JP2003254958A - 新規な蛍光検出試薬及びそれを用いた高感度蛍光分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 蛍光ラベル剤のマイクロカプセル化方法、お
よび新規な増強方法を提供する。 【解決手段】 希土類蛍光ラベル剤をマイクロカプセル
化する方法、および増強イオンやsynergistic配位子な
どを共存させるによる希土類蛍光ラベル剤の増強方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、希土類蛍光ラベル
剤を用いた蛍光検出試薬およびこれらを用いた高感度分
析方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】希土類蛍光錯体を用いた蛍光測定法とし
ては、ＬＫＢシステムと呼ばれる方法とCyber Fluorシ
ステムと呼ばれる方法が用いられている。ＬＫＢシステ
ムは、蛍光を発しない安定なユウロピウム錯体を用いて
タンパク質を標識し、測定前に標識したユウロピウム錯
体からユウロピウムを遊離させ、ユウロピウムと錯形成
すると強い蛍光を発する配位子とトリオクチルホスフィ
ンオキシド（ＴＯＰＯ）をミセル溶液中に共存させるこ
とによって測定する方法である。この方法を用いた蛍光
の増強方法としては、ガドリニウムイオン、１,１０−
フェナントロリンを用いた co- fluorescence Effect
が公知である（Y. -Y. Xu, I. A. Hemmila,T. N. -E. L
ovgren, Analyst, 117, 1061(1992)）。しかしこの方法
では過剰の配位子が存在するため、環境からのユウロピ
ウムと反応すると、強い蛍光を発することが考えられ
る。従って、このシステムはユウロピウムの汚染を非常
にうけやすいという大きな欠点を有している。また、反
応のステップが多くアッセイの自動化には適さない。

【０００３】一方 CyberFluor システムでは、タンパク
質を直接標識できる蛍光ラベル剤４，７−ビス（クロロ
スルホフェニル）−１,１０−フェナントロリン−２,９
−ジカルボン酸（ＢＣＰＤＡ)−Ｅｕ³⁺を開発した。し
かしこのラベル剤ではＬＫＢシステムに比べて蛍光強度
が弱く検出感度が低いという問題がある。近年このラベ
ル剤の蛍光強度を克服すべく、高分子量のポリビニルア
ミン（ＰＶＡ）にＢＣＰＤＡを標識することにより蛍光
強度の増強を行っている（A. Scorlias, A. Bjartell,
H. Lija, C. Moller, E. P. Diamandis, Clinical Chem
istry, 46, 1450(2000)）。しかしながら、この方法も
増強効果は十分なものではなかった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、蛍光増強さ
れた希土類蛍光ラベル剤と、それによる高感度な分析方
法を提供することを課題とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】ある種のβ−ジケトン構
造を有する希土類蛍光錯体は、配位子と錯形成しかつ蛍
光を発しないイオンと消光の原因となる水分子を排除さ
せる配位子を界面活性剤存在下で共存させ蛍光を測定す
ることによって、蛍光強度が数百倍以上増強することが
知られている。

【０００６】本発明者らは、このような知見に基づいて
タンパク質や核酸分子などに直接ラベルできる希土類蛍
光ラベル剤において、増強イオン、シネルジスティック
配位子を用いた蛍光の増強効果及びマイクロカプセル化
による安定化を見いだし、本発明を完成した。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明は、アミノ基、カルボキシ
ル基、水酸基などを有する分析目的物質に共有結合を介
して安定に結合できる希土類蛍光ラベル剤の蛍光増強方
法、希土類蛍光ラベル剤のマイクロカプセル化による安
定化、及びかかる希土類蛍光ラベル剤を用いた高感度蛍
光分析法を特徴とする。かかる希土類蛍光ラベル剤は、
β−ジケトン、または含窒素複素環構造を有し、三価の
希土類イオンと錯形成し強い蛍光を発するものが望まし
い。より詳しくは、かかる希土類蛍光ラベル剤として下
記一般式（Ｉ）

