JPH0715471B2 - 巨大多環式希土類錯体の利用方法 - Google Patents

巨大多環式希土類錯体の利用方法

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JPH0715471B2
JPH0715471B2 JP16373093A JP16373093A JPH0715471B2 JP H0715471 B2 JPH0715471 B2 JP H0715471B2 JP 16373093 A JP16373093 A JP 16373093A JP 16373093 A JP16373093 A JP 16373093A JP H0715471 B2 JPH0715471 B2 JP H0715471B2
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マチス ジェラール
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コンパニュ オリス インダストリ エス アー
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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、巨大多環式化合物で錯
化された少なくとも１つの希土類塩より成る螢光性の巨
大多環式希土類錯体の利用方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】螢光を利用する種々の検出方法は本質的
に非常に敏感であり、放射能測定によれば、その検出限
度をレーザ光源を使用する検出方法における検出限度よ
りさらに低減されたものとできることが知られている。
【０００３】しかしながら、実際の螢光を利用しての検
出にあっては、斯かる低減された検出限度は達成するこ
とは困難である。なぜなら、最適条件を達成するのに必
要とされる特性を有していないマトリックスにおいて測
定が行われるからである。即ち、一般に、測定媒体は濁
体であって螢光の拡散を呈するものとなり、さらには、
測定媒体中に同じ波長で螢光を発する他の分子が存在す
ることが少なくないのである。また、測定設備について
の改良がなされても、検出限度を大幅に向上させるには
充分でないことが多く、あるいは、非常に高価なものと
なってしまうことが多い。
【０００４】斯かる状況は、濁体であり、蛋白質や螢光
性の他の分子を含有していることがある生物学的媒体中
で、非常に少量の活性分子を測定しなければならない生
物学及び免疫学の分野での検出においては極めて深刻で
ある。
【０００５】螢光トレーサを使用する免疫学的測定にお
いては、抗原または抗体を螢光分子で標識化するにあた
り、螢光分子が下記の如くの特性を有していることが要
求される。即ち、斯かる目的で用いられる螢光分子は、 ・変性あるいは免疫学的特性の変化を生じることなく生
物学的分子と結合する化学機能を有するものであるこ
と、 ・モル吸収係数ができるだけ高いこと、 ・螢光定量歩留りが充分に高いこと、 ・ストークス移動ができるだけ大であること、 ・螢光波長が、望ましくは、５００nmより大であるこ
と、 ・水または緩衝溶液に対して可溶性であること、 等が必要とされるのである。このような特性は、例え
ば、E. SOINIによる論文：Clin. Chem. 25, 353 (1979
年) にも記載されているが、この文献に開示されている
螢光分子は、上述の特性を全て具えるものには程遠いも
のである。
【０００６】ところで、いくつかの希土類キレートの螢
光性が、レーザの分野におけるそれらの適用に関する研
究を通じて長年に亙って知られてきた。これらの錯体
は、螢光エネルギの吸収に伴う一重項状態の励起後、内
系交差によって三重項状態を混成することができる電子
系を有するキレート化分子と、比較的大なるイオン螢光
強度あるいは適度イオン螢光強度を有し、共鳴準位が錯
化剤の三重項状態から非放射エネルギの伝達によって混
成される希土類イオンとで形成される。そして、希土類
キレートの強い螢光を得るためには、錯化分子の三重項
エネルギがイオンの共鳴準位の三重項エネルギより大き
く、かつ、充分な寿命を有することが必要である。
【０００７】この場合、キレートの吸収帯域における励
起後、希土類イオンの螢光特性が得られる。これらの化
合物は、螢光の測定による検出分野で極めて有用であ
り、 ・大なるストークス移動、 ・希土類元素のモル吸光係数εに対して高いモル吸光係
数ε、 ・希土類元素を異なるものとすることによって複数のキ
レートについての同時検出が可能なこと、 ・希土類元素の発光スペクトル特性（最大発光線スペク
トルλが５００nmより大）及び長い寿命（μsec オーダ
ー 〜 msec オーダー) 、 等によって特徴ずけられる。
【０００８】米国特許第4058732 号には、比較的長い寿
命を有する螢光分子（希土類キレート）を用いた螢光を
利用する分析分光方法が記載されている。斯かる方法に
おいては、マトリックスの粒子による拡散及びマトリッ
クスを構成する大部分の有機分子の螢光が短命（一般に
１μsec 未満）の現象であることに鑑み、脈動励起、及
び、確認されるべき生物学的分子を標識化する機能化希
土類キレートが勧められており、検出は、各脈動後不所
望な現象が実質的に減少するのに足る充分長い時間が経
過した時行われる。
【０００９】米国特許第4058732 号やE. SOINIによる論
文：Clin. Chem. 25, 353 (1979 年) 等の従来技術を開
示する文献においては、希土類キレートは、特に免疫学
的測定や細胞学における、さらには、細胞分類のための
生物学的分子用のトレーサとして理想的な螢光分子の１
分類を形成する条件すべてを理論的に満たすものとして
記載されている。実際には、従来使用されているキレー
トはこれらの用途に必要とされる下記の特性をすべて具
えるものではないことが見出される。
【００１０】斯かる特性とは、 ・螢光定量歩留り及びモル吸光係数が高いこと、 ・キレート剤の三重項エネルギが適切であること、 ・溶媒（水あるいはその他の溶媒）または測定が行われ
る媒体中に存在する分子による抑制を受けないこと、 ・生物学的に重要な分子または他の分子との結合のため
の機能化が容易であること、 ・測定媒体中に多量に存在することがある他のカチオン
を犠牲にして希土類を選ぶキレート化選択性を有するこ
と、 ・免疫学的測定の適用条件下において水溶性であるこ
と、 ・特に、低希釈のもとでの安定度が高いこと、 等である。米国特許第4048732 号に記載されたβ−ジケ
トンキレートは、水及び生物学的媒体に可溶であるにし
ても水溶性は極めて小であり、また、その螢光は水によ
って著しく抑制される。
【００１１】他のいくつかのキレートも免疫学的測定に
おけるトレーサとして提案されている。特に、ＥＤＴＡ
（エチレンジアミン四酢酸），ＨＥＤＴＡ及びＤＴＰＡ
から導出されるキレート，イミジナセテート等が、例え
ば、Proc. Nat. Acad. Sci.U,S,A 72, 4764 (1975
年），米国特許第4374120 号, ヨーロッパ特許出願第A-
0068875 号，及び，西ドイツ公開特許第3033691 号に記
載されている。これらのキレートの効能は、一般に１０
10より大であるそれらの安定性定数の高い値に起因する
ものと思われる。しかし、Ｔｂ（III ）ＥＤＴＡ錯体の
寿命が蛋白質／キレート結合を特徴とするアポトランス
フェリンの添加によって引き伸ばされることが分かって
いるので、熱力学的要件だけに基づく斯かる評価は充分
ではない。
【００１２】米国特許第4374120 号に記載されているも
の等のＥｕ（III ）ＥＤＴＡ系のトレーサを使用する場
合、斯かるキレートの不安定性を示すことになる、キレ
ートから解離した遊離ユーロピウムを除去するため、Ｄ
ＴＰＡを含有する緩衝液を使用することが最近勧められ
