜놓고 항원항체 반웅을 일으킨다. 그 후 결합한 효소에 반응하는 기질을 넣어주면 효소 반웅이 일어나게 된다. 흔히 이용하는 효소는 알카리성 인산분해효소 (alkaline phosphatase) , 당근과산화효소 (horseradish peroxidase) , 베타갈라토시다제 (β-galactosidase) 등이 있다. 효소 반웅의 산물은 대개 색깔을 띠는 물질로 이를 분광광도계 (spectrophotometer)로 측정한다.
방사 면역 측정법은 항원과 항체의 결합을 방사성동위원소 (radioisotope)를 이용하여 측정한다. 방사성동위원소란 물리적으로 불안정하여 자연적으로 붕괴 (radioactive decay)를 일으키면서 안정한 물질로 바뀌고， 이 과정에서 방사선을 방출하는 물질이다. 측정하고자 하는 물질과 같은 물질에 방사성동위원소를 부착하거나， 또는 측정하고자 하는 물질에 반웅하는 항체에 방사성동위원소를 부착하여 항원항체 반웅을 일으킨다. 반웅이 끝난 후 반응물에서 나오는 방사선의 양을 측정하여 원하는 물질의 농도를 계산해낼 수 있다. 많이 이용하는 방사성동위원소들은 1251， 1311, ¾， 14C, 32P 등이 있다. 방사면역측정법은 과거에 많이 이용되었으나 방사성 물질을 사용해야 하는 위험이 있고, 화학 발광 면역 측정법 같은 방법들이 개발되면서 쓰임새가 감소하는 추세이다. 형광 면역 측정법은 항원과 항체의 결합을 형광 반웅 (fluorescence)을 이용하여 측정한다. 형광 반옹이란 형광 물질이 특정 파장의 빛을 흡수하여 형광 물질의 분자가 여기 (excitation)되었다가 다시 원래의 상태로 돌아오면서 흡수한 빛과는 다른 파장의 빛을 내는 반응을 말한다. 면역 측정에 이용할 때에는 측정하고자 하는 물질과 같은 물질에 형광 물질을 부착하거나， 또는 측정하고자 하는 물질에 반웅하는 항체에 형광 물질을 부착하여 항원항체 반응을 일으킨다. 반응이 일어난 후 형광 반웅을 일으킬 수 있는 파장의 빛을 투사하면 형광 물질의 양에 비례하여 형광을 내고， 이 형광의 양으로부터 측정 물질의 농도를 계산한다. 화학 발광 면역 측정법은 항원과 항체의 결합을 화학 발광 반응 (chemi luminescence)을 이용하여 측정한다. 화학 발광 반웅이란 화학 발광 물질이 여기 (excitation)되었다가 기저 상태 (ground state)로 돌아오면서 빛을 발하는 현상으로， 분자를 여기시키는 에너지가 빛이 아닌 5 화학 반응이라는 점에서 형광과 다르다. 면역 측정에 이용할 때에는 다른 방법들과 마찬가지로 측정하고자 하는 물질과 같은 물질에 화학 발광 물질을 부착하거나， 또는 측정하고자 하는 물질에 반웅하는 항체에 화학 발광 물질을 부착하여 항원항체 반웅을 일으킨다. 반웅이 일어난 후 필요한 화학 반웅을 일으킨 후, 발산되는 발광의 정도를 측정하여 이로부터 측정
10 물질의 농도를 계산한다. 대표적인 발광 물질로는 루미놀 (luminol), 이소루미놀 (isoluminol), 아크리디늄에스터 (acridinium ester) 등이 있다. 본 발명에서 이용하고자 하는 항원 검출방법은 형광 면역 측정법을 기반으로 한 것으로서, 종래의 형광 면역 측정법은 시료의 농도 및 반웅온도에 따라 항원의 측정수치가 달라져， 데이터의 재현성 및 신뢰도가
15 떨어지는 문제점이 있어 이를 개선하기 위한 방법으로 개발되었다. 따라서 본 발명자들은 항원 -항체 반웅을 이용한 형광 면역 측정법을 기반으로 하여ᅳ 현장진단이 가능하고， 분석시료의 농도 및 반웅은도에 구애받지 않는 항원 검출 시스템을 확립하고자 한다.
20 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허 문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
25 【발명의 내용】
【해결하려는 과제】
본 발명자들은 신규한 항원의 검출방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 종래 시험영역 (test zone)과 표준영역 (reference zone)에 서로 다른 검출항체가 결합하도록 하여 30 시험영역에만 특이적으로 결합하는 항원을 검출하는 방법과 달리,
—ᅳᅳ—표준땅악에一 껑출하고쩌 하는—ᅭ청원과一동완한ᅩ 에ᅵ피토프를; ^함하는 표준물질 (reference substance)을 결합시킴으로써, 시험영역 (test zone)과 표준영역 (reference zone)에 동일한 검출항체가 결합하도록 하여， 보다 정확하게 항원의 존재 및 양을 검출할 수 있는 방법을 개발하였다. 본 발명의 검출방법올 이용하여, 종래의 항원 검출방법에 비해 분석시료의 유동 (flow) 및 반웅시간을 조절하여 반웅감도를 향상시키고, 분석시료의 농도 또는 검출반웅 온도에 의한 영향을 최소화하여 데이터의 안전성, 신뢰도 및 재현성이 향상됨올 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다. 따라서 본 발명의 목적은 신규한 항원의 검출방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 신규한 항원의 검출장치를 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다. 【과제의 해결 수단】
본 발명의 일 양태에 따르면， 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 분석시료 내 항원의 검출방법을 제공한다:
(a) 검출가능한 시그널을 발생시키는 표지가 결합되어 있고 상기 항원에 특이적으로 결합하는 검출항체와 분석시료를 접촉시키는 단계;
(b) 검출하고자 하는 항원에 특이적으로 결합하는 포획항체를 상기 단계 (a)의 결과물에 접촉시키는 단계;
(c) 상기 검출항체가 특이적으로 결합하는 에피토프를 포함하며 고상 기질 표면에 결합되어 있는 표준물질 (reference substance)에 상기 검출가능한 시그널을 발생시키는 표지가 결합되어 있는 검출항체를 접촉시키는 단계;
(d) 상기 단계 (b)의 결과물 및 (c)의 결과물의 표지로부터 발생되는 시그널을 측정하는 단계 ; 및
(e) 상기 측정된 시그널을 분석하여 상기 분석시료 내 항원의 존재 여부 또는 양을 결정하는 단계. 본 발명자들은 신규한 항원의 검출방법올 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 종래 시험영역 (test zone)과 표준영역 (reference zone)에 서로 다른 검출항체가 결합하도록 하여 시험영역에만 특이적으로 결합하는 항원을 검출하는 방법과 달리, 표준영역에 검출하고자 하는 항원과 동일한 에피토프를 포함하는 표준물질 (reference substance)을 결합시킴으로써 , 시험영역 (test zone)과 표준영역 (reference zone)에 동일한 검출항체가 결합하도록 하여， 보다 정확하게 항원의 존재 및 양을 검출할 수 있는 방법을 개발하였다. 본 발명의 검출방법을 이용함으로써， 종래의 항원 검출방법에 비해 분석시료의 유동 (flow) 및 반웅시간을 조절하여 반응감도를 향상시키고， 분석시료의 농도 또는 검출반응 온도에 의한 영향을 최소화하여 데이터의 안전성， 신뢰도 및 재현성이 향상됨올 확인하였다.
상기 항원의 검출방법은 분석시료 내 존재하는 항원의 존재 및 양을 측정하는 방법으로서， 본 발명자들은 종래의 항원 검출방법에서 분석시료가 인간의 혈장인 경우, i ) 표준영역에 결합된 표준물질은 인간 유래의 펩타이드 또는 이와 결합가능한 물질일 수 없어 표준물질의 선정에 한계가 있고， 또한 Π) 시험영역 (test zone)과 표준영역 (reference zone)에 서로 다른 검출항체가 결합하도록 하여 각각 항체의 항원에 대한 친화도 (affinity)에 따라 검출결과가 달라질 수 있으며， Hi) 분석시료가 고농도인 경우， 시험영역에 결합되는 검출항체의 포화도와는 무관하게， 표준영역의 검출항체는 계속 일정수준으로 표준영역에 결합되므로, 시험영역의 측정시그널 /표준영역의 시그널 세기의 비율값이 일정하지 않고, iv) 기본적으로 항원 -항체 반웅을 이용함에 따라, 부수적으로 문제되는 온도에 따른 영향을 배제할 수 없는 점에 착안하여， 이를 개선하기 위한 항원의 검출방법을 개발하고자 노력하였고, 그 결과 본 발명의 방법이 설계되었다.
아래에서 이와 같은 본 발명의 방법에 따른 분석시료 내 항원의 측정방법에 대하여 구체적으로 설명한다:
단계 (a): 검출항체와 분석시료의 접촉
우선 검출가능한 시그널을 발생시키는 표지가 결합되어 있고 상기 항원에 특이적으로 결합하는 검출항체와 분석시료를 접촉시킨다.
본 발명의 방법이 사용될 수 있는 분석시료는 모든 포유동물로부터 유래한 유기물질 (organic materials) 및 인위적으로 합성된 유기분자 (organic molecules)를 포함하며 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 분석시료는 바람직하게는 전혈, 혈장, 혈청， 체액 또는 세포 배양 상등액이다.
5 상기 유기분자 (organic molecules)는 탄소， 질소, 산소 및 /또는 황 원자 사이에 공유결합을 가지는 분자를 의미한다. 유기분자는 일산화탄소와 같은 작은 사이즈의 분자부터 폴리머 (polymer)와 같은 복잡한 큰 사이트의 분자로부터 선택할 수 있으며, 또는 상기 유기분자는 글리코시드 분자일 수 있다.
10 본 명세서에서, 용어 "항원" 은 본 발명의 방법을 이용하여 검출될 수 있는 모든 분자를 포함한다. 예컨대, 상기 항원은 체내에 존재하는 소분자 즉, 약물， 독소， 자가항체 (autoantibody), 자가항원^！！^^ ^), 단백질, 탄수화물， 핵산 및 다른 분자이다. 대상 (subject)의 혈청내에 존재할 수 있는 항원은 약물에만 한정되지 않으며， 예컨대 바르비투르산염
15 트리사이클릭 항우울제 (tricyclic antidepressants, TCA), 디기탈리스 (Digitalis), 암 관련 항원 (예컨대, 유방, 정소， 뇌， 간, 대장， 췌장， 위 또는 폐암과 관련된 항원), 바이러스 항원 (예컨대, HIV, 인플루엔자 또는 다른 바이러스와 관련된 항원)， 박테리아 항원 (예컨대, 전신박테리아감염 )， 호르몬 (예컨대， 갑상선자극호르몬 (TSH) ,
20 인간성장호르몬， 프로게스테론, 테스토스테론， 융모성성선자극호르몬 (hCG)), 플라즈마 단백질 (예컨대， 피브린분해산물 (FDP), C—반웅성 단백질 (CRP), 암배아성항원 (CEA), α-페토단백질 (AFP), 암배아성단백질)， 원생동물 항원 (protozoal antigens), 플라그항원 (plaque antigens), 합텐 (예컨대， 안지오텐신 I, 바소프레신， 소마토스타틴， 심방나트륨이뇨성호르몬 (atrial
25 natriuretic hormone) , 엔도세린 (endoserine)， 황체형성호르몬분비호르몬 (LHRH), 카시닌 (kassinin) 또는 다른 펩타이드)， 스테로이드 (예컨대, 코르티솔) 및 사이토카인 (예컨대, 인터루킨 -1， 인터페론 α, 인터페론 -β , 인터페론 인터루킨 -2, 인터루킨 -4， 인터루킨 -6 인터루킨 -7， 인터루킨 -12， 인터루킨 -15， Β7, CD28 또는 다른
30 면역글로불린 슈퍼패밀리 (IgSF) 멤버)를 포함한다.
―ᅳ— ——상 Z]ᅭ하보러스—항원은—ᅵ공지 ᅵ다양 바아러스 ^원을ᅳ포 예컨대， A형간염 바이러스, B형간염 바이러스， C형간염 바이러스， 인플루엔자， 바리셀라 (varicella), 아데노바이러스， 단순포진바이러스 타입 I， 단순포진바이러스 타입 II， 우역 (rinderpest), 리노바이러스 에코바이러스， 로타바이러스， 호흡기세포융합바이러스， 파필로마바이러스 파포바바이러스， 사이토메갈로바이러스， 에키노바이러스, 아르보바이러스 한타바이러스, 콕사키바이러스， 멈프스바이러스, 홍역바이러스 루벨라바이러스， 폴리오바이러스， 인간면역결핍바이러스 타입 I 인간면역결핍바이러스 타입 Π, 피코르나바이러스과， 장내바이러스 토가바이러스 (예컨대， 알파바이러스， 플라비바이러스， 코로나바이러스 광견병바이러스， 에볼라바이러스， 인간 T세포백혈병바이러스 타입 I 인간 T세포백혈병바이러스 타입 II， 렌티바이러스폴리오마바이러스 파르보바이러스， Epstein-Barr 바이러스， 인간헤르페스바이러스 -6 헤르페스바이러스 1 또는 수두바이러스와 관련된 항원 또는 상기 바이러스에서 생산된 항원을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 박테리아 항원은 공지된 다양한 박테리아 항원을 포함하며 예컨대， 마이코박테리아 리케트시아 (Mycobacteria rickettsia), 마이코플라즈마 (Mycoplasma), 네이세리아 종 (Neisseria sp . ) , 레지오넬라 (Legionella), 콜레라균 (Vibrio cholerae), 연쇄상구균 (Streptococci), 코리네박테리아 디프테리아 (Corynebacteria diphtheriae), 파상풍균 (Clostridium tetani), 백일해균 (Bordetel la pertussis), 헤모필러스종 (Haemophi lus spp.), 클라미디아종 (Chlamydia spp.) 또는 독소원성대장균 (enterotoxigenic Escherichia coli)와 관련된 항원 또는 상기 박테리아에서 생산된 항원을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 원생동물 항원은 공지된 다양한 원생동물 항원을 포함하며 예컨대, 플라스모디아 (Plasmodia), 아이메리아 (Eimeria), 레슈마니아 (Leishmania) 또는 트리파노소마 (Trypanosoma)와 관련된 항원 또는 상기 원생동물에서 생산된 항원을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 암 관련 항원 (cancer-related antigen)은 공지된 다양한 암 관련 항원을 포함하며 예컨대， 수르비빈 (survivin), 사이클린 Dl, Her2/neu, K-ras, 키모트립시노겐， XIAPOi— linked inhibitor of apoptosis protein) , 염기성 섬유모세포생장인자 (bFGF), EGF( Epidermal Growth Factor) 수용체， 발암배아성항원 (CEA), 전립선특이항원 (PSA), α-페토단백질， β-2- 마이크로글로불린， 방광암항원 (ΒΤΑ), 크로모그라닌 Α, 뉴런 -특이 에놀라아제， S-100 단백질， ΤΑ-90 단백질, 조직펩타이드항원 (ΤΡΑ) 및 인간 융모성 고나도트로핀 (hCG)을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는， 상기 암 관련 항원은 전립선 특이항원이다.
상기 항원 외에도 본 발명의 항원은 오염물질， 독소, 유독화학물질， 법의학적 물질 또는 이와 유사한 물질을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 항원은 약물, 독소， 자가항체 (autoantibody), 자가항원 (autoantigen) , 단백질， 탄수화물ᅳ 핵산 또는 암 관련 항원이고, 보다 바람직하게는 암 관련 항원이다.
본 발명의 방법은 두 가지 형태의 항체, 즉 검출 항체 및 포획 항체를 이용한다. 용어 "검출 항체" 는 에 상기 포획 항체에 의해 포획된 상기 항원 또는 표준물질에 결합할 수 있는 항체를 의미한다. 본 명세서에서 용어 "포획 항체" 는 분석시료에서 검출하고자 하는 상기 항원에 결합 할 수 있는 항체를 의미한다. 본 발명의 방법에서 이용할 수 있는 항체는 분석시료 내의 항원을 탐지하기 위한 것으로서， 분석시료 내의 항원과 특이적으로 결합하는 뉴클레오타이드 서열의 에피토프를 포함한다. 본 명세서에 이용된 항체는 검출하고자 하는 에피토프， 항원 또는 항원 단편에 결합할 수 있는 전체 항체뿐만 아니라 항체 단편 (예컨대， F(ab' )2, Fab' ， Fab, Fv)을 포함한다. 본 발명에서 이용되는 항체는 플리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다.
상기 항원에 대한 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들， 예를 들어， 융합 방법 (Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법 (미국 특허 제 4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법 (Clackson et al, Nature, 352： 624- 628(1991) 및 Marks et al, J. Mol . Biol., 222:58， 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D. , Using Antibodies: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Press, New York, 1999； Zola, H. , Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. , Boca Raton, Florida, 1984； 및 Col igan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며， 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
상기 검출항체에는 검출가능한 시그널을 발생시키는 표지가 결합되어 있다. 용어 "시그널" 은 검출 가능한 파라미터 (parameter)를 의미하며， 광학적， 전기적 또는 자기적 파라미터의 흐름 형광방사, 적외선 방사， 자외선 방사， 화학발광， 광반사 또한 상기 시그널의 흡수정도를 포함한다. 검출가능한 시그널올 발생시키는 표지는 화학물질 (예컨대, 바이오틴)， 효소 (알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크름 Ρ450), 방사능물질 ((예컨대， 14C, 125I, ¾, 32P 및 3¾)， 형광물질 (예컨대， 플루오레신)， 발광물질, 화학발광물질 (chemi luminescent) 및 FRET( fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed Harlow and David Lane, Using Ant i bodies： A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다. 바람직하게는， 검출가능한 시그널을 발생시키는 표지로서 형광물질이 이용된다.