【化７】 （式中、Ｒ¹は、水素原子、クロロスルホニル基等を示
し、ｎは１〜５の整数を示す）、または下記一般式（I
I）

【化８】 （式中、Ｒ²は、水素原子、スクシンイミジル基等を示
す）、または下記一般式（III）

【化９】 （式中、Ｒ³は芳香族基を示し、ｎは１〜５の整数を示
す）、または下記一般式（IV）

【化１０】 （式中、ｍおよびｎはそれぞれ１〜５の整数を示す）、
または下記一般式（Ｖ）

【化１１】 （式中、ＸはＣＨ₂、ＮＨ、Ｏ、Ｓであり、そして、ｎ
は１〜５の整数を示す）、または下記一般式（VI）

【化１２】 （式中、Ｒ³は芳香族基を示し、ｎは１〜５の整数を示
す）で示される配位子が三価の希土類イオンに配位した
蛍光ラベル剤が好ましい。なお、本発明における芳香族
基とは、芳香族炭化水素基および複素環式芳香族基を示
すものであり、置換基を有してもよいフェニル基、ピリ
ジル基、フリル基、チエニル基、ナフチル基、４−ビフ
ェニルイル基、２−フェナントリル基等が例示できる。
上記における置換基とは枝分かれがあってもよい炭素数
１〜１０個のアルキル基、芳香族基、アルコキシ基、ア
ルキルチオ基、アルキルアミノ基、アミノ基、クロロス
ルホニル基等が例示できる。そのなかでも４,４´−ビ
ス（１″,１″,１″,２″,２″,３″,３″−ヘプタフル
オロ−４″,６″−ヘキサンジオン−６″−イル）−ｏ
−テルフェニル (ＢＨＨＴ)−Ｅｕ³⁺、４,４´−ビス
（１″,１″,１″,２″,２″,３″,３″−ヘプタフルオ
ロ−４″,６″−ヘキサンジオン−６−イル）クロロス
ルホ−ｏ−テルフェニル (ＢＨＨＣＴ)−Ｅｕ³⁺、Ｎ,
Ｎ,Ｎ´,Ｎ´−［２,６−ビス（３´−アミノメチル−
１´−ピラゾリル）−４−フェニルピリジン］四酢酸
(ＢＰＴＡ)−Ｔｂ³⁺、５−（４″−クロロスルホ−１
´,１″−ジフェニル−４´−イル）−１,１,１,２,２
−ペンタフルオロ−３,５−ペンタンジオン (ＣＤＰＰ)
−Ｅｕ³⁺などが好適である。

【０００８】希土類蛍光錯体が蛍光を発するメカニズム
は以前から解明されており、配位子が吸収したエネルギ
ーが項間交差により配位子の三重項状態まで移動し、そ
こから分子内エネルギー移動によって中心金属まで移り
中心金属の発光として観測されるものである。この現象
は分子内だけに限定されるものではなく分子間でも起こ
ることが知られている。それには希土類金属などのイオ
ンと シネルジスティック配位子、さらにそれらを一つ
のミセルの中に取り込むための界面活性剤が必要とな
る。

【０００９】本発明に用いる増強イオンとしては、蛍光
ラベル剤と錯形成はするが蛍光を発しないイオンが望ま
しい。かかる三価イオンとしてガドリニウム、テルビウ
ム、イットリウム、ルテチウム、ランタン、イッテルビ
ウム、ジスプロシウムなどがあるが、そのなかでもガド
リニウムが好適である。

【００１０】一方 、本発明に用いるシネルジスティッ
ク配位子としては、中心金属に配位して消光の原因とな
っている水分子を排除し、かつ希土類金属と配位しても
蛍光を発しないものが望ましい。かかる配位子として
１,１０−フェナントロリンやその誘導体である４,７−
ジメチル−１,１０−フェナントロリン、４,７−ジフェ
ニル−１,１０−フェナントロリン、２,９−ジメチル−
４,７−ジフェニル−１,１０−フェナントロリン、ピリ
ジン誘導体である２,２´−ジピリジル、２,２´−ジピ
リジルアミン、２,４,６−トリメチルピリジン、２,２
´：６´,２″−テトラピリジン、また１,３−ジフェニ
ルグアニジンやトリオクチルホスフィンオキシド（ＴＯ
ＰＯ）などがあるが、前記ラベル剤においてはＴＯＰＯ
が最も好適である。界面活性剤としては、非イオン性界
面活性剤であれば特に制限するものではない。