てきた。斯かる従来技術の状況によれば、特に、免疫学
的測定において、これまで用いられていた希土類キレー
トは他のカチオンを含有する水性媒体または生物学的媒
体中の低い希釈では使用することができず、速度安定性
（錯体の解離速度）及び希土類錯体の形成選択性などの
評価が考慮されるべきであるということになる。
【００１３】さらに、それらの高い形成定数（一般に、
＞１０10）により、従来の大部分のキレートは希釈水溶
液で得られる比較的短い寿命のγ線放出重イオンを使用
するγ像技術に用途が見出される。次いで、キレート剤
を担持する生物学的に重要な分子へのイオンの固着が急
速に起こらなければならず、詳細には、キレートの形成
速度が高くなければならない。ｋ1 及びｋ−１を夫々形
成速度定数及び解離速度定数として、数１の関係があ
り、平衡の場合には数２の如くに表される。
【数１】
【数２】
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】従来使用されている錯
体に関しては、上述の理由によって、従来のキレートに
より高いｋ1 値〔Ｅｕ3+ＥＤＴＡの場合、〜 1.9・１０
22Ｍ-1／分〕を得ることができる（ J. inorg. nucl. C
hem. 33, 127, (1971 年））。しかしながら、所定のｋ
値のもとでは、解離速度定数が比較的大となり、キレー
トと溶液との間のイオン交換速度が比較的速いというこ
とになる。
【００１５】巨大多環式希土類錯体は、選択性及び安定
性、特に、水性媒体及び生物学的媒体中の速度安定性に
優れた特性を有するものであることが知られている。斯
かる巨大多環式錯体は、螢光を利用する免疫学的検出あ
るいは測定技術における生物学的物質用の螢光トレーサ
として特に適しており、さらに、ルミネセンス反応にお
ける試薬としても適している。
【００１６】希土類イオンをその発光準位より三重項エ
ネルギの大きいドナー基を有する巨大多環式化合物によ
って錯化し、そのドナー基を励起することによって、水
溶液中の希土類イオンの発光性を高めることができると
いうことが実際に知られている。希土類元素は一般に低
いモル吸光係数εを有するため、希土類イオンの励起に
よっては非常に弱い螢光が得られるだけであるが、巨大
多環式化合物のドナー基の励起により希土類イオンの螢
光特性を高めることができる。このようにして形成され
る希土類錯体は、優れた螢光トレーサであり、水性媒体
中で安定で、しかも、希土類イオンについて非常に高い
選択性を呈する。
【００１７】斯かる点に鑑み、本発明は、高い形成定数
を特徴とする従来のキレートとは対称的に、主要な特性
として高い動力学的安定性（低い解離速度定数）を有す
るものとされた螢光性の巨大多環式希土類錯体を、螢光
を利用する免疫学的検出もしくは測定を行うに際しての
生物学的生成物用の螢光トレーサとして使用する、巨大
多環式希土類錯体の利用方法を提供することを目的とす
る。螢光トレーサとして使用される巨大多環式希土類錯
体における高い動力学的安定性、従って、低い解離速度
定数を有するという特定は、極めて重要なものである。
なぜなら、免疫学的検出あるいは測定に使用される生物
学的溶液が、一般に希土類イオンを固着することができ
る蛋白質を含有しているからである。一方、斯かる巨大
多環式希土類錯体において形成速度はそう重要ではな
い。希土類イオン錯体の形成と、生成された希土類イオ
ン錯体と生物学的分子との結合とは別々に行われ得るも
のであり、本発明により提案される利用方法に供される
巨大多環式希土類錯体の形成は、非生物学的条件下（有
機溶媒の使用，エネルギ供給，時間設定等）で行うこと
ができる。
【００１８】
【課題を解決するための手段及び作用】本発明に係る巨
大多環式希土類錯体の利用方法は、化３（Ｚは３価また
は４価の原子を示し、Ｒは水素，水酸基，アミノ基また
は炭化水素基、あるいは、なにも無いことを示し、Ａ，
Ｂ及びＣは２価の基を示す。）で表され、Ａ，Ｂ及びＣ
の夫々が、１個以上のヘテロ原子を任意に含有して巨大
複素環で断続された炭化水素鎖であり、また、Ａ，Ｂま
たはＣのうちの少なくとも１つが、少なくとも１つの三
重項エネルギドナー基を含有するか、あるいは、本質的
に三重項エネルギドナー基より成り、その三重項エネル
ギドナー基が錯化された希土類イオンの発光準位より大
なる三重項エネルギを有するものとされた巨大多環式化
合物で錯化された少なくとも１つの希土類塩より成る巨
大多環式希土類錯体を、螢光を利用する免疫学的検出も
しくは測定を行うにあたって生物学的生成物用のトレー
サとして使用するものとされる。
【化３】
【００１９】さらに、本発明に係る巨大多環式希土類錯
体の利用方法は、少なくとも１つの希土類イオンを、錯
化された希土類イオンの発光準位より大なる三重項エネ
ルギを有する三重項エネルギドナー基を含んだ上述の如
くの巨大多環式化合物を用いて錯化し、形成された錯体
を三重項エネルギドナー基の吸収波長をもって励起する
ようにして、希土類イオンの螢光を増大させるものとも
される。
【００２０】本発明に係る利用方法に供される巨大多環
式希土類錯体は、少なくとも１つの希土類イオンを本発
明に係る巨大多環式化合物によって錯化することによっ
て得られる。斯かる巨大多環式希土類錯体は、化４（Ｒ
は水素またはアミノ基を示す）により表される巨大多環
式化合物をもって得られるユーロピウム錯体及びテルビ
ウム錯体を除き、新規な化合物である。
【化４】
【００２１】このような化３により表される巨大多環式
化合物で錯化された少なくとも１種の希土類塩よりなる
ものとされる、本発明に係る利用方法に供される巨大多
環式希土類錯体は、希土類塩がユーロピウム塩またはテ
ルビウム塩である場合には、Ｚは窒素であって、Ａは−
（ＣＨ2 ）2 −Ｏ−Ｃ6 Ｈ3 Ｒ−Ｏ−（ＣＨ2 ）2 −
（Ｒは水素またはアミノ基を示す）であり、また、Ｂ及
びＣは、同時に、一方が−（ＣＨ2)2 −Ｏ−（ＣＨ2)2
−Ｏ− ( ＣＨ2)2 −となり、他方が−（ＣＨ2)2 −Ｏ
−（ＣＨ2)2となることがないものとされる、新規な化
合物である。
【００２２】斯かる錯体において、Ａ ,Ｂ及びＣを形成
する炭化水素鎖は、２個以上の炭素原子を含有すること
ができ、かつ、酸素，イオウまたは窒素原子よりなる群
から選ばれた１個以上のヘテロ原子で任意に断続され得
るものである。ここで好ましい炭化水素鎖はポリエーテ
ル鎖であり、詳細には、エトキシ化またはポリエトキシ
化鎖である。
【００２３】本発明に係る利用方法に供される巨大多環
式希土類錯体を得ることができる巨大多環式化合物は、
錯化された希土類イオンの発光準位より大なる三重項エ
ネルギを有した三重項エネルギドナー基を含有するもの
とされるが、エネルギ伝達は、三重項エネルギドナー基
の三重項準位から錯化された希土類の発光準位のうちの
１つまで起こる。例えば、ユーロピウムは17270 cm-1で
5Ｄ0 の、また、19030 cm-1で 5Ｄ1 さらには 5Ｄ2 の
発光準位を有し、テルビウムは20480 cm-1で 5Ｄ4 の発
光準位を有する。
【００２４】斯かる巨大多環式化合物に適した三重項エ
ネルギドナー基は、希土類イオンの発光準位の三重項エ
ネルギより大きいかあるいはこれに等しい三重項エネル
ギを有していなければならない。例えば、ユーロピウム
及びテルビウム錯体の場合、三重項エネルギドナー基の
三重項準位は17270 cm-1より大きくなければならない。
【００２５】リン光現象は三重項状態の放射失活による
ので、三重項エネルギドナー基についての好ましい評価
基準はこれらの三重項エネルギドナー基のリン光発光波
長であるのがよい。例えば、選ばれた三重項エネルギド
ナー基は希土類の発光準位の混成に相当するものより低
い波長（高いエネルギ）でリン光を発光するものとされ
る。この場合、三重項エネルギドナー基のリン光波長は
５８０nm未満とされる。
【００２６】本発明に係る利用方法に供される巨大多環