상기 표지는 발산하는 파장에 따라 각기 다른 형광 시그널이 관찰될 수 있으며， 바람직하게는 상기 표지는 검출항체에 결합된 형태로 포획항체 또는 표준물질에 결합된다. 상기 표지는 공지된 다양한 형광물질을 포함할 수 있으며 예컨대， 플루오로세인과 그 유도체, 로다민과 그 유도체， 피코에리드린， 루시퍼 엘로우， B-파이토에리^린， 9ᅳ 아크리딘이소티오시아네이트, 루시퍼 엘로우 VS, 4-아세트아미도 -4'- 이소티오-시아나토스틸벤 -2， 2 ' -다이설폰산， 그다이에틸아미노 -3-(41 - 이소티오시아토페닐 )-4-메틸쿠마린， 석시니미딜-파이렌부티레이트， 4- 아세트아미도 -4'-이소티오시아나토스틸벤 -2,2' -다이설폰산 유도체， LC™- Red 640， LC™-Red 705, PC5, Cy5, Cy5.5, 리사민, 이소티오시아네이트， 에리쓰로신 이소티오시아네이트， 다이에틸렌트리아민 펜타아세테이트, 1- 다이메틸아미노나프틸 -5-설포네이트， 1-아닐리노 -8-나프탈렌 설포네이트, 2-p-토우이디닐 -6ᅳ나프탈렌설포네이트， 3-페닐 -7—이소시아나토쿠마린， 9- 이소티오시아나토아크리딘, 아크리딘 오렌지, N-(p-(2- 벤족사조일릴)페닐)멜레이미드， 벤족사디아졸, 스틸벤 및 파이렌을 포함하지만， 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 방법에 따르면， 항원-특이적 검출항체에 결합된 표지가 방출하는 시그널은 형광 시그널로서 측정되는바 , 시험영역 및 표준영역의 양 시그널을 각각 측정하여 검출하고자 하는 항원의 존재여부 및 양을 확인 할 수 있다. 상기 검출항체 및 포획 항체는 상기 항원에 특이적으로 결합하는 친화성 (affinity)올 가지며, 본 발명의 방법에 사용되는 다른 어떠한 시약과도 반웅하지 않는다. 단계 (b): 포획항체 및 상기 단계 (a)의 결과물의 접촉
이어 상기 단계 (a)의 결과물에, 검출하고자 하는 항원에 특이적으로 결합하는 포획항체를 접촉시킨다. 즉, 단계 (a)의 결과물을 시험영역 (test zone) 또는 표준영역 (reference zone)의 항원-특이적 포획항체 또는 표준물질에 결합시킨다.
본 명세서에서, 용어 "포획항체" 는 단계 (a)에 상술한 바와 같다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 상기 포획항체는 고상 기질 표면에 결합되어 있고， 상기 포획항체는 반웅물의 연속적인 흐름이 이루어지는 하나의 반웅용기의 기질 표면 상에 존재하며， 상기 반웅용기는 마이크로채널을 갖는 마이크로칩이다.
본 명세서에서， 용어 "고상 기질 (solid substrate)" 는 고상지지체 (solid support) 또는 고체상 (solid phase)와 동일한 의미로 사용될 수 있으며， 비액상물질을 의미한다. 상기 고상 기질은 바람직하게는 상기 마이크로채널 내에 형성시킬 수 있으며 예컨대， 막 (membrane), 모세관의 일부 또는 마이크로채널 내를 유동 /접착된 소경비드 (small diameter beads)로서 존재할 수 있다. 이러한 형태의 공지의 물질은 폴리스티렌 및 폴리프로필렌， 유리, 금속， 및 젤과 같은 탄화수소 중합체를 포함한다ᅳ 상기 고상 기질은 딥스틱， 마이크로티터 플레이트， 입자 (예컨대， 비드)， 친화성 컬럼 및 이뮤노블롯 멤브레인 (예컨대， 폴리비닐리덴플로라이드 멤브레인) 형태로 있을 수 있다 (참조: 미국 특허 제 5,143，825호， 제 5,374, 530호, 제 4, 908,305호 및 제 5,498,551호).
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 상기 마이크로칩의 마이크로채널은 시험영역 (test zone) 및 표준영역 (reference zone)을 포함하며， 상기 시험영역의 표면에 상기 포획항체가 결합되어 있고 상기 표준영역에 상기 표준물질이 결합되어 있다.
본 명세서에서， 용어 "시험영역 (test zone)" 은 상기 마이크로칩의 마이크로채널 내에 포함된 구획으로서, 시험영역의 표면에는 상기 포획항체가 결합되어 있고， 포획항체에는 검출하고자하는 상기 항원 및 그 항원과 특이적으로 결합하는 검출항체가 결합한다.
본 명세서에서， 용어 "표준영역 (reference zone)" 은 상기 마이크로칩의 마이크로채널 내에 포함된 구획으로서， 표준영역의 표면에는 표준물질 (reference substance)가 결합되어 있고, 표준물질에는 검출하고자하는 상기 항원과 특이적으로 결합하는 검출항체가 결합한다. 본 명세서에서， 용어 "표준물질" 은 상기 검출항체가 결합할 수 있는 물질을 의미하며， 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 상기 표준물질은 상기 항원과 동일한 물질 또는 상기 에피토프를 포함하는 상기 항원의 단편이다.
상기 항체, 항원 또는 표준물질은 물리적인 흡착 또는 화학적인 접착에 의하여 고상 기질에 부착가능하다. 물리적 흡착은 적절한 완층액에 있는 항체 또는 항원과 고체상의 재료 사이에서 반웅에 의하여 수행된다. 완층액으로서는 인산염 완충액， 트리스 -히드로클로라이드 완충액， 탄산염 완층액 등이다. 반웅은 4-37°C, 특히 실온에서 특정시간 동안 상기 완층액을 흔합하고 유지함에 의하여 수행된다. 화학적 부착은 펩티드 부착 방법중 카르보디미드법을 사용함으로서 실행 가능하다. 또 다른 화학법은 글루타르알데히드 또는 시아누트릭 클로라이드 ("펩티드 합성법"， 마루젠 (Maruzen), 1975 또는 "효소 면역측정법 교리쪼 슈판， "프로테인 핵산 효소"， 특별호 31， 1987) 등과 같은 2가 횡연결 시약으로 실행되는 방법이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 상기 분석시료는 상기 마이크로칩에 적용되며 상기 적용된 분석시료는 상기 마이크로채널에 형성된 흐름을 통해 상기 시험영역 및 표준영역과 접촉한다. 또한 상기 분석시료는 상기 시험영역 및 표준영역올 순차적으로 접촉하거나 또는 상기 표준영역 및 시험영역을 순차적으로 접촉할 수 있다.
상술한 바와 같이， 본 발명의 검출방법은 검출항체에 분석시료를 접촉시킨 다음 포획항체를 접촉시키는 것으로 표현되어 있으나, 이는 기재의 편의를 위한 것이며, 본 발명의 검출 방법은 i ) 상기 과정을 반대로 하는 경우， 즉 분석시료를 상기 포획항체와 접촉시키는 단계를 우선적으로 수행하고 이어 분석시료와 포획항체의 반응 결과물을 검출항체와 접촉시키는 것 및 ii) 분석시료를 검출항체 및 포획항체와 동시에 접촉시키는 것을 배제하는 것은 아니다.
상기 과정 중, 분석시료를 상기 검출항체와 접촉시키는 단계를 우선적으로 수행하고 이어 분석시료와 검출항체의 반웅 결과물을 포획항체와 접촉시키는 경우， 상기 분석시료와 검출항체의 반웅은 마이크로칩 내 또는 마이크로칩 외에서 이루어 질 수 있다. 본 발명의 구체적인 일실시예에 따르면， 상기 반응은 마이크로칩 외에서 이루어진다. 단계 (c): 표준물질 (reference substance) 및 검출가능한 시그널을 발생시키는표지가 결합되어 있는 검출항체의 접촉
검출항체 및 상기 단계 (a)의 결과물을 접촉시킨 후， 상기 검출항체가 특이적으로 결합하는 에피토프를 포함하며 고상 기질 표면에 결합되어 있는 표준물질 (reference substance)에 상기 검출가능한 시그널을 발생시키는 표지가 결합되어 있는 검출항체를 접촉시킨다.
본 명세서에서, 용어 "에피토프" 는 항체가 결합하는 항원의 부위를 항원결정 부위 (antigenic determinant)를 의미하며, 상기 표준물질은 1 이상 종류의 에피토프를 포함하거나, 동일한 에피토프를 1 이상 포함할 수 있으나， 상기 검출항체가 결합하는 에피토프는 표준물질 상에서 한번 만 발견될 수 있는 서열올 선택하는 것이 바람직하다. 단계 (0)： 시그널 측정
이어 , 시그널 측정장치를 사용하여 상기 단계 (b)의 결과물 및 (c)의 결과물의 표지로부터 발생되는 시그널을 측정한다. 상기 시그널 측정장치에 대한 상세한 설명은 아래에 기재되어 있다. 단계 (e): 시그널의 분석
상기 단계 (d)에서 측정된 시그널을 분석하여 상기 분석시료 내 항원의 존재 여부 또는 양을 결정한다.
상기 시그널의 양 (amount)에 따라 항원의 존부 및 양을 결정하며, 용어 "양 (amount)"은 상기 시그널의 감도 (sensitivity)가 측정 가능한 특정 레벨 (level)내에 포함됨을 전제로， 물리적 파라미터인 상기 시그널의 강도 (intensity)가 증가, 감소 또는 유지되는 정도를 의미한다. 예컨대, 시그널의 증가가 10 단위로 증가하고， 시그널의 측정감도가 1 단위의 범위 내에 있다면， 시그널 양을 측정할 수 있다. 상기 시그널의 양은 임의의 단위로 표시할 수 있다.
