JP2009513681A - キナーゼおよびユビキネーションアッセイ法 - Google Patents

Abstract

抗体、ポリペプチドおよび有機分子を含む組成物、キット、ならびに、例えば共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）を用いて、分子相互作用（例えば、脱ユビキネーション、ユビキネーションおよびキナーゼ活性）を探索する方法が提供される。

Description

本発明は、蛍光分子および発光金属錯体を用いるアッセイ、ならびに、競合結合または酵素活性（キナーゼ活性、脱ユビキチン化活性またはユビキチン化活性）等の分子相互作用をモニターし測定する方法に関する。

ユビキチン化は主にターゲッティングシグナルとして役立ち、最も一般的なタイプである、ポリユビキチン鎖を有するタンパク質は、細胞質ゾルのタンパク質分解の大部分に関与するユビキチン−プロテアソーム経路による分解の標的である（Ｃｉｅｃｈａｎｏｖｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５巻、２７２７−３０ページ、１９９８年（非特許文献１））。ユビキチン（Ｕｂ）はイソペプチド結合によりタンパク質に結合し、ＵｂのＣ末端カルボン酸およびリジン側鎖のｃ−ＮＨ２が当該結合に関与する（Ｃｉｅｃｈａｎｏｖｅｒら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ、２６巻、５９−６４ぺージ、１９９９年（非特許文献２）；Ｈｏｄｇｉｎｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１巻、３０号、２８７６６−２８７７１ページ、１９９６年（非特許文献３））。ポリＵｂコンジュゲートおよびポリＵｂ鎖形成に関係する酵素カスケードでは、Ｕｂ活性化酵素Ｅ１、Ｕｂ−コンジュゲート化酵素Ｅ２およびＥ３リガーゼを含んでなる、少なくとも３つの酵素による活性セットが関与する（ＨｅｒｓｈｋｏおよびＣｉｅｃｈａｎｏｖｅｒ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６７巻、４２５−７９ページ、１９９８年参照（非特許文献４））。

脱ユビキチン化酵素（ＤＵＢｓ）または脱コンジュゲート化酵素（ＤＣＥｓ）により、Ｕｂは除去される。これらは、２６Ｓプロテアソームによりタンパク質を分解してポリＵｂ鎖を放出して、モノマーＵｂを再生し、Ｕｂ融合タンパク質前駆体からＵｂを開放し、調節的ユビキチン化を逆転させ、不適切にユビキチン化されたタンパク質を編集しうる巨大ファミリーである（Ｃｈｕｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、２６６巻、６３３−４０ページ、１９９９年（非特許文献５）参照）。ＤＵＢｓは、Ｕｂ−Ｃ末端加水分解酵素（ＵＣＨｓ）およびＵｂに特異的なプロセシングプロテアーゼ（ＵＢＰｓ）に細分されうる。インビトロでは、ＵＢＰｓは、Ｕｂとフォールディングされたタンパク質ドメイン（Ｕｂ付加部分または標的タンパク質等）との間のイソペプチド結合を加水分解する。このように、ＵＢＰｓは広い基質特異性を示す（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ、ＦＡＳＥＢＪ、１１巻、１２４５−５６ページ、１９９７年（非特許文献６））。ＵＣＨｓは、一般に、Ｕｂとフォールディングされないポリペプチドとの結合、若しくはＵｂと低分子置換基の間の結合を切断する（Ｐｉｃｋａｒｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６０巻、７９０３−１０ページ、１９８５年（非特許文献７）；Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎら、ＦＡＳＥＢ Ｊ．、１１巻、１２４５−５６ページ、１９９７年（非特許文献６）；Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２５巻、６６４４−９ページ、１９８６年（非特許文献８））。酵母の遺伝子欠失株を用いた研究から、ＵＣＨｓおよびＵＢＰｓの基質特異性の重複が示唆された（Ａｍｅｒｉｋら、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、３８１巻、９８１−９２ページ、１５号、２０００年（非特許文献９）；Ｂａｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７巻、２３３６４−７５ページ、１９９２年（非特許文献１０））。ＵＢＰｓおよびＵＣＨｓは共に２６Ｓプロテアソームと会合することができ、Ｕｂ依存性タンパク質分解の調節に関与する（Ｖｏｇｅｓら、Ａｎｎｕｌ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６８ページ、１９９９年（非特許文献１１））。

ユビキチン化および脱ユビキチン化は、タンパク質分解、タンパク質−タンパク質相互作用、ＤＮＡ修復、および細胞情報伝達等を制御する調節機構として現れる。近年、ＵＳＰ２およびＵＣＨ３７は腫瘍成長促進タンパク質を脱ユビキチン化することが示され。他のＤＵＢｓは癌細胞において過剰発現されることが示された。従って、ＤＵＢｓの阻害は、癌治療等のための強力な治療ストラテジーとして注目されている。癌細胞の増殖をはじめとする細胞プロセスにユビキチン系が広範に関与することから、魅力ある薬剤標的候補のセットが提供される。大部分のアッセイフォーマットは、低スループットの方法またはカスタマイズされた試薬に大きく依存する。