【００１１】蛍光の増強方法としては、前記ラベル剤に
上記のような増強イオン、シネルジスティック配位子、
界面活性剤を共存させて時間分解蛍光測定で分析するこ
とを特徴とする。目的のターゲットは特にこだわらな
い。そのためどの分析方法にも応用することができるの
を特徴とする。ただし測定条件が液相状態であることが
必要となる。目的物とラベル剤を温和な条件下で攪拌す
ることでラベルでき、特にＬＫＢシステムと比べて目的
物に直接ラベル化を行うことができるためホモジニアス
系での分析方法の更なる高感度化が可能である。

【００１２】上記の増強方法は、溶液中だけではなくマ
イクロカプセル中にラベル剤と増強イオン、シネルジス
ティック配位子を共存させることによっても実現でき
る。その場合は、マイクロカプセル表面を官能基化する
ことにより目的ターゲットに結合させる。使用するマイ
クロカプセルの材質は特に限定されないが、好適にはポ
リスチレンやポリメタクリル酸メチルなどが望ましい。
また、マイクロカプセルを生成するときの重合反応は特
に限定されないが、好適にはラジカル重合反応やオレフ
ィンメタセシス重合反応が望ましい。

【００１３】マイクロカプセル中にラベル剤や増強イオ
ン、シネルジスティック配位子を共存させるときには、
マイクロカプセルを作成する系中で錯体を生成させても
よいが、あらかじめ錯体を単結晶として作成し、これを
マイクロカプセルを作成する系中に共存させてもよい。

【００１４】蛍光錯体を含む溶液の蛍光の測定方法は、
特に制限されることではなく従来の測定装置でそのま
ま、あるいは必要な改変を行って測定することができ
る。その際の検出条件については容易に最適化すること
ができる。

【００１５】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明はこれら実施例によって何ら限定され
るものではない。 実施例１ ＢＨＨＣＴ−Ｅｕ³⁺の増強イオンによる増強効果の検
討：特に断りがない限り実験は以下の条件下で行った。
ＢＨＨＣＴは１０mMにエタノールにより希釈後、５０mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ pＨ７.８緩衝溶液によりＥｕＣｌ₃
とともに１００nMに調製し、錯形成が安定するまで４℃
で２時間反応させた。ＢＨＨＣＴ−Ｇｄ³⁺も同様に錯体
を４℃で２時間反応させた後に用いた。測定は９６穴マ
イクロタイタープレート中に５０mLずつ加えてDelfia 1
234 fluorometer (Wallac) で時間分解蛍光測定により
行った。測定条件はDelay time：０.２ms Window tim
e：０.４ms Cycling time：１ms とした。５０mM Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ pＨ７.８緩衝溶液中でＢＨＨＣＴ−Ｅｕ
³⁺の濃度を１００Mと一定にしたときにＢＨＨＣＴ−Ｇ
ｄ³⁺ の濃度を変化させて蛍光の測定を行った（図
１）。また緩衝溶液にＴｗｅｅｎ２０を加えて同条件で
測定を行った（図２）。

【００１６】実施例２ ＢＨＨＣＴ-Ｅｕ³⁺ の シネルジスティック配位子によ
る増強効果の検討：ＢＨＨＣＴ-Ｅｕ³⁺（１００nM）、
ＢＨＨＣＴ-Ｇｄ³⁺（５mM）、Ｔｗｅｅｎ２０（０.０５
％）の条件で５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ pＨ９.１緩衝溶
液中でシネルジスティック配位子にＴＯＰＯを用いて測
定を行った（図３）。

【００１７】実施例３ ＢＨＨＣＴ-Ｅｕ³⁺の増強効果による蛍光スペクトルの
測定：ＢＨＨＣＴ-Ｅｕ ³⁺（１００nM)、ＢＨＨＣＴ−Ｇ
ｄ³⁺（５mM）、ＴＯＰＯ（１０mM）、Ｔｗｅｅｎ２０
（０.０５％)を含む５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ pＨ９.１
緩衝溶液中で蛍光スペクトルをＦ−４５００（HITACH
I）にて測定した（図４および図５）。なお、図５は図
４の縦軸を拡大したものである。このＢＨＨＣＴ蛍光錯
体の励起波長は３２６nmであり、蛍光波長は６１５nmで
あった。またＢＨＨＣＴ−Ｅｕ³⁺（１００nM）、ＢＨＨ
ＣＴ-Ｇｄ³⁺（５mM）、ＴＯＰＯ（１０mM）、Ｔｗｅｅ
ｎ２０（０.０５％）を含む５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ p
Ｈ９.１緩衝溶液中での蛍光強度の増強効果についてガ
ドリニウム、ＴＯＰＯを加えることによる強度比とＳ／
Ｎ比を表１にまとめた。