상기 단계 (a)-(d), 또는 상기 단계 (b)-(d)는 마이크로채널 (microchannel)이 구비된 마이크로칩에서 실시될 수 있으며, 상기 시그널 분석은 상기 마이크로채널에 의해 제공되는 반응시작영역, 시험영역， 표준영역 및 반응종료영역에서의 시그널을 측정하여 실시된다. 상기 반웅시작영역 및 반웅종료영역의 시그널로부터 오류율 (%)올 산출할 수 있으며， 오류율이 20%이상인 경우에는 시험영역 및 표준영역 시그널의 신뢰성올 높이기 위해 분석을 재실시한다. 용어 "오류율 (error rate)"는 분석시료의 점성 또는 유동성 (flow)이 일정하지 않은 이유로 시그널의 분석결과가 다를 수 있고 분석을 실시하는 실험자의 조작 미숙으로 인해 시그널의 분석결과가 다를 수 있으므로 이로 인해 발생하는 오차를 최소화하고， 데이터의 신뢰성을 얻기 위하여 측정되는 값이다.
용어 "반웅시작영역" 및 "반웅종료영역" 은 상기 마이크로칩의 마이크로채널 내에 포함된 구획으로서, 마이크로채널 내의 시그널측정 영역을 일정간격으로 나눈 구획 (0-900) 중 일부이다.
상기 반웅시작영역 및 반응종료영역은 항원의 종류에 따라 구획이 가변적일 수 있다. 일 예에 따르면, 본 발명의 방법을 이용하여 PSA 항원을 검출하는 실험에서， 반웅시작영역은 전체 "0-900" 범위 중 180-370의 구획이며, 반웅종료영역은 700-880의 구획에 해당된다 (도 1 참조).
마이크로채널 내의 시그널 측정 영역은 반응시작영역, 시험영역， 표준영역 및 반응종료영역으로 구성되며, 각 영역에서의 시그널을 그래프로 나타내었을 때 시그널 양은 다음과 같이 계산된다. 그래프에서 가로축은 마이크로채널 내의 시그널측정 영역을 일정간격으로 나눈 구획 (0-900)으로 표시되고， 세로축은 형광시그널의 양 (세기)로 표시할 수 있다.
Figure imgf000016_0001
표준영역 형광시그널 = - n°(^ - Xb)
(In = n위치에서의 형광시그널，
Xtc = 시험영역 중앙지점의 형광시그널，
Xrc = 표준영역 중앙지점의 형광시그널，
Xb = 마이크로채널 0-900의 위치 중 최소 50 지점의 형광시그널 평균값) 수학식 3 반웅시작영역의 형광시그널 =
Figure imgf000016_0002
반웅종료영역의 형광시그널 = ( ^+Src-S-aS^)/60
( n = n위치에서의 형광시그널
Xtc = 시험영역 중앙지점의 형광시그널
Xrc = 표준영역 중앙지점의 형광시그널) 즉， 반응시작영역의 형광시그널은 Xtc-(Xrc-Xtc)-30 지점부터 Xtc- (Xrc-Xtc)+30 지점까지 각 지점의 시그널 평균값이이고, 반웅종료영역의 형광시그널은 Xrc+(Xrc-Xtc)-30 지점부터 Xrc+(Xrc-Xtc)+30 지점까지 각 지점의 시그널 평균값이다.
상기 오류율 (error rate)은 다음과— 산출 H一―있 . 수학식 5
오류율 (%) = [1(반응시작영역의 시그널-반응종료영역의 시그널 )|/반웅시작영역의 시그널] X 100 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 상기 측정된 시그널의 분석은 상기 단계 (b)의 결과물 및 (c)의 결과물의 표지로부터 발생되는 시그널의 세기의 비율을 계산함으로써 실시한다.
종래와 항원 검출 방법은 시험영역 (test zone)에 검출하고자 하는 항원과 특이적으로 결합하는 물질 (본 발명에서의 포획항체)을 결합시키고， 표준영역 (reference zone)에 인간 유래의 항원이 결합할 수 없는 외래의 물질을 결합시켜， 각각의 영역에서 발생하는 시그널을 측정하였으며， 표준영역에서의 시그널은 시험영역의 시그널을 보정하는 수치로서 사용되었다. 같은 농도의 시료일지라도 시료 점성의 차이로 인해 마이크로채널 내로 흐르는 시료의 속도 (반웅 속도)가 를려 시험영역의 시그널이 를려진다. 이를 보정하는 방법으로 같은 농도일 때 낮은 점성의 시료가 마이크로 채널 내로 빠르게 지나가면 시험 영역의 시그널이 감소한 만큼 표준영역의 시그널이 함께 감소하고， 같은 농도의 높은 점성의 시료가 마이크로 채널 내로 느리게 지나가게 되면 시험 영역의 시그널이 증가한 만큼 표준영역의 시그널이 함께 증가함에 따라 결국은 시료의 점성 차이 없이 같은 비율 값을 표현하게 되어 시그널의 값은 다르나 비율 값은 실질적으로 동일한 값을 가지게 된다. 용어
"실질적으로 (substantially)" 는 시료의 점성 차이에 따른 영향을 전혀 받지 않는 경우 및 시료의 점성에 영향을 받지만 그 정도가 미약하여 시료의 점성 차이에 따른 영향이 없다고 할 수 있는 경우도 포함하는 의미이다. 예컨대， 시험영역 및 표준영역의 시그널 세기의 비율 값은 시료의 점성 차이에도 불구하고, 그 편차가 ±2.0으로서 거의 일정하게 유지되며， 이는 상기 시그널 세기의 비율 값이 시료의 점성 차이에 실질적으로 영향을 받지 않음을 의미한다.
그러나 상기 방법은 예컨대 분석시료가 인간의 혈청인 경우， i ) 표준영역에 결합된 표준물질은 인간 유래의 펩타이드 또는 이와 결합가능한 물질일 수 없어 표준물질의 선정에 한계가 있고， ii) 시험영역 (test zone)과 표준영역 (reference zone)에 서로 다른 검출항체가 결합하도록 하여 각각 항체의 항원에 대한 친화도 (affinity)에 따라 검출결과가 달라질 수 있으며， iii) 분석시료가 고농도인 경우， 시험영역에 결합되는 검출항체의 포화도와는 무관하게, 표준영역의 검출항체는 계속 일정수준으로 표준영역에 결합되므로, 시험영역의 측정시그널 /표준영역의 시그널 세기의 비율값이 일정하지 않고, iv) 기본적으로 항원 -항체 반웅을 이용함에 따라， 부수적으로 문제되는 온도에 따른 영향을 배제할 수 없다는 문제점이 있었다. 따라서 본 발명자들은 표준물질 선정의 한계， 분석시료의 농도 및 온도에 따른 영향을 최소화시켜 데이터의 안전성， 신뢰도 및 재현성이 향상된 본 발명의 방법을 개발하였으며, 이 중 본 발명의 가장 큰 특징은 분석시료 내 항원의 검출에 있어， 분석시료의 농도 및 온도에 따른 영향을 최소화시켰다는 데 있다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면， 상기 단계 (b)의 결과물 및 단계 (C)의 결과물의 표지로부터 발생되는 시그널의 세기의 비율 값은 상기 단계 (a)의 분석시료의 농도에 대하여 선형 비례적이다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면， 상기 단계 (b)의 결과물 및 단계 (c)의 결과물의 표지로부터 발생되는 시그널의 세기의 비율 값은 상기 방법이 실시되는 온도의 변화에 대하여 실질적으로 영향을 받지 않는다. 용어 "살질적으로 (substantially)" 는 온도 변화에 따른 영향을 전혀 받지 않는 경우 및 온도에 따른 영향을 받지만 그 정도가 미약하여 온도 변화에 따른 영향이 없다고 할 수 있는 경우도 포함하는 의미이다. 예컨대 시험영역 및 표준영역의 시그널 세기의 비율 값은 온도의 변화에도 불구하고， 그 편차가 ±0.17로서 거의 일정하게 유지되며， 이는 상기 시그널 세기의 비율 값이 온도 변화에 실질적으로 영향을 받지 않음을 의미한다 .
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 상기 단계 (b)의 결과물 및 단계 (c)의 결과물의 표지로부터 발생되는 시그널의 세기의 비율 값은 상기 방법이 실시되는 온도 범위 10-30°C에서 동일한 값을 나타낸다.
본 발명의 방법을 이용하는 경우， 고농도의 항원을 포함한 시료에서도 항원의 정량적 검출이 가능하며, 예컨대 1800 ng/ml 이상 농도인 항원의 검출이 가능하다. 일 예에 따르면， 본 발명의 방법을 이용하여 PSA 항원을 검출하는 경우, PSA 농도가 0.0001-1500 ng/ml의 범위인 시료에서는 실험적으로 측정한 T/R 비율 그래프에 따라 PSA 항원의 농도를 알 수 있으며， PSA 농도가 1500-1800 ng/ml 및 1800 ng/ml 이상의 농도에서는 상기 실험적으로 얻은 그래프의 연장선 상에서 항원의 농도를 알 수 있다. 다른 일 예에 따르면， 본 발명의 방법을 이용하여 PSA 농도가 4000 ng/mL 이상인 고농도 검체의 측정 및 검출이 가능하다. 즉， PSA 농도가 0.0001-4500 ng/mL의 범위인 시료에서 실험적으로 측정한 T/R 비율 그래프에 따라 PSA 항원의 농도를 알 수 있으며， PSA 농도가 4500 ng/ml 이상인 농도에서는 상기 실험적으로 얻은 그래프의 연장선 상에서 항원의 농도를 알 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면， 본발명은 다음을 포함하는 분석시료 내 항원의 검출장치를 제공한다:
(a) 분석시료를 수용하고 반응이 이루어지는 마이크로채널 (microchannel)이 구비된 마이크로칩;
(b) 상기 마이크로채널의 한 부위에 형성되어 있고 검출하고자 하는 항원에 특이적으로 결합하는 포획항체가 표면에 결합되어 있는 시험영역 (test zone); 및
(c) 상기 마이크로채널의 한 부위에 형성되어 있고 검출항체가 특이적으로 결합하는 에피토프를 포함하는 표준물질 (reference substance)이 표면에 결합되어 있는 표준영역 (reference zone).