低分子量のユビキチン関連修飾因子（ＳＵＭＯ）は、細胞中の他のタンパク質と共有結合、分離してその機能を加減する、小タンパク質である。ＳＵＭＯ化は、細胞核−細胞質ゾルの輸送、転写制御、アポトーシス、タンパク質安定化、ストレス応答、および細胞周期の進行等、種々の細胞プロセスに関与する翻訳後修飾である。ＳＵＭＯタンパク質はユビキチンと類似している（Ｕｌｒｉｃｈ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、２００５年１０月、１５巻、１０号、５２５−３２ページ（非特許文献１２））。ユビキチンとは対照的に、ＳＵＭＯは通常、タンパク質分解のためのタグとしては機能しない。典型的には、Ｃ末端の最後の４アミノ酸が切断されるまでは、このタンパク質は不活性である。

Ｃｉｅｃｈａｎｏｖｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５巻、２７２７−３０ページ、１９９８年 Ｃｉｅｃｈａｎｏｖｅｒら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ、２６巻、５９−６４ぺージ、１９９９年； Ｈｏｄｇｉｎｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１巻、３０号、２８７６６−２８７７１ページ、１９９６年 ＨｅｒｓｈｋｏおよびＣｉｅｃｈａｎｏｖｅｒ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６７巻、４２５−７９ページ、１９９８年 Ｃｈｕｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、２６６巻、６３３−４０ページ、１９９９年 Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ、ＦＡＳＥＢＪ、１１巻、１２４５−５６ページ、１９９７年 Ｐｉｃｋａｒｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６０巻、７９０３−１０ページ、１９８５年 Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２５巻、６６４４−９ページ、１９８６年 Ａｍｅｒｉｋら、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、３８１巻、９８１−９２ページ、１５号、２０００年 Ｂａｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７巻、２３３６４−７５ページ、１９９２年 Ｖｏｇｅｓら、Ａｎｎｕｌ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６８ページ、１９９９年 Ｕｌｒｉｃｈ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、２００５年１０月、１５巻、１０号、５２５−３２ページ

大多数の非放射性のキナーゼアッセイは、約２０残基以下の化学合成ペプチド基質のリン酸化に依存している。しかし、「生理的に同等の」より大きな天然型基質（例えば、全長タンパク質またはタンパク質ドメイン）を用いることが好適である（すなわち、それらは生物学的に同等の経路における、キナーゼの「天然型」基質でありうる）。キナーゼアッセイの熟練ユーザの多くにとっては、「天然型」基質を用いるのが好適である。例えば、リン酸化のためにリン酸化部位からはるかに離れた「ドッキング」部位を必要とするキナーゼが知られている。場合によっては、より小さなペプチド基質は基質として機能しない。

薬物の探索では、何千もの化学物質を含む多様な化学物質ライブラリの、系統的および／またはハイスループットのスクリーニングを行う必要がありうる。これらのライブラリの規模および複雑性が、費用およびＦＤＡによる承認を受けたプロセスに要する期間と結びついた結果、分子相互作用を探査するための、単純、効率的および再現性の高いアッセイに対するニーズが生じるに至った。

発光に基づく技術（蛍光偏光（ＦＰ）、共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）およびルミネッセンス共鳴エネルギー移動法（ＬＲＥＴ）を含む）は、典型的に用いられる、分子相互作用の探索のための非常に高感度で再現性の高い方法である。しかしながら、バックグラウンド発光（アッセイ成分からの蛍光または発光等）およびアッセイ成分からの非特異的相互作用により、発光に基づくアッセイの感度が損なわれ、特に、短寿命の発光原子団を用いるときには、薬物または化合物スクリーニングにおいて偽陽性または偽陰性の検出結果が生じるおそれがある。スクリーニング結果の確認のためには、個々に選抜された化合物のフォローアップスクリーニングまたは複数のスクリーニング方法の使用が必要となりうる。蛍光または化学発光アッセイの情報内容を増加させ、薬物スクリーニングにおける疑似結果の数を減少させることが可能なスクリーニングの方法論が有用であろう。

様々な局面において、本発明は、競合的結合イベントおよび酵素反応の結果として生じるそのイベントをはじめとする、分子相互作用のモニターに有用な、組成物、方法、装置およびキットを提供する。幾つかの局面として、本発明は、分子修飾（例えば翻訳後修飾）イベントの検出および／または同定、ならびに分子修飾活性の検出および／または同定のための組成物および方法の提供に関する。多くの場合、当該分子修飾イベントの結果は、光学特性の変化（例えば、（１）修飾された分子、または（２）これらの分子を含む組成物の光学特性の変化）により検出される。

一態様において、本発明は、ドナー部分（例えば、ルミネッセンス金属錯体（テルビウム等））およびアクセプター部分（例えば蛍光タンパク質またはポリペプチド（ＧＦＰ等））を利用する。別の態様において、本発明は、ルミネッセンス金属錯体（例えば、テルビウムまたはユーロピウム）および蛍光原子団（例えば、フルオレセイン）を利用する。一態様において、本発明は、蛍光分子およびルミネッセンス金属錯体を利用し、酵素活性を測定する方法の提供に関する。一態様において、蛍光分子およびルミネッセンス金属錯体は、それぞれ、２つの結合パートナーとして存在する。一態様において、蛍光分子およびルミネッセンス金属錯体は、１分子上（酵素に対する基質等の上）に位置する。一態様において、当該酵素（例えば、ユビキチン化酵素）はその活性により少なくとも２分子を「連結」する。一態様において、当該２分子はそれぞれ共鳴エネルギー移動ペアの一方を構成する。一態様において、１分子は蛍光分子を含んでなり、他の分子はルミネッセンス金属錯体を含んでなる。一態様において、１分子はＲＥＴペアの両方を含んでなる（例えば、ＲＥＴが可能な分子を生成する）。一態様において、この分子は蛍光分子およびルミネッセンス金属錯体を含んでなる。本発明には、関連組成物、例えばそれぞれが共鳴エネルギー移動ペアの一方を構成する２分子を含む組成物が包含される。当該組成物は、当該２分子を「連結」しうる酵素を適宜含むことができる。

本発明の一態様において、酵素はその活性により、ＲＥＴが可能な分子またはＲＥＴが可能な錯体の形成を分裂させるかまたは阻害する。一態様において、酵素（例えば、脱ユビキチン化酵素またはプロテアーゼ）はその活性により、蛍光分子およびルミネッセンス金属錯体を含んでなる分子を切断する（例えば、ＦＲＥＴが可能な分子を分裂する）。一態様において、酵素はその活性により、蛍光分子またはルミネッセンス金属錯体を含んでなる分子をリン酸化または脱リン酸化する（例えば、リン酸化を調整する）。

一態様において、本発明は、第１の結合パートナーと第２の結合パートナーとの結合に対する、被験化合物の作用を測定する方法の提供に関する。一態様において、前記方法は、第１の結合パートナー、第２の結合パートナー、および被験化合物（例えば、キナーゼまたは低分子薬剤候補）を接触させて、被験試料を形成することを含んでなる。幾つかの態様において、第１の結合パートナーおよび第２の結合パートナーは、一方がルミネッセンス金属錯体を含んでなり、他方が蛍光アクセプター部分を含んでなる。第１の結合パートナーおよび第２の結合パートナーは、相互に結合して錯体を形成しうる。

１つの方法においては、被験試料を露光し、被験試料からの蛍光放出を測定する。一態様において、被験試料を１００ｎｍから２０００ｎｍの範囲の波長の光に曝露し、被験試料の蛍光放出を測定する。一態様において、被験試料の蛍光放出計測が対応する対照試料（例えば被験化合物を含まない試料）の蛍光放出計測と異なるときは、当該被験化合物は、第１の結合パートナーと第２の結合パートナーの結合に影響するものとして同定される。一態様において、放出（蛍光等）計測は比率計算を含んでなる。一態様において、当該比率計算は、対照試料に対する被験試料の蛍光放出の比率を含んでなる。他の態様において、当該比率計算は、ＲＥＴペア（ランタニド金属錯体等）のドナー分子の蛍光放出に対するアクセプター分子（フルオレセインまたはＧＦＰ等）の蛍光放出の比率を含んでなる。他の態様において、当該比率測定は、対照試料の蛍光放出に対する被験試料の蛍光放出の比率、およびＲＥＴペア（ランタニド金属錯体等）のドナー分子の蛍光放出に対するアクセプター分子（フルオレセインまたはＧＦＰ等）の蛍光放出の比率を含んでなる。

第１の結合パートナーおよび第２の結合パートナーは、タンパク質またはポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、多糖類、ホルモンおよび低分子有機化合物からなる群から独立に選択されうる。幾つかの態様において、ポリペプチドは抗体または抗体フラグメントでありうる。蛍光アクセプター部分は、フルオレセイン、ローダミン、ＧＦＰ、ＧＦＰ誘導体、ＦＩＴＣ、５−ＦＡＭ、６−ＦＡＭ、７−ヒドロキシクマリン−３−カルボキサミド、６−クロロ−７−ヒドロキシクマリン−３−カルボキサミド、フルオレセイン−５−イソチオシアネート、ジクロロトリアジニルアミノフルオレセイン、テトラメチルローダミン−５−イソチオシアネート、テトラメチルローダミン−６−イソチオシアナート、５−カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル、６−カルボキシフルオレセインのスクシンイミジルエステル、５−カルボキシテトラメチルローダミン、６−カルボキシメチルローダミンおよび７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸からなる群から選択しうるが、これらに限定されない。

ドナー部分の例としては、ランタニド金属錯体等のルミネッセンス金属錯体が挙げられる。ランタニド金属錯体は、有機アンテナ部分、金属連結部分およびランタニド金属イオンを含みうる。ランタニド金属イオンは、Ｓｍ（ＩＩＩ） Ｒｕ（ＩＩＩ） Ｅｕ（ＩