JP2023059089A - 検体中の検出対象を検出又は定量する方法、および検体中の検出対象を検出又は定量するための試薬 - Google Patents

Abstract

【課題】 検体中の微量の検出対象を検出又は定量することが可能な技術を提供すること。
【解決手段】 検体中の検出対象を検出又は定量する方法は、第１担体粒子と、前記第１担体粒子に担持されかつ前記検出対象に対して親和性を有する第１親和性物質とを含み、励起光の照射により蛍光を放出する蛍光粒子と、第２担体粒子と、前記第２担体粒子に担持されかつ前記検出対象に対して親和性を有する第２親和性物質とを含み、前記蛍光粒子が放出する蛍光を吸収するクエンチング粒子と、前記検体とを混合することと、前記混合により得られた反応混合液に前記励起光を照射し、前記蛍光粒子により放出される蛍光の強度を測定し、測定された前記蛍光の強度に基づいて、前記検体中の前記検出対象を検出又は定量することとを含む。
【選択図】 図３

Description

本明細書及び図面に開示の実施形態は、検体中の検出対象を検出又は定量する方法、および検体中の検出対象を検出又は定量するための試薬に関する。

従来から、検体中の検出対象を検出する方法として、ラテックス凝集法が行われてきた。ラテックス凝集法とは、例えば、生体試料等の検体中における抗原を検出する場合、検体と、抗原に特異的に結合する抗体もしくはそのフラグメントを担持させたラテックス粒子とを混合して、ラテックス粒子の凝集の程度を測定することにより、抗原を検出又は定量する方法である。

このラテックス凝集法によれば、検体に含まれる抗原が、複数のラテックス粒子結合抗体を架橋させ、ラテックス粒子の凝集を促す。しかし、抗原が微量の場合、その架橋が起こりにくいため、ラテックス粒子が十分に凝集せず、凝集しても検出感度以下となって検出できない。このため、微量の抗原を検出することが困難であった。

特公昭５８－１１５７５号公報

本明細書及び図面に開示の実施形態が解決しようとする課題の一つは、検体中の微量の検出対象を検出又は定量することが可能な技術を提供することである。ただし、本明細書及び図面に開示の実施形態により解決しようとする課題は上記課題に限られない。後述する実施形態に示す各構成による各効果に対応する課題を他の課題として位置づけることもできる。

実施形態によれば、検体中の検出対象を検出又は定量する方法であって、
第１担体粒子と、前記第１担体粒子に担持されかつ前記検出対象に対して親和性を有する第１親和性物質とを含み、励起光の照射により蛍光を放出する蛍光粒子と、
第２担体粒子と、前記第２担体粒子に担持されかつ前記検出対象に対して親和性を有する第２親和性物質とを含み、前記蛍光粒子が放出する蛍光を吸収するクエンチング粒子と、
前記検体と
を混合することと、
前記混合により得られた反応混合液に前記励起光を照射し、前記蛍光粒子により放出される蛍光の強度を測定し、測定された前記蛍光の強度に基づいて、前記検体中の前記検出対象を検出又は定量することと
を含む方法が提供される。

検体中に検出対象が含まれていない場合の反応混合液の様子の一例を模式的に示す図である。 検体中に低濃度の検出対象が含まれている場合の反応混合液の様子の一例を模式的に示す図である。 検体中に高濃度の検出対象が含まれている場合の反応混合液の様子の一例を模式的に示す図である。 蛍光クエンチング法およびラテックス凝集法の結果を示すグラフ。

以下、実施形態について詳細に説明する。

１．検体中の検出対象を検出又は定量する方法
実施形態に係る方法は、検体中の検出対象を検出又は定量する方法であり、
第１担体粒子と、前記第１担体粒子に担持されかつ前記検出対象に対して親和性を有する第１親和性物質とを含み、励起光の照射により蛍光を放出する蛍光粒子と、
第２担体粒子と、前記第２担体粒子に担持されかつ前記検出対象に対して親和性を有する第２親和性物質とを含み、前記蛍光粒子が放出する蛍光を吸収するクエンチング粒子と、
前記検体と
を混合することと、
前記混合により得られた反応混合液に前記励起光を照射し、前記蛍光粒子により放出される蛍光の強度を測定し、測定された前記蛍光の強度に基づいて、前記検体中の前記検出対象を検出又は定量することと
を含む。