【００１８】

【表１】

【００１９】実施例４ ＢＰＴＡ−Ｔｂ³⁺の増強効果による蛍光スペクトルの測
定：ＢＰＴＡ は１０mMにジメチルホルムアミドにより
希釈後、５０mMホウ酸pＨ９.１緩衝溶液によりＴｂＣｌ
₃とともに１００nMに調製し、錯形成が安定するまで４
℃で２時間反応させた。ＢＰＴＡ−Ｇｄ³⁺も同様に錯体
を４℃で２時間反応させた後に用いた。ＢＰＴＡ−Ｔｂ
³⁺（１００nM）、ＢＰＴＡ−Ｇｄ³⁺（５mM）、ＴＯＰＯ
（１０mM）、Ｔｗｅｅｎ２０（０.０５％）を含む５０m
Mホウ酸pＨ９.１緩衝溶液中で蛍光スペクトルをＦ−４
５００（HITACHI）にて測定した（図６および図７）。
なお、図７は図６の縦軸を拡大したものである。この
ＢＰＴＡ 蛍光錯体の励起波長は３２５nmであり、蛍光
波長は５４５nmであった。またＢＰＴＡ−Ｔｂ³⁺（１０
０nM)、ＢＰＴＡ−Ｇｄ³⁺（５mM）、ＴＯＰＯ（１０m
M）、Ｔｗｅｅｎ２０（０.０５％)を含む５０mM ホウ酸
pＨ９.１緩衝溶液中での蛍光強度の増強効果についてガ
ドリニウム、ＴＯＰＯを加えることによる強度比とＳ／
Ｎ比を表２にまとめた。

【００２０】

【表２】

【００２１】実施例５ ＣＤＰＰ−Ｅｕ³⁺の増強効果による蛍光スペクトルの測
定：ＣＤＰＰは１０ mMにエタノールにより希釈後、５
０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ pＨ７.８緩衝溶液によりＥｕＣ
ｌ₃とともに１００nMに調製し、錯形成が安定するまで
４℃で２時間反応させた。ＣＤＰＰ−Ｇｄ³⁺も同様に錯
体を４℃で２時間反応させた後に用いた。ＣＤＰＰ−Ｅ
ｕ³⁺（１００nM)、ＣＤＰＰ−Ｇｄ³⁺（５mM）、ＴＯＰ
Ｏ（１０mM）、Ｔｗｅｅｎ２０（０.０５％)を含む５０
mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ pＨ９.１緩衝溶液中で蛍光スペク
トルをＦ−４５００（HITACHI）にて測定した（図８お
よび図９）。なお、図８は図９の縦軸を拡大したもので
ある。このＣＤＰＰ蛍光錯体の励起波長は３２５nmであ
り、蛍光波長は６１３nm であった。またＣＤＰＰ−Ｅ
ｕ³⁺（１００nM）、ＣＤＰＰ−Ｇｄ³⁺（５mM）、ＴＯＰ
Ｏ（１０mM）、Ｔｗｅｅｎ２０（０.０５％）を含む５
０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ pＨ９.１緩衝溶液中での蛍光強
度の増強効果についてガドリニウム、ＴＯＰＯ を加え
ることによる強度比とＳ／Ｎ比を表３にまとめた。

【００２２】

【表３】

【００２３】実施例６ ユウロピウムの定量：ＢＨＨＣＴ（１００nM、８１m
L）、ＢＨＨＣＴ−Ｇｄ ^{3 +}（１０mM、８１mL）、ＴＯＰ
Ｏ（１０mM、４０.５mL）と１００nMから１pMまで１０
倍希釈した塩化ユウロピウム水溶液９０mL それぞれを
５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ pＨ９.１緩衝溶液７８９７.
５ mL中に加え４℃で２時間反応させた。反応後２００m
Lずつ９６穴マイクロタイタープレートに加え時間分解
蛍光測定によって測定を行った。それにより得られたユ
ウロピウムの検量線を図１０に示した。測定条件につい
ては前述の通りである。ＢＨＨＣＴのみ、ＢＨＨＣＴと
ＴＯＰＯの時も同条件で測定を行った。それらのユウロ
ピウムの検出限界（Ｓ／Ｎ＝３）を表４に示した。

【００２４】

【表４】

【００２５】これらの結果からＢＨＨＣＴによるユウロ
ピウムの定量の検出限界がガドリニウムイオン、ＴＯＰ
Ｏを共存させることによりＢＨＨＣＴのみのときと比べ
て２桁、ＴＯＰＯ を加えたときよりも１桁以上感度を
上げることができた。従って、本発明にかかる方法を用
いることでユウロピウムの定量のみならずさまざまな目
的物のより高感度な定量を行うことができる。

【００２６】実施例７ ＢＨＨＣＴ−Ｅｕ³⁺を含むマイクロカプセルの合成：エ
タノール５０mL、メタクリル酸メチル４.０g、エチレン
グリコールジメタクリラート１.０g、２,２´−アゾビ
スイソブチロニトリル２５mg、ＢＨＨＣＴ−Ｅｕ³⁺（１
００mM、５０mL）の混合物を毎分３００回の撹拌条件
下、８０℃にて５時間反応させた。冷却後、水を加え生
成したマイクロカプセルを沈殿させ、ろ別後乾燥した。
また、ガドリニウムを添加するときは、上記の条件に、
ＢＨＨＣＴ−Ｇｄ³⁺（１００mM、２.５mL）を加えた。
得られたマイクロカプセルの電子顕微鏡写真を図１１に
示した。また、ガドリニウムを添加したマイクロカプセ
ルと添加しなかったマイクロカプセルの、エタノール中
に分散させたときの蛍光スペクトルをＦ−４５００（HI
TACHI）にて測定した（図１２）。またマイクロカプセ
ル中での蛍光の増強効果について、ＢＨＨＣＴ−Ｇｄ³⁺
を加えることによる強度比を表５にまとめた。

【００２７】

【表５】

【００２８】実施例８ ＢＰＴＡ−Ｔｂ³⁺を含むマイクロカプセルの合成：エタ
ノール５０mL、メタクリル酸メチル４.０g、エチレング
リコールジメタクリラート１.０g、２,２´−アゾビス
イソブチロニトリル２５mg、ＢＰＴＡ−Ｔｂ³⁺（１００
mM、５０mL）の混合物を毎分３００回の撹拌条件下、８
０℃にて５時間反応させた。冷却後、水を加え生成した
マイクロカプセルを沈殿させ、ろ別後乾燥した。また、
ガドリニウムを添加するときは、上記の条件に、ＢＰＴ
Ａ−Ｇｄ³⁺（１００mM、２.５mL）を加えた。ガドリニ
ウムを添加したマイクロカプセルと添加しなかったマイ
クロカプセルの、エタノール中に分散させたときの蛍光
スペクトルをＦ−４５００（HITACHI）にて測定した
（図１３）。またマイクロカプセル中での蛍光の増強効
果について、ＢＰＴＡ−Ｇｄ³⁺を加えることによる強度
比を表６にまとめた。

【００２９】

【表６】

【００３０】実施例９ ＣＤＰＰ−Ｅｕ³⁺を含むマイクロカプセルの合成：エタ
ノール５０mL、メタクリル酸メチル４.０g、エチレング
リコールジメタクリラート１.０g、２,２´−アゾビス
イソブチロニトリル２５mg、ＣＤＰＰ−Ｅｕ³⁺（１００
mM、５０mL）の混合物を毎分３００回の撹拌条件下、８
０℃にて５時間反応させた。冷却後、水を加え生成した
マイクロカプセルを沈殿させ、ろ別後乾燥した。また、
ガドリニウムを添加するときは、上記の条件に、ＣＤＰ
Ｐ−Ｇｄ³⁺（１００mM、２.５mL）を加えた。ガドリニ
ウムを添加したマイクロカプセルと添加しなかったマイ
クロカプセルの、エタノール中に分散させたときの蛍光
スペクトルをＦ−４５００（HITACHI）にて測定した
（図１４）。またマイクロカプセル中での蛍光の増強効
果について、ＣＤＰＰ−Ｇｄ³⁺ を加えることによる強
度比を表７にまとめた。

