JP2009258034A - 表面プラズモン放射光検出方法および装置、表面プラズモン放射光検出用試料セルおよびキット - Google Patents
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Abstract
【解決手段】誘電体プレート11と該プレート11の一面の所定領域に設けられた金属膜12を備えたセンサチップ10を用意し、誘電体プレート11と金属膜12との界面に、全反射条件で励起光L0を入射させて金属膜12に表面プラズモンを誘起し、この表面プラズモンに起因して金属膜12上に生じる電場増強場内において、試料に含まれる蛍光標識が付与された被検出物質から生じる蛍光Lfが、金属膜12に新たな表面プラズモンを誘起し、この表面プラズモンからの放射光Leを誘電体プレート11の励起光を入射させた面側から検出する表面プラズモン放射光検出方法において、蛍光標識として、蛍光色素分子15を、蛍光色素分子15から生じる蛍光を透過すると共に、蛍光色素分子15が金属膜12に近接した場合に生じる金属消光を防止する消光防止材料16により包含してなる消光防止性蛍光物質Fを用いる。
【選択図】図1
Description
前記誘電体プレートと前記金属膜との界面に、前記誘電体プレートの前記一面とは反対の面から全反射条件で励起光を照射して前記金属膜に表面プラズモンを誘起し、
前記表面プラズモンに起因して前記金属膜上に生じる電場増強場内において、前記試料に含まれる被検出物質の量に応じた量の蛍光標識物質の蛍光標識から生じる蛍光が、前記金属膜に新たに表面プラズモンを誘起し、前記誘電体プレートの前記反対の面から出射される、前記新たに誘起された表面プラズモンからの放射光を検出する表面プラズモン放射光検出方法において、
前記蛍光標識として、蛍光色素分子を、該蛍光色素分子から生じる蛍光を透過すると共に、該蛍光色素分子が前記金属膜に近接した場合に生じる金属消光を防止する消光防止材料により包含してなる消光防止性蛍光物質を用いたことを特徴とする。
前記誘電体プレートと前記金属膜との界面に、前記誘電体プレートの前記試料保持面とは反対の面から、前記金属膜において表面プラズモン共鳴を生じる全反射条件で励起光を照射する励起光照射光学系と、
前記金属膜に試料を接触させた状態の前記センサチップへの、前記励起光の照射により生じた電場増強場内において、前記試料に含まれる被検出物質の量に応じた量の蛍光標識物質の蛍光標識から生じる蛍光が、前記金属膜に新たに表面プラズモンを誘起し、前記誘電体プレートの前記反対の面から出射される、前記新たに誘起された表面プラズモンからの放射光を検出する表面プラズモン放射光検出手段とを備え、
前記蛍光標識が、蛍光色素分子を、該蛍光色素分子から生じる蛍光を透過すると共に、該蛍光色素分子が前記金属膜に近接した場合に生じる金属消光を防止する消光防止材料により包含してなる消光防止性蛍光物質であることを特徴とする。
液体試料が流下される流路を有する基台と、
前記流路の上流側に設けられた該流路に前記液体試料を注入するための注入口と、
前記流路の下流側に設けられた、前記注入口から注入された前記液体試料を該下流側に流すための空気孔と、
前記流路の前記注入口と前記空気孔との間の壁面の少なくとも一部に設けられた、所定の光を透過する誘電体プレート、および該プレートの試料接触面側の所定領域に設けられた金属膜からなるセンサチップ部と、
前記金属膜上に固定された、前記被検出物質と特異的に結合する第1の結合物質と、
前記流路内の前記センサチップ部より上流側に固定されてなる、前記被検出物質と特異的に結合する第2の結合物質、または前記第1の結合物質と特異的に結合すると共に前記被検出物質と競合する第3の結合物質が修飾された消光防止性蛍光物質とを備えてなることを特徴とする。