上記方法では、検体中に検出対象が含まれる場合、検出対象を介して蛍光粒子とクエンチング粒子とが結合し、クエンチング粒子が、蛍光粒子の近傍で、蛍光粒子が放出する蛍光を効率良く吸収することができる。このため、上記方法は、蛍光強度を測定することにより、検体中に検出対象が含まれているか否かを検査したり、検体中の検出対象の量を決定したりすることができる。

上記方法において、典型的には、複数の蛍光粒子および複数のクエンチング粒子が使用される。すなわち、上記方法において、典型的には、
第１担体粒子と、第１担体粒子に担持されかつ検出対象に対して親和性を有する第１親和性物質とを各々が含み、各々が、励起光の照射により蛍光を放出する複数の蛍光粒子、および
第２担体粒子と、第２担体粒子に担持されかつ検出対象に対して親和性を有する第２親和性物質とを各々が含み、各々が、蛍光粒子が放出する蛍光を吸収する複数のクエンチング粒子
が使用される。

上記方法は、「混合」および「検出又は定量」の工程を含む。以下、この工程順に説明する。

１－１．混合
混合工程では、「検体」と「蛍光粒子」と「クエンチング粒子」を混合する。この工程では、検体中に検出対象が含まれる場合に、検出対象を介した蛍光粒子とクエンチング粒子との結合反応が起こる（図２および３を参照）。

まず、「検体」、「蛍光粒子」、および「クエンチング粒子」について、以下で順に説明する。

「検体」
検体は、任意の生体試料であり、例えば、体液または排泄物の抽出液であり、具体的には、血液、血清、血漿、尿、リンパ液、喀痰、糞便の抽出液等が挙げられる。

検体中に含まれる検出対象は、臨床診断に利用される物質が挙げられ、具体的には、体液、尿、喀痰、糞便中等に含まれる、ヒトイムノグロブリンＧ、ヒトイムノグロブリンＭ、ヒトイムノグロブリンＡ、ヒトイムノグロブリンＥ、ヒトアルブミン、ヒトフィブリノーゲン（フィブリン及びそれらの分解産物）、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、ミオグロビン、フェリチン、ガン胎児性抗原、肝炎ウイルス抗原、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、ヒト胎盤性ラクトーゲン（ＨＰＬ）、ＨＩＶウイルス抗原、アレルゲン、細菌毒素、細菌抗原、酵素、ホルモン（例えば、ヒト甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、インスリン等）、核酸、ＰＣＲ等により増幅された核酸、サイトカイン、薬剤等が挙げられる。

「蛍光粒子」
蛍光粒子は、第１担体粒子と、第１担体粒子に担持されかつ検出対象に対して親和性を有する第１親和性物質とを含み、励起光の照射により蛍光を放出する。

第１担体粒子は、凝集法で一般に使用される担体粒子を使用することができる、担体粒子は、例えば、セルロース粒子、多孔質ガラス粒子、シリカ粒子、ジビニルベンゼンにより随意的に架橋されている低架橋度及び高架橋度ポリスチレン粒子、グラフト化コポリマー粒子、ポリアクリルアミド粒子、ラテックス粒子、Ｎ，Ｎ－ビス－アクリロイル・エチレン・ジアミンにより随意的に架橋されているジメチルアクリルアミド粒子、及び疎水性ポリマーにより被覆されているガラス粒子等が挙げられる。あるいは、担体粒子は、アルカンチオレート誘導した金、ポリアミド、アクリルコポリマー、ナイロン、デキストラン、ポリアクロレイン等を含む粒子であってもよい。

第１担体粒子は、例えば２０～８００ｎｍ、好ましくは１００～４００ｎｍ、より好ましくは１５０～２００ｎｍの平均粒径を有する。

第１親和性物質は、好ましくは、検出対象に対して特異的に結合する物質であり、より好ましくは、検出対象に対して特異的に結合するタンパク質であり、更に好ましくは、検出対象に対して特異的に結合する抗体である。抗体は、いかなるタイプの免疫グロブリン分子であってもよく、Ｆａｂ等の抗原結合部位を有する免疫グロブリン分子断片であってもよい。また、抗体は、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよいが、抗原の異なる抗原決定基を認識するモノクローナル抗体であることが好ましい。あるいは、第１親和性物質は、抗体以外のタンパク質であってもよいし、核酸、脂質、糖などであってもよい。