【００３１】

【表７】

【００３２】実施例１０ ユウロピウム錯体の単結晶化 （１）４,４´−ビス（１″,１″,１″−トリフルオロ
−２″,４″−ブタンジオン−４″−イル）−ｏ−テル
フェニルの合成（図１５）：文献公知の方法（J. Yuan,
K. Matsumoto, H. Kimura, Analytical Chemistry, 7
0, 596(1998)）により合成した４,４´−ジアセチル−
ｏ−テルフェニル３.１４ｇ、ナトリウムメトキシド
３.０ｇ、トリフルオロ酢酸エチル３.５５ｇ、および脱
水ジエチルエーテル５０ mLの混合物を室温にて４８時
間反応させた。反応混合物より溶媒を減圧留去し、得ら
れた固体を１５％硫酸水溶液に加え、室温にて３０分撹
拌した。上澄み液を除き、得られた固体を水で洗浄し
た。得られた固体をエタノール４０mLに加え、加熱して
溶解した。溶液を熱時ろ過し、ろ液に石油エーテル２０
０mLを加え、室温にて１０分間撹拌した。生成した沈殿
をろ別し、ろ液を減圧濃縮し、生成した固体を真空乾燥
することにより、目的物を収率７８％で単離した。¹ H-NMR (CDCl₃, TMS): d = 6.93 (2H. s), 7.29 (4H,
d, J = 8.6 Hz), 7.39- 7.61 (4H, m), 7.84 (4H, d, J
= 8.6 Hz).

【００３３】（２）単結晶ユウロピウム錯体の合成：
４,４´−ビス（１″,１″,１´−トリフルオロ−２″,
４″−ブタンジオン−４″−イル）−ｏ−テルフェニル
２５３mg、２,２´−ビピリジン７６mg、エタノール１
５mLの混合物に、水２mLに溶解した硝酸ユウロピウム６
水和物２２３mg を加え、その後５分間加熱還流した。
放冷後、溶媒を減圧留去し、生成した固体を水で洗浄
後、真空乾燥して粗錯体を得た。得られた粗錯体１０mg
をアセトン７.５mL に溶解し、トリエチルアミン２０m
g を含む石油エーテル６mLにて室温下拡散させ、黄色の
板状結晶を得た。得られた結晶をＡＦＣ−７Ｒ（Rigak
u）にて単結晶Ｘ線結晶構造解析を行った（図１６）。
また、得られた単結晶の格子定数を表８に示した。¹ H-NMR (Acetone - d₆, TMS): d = 1.16 (18H, t, J =
7.3 Hz), 1.27 (3H, t, J = 7.3 Hz), 3.42 (2H, q, J
= 7.3 Hz), 4.23 (12H, q, J = 7.3 Hz), 6.94(8H, s),
7.41 (16H, d, J = 8.4 Hz), 7.52 ？ 7.65 (16H, m),
8.06 (16H, d, J = 8.4 Hz). 元素分析：C₁₁₈H₉₄N₂O₁₇F₂₄Eu₂； 実測値 C, 55.31; H, 3.47; N, 0.99. 計算値 C, 55.10; H, 3.68; N, 1.09.

【００３４】

【表８】

【００３５】

【発明の効果】本発明にかかる蛍光ラベル剤の増強効果
は、共有結合を形成する官能基を有し、目的物に直接ラ
ベルできるのであるから多様の目的物に対して１ステッ
プで測定することができる。さらに本発明における蛍光
ラベル剤の増強効果と生体高分子へのラベルによる標識
率の向上の技術を応用することによって、イムノアッセ
イ、ＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイ等のさらな
る高感度化が期待される。さらに、配位子と金属との錯
体の安定性も、蛍光錯体をつつんだポリマーによりコー
ティングすることによって増加する。また、ポリマーの
表面にカルボキシル基やアミノ基をコーティングするこ
とにより、ストレプトアビジンへの標識や、ＤＮＡへの
直接ラベル化による時間分解蛍光イムノアッセイやＤＮ
Ａハイブリダイゼーションアッセイなどのラベル剤とし
て更に高感度な測定法が実現できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＢＨＨＣＴ−Ｅｕ³⁺にＢＨＨＣＴ−Ｇｄ³⁺を添
加した時の蛍光測定のデータを示す図である。