液体試料が流下される流路を有する基台と、前記流路の上流側に設けられた該流路に前記液体試料を注入するための注入口と、前記流路の下流側に設けられた、前記注入口から注入された前記液体試料を該下流側に流すための空気孔と、前記流路の前記注入口と前記空気孔との間の壁面の少なくとも一部に設けられた、所定の光を透過する誘電体プレート、および該プレートの試料接触面側の所定領域に設けられた金属膜からなるセンサチップ部と、前記金属膜上に固定された、前記被検出物質と特異的に結合する第1の結合物質とを備えた試料セル、および
表面プラズモン放射光検出測定を行うにあたり、前記液体試料と同時もしくは前記液体試料の流下後に前記流路内に流下するための、前記被検出物質と特異的に結合する第2の結合物質、または前記第1の結合物質と特異的に結合すると共に前記被検出物質と競合する第3の結合物質が修飾された消光防止性蛍光物質を含む標識用溶液を備えたことを特徴とする。
図面を参照して、本発明の第1実施形態に係る表面プラズモン放射光検出方法およびそれに用いられる装置について説明する。図1は装置の全体図である。各図において説明の便宜上、各部の寸法は実際のものとは異ならせている。
なお、本実施形態においては、センサチップ10上に液体試料Sを保持する試料保持部13が備えられ、センサチップ10と試料保持部13により液体試料を保持可能な箱状セルが構成されている。
励起光照射光学系20により励起光Loが誘電体プレート11と金属膜12との界面に対して全反射角以上の特定の入射角度で入射されることにより、金属膜上12の試料S中にエバネッセント波Ewが滲み出し、このエバネッセント波Ewによって金属膜12中に表面プラズモンが励起される。この表面プラズモンにより金属膜12表面に電界分布が生じ、電場増強領域が形成される。このとき、エバネッセント波Ewの滲み出し領域において蛍光標識Fが存在する場合、その蛍光標識Fが励起されて蛍光が発生する。このとき、エバネッセント波の染み出し領域とほぼ同等の領域に存在する表面プラズモンによる電場増強の効果により蛍光は増強されたものとなる。なお、エバネッセント波Ewの滲み出し領域外の蛍光標識Fは励起されず蛍光を発しない。金属膜12上で生じた蛍光Lfが、金属膜の表面プラズモンを新たに励起し、この表面プラズモンによりセンサチップ10の金属膜形成面と反対側のプリズム22から特定の角度で放射光Leが射出される。光検出器30は、蛍光標識Fから生じた蛍光が金属膜の表面プラズモンを新たに誘起し、この新たに誘起された表面プラズモンから生じるこの放射光Leを検出する。放射光Leは蛍光が金属膜の特定の波数の表面プラズモンと結合する際に生じるものであり、蛍光の波長に応じてその結合する波数は定まり、その波数に応じて放射光の出射角度が定まる。通常励起光Loの波長と蛍光の波長とは異なることから、する表面プラズモンは、励起光Loにより生じた表面プラズモンとは異なる波数のものとなり、励起光Loの入射角度とは異なる角度で放射光Leは射出される。
蛍光標識として消光防止性蛍光物質Fを用いれば、蛍光色素分子は消光防止材料16で覆われていることから直接金属膜に触れることがなく、金属消光を防止するための既述の膜を設ける複雑な作業を行う必要がない。また、本実施形態では消光防止性蛍光物質中に複数の蛍光色素分子が内包されていることから、金属膜から10〜20nmの距離の範囲に複数の蛍光色素分子が存在する状態を容易に達成することができる。
まず、センサチップ10の金属膜12上に検査対象となる試料Sを接触させる。ここでは、一例として、試料Sに含まれる被測定物質として抗原Aを検出する場合について説明する。金属膜12上には抗原Aと特異的に結合する第1の結合物質として1次抗体B1が修飾されている。試料保持部13中に試料Sが流され、次いで同様に抗原2と特異的に結合する第2の結合物質である2次抗体B2が表面に修飾された消光防止性蛍光物質Fが流される。この場合、金属膜12に表面修飾される1次抗体B1と蛍光標識に表面修飾される2次抗体B2とは、被検出物質である抗原Aに対して互いに別の部位に結合するものが用いられる。その後、誘電体プレート11の所定領域に向けて励起光照射光学系20により励起光Loが照射され、また光検出器30により放射光Leの検出がなされる。このとき、光検出器30によって所定の放射光Leが検出されたなら、上記2次抗体B2と抗原Aとの結合、すなわち試料中における抗原Aの存在を確認できることになる。
まず、ポリスチレン粒子(Estapor社、φ500nm、10%solid、カルボキシル基、製品番号K1−050)を調液して0.1%solid in phosphate(ポリスチレン溶液:pH7.0)を作製する。
次に、蛍光色素(MolecularProbes社、BODIPY−FL−SE、製品番号D2184)0.3mgの酢酸エチル溶液(1mL)を作製する。
上記ポリスチレン溶液と蛍光色素溶液を混合し、エバポレートしながら含浸を行った後、遠心分離(15000rpm、4℃、20分を2回)を行い、上清を除去する。以上の工程により、金属消光を防止する機能を有するポリスチレンにより蛍光色素を内包してなる消光防止性蛍光物質Fを得ることができる。このような手順で、ポリスチレン粒子に蛍光色素を含浸させて作製された消光防止性蛍光物質Fの粒径はポリスチレン粒子の粒径と同一(上記例ではφ500nm)となる。
第2の実施形態の蛍光検出方法および装置2を図2から図4を参照して説明する。ここでは、第1実施形態と同じ構成要素には同じ参照符号を付してある。
試料セル50は、基台51と、該基台51上に液体試料Sを保持し、液体試料Sの流路52を形成するスペーサ53と、試料Sを注入する注入口54aおよび排出する排出口となる空気孔54bを備えたガラス板からなる上板54とを備えている。また、流路52下流の空気孔54bに接続する部分には廃液だめ56が形成されている。なお、本実施形態では、スペーサ53により構成された流路を上部に有する基台51は誘電体プレートで構成されており、センサチップ部の誘電体プレートを兼ねている。基台はセンサチップ部となる一部のみ誘電体プレートで構成されたものであってもよい。流路52の高さhは例えば、30μm程度である。
被検出物質である抗原を含むか否かの検査対象である血液(全血)を試料セル61の注入口から注入し、アッセイを行う手順について図4を参照して説明する。
step2:血液Soは毛細管現象で流路52に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔54bにポンプを接続し、血液をポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。
step3:流路52に染み出した血液Soと標識2次抗体B2が付与された消光防止性蛍光物質とが混ぜ合わされ、抗原Aが標識2次抗体B2と結合する。
step4-5:血液Soは流路52に沿って空気孔54b側へと徐々に流れ、標識2次抗体B2と結合した抗原Aが、第1の測定エリア58上に固定されている1次抗体B1と結合し、抗原Aが1次抗体B1と2次抗体B2で挟み込まれたいわゆるサンドイッチが形成される。
第3の実施形態の表面プラズモン放射光検出方法として、本発明の一実施形態の表面プラズモン放射光検出用キットを用いた方法について図5および6を参照して説明する。図5、6において、上述の試料セルと同一の要素には同一符号を付し、詳細な説明を省略する。
被検出物質である抗原を含むか否かの検査対象である血液(全血)を試料セル61の注入口から注入し、アッセイを行う手順について図6を参照して説明する。
step2:血液Soが毛細管現象で流路52に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔54bにポンプを接続し、血液をポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。
step3:血液Soは流路52に沿って空気孔54b側へと徐々に流れ、血液So中の抗原Aが、第1の測定エリア58上に固定されている1次抗体B1と結合する。
step4:2次抗体B2が修飾された消光防止性蛍光物質Fを含む標識用溶液63を供給口54aから注入する。
step5:2次抗体B2が修飾された消光防止性蛍光物質Fが毛細管現象により流路52に染み出す。
step6:消光防止性蛍光物質Fは徐々に下流側に流れ、消光防止性蛍光物質Fに修飾されている2次抗体が抗原Aと結合し、抗原Aが1次抗体B1と2次抗体B2で挟み込まれたいわゆるサンドイッチが形成される。
前述の手順で作製した消光防止性蛍光物質溶液(蛍光物質の直径500nm、励起波長502nm、蛍光波長510nm)に50mM MESバッファーおよび、5.0mg/mLの抗hCGモノクローナル抗体(Anti−hCG 5008 SP−5、Medix Biochemica社)溶液を加えて撹拌する。これにより消光防止性蛍光物質への抗体の修飾がなされる。
さらに、2mol/L Glycine水溶液を添加し撹拌した後、遠心分離にて、粒子を沈降させる。
最後に、上清を取り除き、PBS(pH7.4)を加え、超音波洗浄機により消光防止性蛍光物質を再分散させる。さらに遠心分離を行い、上清を除いた後、1%BSAのPBS(pH7.4)溶液500μL加え、消光防止性蛍光物質を再分散させて標識用溶液とする。
図8(A)に示すように、被検出物質(例えば、抗原)Aと同一の免疫反応を示す第3の結合物質C3を消光防止性蛍光物質Fに修飾させておく。金属膜12上には、被検出物質Aおよび第3の結合物質C3といずれとも特異的に結合する第1の結合物質C1(例えば、1次抗体)を固定化しておく。第3の結合物質C3(例えば、2次抗体)が修飾された消光防止性蛍光物質Fを所定濃度で、被検出物質Aと混合し、金属膜12上に固定化された第1の結合物質C1に競合的に反応させる(抗原−抗体反応)。抗原と消光防止性蛍光物質との混合時における消光防止性蛍光物質の濃度は既知である。
step2:全血液Soは毛細管現象で流路52に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔54bにポンプを接続し、血液をポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。
step3:流路52に染み出した血液S0と標識2次抗体C3が付与された消光防止性蛍光物質Fとが混ぜ合わされ、血液Soは流路52に沿って空気孔54b側へと徐々に流れる。
step4−5:抗原Aと標識2次抗体C3とが競合して、第1の測定エリア58’上に固定されている1次抗体C1と結合する。第1の測定エリア58’上の1次抗体C1と結合しなかった標識2次抗体C3の一部は、第2の測定エリア59’上に固定されている1次抗体C0と結合する。
10 センサチップ
11 誘電体プレート
12 金属膜
15 蛍光色素分子
16 消光防止材料
20 励起光照射光学系
21 光源
22 プリズム
30 光検出器
50、61 試料セル
51 誘電体プレート
52 流路
53 スペーサ
54 上板
57 消光防止性蛍光物質吸着エリア
58、59 検出エリア
A 抗原(被検出物質)
B1 1次抗体(第1の結合物質)
B2 2次抗体(第2の結合物質)
F 消光防止性蛍光物質
Lo 励起光
Lf 蛍光
Claims (4)
- 誘電体プレートおよび該プレートの一面の所定領域に設けられた金属膜を備えたセンサチップを用意し、
該センサチップの前記金属膜に試料を接触させた状態で、前記誘電体プレートと前記金属膜との界面に、前記誘電体プレートの前記一面とは反対の面から全反射条件で励起光を照射して前記金属膜に表面プラズモンを誘起し、
前記表面プラズモンに起因して前記金属膜上に生じる電場増強場内において、前記試料に含まれる被検出物質の量に応じた量の蛍光標識物質の蛍光標識から生じる蛍光が前記金属膜に新たに表面プラズモンを誘起し、前記誘電体プレートの前記反対の面から出射される、前記新たに誘起された表面プラズモンからの放射光を検出する表面プラズモン放射光検出方法において、
前記蛍光標識として、蛍光色素分子を、該蛍光色素分子から生じる蛍光を透過すると共に、該蛍光色素分子が前記金属膜に近接した場合に生じる金属消光を防止する消光防止材料により包含してなる消光防止性蛍光物質を用いたことを特徴とする表面プラズモン放射光検出方法。 - 誘電体プレートおよび該プレートの一面の所定領域に設けられた金属膜を備えたセンサチップと、
前記誘電体プレートと前記金属膜との界面に、前記誘電体プレートの前記試料保持面とは反対の面から、前記金属膜において表面プラズモン共鳴を生じる全反射条件で励起光を照射する励起光照射光学系と、
前記金属膜に試料を接触させた状態の前記センサチップへの、前記励起光の照射により生じた電場増強場内において、前記試料に含まれる被検出物質の量に応じた量の蛍光標識物質の蛍光標識から生じる蛍光が、前記金属膜に新たに表面プラズモンを誘起し、前記誘電体プレートの前記反対の面から出射される、前記新たに誘起された表面プラズモンからの放射光を検出する表面プラズモン放射光検出手段とを備え、
前記蛍光標識が、蛍光色素分子を、該蛍光色素分子から生じる蛍光を透過すると共に、該蛍光色素分子が前記金属膜に近接した場合に生じる金属消光を防止する消光防止材料により包含してなる消光防止性蛍光物質であることを特徴とする表面プラズモン放射光検出装置。 - 被検出物質の量に応じた量の蛍光標識物質の蛍光標識からの蛍光により誘起された表面プラズモンからの放射光を検出する表面プラズモン放射光検出方法に使用される試料セルであって、
液体試料が流下される流路を有する基台と、
前記流路の上流側に設けられた該流路に前記液体試料を注入するための注入口と、
前記流路の下流側に設けられた、前記注入口から注入された前記液体試料を該下流側に流すための空気孔と、
前記流路の前記注入口と前記空気孔との間の壁面の少なくとも一部に設けられた、所定の光を透過する誘電体プレート、および該プレートの試料接触面側の所定領域に設けられた金属膜からなるセンサチップ部と、
前記金属膜上に固定されてなる、前記被検出物質と特異的に結合する第1の結合物質と、
前記流路内の前記センサチップ部より上流側に固定されてなる、前記被検出物質と特異的に結合する第2の結合物質、または前記第1の結合物質と特異的に結合すると共に前記被検出物質と競合する第3の結合物質が修飾された消光防止性蛍光物質とを備えてなることを特徴とする表面プラズモン放射光検出用試料セル。 - 被検出物質の量に応じた量の蛍光標識物質の蛍光標識からの蛍光により誘起された表面プラズモンからの放射光を検出する表面プラズモン放射光検出方法に使用される表面プラズモン放射光検出用キットであって、
液体試料が流下される流路を有する基台と、前記流路の上流側に設けられた該流路に前記液体試料を注入するための注入口と、前記流路の下流側に設けられた、前記注入口から注入された前記液体試料を該下流側に流すための空気孔と、前記流路の前記注入口と前記空気孔との間の壁面の少なくとも一部に設けられた、所定の光を透過する誘電体プレート、および該プレートの試料接触面側の所定領域に設けられた金属膜からなるセンサチップ部と、前記金属膜上に固定された、前記被検出物質と特異的に結合する第1の結合物質とを備えた試料セル、および
表面プラズモン放射光検出測定を行うにあたり、前記液体試料と同時もしくは前記液体試料の流下後に前記流路内に流下するための、前記被検出物質と特異的に結合する第2の結合物質、または前記第1の結合物質と特異的に結合すると共に前記被検出物質と競合する第3の結合物質が修飾された消光防止性蛍光物質を含む標識用溶液を備えたことを特徴とする表面プラズモン放射光検出用キット。
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