蛍光粒子は、第１担体粒子および第１親和性物質の少なくとも一方が蛍光物質により標識されている。

一例によれば、第１担体粒子は、蛍光物質により標識された担体粒子である。第１担体粒子は、粒子の内部に蛍光物質を含んでいてもよいし、粒子の表面に蛍光物質を担持していてもよい。蛍光標識された担体粒子の典型的な例としては、蛍光色素を粒子の内部に含んだ蛍光ラテックス粒子や、蛍光色素を粒子の内部に含んだ蛍光シリカ粒子が挙げられる。これらは、市販されており、後者の例として、Ｑｕａｒｔｓ Ｄｏｔ（株式会社古河電工アドバンストエンジニアリング）が挙げられる。

別の例によれば、第１親和性物質は、蛍光物質により標識された親和性物質である。蛍光標識された親和性物質は、市販の蛍光標識キットを用いて親和性物質を蛍光物質で標識することにより得ることができる。親和性物質が抗体である場合、蛍光標識された親和性物質は、市販の抗体蛍光標識キットを用いて抗体を蛍光物質で標識することにより得ることができる。

蛍光粒子は、通常、１つの蛍光粒子に蛍光物質の分子を多数含んでおり、蛍光粒子が放出する蛍光強度は高い。このため、蛍光粒子を使用して上記方法（すなわち、検体中の検出対象を検出又は定量する方法）を実施すると、高感度な検出又は定量を実現することができる。

蛍光粒子は、第１親和性物質を第１担体粒子に結合させることによって作製することができる。例えば、第１親和性物質が抗体である場合、物理吸着法、化学結合法等の常法を用いて、第１親和性物質を担体粒子と直接結合させることができる。あるいは、互いに親和性を有する物質（例えば、アビジン及びビオチン、グルタチオン及びグルタチオンＳトランスフェラーゼ）を介して、第１親和性物質を第１担体粒子と間接的に結合させてもよい。

「クエンチング粒子」
クエンチング粒子は、第２担体粒子と、第２担体粒子に担持されかつ検出対象に対して親和性を有する第２親和性物質とを含み、蛍光粒子が放出する蛍光を吸収する。

クエンチング粒子は、検体中に検出対象が含まれている場合、検出対象を介して蛍光粒子に結合し、蛍光粒子の近傍で、蛍光粒子が放出する蛍光を効率良く吸収することができる（図３参照）。一方、クエンチング粒子は、検体中に検出対象が含まれていない場合、検出対象を介して蛍光粒子に結合することなく反応混合液中で浮遊し、ほとんどが蛍光粒子の近傍に存在せず、蛍光粒子が放出する蛍光を効率良く吸収することができない（図１参照）。したがって、上述の蛍光粒子とクエンチング粒子とを組み合わせて使用することにより、検体中の検出対象を検出したり定量したりすることができる。

クエンチング粒子に含まれる第２担体粒子は、蛍光粒子が放出する蛍光を吸収することができる。第２担体粒子は、例えば金属ナノ粒子、好ましくは、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、または白金ナノ粒子である。金属ナノ粒子が吸収する光の波長は、金属の種類、粒子の大きさ、粒子の形状などにより変化することが知られている。例えば、２０ｎｍの粒径を有する球状金ナノ粒子は、約５２０ｎｍに吸収ピークを示し、１００ｎｍの粒径を有する球状金ナノ粒子は、約５７０ｎｍに吸収ピークを示すことが知られている。したがって、第２担体粒子は、蛍光粒子が放出する蛍光を効率良く吸収できるように、蛍光粒子が放出する蛍光の波長に応じて適宜選択することが好ましい。

第２担体粒子は、例えば１０～１００ｎｍ、好ましくは１０～２０ｎｍの平均粒径を有する。第２担体粒子の形状は、特に限定されず、例えば、球状、楕円体、またはロッド形状など任意の形状であってもよく、好ましくは球状である。

クエンチング粒子に含まれる第２親和性物質は、好ましくは、検出対象に対して特異的に結合する物質であり、より好ましくは、検出対象に対して特異的に結合するタンパク質であり、更に好ましくは、検出対象に対して特異的に結合する抗体である。抗体は、いかなるタイプの免疫グロブリン分子であってもよく、Ｆａｂ等の抗原結合部位を有する免疫グロブリン分子断片であってもよい。また、抗体は、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよいが、抗原の異なる抗原決定基を認識するモノクローナル抗体であることが好ましい。あるいは、第１親和性物質は、抗体以外のタンパク質であってもよいし、核酸、脂質、糖などであってもよい。

クエンチング粒子に含まれる第２親和性物質は、蛍光粒子に含まれる第１親和性物質と同じであってもよいし、異なっていてもよい。いずれの場合も、第２親和性物質は、第１親和性物質が結合する検出対象上の部位とは異なる部位に結合することができる。これにより、１つの検出対象に、第１親和性物質および第２親和性物質の両方が結合することができる。

好ましくは、第１親和性物質および第２親和性物質の各々が抗体である。この場合、第１親和性物質である第１抗体および第２親和性物質である第２抗体は、サンドイッチ法で使用される捕捉抗体（固相用抗体）と検出抗体との組み合わせを使用することができる。かかる組み合わせを使用することにより、第２抗体は、第１抗体が結合する検出対象上の部位（エピトープ）とは異なる部位（エピトープ）に結合することができる。

クエンチング粒子は、第２親和性物質を第２担体粒子に結合させることによって作製することができる。例えば、第２親和性物質が抗体である場合、物理吸着法、化学結合法等の常法を用いて、第２親和性物質を担体粒子と直接結合させることができる。あるいは、互いに親和性を有する物質（例えば、アビジン及びビオチン、グルタチオン及びグルタチオンＳトランスフェラーゼ）を介して、第２親和性物質を第２担体粒子と間接的に結合させてもよい。

「混合」
実施形態に係る方法では、検体と蛍光粒子とクエンチング粒子とを混合して、検体中に検出対象が含まれる場合に、検出対象を介した蛍光粒子とクエンチング粒子との結合反応を生じさせる。本明細書では、検体と蛍光粒子とクエンチング粒子とを混合することにより得られた混合液を「反応混合液」と呼ぶ。

混合は、検体に蛍光粒子およびクエンチング粒子を同時に添加して、検出対象を介した蛍光粒子とクエンチング粒子との結合反応を生じさせることにより行ってもよい。あるいは、混合は、検体に蛍光粒子を添加して、検出対象と蛍光粒子との結合反応を生じさせ、その後、得られた混合液にクエンチング粒子を添加して、検出対象と蛍光粒子との複合体と、クエンチング粒子との結合反応を生じさせることにより行ってもよい。あるいは、混合は、検体にクエンチング粒子を添加して、検出対象とクエンチング粒子との結合反応を生じさせ、その後、得られた混合液に蛍光粒子を添加して、検出対象とクエンチング粒子との複合体と、蛍光粒子との結合反応を生じさせることにより行ってもよい。

反応混合液は、結合反応を促進するために撹拌してもよい。また、反応混合液は、結合反応に必要な時間（例えば５分間）にわたって静置してもよいし、結合反応に適した温度（例えば３７℃）に加温してもよい。

反応混合液の総量は、特に制限されないが、例えば５０～３０００μＬ、好ましくは１００～４００μＬとすることができる。反応混合液は、緩衝液を更に含んでいてもよい。

反応混合液中の蛍光粒子の濃度は、例えば０．００１～０．０２質量％、好ましくは０．００１～０．０１質量％とすることができる。反応混合液中のクエンチング粒子の濃度は、例えば０．００１～０．０２質量％、好ましくは０．００１～０．０１質量％とすることができる。反応混合液において、蛍光粒子の濃度とクエンチング粒子の濃度の比は、例えば１：３～３：１であり、好ましくは１：２～２：１である。

１－２．検出または定量
実施形態に係る方法では、反応混合液に励起光を照射し、蛍光粒子により放出される蛍光の強度を測定し、測定された蛍光の強度に基づいて、検体中の検出対象を検出又は定量する。

励起光は、蛍光粒子に励起を引き起こすレーザー光を使用することができる。励起光の波長は、蛍光粒子の励起スペクトルおよび蛍光スペクトルに基づいて決定することができる。例えば、蛍光粒子として、Ｑｕａｒｔｓ Ｄｏｔ（株式会社古河電工アドバンストエンジニアリング）を使用した場合、５００ｎｍの波長のレーザー光を照射し、５５０ｎｍの波長の光を検出することができる。

蛍光強度の測定は、検体と蛍光粒子とクエンチング粒子とを混合してから所定の時間が経過した後（すなわち、検出対象を介した蛍光粒子とクエンチング粒子との結合反応が終わった後）に行うことができる。この場合、検体と蛍光粒子とクエンチング粒子とを混合した直後に、基準値となる蛍光強度を測定し、結合反応が終わった後に測定された蛍光強度が基準値より低かった場合に、検体中に検出対象が含まれていると判定することができる。

あるいは、蛍光強度の測定は、検体と蛍光粒子とを混合して、検出対象と蛍光粒子との結合反応を生じさせ、その後、得られた混合液にクエンチング粒子を添加し、クエンチング粒子の添加直後から所定の期間にわたって行ってもよい。この場合、蛍光強度の測定は、一定の間隔で断続的に行ってもよいし、経時的に連続して行ってもよい。このように蛍光強度の測定を所定の期間にわたって行うと、検出対象を介して蛍光粒子に結合したクエンチング粒子の経時的な増加を、蛍光強度の経時的な低下として検出することができるため、検出対象の検出を高精度に行うことができる。

あるいは、蛍光強度の測定は、検体とクエンチング粒子とを混合して、検出対象とクエンチング粒子との結合反応を生じさせ、その後、得られた混合液に蛍光粒子を添加し、蛍光粒子の添加直後から所定の期間にわたって行ってもよい。この場合も、蛍光強度の測定は、一定の間隔で断続的に行ってもよいし、経時的に連続して行ってもよい。このように蛍光強度の測定を所定の期間にわたって行うと、検出対象を介してクエンチング粒子に結合した蛍光粒子の経時的な増加を、蛍光強度の経時的な低下として検出することができるため、検出対象の検出を高精度に行うことができる。また、このように蛍光粒子を最後に添加すると、蛍光粒子の蛍光消光現象（すなわち、蛍光強度が低下する現象）を抑制できるという利点がある。

検出対象の定量は、検出対象の量と蛍光強度との相関式に基づいて、測定された蛍光強度の値から、検出対象の量を算出することにより行うことができる。

検出対象の量と蛍光強度との相関式は、予め作成しておくことが好ましい。この相関式を構成する検出対象の量と蛍光強度との測定は、データが多い程に信頼性の高い相関式が得られる。そこでデータは、２以上の検出対象の量に関するものであればよく、３点以上の検出対象の量に関するものであることが好ましい。

測定された蛍光強度の値を、作成した相関式に代入することによって、検体中の検出対象の量を算出することができる。

１－３．具体例
第１親和性物質および第２親和性物質の各々が抗体である場合の反応混合液の様子の一例を図１～３に模式的に示す。図１は、検体中に検出対象が含まれていない場合の反応混合液の様子の一例を示し、図２は、検体中に低濃度の検出対象が含まれている場合の反応混合液の様子の一例を示し、図３は、検体中に高濃度の検出対象が含まれている場合の反応混合液の様子の一例を示す。

図１～３において、蛍光粒子１０は、蛍光物質により標識された第１担体粒子１１と、第１担体粒子１１に担持されかつ検出対象３０に対して特異的に結合する第１抗体１２とから構成される。また、図１～３において、クエンチング粒子２０は、蛍光粒子が放出する蛍光を吸収する第２担体粒子２１と、第２担体粒子２１に担持されかつ検出対象３０に対して特異的に結合する第２抗体２２とから構成される。上述のとおり、第２抗体２２は、第１抗体１２が結合する検出対象３０上の部位（エピトープ）とは異なる部位（エピトープ）に結合する。例えば、検出対象３０がフェリチンである場合、第１抗体１２および第２抗体２２の各々は、抗フェリチンモノクローナル抗体とすることができる。

図１では、検体中に検出対象が含まれていないため、クエンチング粒子２０は、検出対象を介して蛍光粒子１０に結合することができず、反応混合液中で浮遊している。反応混合液中で浮遊しているクエンチング粒子２０は、そのほとんどが蛍光粒子１０の近傍に存在せず、蛍光粒子１０が放出する蛍光Ｌ２を効率良く吸収することができない。このため、励起光Ｌ１を反応混合液に照射すると、蛍光粒子１０が放出した蛍光Ｌ２は、高い蛍光強度で検出される。

図２では、検体中に低濃度の検出対象３０が含まれているため、クエンチング粒子２０は、低濃度の検出対象３０を介して蛍光粒子１０に結合する。このため、少数のクエンチング粒子が、検出対象３０を介して蛍光粒子１０に結合している。蛍光粒子１０に結合している少数のクエンチング粒子２０は、蛍光粒子１０の近傍で、蛍光粒子１０が放出する蛍光Ｌ２の一部を効率良く吸収することができる。このため、ここで検出される蛍光強度は、図１の場合に検出される蛍光強度よりも低下する。

図３では、検体中に高濃度の検出対象３０が含まれているため、クエンチング粒子２０は、高濃度の検出対象３０を介して蛍光粒子１０に結合する。このため、多数のクエンチング粒子が、検出対象３０を介して蛍光粒子１０に結合している。蛍光粒子１０に結合している多数のクエンチング粒子２０は、蛍光粒子１０の近傍で、蛍光粒子１０が放出する蛍光Ｌ２の多くを効率良く吸収することができる。このため、ここで検出される蛍光強度は、図２の場合に検出される蛍光強度よりも低下する。

図１～３に示したとおり、検体中の検出対象の量に応じて、検出される蛍光強度は変化する。すなわち、検体中に含まれている検出対象３０の量が多いほど、より多くのクエンチング粒子２０が、検出対象３０を介して蛍光粒子１０に結合し、蛍光粒子１０が放出する蛍光を効率良く吸収することができるため、蛍光強度の値は低下する。一方、検体中に検出対象３０が含まれていない場合、クエンチング粒子２０が、検出対象３０を介して蛍光粒子１０に結合することができず、反応混合液中に浮遊し、蛍光粒子１０が放出する蛍光を効率良く吸収することができないため、高い蛍光強度の値を示す。

１－４．効果
以上述べたとおり、実施形態に係る方法は、検体中の検出対象の存在を、蛍光強度の低下と関連づけることにより、検体中の検出対象を検出又は定量することができる。一方、従来のラテックス凝集法は、多数の検出対象（抗原）と多数のラテックス粒子結合抗体との架橋反応により得られる凝集物を検出するため、背景技術の欄に記載したとおり、検出対象（抗原）が微量の場合には検出することができない。実施形態に係る方法は、従来のラテックス凝集法と比較して、微量の検出対象を検出又は定量することが可能である。

２．試薬
実施形態によれば、検体中の検出対象を検出又は定量するための試薬であって、
第１担体粒子と、前記第１担体粒子に担持されかつ前記検出対象に対して親和性を有する第１親和性物質とを含み、励起光の照射により蛍光を放出する蛍光粒子と、
第２担体粒子と、前記第２担体粒子に担持されかつ前記検出対象に対して親和性を有する第２親和性物質とを含み、前記蛍光粒子が放出する蛍光を吸収するクエンチング粒子と
を含む試薬が提供される。

上記試薬は、上述の「蛍光粒子」の欄で述べた蛍光粒子と、上述の「クエンチング粒子」の欄で述べたクエンチング粒子とを含む。上記試薬は、検体と混合して反応混合液を調製することができる。上記試薬は、緩衝液を更に含んでいてもよい。

上記試薬は、典型的には、複数の蛍光粒子および複数のクエンチング粒子を含む。すなわち、上記試薬は、典型的には、
第１担体粒子と、第１担体粒子に担持されかつ検出対象に対して親和性を有する第１親和性物質とを各々が含み、各々が、励起光の照射により蛍光を放出する複数の蛍光粒子、および
第２担体粒子と、第２担体粒子に担持されかつ検出対象に対して親和性を有する第２親和性物質とを各々が含み、各々が、蛍光粒子が放出する蛍光を吸収する複数のクエンチング粒子
を含む。

上記試薬は、蛍光粒子とクエンチング粒子とを、別々のパッケージで含んでいてもよいし、蛍光粒子とクエンチング粒子とを、同じパッケージに含んでいてもよい。

前者の場合、好ましい実施形態に係る試薬は、
上述の複数の蛍光粒子と、前記複数の蛍光粒子が分散した第１分散媒とを含む第１パッケージと、
上述の複数のクエンチング粒子と、前記複数のクエンチング粒子が分散した第２分散媒とを含む第２パッケージと
を含むことができる。ここで、第１分散媒および第２分散媒の各々は、反応混合液を構成する緩衝液とすることができる。

後者の場合、好ましい実施形態に係る試薬は、
上述の複数の蛍光粒子と、
上述の複数のクエンチング粒子と、
前記複数の蛍光粒子および前記複数のクエンチング粒子が分散した分散媒と
を含むことができる。ここで、分散媒は、反応混合液を構成する緩衝液とすることができる。

上記試薬を用いて、検体中の検出対象を検出又は定量すると、検体中の検出対象の存在を、蛍光強度の低下と関連づけることができるため、従来のラテックス凝集法（多数の検出対象（抗原）と多数のラテックス粒子結合抗体との架橋反応により得られる凝集物を検出する方法）と比較して、微量の検出対象を検出又は定量することが可能である。

１．方法
＜例：蛍光クエンチング法＞
検出対象を含む検査液：アビジン溶液
蛍光粒子の分散液：ビオチンを担持したＱｕａｒｔｓ Ｄｏｔの分散液（粒径：２００ｎｍ）（株式会社古河電工アドバンストエンジニアリング）
クエンチング粒子の分散液：ビオチンを担持した金ナノ粒子の分散液（粒径：１００ｎｍ）
反応容器：蛍光光度計用セル

検査液としては、反応混合液中のアビジンの濃度が、０．１μｇ／ｍＬ、０．３μｇ／ｍＬ、０．６μｇ／ｍＬ、１．３μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、または５０μｇ／ｍＬとなるように、７種類の濃度のアビジン溶液を準備した。蛍光粒子の分散液は、反応混合液中の蛍光粒子の濃度が、０．００５質量％となるように準備した。クエンチング粒子の分散液としては、反応混合液中のクエンチング粒子の濃度が、０．００６質量％または０．０１２質量％となるように、２種類の濃度の分散液を準備した。

反応容器に、検査液１０μＬを分注し、その後、蛍光粒子の分散液１８０μＬを分注し、得られた中間混合液を撹拌した。撹拌後、中間混合液を収容する反応容器にクエンチング粒子の分散液１０μＬを分注して、反応混合液を得た。

クエンチング粒子の分散液を分注した直後に、５００ｎｍの励起光を照射し、５５０ｎｍにおける蛍光強度を測定した。ここで測定された蛍光強度は、基準値の蛍光強度である。

反応混合液を撹拌した後、３７℃で５分間静置した。その後、５００ｎｍの励起光を照射し、５５０ｎｍにおける蛍光強度を測定した。基準値の蛍光強度の値から、ここで測定された蛍光強度の値を差し引いて、蛍光強度の低下率を算出した。結果を図４に示す。

＜比較例：ラテックス凝集法＞
検出対象を含む検査液：アビジン溶液
ラテックス粒子の分散液：ビオチンを担持したラテックス粒子の分散液（粒径：１５０ｎｍ）
反応容器：分光光度計用セル

検査液としては、反応混合液中のアビジンの濃度が、０．１μｇ／ｍＬ、０．３μｇ／ｍＬ、０．６μｇ／ｍＬ、１．３μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、または５０μｇ／ｍＬとなるように、７種類の濃度のアビジン溶液を準備した。ラテックス粒子の分散液は、反応混合液中のラテックス粒子の濃度が、０．００５質量％になるように準備した。

反応容器に、検査液１０μＬを分注し、その後、ラテックス粒子の分散液１８０μＬを分注して、反応混合液を得た。

ラテックス粒子の分散液を分注した直後に、光を照射し、反応容器を透過した光の強度を測定した。測定された透過光強度に基づき、吸光度を算出した。ここで算出された吸光度は、基準値の吸光度である。

反応混合液を攪拌した後、３７℃で５分間静置した。その後、光を照射し、反応容器を透過した光の強度を測定した。測定された透過光強度に基づき、吸光度を算出した。ここで算出された吸光度の値から、基準値の吸光度の値を差し引いて、吸光度の増加率を算出した。結果を図４に示す。

２．結果
図４のグラフにおいて、横軸はアビジンの濃度を示し、縦軸は、左側の目盛りに蛍光強度の低下率を示し、右側の目盛りに吸光度（Δａｂｓ）の増加率を示す。図４において、〇は、蛍光クエンチング法でクエンチング粒子（金ナノ粒子）の濃度が０．００６質量％である場合の蛍光強度の低下率を表し、△は、蛍光クエンチング法でクエンチング粒子（金ナノ粒子）の濃度が０．０１２質量％である場合の蛍光強度の低下率を表し、□は、ラテックス凝集法における吸光度（Δａｂｓ）の増加率を表す。

図４の結果から、蛍光クエンチング法は、ラテックス凝集法と比較して、微量のアビジンを検出および定量できることが示された。蛍光クエンチング法では、クエンチング粒子の濃度が０．００６質量％の場合も、クエンチング粒子の濃度が０．０１２質量％の場合も、ラテックス凝集法と比較して、微量のアビジンを検出および定量することができた。

いくつかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更、実施形態同士の組み合わせを行うことができる。これら実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれると同様に、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれるものである。

１０…蛍光粒子、１１…第１担体粒子、１２…第１抗体、
２０…クエンチング粒子、２１…第２担体粒子、２２…第２抗体、
３０…検出対象、
Ｌ１…励起光、Ｌ２…蛍光

Claims (12)

1. 検体中の検出対象を検出又は定量する方法であって、
   第１担体粒子と、前記第１担体粒子に担持されかつ前記検出対象に対して親和性を有する第１親和性物質とを含み、励起光の照射により蛍光を放出する蛍光粒子と、
   第２担体粒子と、前記第２担体粒子に担持されかつ前記検出対象に対して親和性を有する第２親和性物質とを含み、前記蛍光粒子が放出する蛍光を吸収するクエンチング粒子と、
   前記検体と
   を混合することと、
   前記混合により得られた反応混合液に前記励起光を照射し、前記蛍光粒子により放出される蛍光の強度を測定し、測定された前記蛍光の強度に基づいて、前記検体中の前記検出対象を検出又は定量することと
   を含む方法。
2. 前記第１担体粒子が、蛍光物質により標識された担体粒子である請求項１に記載の方法。
3. 前記第１親和性物質が、蛍光物質により標識された親和性物質である請求項１に記載の方法。
4. 前記第２担体粒子が、金属ナノ粒子である請求項１～３の何れか１項に記載の方法。
5. 前記第２担体粒子が、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、または白金ナノ粒子である請求項１～４の何れか１項に記載の方法。
6. 前記第１親和性物質および前記第２親和性物質の各々が、抗体である請求項１～５の何れか１項に記載の方法。
7. 検体中の検出対象を検出又は定量するための試薬であって、
   第１担体粒子と、前記第１担体粒子に担持されかつ前記検出対象に対して親和性を有する第１親和性物質とを含み、励起光の照射により蛍光を放出する蛍光粒子と、
   第２担体粒子と、前記第２担体粒子に担持されかつ前記検出対象に対して親和性を有する第２親和性物質とを含み、前記蛍光粒子が放出する蛍光を吸収するクエンチング粒子と
   を含む試薬。
8. 前記第１担体粒子が、蛍光物質により標識された担体粒子である請求項７に記載の試薬。
9. 前記第１親和性物質が、蛍光物質により標識された親和性物質である請求項７に記載の試薬。
10. 前記第２担体粒子が、金属ナノ粒子である請求項７～９の何れか１項に記載の試薬。
11. 前記第２担体粒子が、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、または白金ナノ粒子である請求項７～１０の何れか１項に記載の試薬。
12. 前記第１親和性物質および前記第２親和性物質の各々が、抗体である請求項７～１１の何れか１項に記載の試薬。

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