【図２】ＢＨＨＣＴ−Ｅｕ³⁺に０.０５％ Ｔｗｅｅｎ２
０を加えた時のＢＨＨＣＴ−Ｇｄ³⁺の濃度変化による蛍
光測定のデータを示す図である。

【図３】ＢＨＨＣＴ−Ｅｕ³⁺にＴＯＰＯを添加した時の
蛍光測定のデータを示す図である。

【図４】ＢＨＨＣＴ−Ｅｕ³⁺に ＢＨＨＣＴ−Ｇｄ³⁺、
ＴＯＰＯを加えた時の蛍光スペクトルを示す図である。
なお、点線はＢＨＨＣＴ−Ｅｕ³⁺（１００nM）の蛍光ス
ペクトル、破線はＢＨＨＣＴ−Ｇｄ³⁺（１mM）の蛍光ス
ペクトルである。

【図５】図４の縦軸を拡大したデータを示す図である。

【図６】ＢＰＴＡ−Ｔｂ³⁺にＢＨＨＣＴ−Ｇｄ³⁺、ＴＯ
ＰＯを加えた時の蛍光スペクトルを示す図である。な
お、点線はＢＰＴＡ−Ｔｂ³⁺（１００nM）の蛍光スペク
トル、破線はＢＰＴＡ−Ｔｂ³⁺（１mM）の蛍光スペクト
ルである。

【図７】図６の縦軸を拡大したデータを示す図である。

【図８】ＣＤＰＰ−Ｅｕ³⁺にＣＤＰＰ−Ｇｄ³⁺、ＴＯＰ
Ｏを加えた時の蛍光スペクトルを示す図である。なお、
点線はＣＤＰＰ−Ｅｕ³⁺（１００nM）の蛍光スペクト
ル、破線はＣＤＰＰ−Ｇｄ³⁺（１mM）の蛍光スペクトル
である。

【図９】図８の縦軸を拡大したデータを示す図である。

【図１０】蛍光ラベル剤を用いたユウロピウムの検量線
を示す図である。

【図１１】合成したマイクロカプセルの電子顕微鏡写真
を示す図である。

【図１２】ＢＨＨＣＴ−Ｅｕ³⁺を含むマイクロカプセル
の蛍光スペクトルを示す図である。なお、点線は ＢＨ
ＨＣＴ−Ｇｄ³⁺を添加せずに合成したマイクロカプセル
の蛍光スペクトルである。

【図１３】ＢＰＴＡ−Ｔｂ³⁺を含むマイクロカプセルの
蛍光スペクトルを示す図である。なお、点線は ＢＰＴ
Ａ−Ｇｄ³⁺を添加せずに合成したマイクロカプセルの蛍
光スペクトルである。

【図１４】ＣＤＰＰ−Ｅｕ³⁺を含むマイクロカプセルの
蛍光スペクトルを示す図である。なお、点線は ＣＤＰ
Ｐ−Ｇｄ³⁺を添加せずに合成したマイクロカプセルの蛍
光スペクトルである。

【図１５】４,４´−ビス（１″,１″,１″−トリフル
オロ−２″,４″−ブタンジオン−４″−イル）−ｏ−
テルフェニルの合成経路を示す図である。

【図１６】単結晶Ｘ線結晶構造解析により得られた、生
成した結晶の構造を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 松本 和子 東京都世田谷区代沢３−９−12−105 Ｆターム(参考） 2G042 AA01 BD19 DA06 DA08 EA13 FA11 FA17 FB02 FB05 2G045 BA11 BA13 BB22 BB29 DA12 DA13 DA14 DA36 FB02 FB03 FB07 FB12 FB15

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 三価の希土類イオンと以下の一般式
   （Ｉ）〜（VI）のいずれかの配位子からなる希土類蛍光
   ラベル剤に増強イオンを添加してなる蛍光検出試薬。 一般式（Ｉ）〜（VI）： 【化１】 【化２】 【化３】 【化４】 【化５】 【化６】 上記式中、 Ｒ¹は水素原子、クロロスルホニル基等であり、 Ｒ²は水素原子、スクシンイミジル基等であり、 Ｒ³は芳香族基であり、 ＸはＣＨ₂、ＮＨ、Ｏ、Ｓであり、そして、 ｍおよびｎはそれぞれ１〜５の整数を示す。
2. 【請求項２】 三価の希土類イオンの配位子としてシネ
   ルジスティク配位子を用いる請求項１に記載の蛍光検出
   試薬。
3. 【請求項３】 希土類蛍光ラベル剤がマイクロカプセル
   化されている請求項１または２に記載の蛍光検出試薬。
4. 【請求項４】 請求項１〜３のいずれかに記載の蛍光検
   出試薬を用いた高感度蛍光分析方法。