式希土類錯体は、Ａ ,Ｂ及びＣの全て、または、一部を
構成する三重項エネルギドナー基を１種以上有するのが
よい。使用することができる三重項エネルギドナー基
は、必要な三重項エネルギを有する任意の三重項増感
剤、例えば、ヨーロッパ特許出願第Ａ−0068875 号また
はSpectroscop. Inorg. Chem. 2 , 255,（1971年）に記
載されたものである。そして、特に好ましい三重項エネ
ルギドナー基は、フェナントロリン，アントラセン，ベ
ンゼン，ナフタレン，ビフェニル及びターフェニル，ビ
ピリジン，ビスイソキノリンなどのビキノリン、例え
ば、２，２’−ビピリジン，アゾベンゼン，アゾピリジ
ン，ピリジンまたは２，２’−ビスイソキノリンであ
る。
【００２７】三重項エネルギドナー基を含有するＡ ,Ｂ
及びＣの具体例としては、下記の如くの鎖をあげるこ
とができる。 −Ｃ2 Ｈ4 −Ｘ1 −Ｃ6 Ｈ4 −Ｘ2 −Ｃ2 Ｈ4 （Ｘ1 及びＸ2 は同一であっても相違してもよく、酸
素，窒素またはイオウを示す。）； −Ｃ2 Ｈ4 −Ｘ1 −ＣＨ2 −Ｃ6 Ｈ4 −ＣＨ2 −Ｘ2 −
Ｃ2 Ｈ4 − （Ｘ1 及びＸ2 は同一であっても相違してもよく、酸
素，窒素またはイオウを示す。）；化５，化６，化７ま
たは化８（Ｘは酸素または水素を示す）。
【化５】
【化６】
【化７】
【化８】
【００２８】本発明に係る利用方法に供される巨大多環
式希土類錯体は、巨大多環式化合物と被錯化カチオンを
供与する化合物とを反応させることより成る、従来の金
属錯体製造方法によって得ることができる。斯かる方法
は、米国特許第3888377 号，第3966766 号及び第415668
3 号に記載されている。
【００２９】例えば、希土類カチオンドナー化合物と本
発明に係る巨大多環式化合物とを、好ましくは、錯体形
成に対して不活性である同一溶媒または相溶性溶媒中で
溶液状態として反応させることによって得ることができ
る。その際、一般に、溶媒としてアセトニトリル，ＤＭ
ＳＯまたはエタノールが使用される。使用することがで
きる希土類カチオンドナー化合物は、任意の希土類塩、
好ましくは、クロリド，アセチルシセトネートまたはニ
トレートであり、反応は溶媒の沸点で行われるのが好ま
しい。
【００３０】形成された巨大多環式希土類錯体が反応溶
媒に可溶であれば、蒸発乾燥によって溶媒からこの錯体
を単離する。形成された巨大多環式希土類錯体が反応溶
媒から結晶化すれば、濾過または任意の他の適切な従来
手段によってこの錯体を分離する。このようにして得ら
れた錯体は、それを結晶化によって精製することができ
るものとなる。
【００３１】また、上記の反応は、巨大多環式化合物の
溶液及び結晶質形態のカチオンドナー化合物を使用して
行わせることができる。また、J. Chem. Phys.40，2790
（1964年）及び41，157 (1964 年）に記載されている如
く、失活に対する保護用相乗剤をカチオンの配位領域に
導入することもできる。
【００３２】本願明細書における後述部では、本発明に
係る利用方法に供される巨大多環式希土類錯体が「クリ
プテート」とも称され、また、それを形成することがで
きる巨大多環式化合物が「クリプタンド」とも称され
る。そして、クリプテート及びクリプタンドを表すの
に、ＬＥＨＮにより定められた命名法が採用される。
（Struct. Bonding （Berlin）16, 1, (1973年) 及び A
cc. Chem. Res.11, 49, (1978 年）における J．M, LEH
N による論文参照）。
【００３３】本発明に係る利用方法に供されるクリプテ
ートにあっては、全ての希土類イオンが適用可能とされ
るが、それが用いられて得られるクリプテートが最も強
いイオン発光を示すようにされるもの、例えば、テルビ
ウム及びユーロピウムが選ばれるのが望ましく、それに
準じてサマリウム及びジスプロシウムが選ばれるのがよ
い。
【００３４】本発明に係る利用方法に供されるクリプテ
ートを形成することができるクリプタンドは、化３にお
いて、クリプテート化すべき希土類のエネルギより大な
る三重項エネルギを有する三重項エネルギドナー基が、
エネルギ伝達の効率を増大することができるか、あるい
は、希土類クリプテートの励起スペクトルを変性すべき
基（このような基の一例はフェニル基である）によって
適切な位置でできる限り置換されて得られるフェナトロ
リン，アントラセン，ビピリジン及びビスキノリンより
なる群から選択されたものとされる。そして、これらの
新規なクリプタンドにおいて、Ａ，Ｂ及びＣの少なくと
も１つは好ましくは化９〜化１５のうちの１つで表され
るものとされる。
【化９】
【化１０】
【化１１】
【化１２】
【化１３】
【化１４】
【化１５】
【００３５】これらのクリプタンドを特定する部類は、
Ｚが窒素であり、Ａ及びＢが２つのモノまたはポリエト
キシ化鎖、好ましくは、ジエトキシ化鎖であり、Ｃが化
９〜化１５のうちの１つに相当するものとされた化３に
よって表される化合物により構成されるものとなる。
【００３６】また、これらの新規なクリプタンドは、Ａ
及びＢの各々が化１６によって表される基であり、Ｃが
化１７〜化２０のうちの１つに相当するものとされた化
３によって表される化合物を含むものとなる。斯かる新
規なクリプタンドを特定する他の部類は、Ｚが窒素であ
り、Ａ ,Ｂ及びＣが同一であって、上記の複素環、即
ち、２，２’−ピリジン及びフエナントロリンのうちの
１つであるものとされた化４により表される化合物によ
り構成される。
【化１６】
【化１７】
【化１８】
【化１９】
【化２０】
【００３７】ドナー基部分がフェナントロリン，アント
ラセン、ビピリジンまたはキノリンであるものとされた
化４により表されるクリプタンドは、Ａ及びＢの夫々が −（ＣＨ2 ）2 −Ｏ−（ＣＨ2 ）2 −Ｏ−（ＣＨ2 ）2
− の鎖であり、Ｃが化２１または化２２により表される基
であるものを除き、新規な化合物である。
【化２１】
【化２２】
【００３８】化４により表されるクリプタンドは主とし
て縮合反応及び／または付加反応を含む従来知られた化
学的方法によって得ることができる。このような方法の
具体例として、フランス特許第70 21079号（第2052947
号）及び米国特許第3888877号, 第3966766 号及び第415
6683 号に記載された方法を挙げることができる。これ
らの方法はＺが窒素またはリンであるものとされた化３
により表される化合物の製造には特に好適である。
【００３９】また、Ｚが炭素であり、Ｒが上記の如くで
ある化３により表される化合物を得るには、縮合方法を
使用することができる。
【００４０】いずれの場合にも、Ａ ,ＢまたはＣのうち
の１つ、及び、置換ができる、あるいは、容易に除去す
ることができる末端基を含有する化学化合物を原料とし
て使用することで足りる。そして、例を挙げると、Ｚが
炭素であり、Ｒが水酸基であり、Ａ ,Ｂ及びＣが各々
２，２’−ビピリジンである化４により表される化合物
は、６，６' −ジリチオビピリジンと６，６’−ジシア
ノ−２，２’−ビピリジンとを縮合し、それにより得ら
れた巨大環シアノ基を加水分解し、その生成物と６，
６’−ジリチオビピリジンとを縮合することによって得
ることができる。
【００４１】好ましい手法においては、Ｚが窒素であ
り、Ａ及びＢがポリエトキシ化鎖である化３により表さ
れる新規なクリプタンドは、２つのポリエトキシ化鎖よ
りなる巨大窒素環と、上述された三重項エネルギドナー
基を含有し、かつ、例えば、ハロゲン基等の切離可能な
末端基を有する炭化水素鎖とを反応させることによって
得ることができる。この結合反応は、好ましくは、無水
溶媒、例えば、ジメチルスルホキド（ＤＭＳＯ）または
アセトニトリル中において、水素化ナトリウムまたは炭
酸ナトリウム等の還元剤の存在下で行われ、クリプタン
ドはナトリウム塩の形で得られる。さらに、この反応
は、好ましくは溶媒の沸点未満の温度、例えば、６０°
Ｃから１００°Ｃまでの間で行われる。
【００４２】遊離クリプテートは、次のようにして得る
ことができる。即ち、上述のナトリウム塩と硝酸銀とを
反応させて巨大多環式銀錯体を形成し、この錯体を硫化
水素（Ｈ2 Ｓ）流で処理した後、形成された沈澱物をＮ
（ＣＨ3 ）4 ＯＨ溶液で中和して、メチレンクロリドで
抽出するのである。
【００４３】本発明に係る利用方法に供される巨大多環
式希土類錯体（希土類クリプテート）が、活性分子を共
有結合により生物学的に標識化すべく使用される場合に
は、その成分原子のうちの１つ以上について、生物学的
分子とその生物学統合性に適合する操作条件下で共有結
合する１つ以上の三重項エネルギドナー基を有する少な
くとも１つの反応性に富む置換基による置換がなされ
る。
【００４４】これらの三重項エネルギドナー基の例（本
発明を限定するものでない）として挙げることができる
ものとして、アルキルアミノ，アリールアミノ，イソチ
オシアノ，シアノ，イソシアノ，チオシアノ，カルボキ
シ，ヒドロキシル，メルカプト，フェノール，イミダゾ
ール，アルデヒド，エポキシド，チオニルハライド，ス
ルホニルハライド，ニトリルベンゾイルハライド，カル
ボニルハライド，トリアゾ，スクシンイミド，酸無水
物，ハロゲンアセテート，ヒドラジノ，ジハロゲノトリ
アジニル及びその他の基がある。クリプタンドを生物学
的分子に結合する腕の長さは、例えば、１個の原子から
２０個の原子まで変化することができ、かつ、炭素原子
ならびに窒素，酸素，硫黄及び燐などのヘテロ原子を含
有することができる。従って、本発明に係るクリプタン
ドからは、結合または吸着によってクリプテートに会合
する生物学的分子からなる生物学的錯体も得られること
になる。
【００４５】斯かる結合は、後述される試薬のいずれか
を使用して行うことができ、標識化された分子は任意の
適当な分離手段（例えば、ゲル濾過）によって未反応の
希土類クリプテートから分離することができる。そし
て、本発明に係るクリプタンドが用いられて得られる希
土類クリプテートにより、好ましい態様で標準化するこ
とができる生物学的重要分子の中には、抗原，抗体，単
分枝系抗体，フラグメント及び抗体／フラグメント組合
せ，薬剤，受容体，モルホン，モルホン受容体，バクテ
リア，ステロイド，アミノ酸，ペプチド，ビタミン，ビ
ールス，交配方法におけるヌクレオチドまたはポリヌク
レオチド，酸素及び他の物質，レクチン，核酸，ＤＮＡ
及びＲＮＡ等が含まれる。
【００４６】そして、本発明に係る利用方法に供される
希土類クリプテートには、均一相または不均一相のもと
での、所謂、競争測定方法または過剰測定方法のいずれ
かの免疫学的測定において、螢光トレーサとして用いら
れる重要な用途がある。不均一相方法にあっては、好ま
しくは、被測定物質に適した抗体で被覆されたチューブ
を使用し、そのチューブを通して螢光を読み取ること
や、異なる固体相、詳細には、特定の抗体を分有する媒
体を予め付着させた幅の狭いストリップまたはゼラチン
質フィルムを使用して螢光を励起及び励起波の反射から
異なる角度で読み取ること、あるいは、支持体が透明で
あればその支持体を通して螢光を読み取ることが可能で
ある。
【００４７】これらのトレーサの線スペクトルを利用し
て、螢光線が重なり合わない異なる希土類（例えば、Ｔ
ｂ及びＥｕ）のクリプテートを使用する、あるいは、従
来の螢光トレーサ（フルオレセインまたはロダミン）と
本発明に係るクリプタンドが用いられて得られる希土類
クリプテートとを使用するようになすことにより、複数
の抗原を同時に検出することが可能とされる。
【００４８】本発明に係る利用方法に供される希土類ク
リプテートは、標識化細胞の螢光を顕微鏡検査によって
検出する免疫化学の分野においても用いられ得るもので
あり、また、細胞学及び細胞分類に関連して用いられ、
短波長の線スペクトルを有するトレーサと従来のトレー
サとの併用により多パラメータ分析を行うことができる
ものとされる。さらに、所定のクリプタンド及び異なる
複数の希土類イオンのもとに、エネルギを伝達する分子
単位の物であって、単一源（例えば、レーザ）で発生さ
れる単一励起波長により、２種のクリプテート化イオン
（例えば、Ｔｂ及びＥｕ）の二螢光線特性を得て、クリ
プテートが固着された夫々の生物学的分子を明らかにす
ることが可能である。
【００４９】本発明に係る利用方法に供される希土類ク
リプテートのさらに他の用途としては、遺伝子工学の分
野における、ヨーロッパ特許出願第Ａ−0070685 号及び
Ａ−00706878号に記載されているもの等の交配反応に際
しての指示薬としての使用がある。
【００５０】
【実施例】以下、本発明の実施例（本発明を例示するた
めのものであって、限定するものではない）について詳
細に述べる。
【００５１】（実施例−１） Ａ）（２２）フエノントロリン（以下（２２）phenと称
する）の生成
【００５２】（２２）phen の生成は化２３によって示
される。
【化２３】
【００５３】この合成に使用する溶媒は、４オングスト
ローム・モレキュラーシーブ上で数日間に亙って水分を
除去し、必要に応じて、真空抽出されたＤＭＳＯ（ジメ
チルスルホキシド）である。
【００５４】水分が除去され、新たにクロマトグラフィ
分離されたジブロモメチルフェナントロリン化合物（ジ
ーＣＨ2 Ｂγ−phen）１mmol（３６６mg）をＤＭＳＯ 1
0 〜20 mｌに溶解した。これを乾燥された滴下ロートに
移し、容量をＤＭＳＯを含めて１００mlとした。
【００５５】ＮａＨ 100〜200mg が混入されたオイルを
乾燥された丸底フラスコに入れ、この混合物にトルエン
（またはヘキサン）５mlを添加して、これを沈降するま
まにした。この溶液を真空（１torr）中で１時間蒸発さ
せた。水分が除去されたＤＭＳＯ 20ml に、ＮａＨを５
０°Ｃに加熱しながら再溶解した（Ｈ2 発生）。
【００５６】Ｎ2 Ｏ4 巨大環１mmol（２６２mg）の水分
の除去を行い、それに水分が除去されたＤＭＳＯ 10 〜
20mlを添加した。また、ＮａＨ溶液及びＮ2 Ｏ4 巨大環
溶液を各々滴下ロートへ導入し、容量をＤＭＳＯを含め
て１００mlまでにした。
【００５７】水分が除去されたＤＭＳＯ 100mlを３つ首
丸底フラスコに入れ、このフラスコに２つの滴下ロー
ト，還流冷却器及び乾燥系（シリカゲル）を備えつけ
た。フラスコを磁気撹拌しながら６０〜１００°Ｃまで
加熱し、２つの滴下ロートの内容物を１〜２時間にわた
って一滴ずつ同時に滴下させた。
【００５８】反応物を添加した後、反応混合物を１時間
加熱し次いで、混合物を真空中で蒸溜して溶媒を除去し
た。（ここで、ビドリド及び塩基を除去すべく、少量の
水を添加することも可能である。）反応混合物を減圧乾
燥して、乾燥された、即ち、ペースト状の赤色残留物を
得た。
【００５９】ＣＨ2 Ｃｌ2 100〜200ml を添加し、ペー
ストを室温で少なくとも３０分間磨り潰して、残留物を
濾別し、洗浄した。有機溶液相を真空中に保持して蒸発
させ、得られた残留物を真空中で（１torr, 少なくとも
３０分）乾燥した。エチルエーテル１００mlをこの残留
物に添加し、これらの成分を混合して混合物を沈降する
ままにし、この操作を３〜４回繰り返した。
【００６０】単環式Ｎ2 Ｏ4 巨大環の残部をより完全に
除去すべく、ヘキサン５０ml及びＣＨ3 ＯＨ 1mlを残留
物に添加し、この溶液を濁りが現れるまで真空中で（穏
やかに加熱しつつ）蒸発させ、溶液をデカント濾過し、
この操作を数回繰り返した。
【００６１】赤色残留物をスラブクロマトグラフィ（Ma
cherey-Nagel製のPolygram Alox N/UV254 ）によって試
験した。その結果、媒体ＣＨ2 Ｃｌ2 ／ＣＨ3 ＯＨ（９
／１）中のマイグレーションは下記の値を示した。 （２２）phen Ｒｆ＝0.4 〜0.8 単環式Ｎ2 Ｏ4 巨大環 Ｒｆ＝0.2 〜0.5