본 발명의 방법을 이용한 검출 장치는 항체의 친화도, 분석시료의 농도 및 검출 온도에 따른 영향을 받지 않아, 검출하고자 하는 항원의 양을 정확히 측정할 수 있고, 전문적인 기술 없이도 쉽게 조작이 가능하여 표적 항원 검출의 현장진단이 가능하다. 본 발명의 항원 검출장치는 상술한 본 발명의 항원 검출방법을 이용한 것으로서， 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여， 그 기재를 생략한다.
본 발명의 장치를 각각의 구성 별로 상세하게 설명하면 다음과 같다: 구성 (a): 마이크로채널 (mi crochanne 1 )이 구비된 마이크로칩
상기 항원 검출장치에는 분석 시료를 수용하고 반웅이 이루어지는 마이크로칩이 포함된다. 상기 마이크로칩 내에는 분석 시료를 수용하기 위한 마이크로채널이 구비되어 있으며, 상기 마이크로채널은 다양한 깊이 (depth)를 가질 수 있다.
분석 시료를 수용할 수 있는 상기 마이크로칩은 1 이상의 마이크로채널을 포함할 수 있으며， 상기 마이크로채널에는 각각 다른 항원을 검출하는 포획항체 및 표준물질이 결합될 수 있다. 상기 마이크로채널에는 반웅시작영역 시험영역, 표준영역 및 반웅종료영역이 포함되며， 바람직하게는 상기 각 영역은 반웅시작영역, 시험영역， 표준영역 및 반웅종료영역의 순서로 위치한다.
상술한 본 발명의 방법을 이용한 상기 검출 장치는 분석시료와 포획항체 및 검출항체와의 반응， 및 표준물질과 검출항체의 반웅 등을 각각의 단계로서 실시하는 것으로 표현되어 있으나， 이는 기재의 편의를 위한 것이며， 본 발명의 항원 검출 장치는 분석 시료를 마이크로칩에 분주하는 것만으로 항원의 존재여부 및 양을 측정할 수 있다. 따라서 상기 마이크로칩은, 바람직하게는 상기 항원 검출 방법에서 사용되는 i ) 시약， 표준물질 및 포획항체， 또는 Π) 시약， 표준물질, 시그널 발산 표지가 결합된 검출항체 및 포획항체가 포함되어 있으며, 마이크로채널 내에 분석시료를 떨어뜨린 후 상기 마이크로칩을 본 발명에 따른 장치에 장착하면， 자동적으로 검출 항원의 존재여부 및 양이 측정되도록 제작된다. 따라서 사용이 편리하고 현장진단에 적합하므로, 전문가뿐만 아니라 일반인들도 용이하게 사용할 수 있다.
상기 마이크로채널은 분석시료를 주입할 수 있는 투입구를 포함할 수 있으며, 분석시료가 상기 투입구를 통하여 마이크로채널 내부로 유입되면 마이크로채널을 지나면서 검출하고자 하는 항원을 탐지 (detect ion)하거나 항원의 양을 측정하기 위하여 반웅 시약 등과 반웅할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일실시예에 따르면， 검출하고자 하는 항원의 탐지를 위하여 형광 물질 등을 이용한 분석 시료의 라벨링 (labelling) 반응 또는 항원 -항체 반웅 등을 이용한 분석 시료의 특이 반웅 (specific reaction) 등이 마이크로채널 내에서 이루어질 수 있다. 즉， 단백질의 항원 -항체 특이 반웅 (specification) 등올 이용하여， 추후 센서 등 다양한 탐지 수단을 통하여 원하는 항원만을 선별적으로 확인할 수 있다. 표지된 분석 시료는 마이크로 채널 내부를 통과하게 되는데 이때 마이크로 채널의 일 단면이 광학 센서에 노출되며, 이를 이용하여 형광 시그널을 탐지할 수도 있다. 구성 (b): 시험영역 (test zone)
본 발명의 항원 검출장치에 있어서， 상기 시험영역은 상기 마이크로채널의 한 부위에 형성되어 있고 검출하고자 하는 항원에 특이적으로 결합하는 포획항체가 표면에 결합되어 있도록 설계된다. 구성 (c): 표준영역 (reference zone)
본 발명의 항원 검출장치에 있어서， 상기 표준영역은 상기 마이크로채널의 한 부위에 형성되어 있고 검출항체가 특이적으로 결합하는 에피토프를 포함하는 표준물질 (reference substance)이 표면에 결합되어 있도록 설계된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 장치는 검출가능한 시그널을 발생시키는 표지가 결합되어 있고 상기 항원에 특이적으로 결합하는 검출항체를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면， 상기 장치는 상기 표지로부터 발생되는 시그널을 측정하는 측정수단을 추가적으로 포함할 수 있으며， 또는 상기 장치는 상기 시험영역 및 표준영역에서 측정된 시그널의 세기의 비율을 계산하는 분석수단을 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 측정수단은 상기 검출항체에 결합된 표지에서 발생되는 시그널이 통과하는 장치의 구성요소를 의미하며， 예컨대 광학적 요소 (optical component)를 포함한다. 상기 측정수단은 형광 시그널을 통과시켜 시그널 분석수단까지 전달하며， 부분적으로 형광시그널을 전기적 시그널로 변환시킬 수 있다. 상기 측정수단은 본 발명에 의한 장치와 일체화 되어 존재하거나 독립적인 장치로 존재할 수 있다.
상기 분석수단은 시그널 프로세서 (signal processor)와 동일한 의미로 사용될 수 있으며, 상기 시험영역 및 표준영역에서 측정된 시그널을 부분적으로 변형시키거나, 시그널의 측정값을 보정할 수 있는 장치의 구성요소를 의미한다. 상기 분석수단은 상기 광학적 요소와 동시 작용하고， 형광시그널을 전기적 시그널로 변환할 수 있다. 본 발명의 방법 및 장치는 다양한 방식으로 이용될 수 있으몌 예컨대 전립선암 관련 항원을 검출하는 경우， 전립선 특이항원 (prostate specifie antigen, PSA)을 종양표지자로 하여 양성 및 악성의 전립선암 세포의 유무， 전립선암의 재발여부, 위험도， 전이여부 등의 임상적 판단이 가능하며, 신속하게 질병 경과 등을 보고할 수 있다. 또한 전립선암의 치료에 사용되는 약물의 효능평가에도 본 발명의 방법이 이용될 수 있다.
【발명의 효과】
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 신규한 항원 검출방법 및 그를 이용한 항원 검출장치에 관한 것이다.
(b) 본 발명의 항원 검출방법은 종래 시험영역 (test zone)과 표준영역 (reference zone)에 서로 다른 에피토프를 가진.물질을 결합시켜 이와 특이적으로 결합하는 항원을 검출하는 방법과 달리, 표준영역에 검출하고자 하는 항원과 동일한 에피토프를 포함하는 표준물질 (reference substance)을 결합시킴으로써, 보다 정확하게 항원의 존재 및 양을 검출할 수 있다.
(c) 종래의 항원 검출방법을 사용하는 경우 항원 농도가 고농도로 갈수록 반웅성이 감소하고, 반응이 포화되면 일정수준에서 더 이상 시그널 값이 증가하지 않게 되는 단점이 있으나, 본 발명의 항원 검출방법을 사용하는 경우에는 T/R 비율값으로 시험 (test)값을 측정함으로써 이러한 후크효과 (hook effect)가 오지 않고， 결과적으로 검출 범위 (detection range)가 늘어나게 되는 특징이 있다.
(d) 또한， 본 발명의 검출방법은 종래의 항원 검출방법에 비해 분석시료의 유동 (flow) 및 반응시간을 조절할 수 있어 반웅감도가 향상되었고, 분석시료의 농도 또는 검출반웅 온도에 의한 영향을 최소화하여 데이터의 안전성， 신뢰도 및 재현성이 우수하다.
(e) 따라서 본 발명의 항원 검출방법 및 검출장치는 전문적인 기술 없이도 쉽게 조작이 가능하여 분석시료 내 검출항원의 존재유무 및 양을 현장진단으로 즉시 파악할 수 있다. 【도면의 간단한 설명】
도 1은 본 발명의 항원 검출방법을 통해 측정된 시그널 측정치가 유효한지 검증하고자， 5개의 카트리지에서 시그널을 측정한 결과이다. 가로축은 마이크로채널 내의 시그널측정 영역을 일정간격으로 나눈 구획을 의미하고， 세로축은 형광시그널 세기의 수치를 의미한다.
도 2a는 기존의 항원 검출방법인 Rabbit IgG 표준시스템을 사용하여， ( i ) 분석시료의 농도에 따른 시험영역 및 표준영역 시그널 세기 및 (ii) 분석시료의 농도에 따른 시험영역 /표준영역 시그널 세기의 비율 값을 각각 그래프로 나타낸 것이다.
도 2b는 본 발명의 방법을 이용한 전립선 특이항원 (PSA) 표준시스템을 사용하여, ( i ) 분석시료의 농도에 따른 시험영역 및 표준영역 시그널 세기 및 (ii) 분석시료의 농도에 따른 시험영역 /표준영역 시그널 세기의 비율 값을 각각 그래프로 나타낸 것이다.
도 3a는 Rabbit IgG 표준시스템을 사용하여 , ( i ) 측정 온도에 따른 시험영역 및 표준영역 시그널 세기 및 (ii) 측정 온도에 따른 시험영역 /표준영역 시그널 세기의 비율 값을 각각 그래프로 나타낸 것이다. 도 3b는 전립선 특이항원 (PSA) 표준시스템을 사용하여， ( i ) 측정 온도에 따른 시험영역 및 표준영역 시그널 세기 및. (ii) 측정 온도에 따른 시험영역 /표준영역 시그널 세기의 비율 값을 각각 그래프로 나타낸 것이다. 도 4은 기존의 항원 검출방법 (Rabbit-Goat ant i -Rabbit system)을 이용하여 ( i ) 측정 온도에 따른 시험영역 및 표준영역 시그널 세기 (도 4a) 및 (ii) 측정 온도에 따른 시험영역 /표준영역 시그널 세기의 비율 값 (도 4b)을 각각 그래프로 나타낸 것이다.
도 5는 기존의 항원 검출방법 (Taq-Mouse anti-Taq system)을 이용하여 ( i ) 측정 온도에 따른 시험영역 및 표준영역 시그널 세기 (도 5a) 및 (ii) 측정 온도에 따른 시험영역 /표준영역 시그널 세기의 비율 값 (도 5b)을 각각 그래프로 나타낸 것이다.
도 6는 본 발명의 방법을 이용한 항원 검출방법 (PSA-Mouse ant i -PSA system)을 이용하여 ( i ) 측정 온도에 따른 시험영역 및 표준영역 시그널 세기 (도 6a) 및 (ii) 측정 온도에 따른 시험영역 /표준영역 시그널 세기의 비율 값 (도 6b)을 각각 그래프로 나타낸 것이다. 도 7은 바이오사이트 (Biosite)사의 항원 검출방법을 이용하여 측정 온도에 따른 시험영역 /표준영역 시그널 세기의 비율 값을 그래프로 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 방법을 이용한 전립선 특이항원 (PSA) 표준시스템을 사용하여, 분석시료의 농도에 따른 시험영역 /표준영역 시그널 세기의 비율 값을 각각 그래프로 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 방법을 이용한 전립선 특이항원 (PSA) 표준시스템 및 기존의 항원 검출방법 (Rabbit— Goat ant i -Rabbit system)을 사용하여， 고농도 분석시료의 시험영역 /표준영역 시그널 세기의 비율 값을 각각 그래프로 나타낸 것이다.
【발명을 실시하기 위한 구체적인 내용】
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명올 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 실시예 실시예 1: 유속 (flow rate) 보정에 의한 검출 데이터 측정
1-1. 본 발명의 항원 검출방법을 이용한 PSA 검출
본 발명에서 이용한 혈액 시료는 고려대학교 안산병원 진단검사의학과 외래 검사실에 의뢰한 환자의 혈액시료를 이용하였으며, 환자군은 무작위로 선정되었다.
본 발명의 방법을 이용한 검출장치를 이용하여 환자시료 내 항원의 양올 측정하였다. 상기 환자군은 전립선암 환자로서, 전립선 특이적 항원 (prostate specific antigen, PSA)를 종양표지자로 하여, 환자의 혈청 (serum) 내에 존재하는 PSA의 양을 측정하였다.
전립선 특이적 항원 (PSA)은 대개 주로 사람의 전립선 상피에 의해 생산되는 단일쇄 33 kDa 당단백질로 사람의 정액중에 0.5 내지 2.0 rag/ 의 농도로 존재한다. 전립선 특이항원은 전립선의 상피세포에서 합성되는 단백분해 효소로 전립선 이외의 조직에서는 거의 발현되지 않아 전립선암의 선별에 이용되는 유용한 종양표지자이다. 전립선 특이항원은 전립선 조직에는 특이적이지만 종양에는 특이적이지 않아 전립선 비대증， 전립선염， 전립선 경색 등에서도 증가할 수 있으며, 전립선암의 선별 검사뿐만 아니라 수술 후 재발 판정에도 유용하게 이용할 수 있다.
상기 환자군에서 수득한 혈청시료 중에서, 같은 농도의 시료 중 각기 점성이 다른 시료를 선별하여 본 발명을 이용한 검출 장치를 이용한 항원 측정을 실시하였다. 칩 (또는 카트리지)의 샘플 주입 (inlet) 부위에 샘플 (지단백리파아제가 존재하거나 또는 존재하지 않는 환자 혈청 또는 혈장) 30 ^를 떨어뜨렸다. 샘플을 떨어뜨린지 5 분 경과 후, 칩을 본 발명에 따른 항원 검출장치에 삽입하였다. 약 40 초 후에 검출장치의 디스플레이 화면에 샘플 내 전립선특이항원의 존재 정도가 정량적으로 표시되었으며， 또한 시험영역 및 표준영역의 시그널 세기 값이 표시되었다. 환자 A 보다 환자 B 에서의 시그널 측정값을 각각 측정하였으몌 이를 이용하여 시험영역 (T)/표준영역 (R)의 시그널 세기의 비율 값을 산출하였다 (표 1). 각 영역의 시그널 산출방법은 수학식 1 및 2 에 나타내었다. 수학식 1 시험영역 형광시그널 = /^ _+3 3 0 0( 1 - Xb)
표준영역 형광시그널 = /γ Χ _+3 η 0(^η - Xb)
J/? = n 위치에서의 형광시그널
시험영역 중앙지점의 형광시그널
Xrc = 표준영역 중앙지점의 형광시그널 Xb = 마이크로채널 0-900 의 위치 중 최소 50 지점의 형광시그널 평균값， 0-900 은 마이크로채널 내의 시그널측정 영역을 일정간격으로 나눈 구획을 의미한다. 【표 1】
각 영역의 시그널 및 비율
Figure imgf000026_0001
그 결과, 시그널의 강도로만 비교하였을 때 환자 B 의 시그널이 높았으나， 시험영역과 표준영역의 시그널 세기의 비율 값을 각각 산출한 결과， 양 환자의 시료 내 전립선 특이항원 양은 같은 것으로 분석되었다. 상기 표 1 의 결과와 더불어, 각 시험영역과 표준영역의 시그널 세기의 비율 값에서 발생할 수 있는 표준편차 (CV, %) 값을 산출하였다 (표 2). 분석시료 중 하나를 선택하여 5 개의 카트리지에 동일한 분석시료를 각각 분주한 다음 분석을 실시하였다.
【표 2]
Figure imgf000026_0002
그 결과， 시험영역과 표준영역의 시그널은 각 분석 카트리지마다 조금씩 차이가 있지만， 시험영역 시그널 /표준영역 시그널의 비율값 (T/R)은 거의 일정하게 나타났다.. 1-2. 본 발명의 항원 검출방법의 조건확립
본 발명의 항원 검출방법의 목적은 분석시료의 유동을 조절하고， 반웅시간을 조절하여 유동반웅에서 볼 수 있는 단점들을 제거하여 반웅감도를 최대한 높이는 것이므로， 이러한 목적이 달성되는지와 관련된 실험을 실시하였다. 즉， 본 발명의 항원 검출방법을 통해 측정된 시그널 측정치가 유효한지 검증하고자 오류율 (error rate) 분석을 실시하였으며， 오류율의 산출방법은 수학식 3 내지 수학식 5 와 같다. 반응시작영역의 형광시그널은 Xtcᅳ (Xrc-Xtc)-30 지점부터 Xtc-(Xrc-Xtc)+30 지점까지 각 지점의 시그널 평균값이이고, 반웅종료영역의 형광시그널은 Xrc+(Xrc_Xtc)- ^ ^지점부터 /c c- > ^지점까지 각 지점의 시그널 평균값이다. 수학식 3 반웅시작영역의 형광시그널 =
수학식 4 반웅종료영역의 형광시그널 =
Figure imgf000027_0001
Xn = n 위치에서의 형광시그널
시험영역 중앙지점의 형광시그널
Xrc = 표준영역 중앙지점의 형광시그널 ¬시작영역의 시그널-반웅종료영역의
Figure imgf000027_0002
100 각각의 시료가 주입되는 마이크로칩, 즉 카트리지 (1 내지 5)에서 반웅시작영역 및 반웅종료영역에서의 시그널을 측정하였고, 상기 반웅시작영역 및 반웅종료영역으로부터 오류율을 산출하였다 (표 3 및 도 1 참조).
【표 3】
오류율 측정
Figure imgf000028_0002
그 결과， 카트리지 3 의 분석시료에서 오류율이 가장 높게 측정되었으며, 오류율이 20% 이상인 경우 분석시료의 농도를 조정한 후 분석을 재실시하였다. 실시예 2: 분석시료의 농도에 따른 검출 데이터의 비교
본 발명의 검출방법 및 기존의 항원 검출방법 (Rabbit IgG 표준 시스템)을 이용하여 분석시료가 고농도인 경우의 측정 결과치의 해상도를 비교시험을 실시하였다.
2-1. 기존의 항원 검출방법을 이용한 PSA 검출
본 발명의 방법에 따른 전립선특이항원 검출결과에 대한 참고치로서， 아래와 같이 전립선특이항원 검출실험을 실시하였다.
본 발명에 이용한 시료 중 비선형 구간의 고농도 환자 시료를 선별하여 본 발명을 이용한 검출 장치를 이용하여 측정을 실시하였다. 칩의 샘플 주입 (inlet) 부위에 샘플 (지단백리파아제가 존재하거나 또는 존재하지 ¾늘ᅩ直잔——혈표— 1는—혈장 — 30ᅳ/ 를——떨의^
Figure imgf000028_0001
경과 후， 칩을 본 발명에 따른 항원 검출장치에 삽입하였다. 약 40 초 후에 검출장치의 디스플레이 화면에 샘플 내 전립선특이항원의 존재 정도가 정량적으로 표시되었으며， 또한 시험영역 및 표준영역의 시그널 세기 값이 표시되었다.
그 결과, 분석시료의 농도가 높아질수록， 시험영역 /표준영역 시그널 세기의 비율이 증가하는 폭이 감소하는 것을 확인 할 수 있었다 (도 2a).
2- 2. 본 발명의 방법을 이용한 PSA 검출
본 발명의 검출방법을 이용하여 PSA 의 검출실험을 아래와 같이 실시하였다.
상기 실시예 2—1 과 같은 실험 방법 실시하였으며 같은 시료를 사용하였다.
그 결과, 분석시료의 농도가 높아질수록, 시험영역 /표준영역 시그널 세기의 비율도 일정하게 증가하여 선형 비례적인 그래프를 나타냄을 확인할 수 있었다 (도 2b). 실시예 3: 측정 은도에 따른 검출 데이터의 비교
본 발명의 검출방법 및 기존의 항원 검출방법 (Rabbit IgG 표준 시스템)을 이용하여 비교시험을 실시하였다.
3- 1. 기존의 항원 검출방법을 이용한 PSA 검출
본 발명의 방법에 따른 PSA 검출결과에ᅳ 대한 참고치로서， 아래와 같이 PSA 검출실험을 실시하였다.
본 발명에 이용한 시료 중 선형 구간의 한 농도의 환자 시료를 사용하여 각각 13.8°C, 24.2°C 및 29.7°C의 온도의 환경에서 시험을 실시하였다. 칩을 각각의 온도에 맞게 미리 셋팅한 후， 칩의 샘플 주입 (inlet) 부위에 샘플 (지단백리파아제가 존재하거나 또는 존재하지 않는 환자 혈청 또는 혈장) 30 떨어뜨렸다. 샘플을 떨어뜨린지 5분 경과 후, 칩을 본 발명에 따른 항원 검출장치에 삽입하였다. 약 40 초 후에 검출장치의 디스플레이 화면에 샘플 내 전립선특이항원의 존재 정도가 정량적으로 표시되었으며， 또한 시험영역 및 표준영역의 시그널 세기 값이 표시되었다.
그 결과， 측정 온도가 높아질수록， 시험영역 /표준영역 시그널 세기의 비율도 함께 증가하는 것을 확인 할 수 있었다 (도 3a). 이로써 항원—항체 반웅이 은도에 따라 증가됨을 확인하였다.
3-2. 본 발명의 방법을 이용한 PSA 검출
본 발명의 검출방법을 이용하여 PSA 의 검출실험을 아래와 같이 실시하였다.
상기 실시예 3-1 과 같은 실험 방법을 사용하였으며 같은 시료를 사용하여 실시하였다.
그 결과， 측정 온도의 변화에도 불구하고 시험영역 /표준영역 시그널 세기의 비율이 거의 일정하게 유지됨을 확인할 수 있었다 (도 3b). 실시예 4: 동일 검체에 대한 은도에 따른 은도 변이계수의 측정
본 발명의 검출방법이 온도에 영향을 받는지 알아보기 위하여 아래와 같이 온도에 따른 변이계수 측정 실험을 실시하였다. 상기 Rabbit IgG 표준 시스템, Taq IgG 표준 시스템， 본 발명의 검출방법 (PSA 표준시스템) 및 바이오사이트 (Biosite)사 (미국 등록특허 제 6， 194,222 호)의 항원 검출방법을 이용하여 비교시험을 실시하였다.
상기 실시예 3-1 과 같은 실험 방법을 사용하였으며 같은 시료를 사용하여 실시하다.
각각 3 가지의 온도에서 시험영역 및 표준영역의 시그널을 측정하였으며, 이를 그래프상에 표현하기 위하여 표현값을 산출하였다. 표현값은 다음과 같이 계산된다. 시험영역에만 특이적으로 반응하는 각 농도별 표준물질 (reference substance)을 사용하여 표준 농도 그래프를 그린다. 이 그래프에 상웅하는 함수를 본 발명에 이용된 검출 장치의 코드칩에 입력시켜 놓는다. 그 결과, 시험영역에 나온 시그널은 그에 상웅하는 농도의 표현값이 산출 되게 하였다. (표 4 및 표 5). 그 결과, Rabbit IgG 표준 시스템 (도 4a 및 4b, 온도에 따른 변이계수 33%), Taq IgG 표준 시스템 (도 5a 및 5b, 온도에 따른 변이계수 36.9%) 및 바이오사이트사의 검출방법 (도 7， 온도에 따른 변이계수 31.0%)을 이용하였을 때는 측정온도가 증가함에 따라 시험영역 /표준영역 시그널 세기의 비율 값이 증가하여, 온도 변화에 따라 PSA 의 검출양이 달라짐을 확인할 수 있었다. 반면 본 발명의 방법을 이용하였올 때， PSA 의 표현값은 13.8°C, 24.2°C 및 29/ C에서 각각 4.35， 4.01 및 4.45 로 측정되었으며， 따라서 온도의 변화에 거의 영향을 받지 않는 것으로 나타났다 (도 6a 및 6b, 온도에 따른 변이계수 5.5%). 수학식 6
변이계수 = 표준편차 /평균값 X 100
【표 4】
본 발명의 검출방법에 의한 온도에 따른 변이계수의 확인
Figure imgf000031_0001
Figure imgf000032_0001
【표 5】
바이오사이트사 (Biosite) 분석법에 의한 온도에 따른 변이계수의 확인
Figure imgf000032_0002
실시예 5: 고농도 분석시료의 검출 데이터의 비교 1
본 발명의 검출방법 및 기존의 항원 검출방법 (Rabbit IgG 표준 시스템)을 이용하여 분석시료가 고농도인 경우의 측정 결과치의 해상도를 비교시험을 실시하였다. PSA 항원으로서 인간 정액 (BiosPacific, J63000)을 이용하였으며 , 실험방법은 상기 실시예 2와 같다.
표 6 은 본 발명의 방법을 이용한 전립선 특이항원 (PSA) 표준시스템을 사용하여， 분석시료의 농도에 따른 시험영역 /표준영역 시그널 세기의 비율 값을 측정한 결과를 나타낸 것이다. 【표 6】
PSA농도에 따른 시그널 세기의 확인
Figure imgf000033_0001
도 8 에서 볼 수 있는 바와 같이, 기존의 Goat 항 R IgG-R IgG 시스템을 이용한 경우 분석시료의 농도가 높아질수록 시험영역 /표준영역 시그널 세기의 비율이 증가하는 폭이 감소하였으며， PSA 농도 100 ng/ml 이상에서는 그래프의 기울기가 급감하여 100 ng/ml 이상의 항원은 정량적 분석이 불가능하였다 (도 8).
그러나， 본 발명의 방법을 이용한 경우 1500 ng/ml 의 농도에서도 시료의 정량적 검출이 가능하였으며, 도 8 의 그래프를 이용하는 경우 1500 ng/ml 이상의 농도에서도 항원의 검출이 가능함을 알 수 있었다. 실시예 6: 고농도 분석시료의 검출 데이터의 비교 2
본 발명의 검출방법 및 기존의 항원 검출방법 (Rabbit IgG 표준 시스템)을 이용하여 분석시료가 고농도인 경우의 측정 결과치의 해상도를 비교시험 하였다. PSA 고농도 검체로서 Beckman Coulter UN I CELL DXI 800, Access Hybritech PSA 로 측정하여 8720 ng/mL 로 확인된 검체를 사용하였으며， 실험방법은 상기 실시예 2와 같다. 도 9a 및 도 9b 는 본 발명의 방법을 이용한 전립선 특이항원 (PSA) 표준시스템 및 기존의 항원 검출방법 (Rabbit IgG 표준 시스템)을 이용하여 PSA 의 농도에 따른 시험영역 /표준영역 시그널 세기의 비율 값을 측정한 결과를 나타낸 것이다. 표 7은 각각의 시료에서 시그널을 2 회 측정한 값을 평균하여 나타낸 것이다.
도 9 및 표 7 에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명의 방법을 이용한 경우 4360 ng/mL 의 PSA 항원의 검출 /측정이 가능하였으나 (도 9a), 기존의 Goat 항 R IgG-R IgG 시스템을 이용한 경우 항원의 농도가 272.5 ng/mL 이상인 경우 후크 효과 (hook effect)가 나타나 항원의 정량적 분석이 불가능하였다 (도 9b).
【표 7]
PSA농도에 따른 시그널 세기의 확인
Figure imgf000034_0001
Figure imgf000035_0001
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며， 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서， 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

【특허청구범위】
【청구항 1】
다음의 단계를 포함하는 분석시료 내 항원의 검출방법:
(a) 검출가능한 시그널을 발생시키는 표지가 결합되어 있고 상기 항원에 특이적으로 결합하는 검출항체와 분석시료를 접촉시키는 단계;
(b) 검출하고자 하는 항원에 특이적으로 결합하는 포획항체를 상기 단계 (a)의 결과물에 접촉시키는 단계;
(c) 상기 검출항체가 특이적으로 결합하는 에피토프를 포함하며 고상 기질 표면에 결합되어 있는 표준물질 (reference substance)에 상기 검출가능한 시그널을 발생시키는 표지가 결합되어 있는 검출항체를 접촉시키는 단계 ;
(d) 상기 단계 (b)의 결과물 및 (c)의 결과물의 표지로부터 발생되는 시그널을 측정하는 단계; 및
(e) 상기 측정된 시그널을 분석하여 상기 분석시료 내 항원의 존재 여부 또는 양을 결정하는 단계;
상기 단계 (a)-(d), 또는 상기 단계 (b)-(d)는 마이크로채널 (microchannel)이 구비된 마이크로칩에서 실시되며， 상기 시그널 분석은 상기 마이크로채널에 의해 제공되는 반웅시작영역, 시험영역, 표준영역 및 반웅종료영역에서의 시그널을 측정하여 실시된다.
【청구항 2]
제 1 항에 있어서， 상기 포획항체는 고상 기질 표면에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 3]
제 2 항에 있어서， 상기 포획항체 및 표준물질은 반응물의 연속적인 흐름이 이루어지는 하나의 마이크로칩의 기질 표면 상에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 4】
제 1 항에 있어서， 상기 마이크로칩의 마이크로채널은 시험영역 (test zone) 및 표준영역 (reference zone)을 포함하며， 상기 시험영역의 표면에 상기 포획항체가 결합되어 있고 상기 표준영역에 상기 표준물질이 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 5】
제 4 항에 있어서, 상기 분석시료는 상기 마이크로칩에 적용되며 상기 적용된 분석시료는 상기 마이크로채널에 형성된 흐름을 통해 상기 시험영역 및 표준영역과 접촉하는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 6】
제 5 항에 있어서， 상기 분석시료는 상기 시험영역 및 표준영역을 순차적으로 접촉하거나 또는 상기 표준영역 및 시험영역을 순차적으로 접촉하는 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 7】
제 1 항에 있어서, 상기 표준물질은 상기 항원과 동일한 물질 또는 상기 에피토프를 포함하는 상기 항원의 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 8]
제 1 항에 있어서， 상기 측정된 시그널의 분석은 상기 단계 (b)의 결과물 및 (c)의 결과물의 표지로부터 발생되는 시그널의 세기의 비율을 계산하는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 9】
제 1 항에 있어서, 상기 측정된 시그널의 분석은 상기 시험영역 및 표준영역에서 측정된 시그널의 오류율 (error rate)을 계산하는 분석단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법으로서, 상기 오류율은 상기 시험영역 및 표준영역으로부터 일정 거리에 위치하는 반응시작영역 및 반응종료영역의 시그널을 측정하여 실시되고, 상기 반웅시작영역 및 반웅종료영역으로부터 산출한 오류율 (error rate)이 20% 이상인 경우에는 상기 시그널 분석을 재실시하며， 상기 오류율 (error rate)은
[1(반웅시작영역의 시그널-반응종료영역의 시그널 )1/반웅시작영역의 시그널 X 100으로 산출하는 것을 특징으로 하는 방법 .
,
【청구항 10】
제 1 항에 있어서， 상기 분석시료는 전혈， 혈장， 혈청， 체액 또는 세포 배양 상등액인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 11】
제 1 항에 있어서， 상기 항원은 약물， 독소, 자가항체, 자가항원， 단백질, 탄수화물， 핵산 또는 암 관련 항원인 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 12】
제 11 항에 있어서， 상기 항원은 암 관련 항원인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 13]
제 8 항에 있어서, 상기 단계 (b)의 결과물 및 단계 (c)의 결과물의 표지로부터 발생되는 시그널의 세기의 비율 값은 상기 단계 (a)의 분석시료의 농도에 대하여 선형 비례적인 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 14】
제 8 항에 있어서， 상기 단계 (b)의 결과물 및 단계 (c)의 결과물의 표지로부터 발생되는 시그널의 세기의 비율 값은 상기 방법이 실시되는 온도의 변화에 대하여 영향을 받지 않는 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 15]
제 8 항에 있어서, 상기 단계 (b)의 결과물 및 단계 (c)의 결과물의 표지로부터 발생되는 시그널의 세기의 비율 값은 상기 방법이 실시되는 온도 범위 1()-3( C에서 동일한 을 난관내는—것을 _릎一징으로 _하는ᅩ방법
【청구항 16】
제 1 항에 있어서, 상기 분석시료 내 항원은 농도 0.0001 ng/m 1-4500 ng/ml의 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 17】
다음을 포함하는 분석시료 내 항원의 검출장치:
(a) 분석시료를 수용하고 반웅이 이루어지는 마이크로채널 (microchannel)이 구비된 마이크로칩;
(b) 상기 마이크로채널의 한 부위에 형성되어 있고 검출하고자 하는 항원에 특이적으로 결합하는 포획항체가 표면에 결합되어 있는 시험영역 (test zone); 및
(c) 상기 마이크로채널의 한 부위에 형성되어 있고 검출항체가 특이적으로 결합하는 에피토프를 포함하는 표준물질 (reference substance)이 표면에 결합되어 있는 표준영역 (reference zone).
【청구항 18】
제 17 항에 있어서, 상기 장치는 검출가능한 시그널을 발생시키는 표지가 결합되어 있고 상기 항원에 특이적으로 결합하는 검출항체를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 검출장치.
【청구항 19]
제 17 항 또는 제 18 항에 있어서， 상기 장치는 상기 표지로부터 발생되는 시그널을 측정하는 측정수단을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 검출장치 .
【청구항 20】
제 19 항에 있어서， 상기 장치는 상기 시험영역 및 표준영역에서 측정된 시그널의 세기의 비율을 계산하는 분석수단을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 검출장치 .
【청구항 21]
제 17 항에 있어서, 상기 검출장치는 상기 시험영역 및 표준영역에서 측정된 시그널의 오류율 (error rate)올 계산하는 분석수단을 추가적으로 포함하는 것올 특징으로 하는 장치로서， 상기 오류율은 상기 시험영역 및 표준영역으로부터 일정 거리에 위치하는 반응시작영역 및 반웅종료영역의 시그널을 측정하여 실시되고, 상기 반웅시작영역 및 반웅종료영역으로부터 산출한 오류율 (error rate)이 20% 이상인 경우에는 상기 시그널 분석을 재실시하며, 상기 오류율 (error rate)은 1(반웅시작영역의 시그널- 반웅종료영역의 시그널 )1/반웅시작영역의 시그널 X 100으로 산출하는 것을 특징으로 하는 검출장치 .
【청구항 22]
제 17 항에 있어서, 상기 분석시료는 상기 마이크로칩에 적용되며 상기 적용된 분석시료는 상기 마이크로채널에 형성된 흐름을 통해 상기 시험영역 및 표준영역과 접촉하는 것을 특징으로 하는 장치.
【청구항 23]
제 22 항에 있어서， 상기 분석시료는 상기 시험영역 및 표준영역을 순차적으로 접촉하거나 또는 상기 표준영역 및 시험영역을 순차적으로 접촉하는 것을 특징으로 하는 장치 .
【청구항 24】
제 17 항에 있어서, 상기 표준물질은 상기 항원과 동일한 물질 또는 상기 에피토프를 포함하는 상기 항원의 단편인 것을 특징으로 하는 장치.
【청구항 25】
제 17 항에 있어서， 상기 분석시료는 전혈， 혈장, 혈청， 체액 또는 세포 배양 상등액인 것을 특징으로 하는 장치.
【청구항 26】
제 17 항에 있어서， 상기 항원은 약물， 독소, 자가항체， 자가항원, 단백질 , 탄수화물， 핵산 또는 암 관련 항원인 것을 특징으로 하는 장치
【청구항 27]
제 26 항에 있어서， 상기 항원은 암 관련 항원인 것을 특징으로 하는 장치 .
【청구항 28]
제 20 항에 있어서， 상기 시그널의 세기 의 비율 값은 상기 분석시료의 농도에 대하여 선형 비 례적 인 것올 특징으로 하는 장치 .
【청구항 29】
제 20 항에 있어서， 상기 단계 (b)의 결과물 및 단계 (c)의 결과물의 표지로부터 발생되는 시그널의 세기의 비율 값은 상기 장치가 작동되는 온도의 변화에 대하여 영향을 받지 않는 것을 특징으로 하는 장치 .
【청구항 30]
제 20 항에 있어서 , 상기 단계 (b)의 결과물 및 단계 (c)의 결과물의 표지로부터 발생되는 시그널의 세기의 비율 값은 상기 방법 이 실시 되는 온도 범위 10-30°C에서 동일한 값을 나타내는 것을 특징으로 하는 장치 .
【청구항 31】
제 17 항에 있어세 상기 분석시료 내 항원은 농도 0.0001 ng/ml- 4500 ng/ml의 범위 인 것을 특징으로 하는 장치 .
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