【００６２】７０〜２３０メッシュの中性の活性酸化ア
ルミニウムを充填したカラム（２０cm，φ１５cm）で、
溶離剤としてＣＨ2 Ｃｌ2 ／ＣＨ3 ＯＨ（５％），ＣＨ
Ｃｌ 3 ／Ｃ2 Ｈ5 ＯＨ（５％），ＣＨ3 ＯＨ／ヘキサン
（９／１）の混合物を使用して残留物をクロマトグラフ
ィ分離した。収率は操作条件に応じて１２〜３５％であ
った。
【００６３】この結果、式：Ｎａ+ Ｃ（２２）phen−Ｂ
ｒ．Ｈ2 Ｏ で表される（２２）phenナトリウム塩が得
られ、その元素分析は次の如くであった。 実測値： Ｃ 53.00 Ｈ 6.21 Ｎ9.44 計算値： Ｃ 53.16 Ｈ 6.18 Ｎ9.55
【００６４】Ｂ）錯体〔Ｅｕ3+Ｃ（２２）phen〕の生成 無水ＥｕＣｌ3 0.07mol (19.4mg)を水分を除去されたＣ
Ｈ3 ＣＮ 4mlに溶解し、溶液を還流下で１時間３０分加
熱した。ＣＨ3 ＣＮ 2.5ml 中に予め得られた（２２）
phenナトリウム塩を３５mg添加し：混合物を還流下で２
時間３０分加熱した。混合物を４°Ｃで一晩放置した
後、黄色の沈澱物を濾別した。
【００６５】採取した沈澱物（１１mg）は強い螢光を示
し、これはＨ2 Ｏ及びＣＨ3 ＯＨ中での溶液状態にある
場合に同様である（ＵＶ254nm ）。１０-4mol/l 未満の
濃度の水溶液では、３ケ月後、励起及び発光スペクトル
ノ変化は認められなかった。
【００６６】（実施例−２） Ａ）（２２）フエナントロリンアミド（以下（２２）ph
enアミドと称する）の生成 （２２）phenアミドの生成は化２４により示される。
【化２４】
【００６７】この合成で使用する溶媒は、Ｐ2 Ｏ5 を使
用して蒸溜したアセトニトリルである。この処理は乾燥
されたガラス装置で行った。
【００６８】乾燥再結晶ジ−ＣＯＣｌ−phen 305mg（１
mmol）をＣＨ3 ＣＮ 50ml に溶解し、一晩後、溶液の濾
過して滴下ロートに移し、容量をＣＨ3 ＣＮを含んで９
０mlにした。
【００６９】化２４により示される（２２）の５２４mg
（２mmol）を真空中（１torrより大）で一晩乾燥した。
生成物をＣＨ3 ＣＮ 90ml に溶解し、滴下ロートに移し
た。
【００７０】２つの滴下ロートをＣＨ3 ＣＮ１リットル
を収容した２〜３リットル丸底フラスコに取り付けた。
２種の反応物を急速撹拌しながら２時間〜２時間３０分
にわたって同時に添加し、撹拌を添加後３０分間続け
た。溶媒を５０°Ｃの真空中で除去し、残留物を１torr
より大の状態で少なくとも１時間乾燥した。そして、残
留物をＣＨ2 Ｃｌ2 300ml 中に３０分間混合して濾別
し、濾液を蒸発乾燥した。中性活性化Alox９０（カラム
３０cm，φ1.5 cm）でＣＨ3 ＯＨ１％を含有するＣＨ2
Ｃｌ2 を溶出剤として、残留物をクロマトグラフィ分離
し、溶出された第１生成物を回収した。
【００７１】３１０mgの（２２）phenアミドが６３％の
収率で回収され、生成物をトルエン／ヘキサン（１／
１）混合物で再結晶させた。 融点：３００−３０２°Ｃ ＩＲ：１６３０cm-1でアミド帯域 マススペクトル：４９４でＭ+ ，ＭＷ＝494.55
【００７２】Ｂ）錯体〔Ｅｕ3+Ｃ（２２）phenアミド〕
の生成 無水ＥｕＣｌ3 45mg( 0.17mmol）を水分が除去されたＣ
Ｈ3 ＣＮ 10ml に溶解した。ＣＨ2 Ｃｌ2 2ml中に（２
２）phenアミド８０mg（0.16mmol）が含まれた溶液を還
流下で３時間加熱し、ＣＨ3 ＣＮ 50ml を添加し、混合
物をＣＨ3 ＣＮの沸点まで加熱した（ＣＨ2 Ｃｌ2 は蒸
発除去される）。次いで、Ｅｕ3+溶液を添加した。
【００７３】混合物を還流下で２時間加熱し、室温で放
置して、白色沈澱物を濾過して回収した（５０mg）。こ
の沈澱物は強い赤色螢光を示し（λ励起：254nm ）、Ｈ
2 Ｏ，ＣＨ3 ＯＨ及びＤＭＳＯ中での溶液状態でも同じ
であった。
【００７４】ＥｕＣ（２２）phenアミド（ＯＨ）Ｃｌ2
・３Ｈ2 Ｏについての元素分析： Ｃ26Ｈ37Ｎ4 Ｏ10Ｃｌ2 Ｅｕ ＭＷ＝788.47 １０-4mol/l 未満の濃度の水溶液では、３ケ月後、この
錯体の励起及び発光スペクトルの変化は認められなかっ
た。
【００７５】（実施例−３）（２２）アントラセンアミドの生成 （２２）アントラセンアミドの生成は化２５によって示
される。
【化２５】
【００７６】この実施例では、高希釈方法が使用され
た。そして、酸ジクロライド１ 0.564g（1.7mmol)を無
水ＣＨ2 Ｃｌ2 70 ml に溶解し、溶液を１００ml滴下ロ
ートに入れた。また、巨大環（２２）0.446g (1.7mmol)
及びトリエチルアミン 0.47ml（2 ×1.7mmol)を無水Ｃ
Ｈ2 Ｃｌ2 70ml に溶解し、溶液を１００ml滴下ロート
に入れた。
【００７７】トルエン0.4ml 及び無水メチレンクロライ
ド0.15リットルを３リットル３つ首フラスコに入れ、滴
下ロート中に入れられた上述の２種の反応物を５時間に
亙り、１時間当たり１４mlの割合でフラスコに同時に導
入した。有機相を採取して数ml に濃縮し、次いで、圧
力下でＳｉＯ2 カラムに移した（カラム直径3.5 cm；高
さ１７cm；溶出剤ＣＨ2 Ｃｌ2 ／メタノール１％）。
【００７８】その結果、下記の如くに、淡黄色の結晶質
螢光生成物を得た。 収率： ４５％ 薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）： 溶媒ＣＨ2 Ｃｌ2
／メタノール２％；ＳｉＯ2 ； Ｒｆ＝0.61 Ｈ ＮＭＲ： 溶媒ＣＤＣｌ3 ／ＣＤ2 Ｃｌ2 ( ５／
５) ，２００ＭＨｚ 表１ 計算値 ： Ｃ 69.20 Ｈ 6.97 Ｎ 5.38 実測値 ： Ｃ 69.07 Ｈ 7.00 Ｎ 5.22 分子量 520.55
【表１】
【００７９】この実施例で原料として使用される酸クロ
リド１は従来の方法によって得ることができる。
【００８０】（実施例−４）（２２）アントラセンの生成 （２２）アントラセンの生成は化２６によって示され
る。
【化２６】
【００８１】ジアミド３ 380mg （0.73mmol）を、丸底
フラスコに入った無水ＴＨＦ 20mlに部分的に溶解し
た。
【００８２】還流冷却器が装着されたフラスコをアルゴ
ン雰囲気下に置き、無水ＴＨＦ中の1.1 Ｍ Ｂ2 Ｈ6 8m
l を室温で添加した。そして、全反応混合物を一晩還流
下に保ち、次いで、過剰のジボランを０°Ｃで蒸溜水数
滴により破壊した。溶媒を蒸発除去し、６Ｎ・ＨＣl 溶
液４０mlを残留した白色固体に添加した。そして、溶液
をアルゴン雰囲気中で還流させて３０分間加熱した。こ
れにより、溶液は暗緑色になった。
【００８３】この溶液を放冷し、次いで、水を留去して
生成固体をベーンポンプで１時間乾燥させた。そして、
蒸溜水５０mlに溶解させ、ＣＨ2 Ｃｌ2 50ml を添加し
て２相を振りまぜ、次いで、溶相を分離し、ＬｉＯＨ水
溶液により０°Ｃで塩基性にしてｐＨ１３にして、固体
を沈澱させた。その後、ＣＨ2 Ｃｌ2 をさらに５０ml添
加して２相を振りまぜ、沈降するままにし、有機相を回
収してＭｇＳＯ4 を用いて脱水した。
【００８４】粗製生成物をアルミナカラムに移し、ＣＨ
2 Ｃｌ2 ／メタノール１％で溶出し、薄層クロマトグラ
フィ板上に純粋な結晶質生成物を、つぎの如くに得た。 収率：６２〜７０％ 薄層クロマトグラフィ：Ａｌ2 Ｏ3 ； 溶出剤ＣＨ2 Ｃ
ｌ2 ／ＭｅＯＨ６％； Ｒｆ＝0.33 融点： ＞２６０°Ｃ13 Ｃ ＮＭＲ： 溶媒ＣＤＣｌ3 ppm 25.2 （芳香族 ＣＨ2 ） 表２1 Ｈ ＮＭＲ： 溶液 ＣＤＣｌ3 ppm 2.39 （ｔ） ８Ｈ ＮＣＨ2 巨大環 2.55 及び2.76（ｍ） −２×４Ｈ ＯＣＨ2 化２７ 2.89 及び3.19（ｍ） −２×４Ｈ ＯＣＨ2 化２８ 3.03 及び3.82（ｔ） −２×４Ｈ−ＣＨ2 −ＣＨ2 表３ 微量分析：Ｃ30Ｈ40Ｏ4 Ｎ2 （分子量492.6 ） 計算値 ：Ｃ 73.13 Ｈ 8.18 Ｎ 5.6 実測値 ：Ｃ 73.06 Ｈ 8.04 Ｎ 5.2
【表２】
【化２７】
【化２８】
【表３】 これに基づいて、錯体〔Ｅｕ3+Ｃ（２２）アントラセ
ン〕が、実施例１の説明部に記載された手順に従って生
成された。
【００８５】（実施例−５）化２９における式７で表される巨大多環式化合物及びそ
のユーロピウム錯体の生成 この合成は化２９により示される。
【化２９】
【００８６】Ａ）６，６’−ビス−ブロモメチル−２，
２’−ビピリジンの生成 ６，６’−ビス−ブロモメチル−２，２’−ビピリジン
の生成は、化３０により示される。
【化３０】
【００８７】６，６’−ジメチル−２，２’−ビピリジ
ン （2.76g ，１５mmol) とＮ−ブロモスクシンイミド
（5.10g ，28.6mmol) との混合物を還流下で３０分間加
熱した。次いで、ベンゾイルパーオキシド（３０mg）を
混合物に添加し、これを再び還流下で２時間加熱して、
スクシンイミドを濾別した。溶液を０°Ｃに冷却して固
体を濾別し、メタノールで洗浄して白色結晶質固体の形
態でビスジブロミドを次の如くに得た（1.65g ）。 収率：３２％， 融点：１８０−１８１°Ｃ
【００８８】ＣＣｌ4 溶液を濃縮し、カラム（シリカゲ
ル）でメチレンクロリド／メタノール（９８／１）混合
物による溶出によってクロマトグラフィ分離した結果、
次の如くであった。 ６，６’−ビス−ジブロモメチル−２，２’−ビピリジ
ン 0.9g，１２％ ６，６’−ビス−ブロモメチル−２，２’ −ビピリジ
ン 1.38g ，２７％ ６−メチル−６’−ブロモメチル−２，２’−ビピリジ
ン 0.55g ，１４％
【００８９】Ｂ）巨大多環式化合物の生成 アセトニトリル（２００ml）中の式(5) で表される巨大
環ビス−ビピリジン（0.15g ，0.38mmol) と、Ｎａ2 Ｃ
Ｏ3 （0.4g）との混合物を還流温度に加熱し、次いで、
６，６’−ブロモメチル−２，２’−ビピリジン（0.12
g ，0.38mmol）溶液を３時間に亙って添加して、引続
き、混合物を還流下で２０時間加熱した。その後、Ｎａ
2 ＣＯ3 を濾別し、濾液を蒸発させた。短いアルミナカ
ラムで残留物を ＣＨ2 Ｃｌ2 ／ＭｅＯＨ（９８／２）
による溶出によって濾過し、白色固体の形態でトリス−
ビピリジン巨大ビシクロ化合物のナトリウム塩を得た
（0.16g ，７３％；融点２７０°Ｃ以上）。このナトリ
ウム塩の特性は、次の如くであった。 微量分析：Ｃ36Ｈ30Ｎ8 ，Ｎａ Ｂｒ（677,6 ） 計算値 ：Ｃ 63.81 Ｈ 4.46 Ｎ 16.53 実測値 ：Ｃ 63.79 Ｈ 4.48 Ｎ 16.49 ＮＭＲ 1Ｈ：溶媒ＣＤＣｌ3 3.85 （ｓ，６ＣＨ2 ）； 7.33 （ｄｄ，Ｊ＝7.2 ; １，２；６Ｈ；Ｈ−Ｃ
（５）；Ｈ−Ｃ（５’）） 7.82 （ｔ，Ｊ＝7.2 ；６Ｈ，Ｈ−Ｃ（４）；Ｈ−Ｃ
（４’）） 7.90 （ｄｄ，Ｊ＝7.2 ; １，２；６Ｈ；Ｈ−Ｃ
（３）；Ｈ−Ｃ（３’））
【００９０】硝酸銀ＡｇＮＯ3 （１５mg，0.08mmol) と
上述の如くにして得たナトリウム塩（２０mg，0.03mmo
l) との混合物をＣＨ2 ＯＨ 5ml とともに３０分間加
熱した。メタノールを蒸発させ、シリカゲルカラムでＣ
Ｈ2 Ｃｌ2 ／ＣＨ3 ＯＨ（９６／４）を溶出剤として生
成錯体を精製した。
【００９１】この精製錯体（２０mg）を水／メタノール
混合物（１：１，５ml）に溶解し、Ｈ2 Ｓ流で１５分間
処理した。それにより得られた沈澱物を遠心分離し、溶
液をＮ（ＣＨ3 ）4 ＯＨ（0.1 Ｎ）で中和して、メチレ
ンクロリド（3.5ml ）で抽出を行った。ＭｇＳＯ4 を使
用して溶液を脱水し、蒸発させ、その結果生じた固体を
シリカゲル（ＣＨ2 Ｃｌ／ＣＨ3 ＯＨ（９６：４）を使
用）で濾過して遊離錯体（１３mg，８６％）を得た。こ
の錯体の特性は次の如くであった。 ＮＭＲ 1Ｈ ： 溶媒 ＣＤＣｌ3 表４ 微量分析 ： Ｃ36Ｈ30Ｎ8 （574.7 ） 実測値： 75.37 Ｈ 4.98 Ｎ 19.41 計算値：Ｃ75.24 Ｈ 5.26 Ｎ 19.50
【表４】
【００９２】このようにして得られた巨大多環式化合物
が使用されて、錯体〔Ｅｕ3+Ｃ（トリス−ビピリジン巨
大多環）〕が実施例１の説明部に記載された手順に従っ
て生成された。
【００９３】（実施例−６）化３１における式９で表されるビス−ビピリジンフェノ
ントロリン巨大多環式化合物及びそのユーロピウム錯体
の生成 この合成は化３１により示される。
【化３１】
【００９４】ビス−ピリジン巨大環（５）0.158mmol を
評量して５００ml ２つ首丸底フラスコに入れ、Ｎａ2
ＣＯ3 0.75mmol（ほぼ５倍過剰）及び新たに蒸溜された
ＣＨ 3 ＣＮ 105ml を添加した。混合物を還流下で撹拌
しながら３０分間加熱し、次いで、アセトニトリル１０
０ml中等モル量のジブロモフェナントロリン溶液を一滴
ずつ添加した。そして、比較的遅い速度で行われた添加
期間（２時間１０分）全体に亙って還流及び撹拌を続け
た。
【００９５】次いで、混合物を同じ条件でさらに１８時
間加熱し、得られた溶液を蒸発乾燥した。そして、粗製
精製物をＣＨ2 Ｃｌ2 に溶解し、水で洗浄した。（ＣＨ
2 Ｃｌ2 ／ＭｅＯＨ ９０／１０を溶離剤としてのアル
ミナ薄層クロマトグラフィ。）
【００９６】この粗製精製物を標準化アルミナカラム
（活性度II−III ）でＣＨ2 Ｃｌ2 ／ＭｅＯＨ ９８／
２を溶出剤として精製した。精製物の特性は次の如くで
あった。 微量分析：Ｃ38Ｈ30Ｎ8 ，Ｎａ Ｂｒ，Ｈ2 Ｏ（719,6
） 計算値：Ｃ 63.42 Ｈ 4.45 Ｎ 15.57 実測値：Ｃ 62.77 Ｈ 4.46 Ｎ 15.31 ＮＭＲ 1Ｈ： 溶媒 ＣＤＣｌ3 3.91 （ｓ，８Ｈ，ＣＨ2 −ｂｐｙ） 4.07 （ｓ，４Ｈ，ＣＨ2 −ｐｈｅｎ） 7.36 （ｄｄ，Ｊ＝7.2 ；１，３；４Ｈ；Ｈ−Ｃ
（５）；Ｈ−Ｃ（５’）（ビピリジン） 7.64 （ｄ，Ｊ＝8.2 ；２Ｈ；Ｈ−Ｃ（３），Ｈ−Ｃ
（８）（フエノントロリン） 7.78 （ｓ，２Ｈ，Ｈ−Ｃ（５），Ｈ−Ｃ（６）（フエ
ナントロリン） 7.83 （ｔ，Ｊ＝7.2 ；４Ｈ；Ｈ−Ｃ（４）；Ｈ−Ｃ
（４’）（ビピリジン） 7.91 （ｄｄ，Ｊ＝7.2 ；１，３；４Ｈ；Ｈ−Ｃ
（３）；Ｈ−Ｃ（３’）（ビピリジン） 8.27 （ｄ，Ｊ＝8.2 ；２４；Ｈ−Ｃ（４）；4-C(7)
（フエナントロリン）
【００９７】かくして得られた巨大多環式化合物が使用
されて、錯体〔Ｅｕ3+Ｃ（ビス−ビピリジンフエナント
ロリン巨大多環）〕が実施例１の説明部に記載された如
くの手順に従って生成された。この錯体の励起及び発光
波長特性を表５〜表１０に示す。
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【表９】
【表１０】 ＊ リン光方式で測定；遅延ｔｄ＝0.1 msec. ｔｇ＝2 msec. ＊＊リン光方式で測定；遅延ｔｄ＝0.2 msec. ｔｇ＝5 msec.
【００９８】（実施例−７）巨大多環式化合物（２２）
ピリジンアミド及び（２２２B ）を夫々使用して、実施
例１の説明部に記載された如くの手順に従って下記の巨
大多環式錯体を得た。 〔Ｅｕ3+Ｃ（２２）ピリジンアミド〕 〔Ｔｂ3+Ｃ（２２２B ）〕
【００９９】（実施例−８）化３２における式１２で表される（２２）ビスイソキノ
リン巨大多環式化合物及びそのユーロピウム錯体の生成 この合成は化３２により示される。
【化３２】
【０１００】ａ）化３２における式１０で表される
１，１’−ビス（ブロモメチル）−３，３’−ビスキノ
リンの生成 この化合物を化３３により表される１−メチル−３−ヒ
ドロキシイソキノリンから生成した。Ｎ−（±）−フエ
ニルエチル−ジエトキシアセトアミドの環化によって、
１−メチル−３−ヒドロキシイソキノリンを生成した。
従来の方法により生成し、減圧下（１４０°Ｃ，0.1 mm
Ｈｇ）での蒸溜により精製したこの原料72g を１０°Ｃ
まで冷却された濃Ｈ2 ＳＯ4 400ml 中に、撹拌下で１時
間に亙って一滴ずつ添加した。添加中、反応混合物を冷
却してその温度が１０°Ｃを越えないようにした。
【化３３】
【０１０１】次いで、反応混合物を室温で１０時間撹拌
し、それから氷６００ g中に注入した。濾過後、透明な
溶液を効率的な冷却を行ったもとで２０％水性媒体によ
り中和した。それによって得られた黄色の沈澱物を濾別
し、水で洗浄して真空乾燥し、41.5g の１−メチル−３
−ヒドロキシイソキノリンを得た（収率９０％）。さら
に、この化合物をトシル化した。次に、１−メチル−３
−ヒドロキシイソキノリン（41.5g ）懸濁液を氷水浴で
の冷却下でピリジン（２５０ml) とともに撹拌し、Ｐ−
トルエンスルホニルクロリド（７０g ，1.5 当量）を３
０分間にわたって徐々に添加した。これにより、黄色の
原料化合物が消えた。この反応を薄層クロマトグラフィ
によって監視した。反応が終了するや否や、水（５０m
l）を添加し、撹拌を１時間続けた。次いで、この反応
混合物を水７００mlで希釈し、固形Ｎａ2 ＣＯ3 で中和
した。その結果生じた沈澱物を濾別し、水で充分に洗浄
して乾燥した。その結果、空気中で安定な非親水性生成
物を70.5g 得た（収率：８６％）。
【０１０２】次に、生成された１−メチル−３−Ｐ−ト
ルエンスルホニル−オキシイソキノリンを従来知られた
製造方法を用いて結合した。
【０１０３】アルゴンで洗浄された撹拌機を備えた３つ
首フラスコに、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１ml，
トリフェニルホスフィン236.3g及びＮｉＣｌ2 ・６Ｈ2
Ｏ53.5g を入れて、深青緑色の溶液を形成した。油浴の
温度が５０°Ｃに達したとき、亜鉛粉末14.64gを添加
し。これにより、溶液の色は茶褐色に変化した。１時間
後、原料生成物、即ち、１−メチル−３−トルエンスル
ホニル−オキシイソキノリンの溶液（ＤＭＦ 200ml 中
70.5g ）を５０°Ｃで加熱，撹拌しながら一滴ずつ迅速
に添加し、この温度をさらに６時間維持した。そして、
室温まで冷却した後、反応混合物を希釈アルミナ４リッ
トル（Ｈ2 Ｏ 1.5リットル及び２０％ＮＨ3 500ml ）中
に注いだ。この懸濁液に激しい空気流を通してＮｉ（Ｐ
ｈ3 Ｐ） 4 （Ｐｈ＝フェニル）を酸化した。このとき、
茶色の消失によって酸化の終わりが指示された。この懸
濁液を濾別し、水で洗浄して、２０％ＨＣｌ 400ml 中
に注入し、ビイソキノリンをその水溶性塩酸塩に変え
た。
【０１０４】次いで、懸濁液をエチルエーテル４００ml
とを２回に分けて振りまぜてトリフェニルホスフィンを
除去し、酸相を濾別し、水１００ml及びアセトンで洗浄
して痕跡量のＰｈ3 Ｐ及びＰｈ3 ＰＯを除去した。塩化
水素を２０％アンモニア２００mlとともに丸底フラスコ
に入れ、一晩撹拌して塩基を放出した。かくして、得ら
れた白色生成物を濾別し、水で充分に洗浄し、真空中で
乾燥した（収率：８１％）。この生成物は溶媒のほとん
どにあまり可溶でなく、ＣＨＣｌ3 及びＴＨＦよりわず
かに可溶性が大である。このようにして得られた１，１
−ジメチル−３，３’−ビイソキノリンを臭素化して、
１，１’−ビス（ブロモメチル）−３，３’−ビイソキ
ノリンを形成した。
【０１０５】１，１’−ジメチル−３，３’−ビシクロ
キノリン 1.20gを還流下のＣＣｌ4500ml に溶解し、Ｎ
−ブロモサクテンイミド（2.26g ，３当量）を添加し
た。１０分後、さらに、２，２’−アゾビス（２−メチ
ルプロピオニトリル）１０g を添加した。そして、この
反応を薄層クロマトグラフィによって監視した。開始剤
を２回に分けて（各々１０mgずつ１時間にわたって添加
し、３時間後、溶液を蒸発乾燥し、残留物をメタノール
１５０mlで処理し、３０分間撹拌して濾別した。その結
果得た固体をメタノール１００mlで洗浄した。濾過ケー
クを真空中で乾燥し、沸騰トルエン（１００ml）に溶解
しさせて迅速に濾過した。この結果、液中に、冷却装置
において生成物が沈澱した（1.28g ，収率：６８％）。
【０１０６】ｂ）化３２における式１２で表される巨大
多環式化合物の生成 ＣＨ3 ＣＮ 150ml 中にＮ2 Ｏ4 巨大環1.416gとＮａ2
ＣＯ3 3.39g とが混入されて撹拌状態におかれた混合物
に、ＣＨ3 ＣＮ（１００ml) 中の１−１’−ビス（ブロ
モメチル）−３，３’−ビスイソキノリン懸濁液を３時
間に亙って添加し、撹拌を２０時間続けた。濾過，ＣＨ
3 ＣＮによる洗浄及び蒸発の後に粗製生成物を得、まず
アルミナで（溶出剤：ＣＨＣｌ3 中で３％のＣＨ3 Ｏ
Ｈ、次いでＣＨＣｌ3 中で１０％のＣＨ3 ＯＨ Ｖ／
Ｖ）、次に、シリカゲルで（溶出剤：ＣＨＣｌ3 中で１
０％のＣＨ3 ＯＨ）、２回クロマトグラフィ分離した。
【０１０７】２回の精製の後の収量は0.289gであって、
従って、収率１４％であった。そして、蒸気拡散による
エタノール／エーテル混合物中での結晶化により再度精
製を行った。
【０１０８】ｃ）錯体〔Ｅｕ3+Ｃ（２２）ビイソキノリ
ン〕の生成 無水硝酸ユーロピウム 24.5mg （１当量）を無水ＣＨ3
ＣＮ 0.5mlに溶解した。ＣＨ3 ＣＮ 0.3ml 中の（２
２）ビイソキノリンナトリウム錯体（37.0mg）を添加
し、その結果生じた混合物を実施例２ｂ）の説明部に記
載された方法に従って処理した。
【０１０９】このようにして得た淡黄色の沈澱物をアセ
トニトリル３mlに希釈して、２時間加熱した。そして、
この溶液を室温で数日間放置し、式１２により表される
黄色結晶化生成物を得た。
【０１１０】（実施例−９）化３４における式１８で表される（２２）ジフェニルビ
ピリジン巨大多環式化合物の生成 この合成は化３４により示される。
【化３４】
【０１１１】ａ）６，６’−ビス（ブロモメチル）−
４，４’−ジフェニル−２，２’−ビピリジン（１６）
の生成 この化合物は、下記の方法により市販の４，４’−ジフ
ェニル−２，２’−ビピリジンから得た。
【０１１２】６，６’−ジメチル−４，４’−ジフェニ
ル−２，２’−ビピリジン 氷浴で冷却された無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中
の４，４’−ジフェニル−２，２’−ビピリジン（４
g，１３mmol) の撹拌状態にある懸濁液に、1.5Ｍメチル
リチウム（３当量）を窒素雰囲気下で一滴ずつ添加し
た。この添加後、溶液を同じ条件でさらに３０分間撹拌
し、次いで、得られた暗褐色の混合物を加熱し、窒素雰
囲気下で４０°Ｃの条件のもとで３時間撹拌した。その
後、窒素雰囲気下で０°Ｃの条件のもとで、過剰量の水
をゆっくり添加し、有機相を分離して水性相をジクロロ
メタンで３回抽出した。次いで、二酸化マンガン（原料
化合物の重量の２０〜４０倍）をオレンジ色の有機溶液
に添加した。この混合物を室温で３０〜５０分間撹拌し
た。そして、薄層クロマトグラフィ（Ａｌ2 Ｏ3 ，溶離
剤：トルエン）によって反応の進行を監視した。
【０１１３】次に、硫酸マグネシウムを反応媒体に添加
し、これをさらに３０分間撹拌した。次いで、濾過して
濾液を得、この濾液を蒸発させた。そして、残留物をア
ルミナクロマトグラフィ（溶出剤：トルエン／ヘキサン
１：１）にかけ、２種の生成物を得た。結果は次の如く
であった。 ６，６’−ジメチル−４，４’−ジフェニル−２，２’
−ビピリジン：0.85g ，１９％ ６−モノメチル−４，４’−ジフェニル−２，２’−ビ
ピリジン：0.45g ，10.8％
【０１１４】６，６’−ジメチル−４，４’−ジフェニ
ル−２，２’−ビピリジン−Ｎ，Ｎ’−ジオキシド クロロホルム（６０ml）中に上述の化合物（0.28g ，0.
83mmol) が混入された溶液が氷冷却及び撹拌状態とされ
て入れられた２５０mlフラスコに、ｍ−クロロ過安臭香
酸（0.57g ，3.3mmol)のクロロホルム（６０ml）溶液を
徐々に添加した。そして、撹拌を３時間続け、この間、
混合物を室温に戻るままにした。この反応混合物を３０
分間撹拌しつつ重炭酸ナトリウム水溶液で処理した。
【０１１５】有機相を分離して真空中で蒸発させ、残留
物をジクロロメタン（ＣＨ2 Ｃｌ2）に再び溶解し、塩
基性アルミナカラムに通した。標準アルミナでさらにク
ロマトグラフィを行って生成物を完全に精製した（収量
0.21g ，収率６８％）。
【０１１６】６，６’−ビス（アセトキメチル）−４，
４’−ジフェニル−２，２’−ビピリジン 上述の化合物 0.21g（0.57mmol) を無水酢酸 （1.3ml
）中で還流状態として１時間加熱した。この溶液を真
空中で濃縮し、トルエンを共沸混合物が形成するまで添
加した。その結果生じた固体をジクロロメタンに再び溶
解し、１０％重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄し、乾燥し
て溶媒を蒸発させた。そして、得られた粗製生成物をシ
リカゲルカラムに通し、ジクロロメタンで溶出して所望
の化合物を0.126gを得た（収率：４９％）。
【０１１７】６，６’−ビス（ブロモメチル）−４，
４’− ジフェニル−２，２’−ビピリジン（１６） 上述の化合物（0.053g；0.117mmol ）と、４７％臭化水
素酸（0.9ml ）とよりなる溶液を、撹拌状態として１３
０°Ｃで４時間加熱した。次いで、この溶液をメタノー
ル／氷浴で冷却し、これに水１５ml，クロロホルム４０
ml、次いで、重炭酸ナトリウム飽和溶液を溶液のｐＨが
アルカリ性になるまで徐々に添加した。その後、有機相
を分離し、水性相をクロロホルムで抽出し（１０mlずつ
２回）、有機分留部すべてを一緒にして蒸発させた。ク
ロロホルムを溶出剤として、残留物をアルミナカラムで
のクロマトグラフィにかけ、式（１６）で表されるジブ
ロミドを４０mg得た（収率：６９％）。
【０１１８】ｂ）化３４における式１８で表される塩
〔Ｎａ+ Ｃ（２２）ジフェニル−ビピリジンＢｒ〕の生
成 式１７で表される巨大環Ｎ2 Ｏ4 21.2mg（0.081mmo
l)，炭酸ナトリウム４３mg（0.40mmol) ，式１６で表さ
れるジブロミド４０mg (0.081mmol)を使用して、実施例
５ｂ）の説明部に記載された方法を繰り返し、式１８で
表される錯体が29.8mg得られた（収率：５３％）。
【０１１９】（実施例−１０）化３５により表されるジフェニルビヒリジン−ビスビピ
リジン巨大多環式錯体の生成 式１７で表されるＮ2 Ｏ4 巨大環に代えて式５（実施例
５）で表されるビス−ピリジン巨大環を使用して、上述
の実施例の方法を繰り返した。使用した物質は次の如く
である。 ビス−ピリジン巨大環（式５） 24.7mg（0.063mmol) 式１６で表されるジブロミド 31.1mg（0.063mmol) 炭酸ナトリウム 0.1mg （0.94mmol) 反応を２３時間続け、化３４により表される化合物を２
０％の収率で得た。
【化３５】
【０１２０】（実施例−１１）化３６により表されるビイソキノリンビス−ビピリジン
巨大多環式化合物 式１１で表される巨大環Ｎ2 Ｏ4 に代えて式５で表され
る巨大環ビス−ピリジンを使用し、実施例８の説明部に
記載された方法を繰り返した。その結果、式５で表され
る化合物及び式１０で表されるジブロミドを等モル量使
用したもとで、式２０で表される化合物を31.7g 得た
（収率：２０％）。
【化３６】
【０１２１】（実施例−１２）（２２）ビピリジン巨大多環式化合物の生成 実施例５の説明部に記載された方法に従い、式５で表さ
れるビス−ビピリジンに代えて式１１で表される巨大環
Ｎ2 Ｏ4 を使用し、化３７により表される巨大多環式化
合物を１２％の収率で得た。
【化３７】
【０１２２】（実施例−１３）実施例１の説明部に記載
された方法、ならびに実施例９〜１１により得られる巨
大多環式化合物を使用して、下記の巨大環式錯体を夫々
得た。 〔Ｅｕ3+Ｃ（２２）ビピリジン〕 〔Ｅｕ3+Ｃ（ビピリジン、ビピリジン，ビイソキノリ
ン）〕 〔Ｅｕ3+Ｃ（２２）ジフェニルビピリジン〕 〔Ｔｂ3+（２２）ビヒリジン〕
【０１２３】同様に、実施例５の説明部に記載された方
法を用い、６，６’−ビス−ブロモメチル−フェナント
ロリン及びジアミンビス（フェナントロリンジイル）巨
大環を使用して、錯体〔Ｅｕ3+Ｃ（巨大多環トリス−フ
ェナントロリン）〕を生成した。対応する巨大多環式化
合物は下記の特性を有していた。 微量分析：Ｃ42Ｈ38Ｎ8 ，ＮａＢｒ，Ｈ2 Ｏ（767.6 ） 計算値：Ｃ 65.71 Ｈ 4.17 Ｎ 14.6 実測値：Ｃ 65.23 Ｈ 4.26 Ｎ 13.1 ＲＭＲ 1Ｈ：溶媒 ＣＤＣｌ3 4.03 4.45（非常に広い；ＡＢ，１２Ｈ，ＣＨ2 ） 7.66 （ｄ，Ｊ＝8.1 ；６Ｈ；Ｈ−Ｃ（３）；Ｈ−Ｃ
（８）） 7.78 （ｓ，６Ｈ，Ｈ−Ｃ（５）；Ｈ−Ｃ（６）） 8.27 （ｄ，Ｊ＝8.1 ，６Ｈ，Ｈ−Ｃ（４）；Ｈ−Ｃ
（７））
【０１２４】本発明に係るクリプテートの螢光特性 ａ）所定の発光波長についての励起ピーク 各錯体ごとに、所定の発光波長，錯体の希土類イオン、
及び、励起波長について測定した結果、測定された励起
ピークは希土類イオン単独の場合のものには相当しなか
った。また、測定された励起ピークに相当する波長で錯
体を励起することによって、螢光が最大になるのが希土
類イオンの特徴であることが明確にされた。
【０１２５】スペクトル計：ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ
ＬＳ５を使用して、上述の測定を表５〜表１０に示す
如くの条件で行った。
【０１２６】ｂ）ユーロピウム及びテルビウムクリプテ
ートの寿命τの測定 スペクトル計ＬＳ５で、ユーロピウムの場合について６
１０nmから６２０nmまでの間及びテルビウムの場合につ
いて５４０nmから５５０nmまでの間に位置する発光ピー
クのスペクトルを記録した。その際、溶媒は吸収ピーク
のうちの１つで励起し、また、スリットの値を1ms ＝ｔ
ｇに固定してリン光方法で行った。記録はいくつかのｔ
ｄ（時限）値、即ち、0.1 ；0.2 ；0.3 ；0.4 及び0.5m
s について行った。
【０１２７】そして、発光ピークの大きさを測定し、寿
命τを下記の数３及び数４に従って求めた。Ｉｏは曲線
１ｏｇＩｔを描くことによって求められ、τがｔｄの関
数として算出される。
【数３】 Ｉｔ＝Ｉｏ・ｅ
【数４】
【０１２８】得られた結果を表１１及び表１２に示す。
【表１１】
【表１２】
【０１２９】
【発明の効果】以上の説明から明らかな如く、本発明に
係る巨大多環式希土類錯体の利用方法によれば、主要な
特性として高い動力学的安定性（低い解離速度定数）を
有するものとされた螢光性の巨大多環式希土類錯体が、
螢光を利用する免疫学的検出もしくは測定を行うに際し
ての生物学的生成物用の螢光トレーサとして使用される
ことになるので、生物学的生成物についての螢光を利用
しての免疫学的検出もしくは測定を、高い感度をもっ
て、確実かつ安定に行うことができることになる。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ０７Ｄ 498/08 273:00） (Ｃ０７Ｄ 498/22 221:00 273:00）

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】化１（Ｚは３価または４価の原子を示し、
    Ｒは水素，水酸基，アミノ基または炭化水素基、あるい
    は、なにも無いことを示し、Ａ ,Ｂ及びＣは２価の基を
    示す。）により表され、上記Ａ ,Ｂ及びＣの夫々が、１
    個以上のヘテロ原子を任意に含有して巨大複素環で断続
    された炭化水素鎖であり、また、上記Ａ ,ＢまたはＣの
    うちの少なくとも１つが、少なくとも１つの三重項エネ
    ルギドナー基を含有するか、あるいは、本質的に三重項
    エネルギドナー基より成り、該三重項エネルギドナー基
    が錯化された希土類イオンの発光準位より大なる三重項
    エネルギを有するものとされた巨大多環式化合物で錯化
    された少なくとも１つの希土類塩より成る巨大多環式希
    土類錯体を、螢光を利用する免疫学的検出もしくは測定
    方法のもとでの生物学的生成物用のトレーサとして使用
    する、巨大多環式希土類錯体の利用方法。 【化１】
  2. 【請求項２】巨大多環式希土類錯体が、アルキルアミ
    ノ，アリールアミノ，イソチオシアノ，シアノ，イソシ
    アノ，チオシアノ，カルボキシ，ヒドロキシル，メルカ
    プト，フェニル，イミダゾール，アルデヒド，エポキシ
    ド，チオニルハライド，スルホニルハライド，ニトロベ
    ンゾイルハライド，カルボニルハライド，トリアゾ，ス
    クシンイミド，酸無水物，ハロゲンアセテート，ヒドラ
    ジノ及びジハロゲノトリアジニル基より成る群から選択
    された結合基による置換がなされたものとされることを
    特徴とする請求項１記載の巨大多環式希土類錯体の利用
    方法。
  3. 【請求項３】化２（Ｚは３価または４価の原子を示し、
    Ｒは水素，水酸基，アミノ基または炭化水素基、あるい
    は、なにも無いことを示し、Ａ ,Ｂ及びＣは２価の基を
    示す。）により表され、上記Ａ ,Ｂ及びＣの夫々が、１
    個以上のヘテロ原子を任意に含有して巨大複素環で断続
    された炭化水素鎖であり、また、上記Ａ ,ＢまたはＣの
    うちの少なくとも１つが、少なくとも１つの三重項エネ
    ルギドナー基を含有するか、あるいは、本質的に三重項
    エネルギドナー基より成り、該三重項エネルギドナー基
    が錯化された希土類イオンの発光準位より大なる三重項
    エネルギを有するものとされた巨大多環式化合物によ
    り、少なくとも１つの希土類イオンを錯化し、形成され
    た錯体の三重項エネルギドナー基を励起するようにした
    希土類イオンの螢光を増大させる巨大多環式希土類錯体
    の利用方法。 【化２】
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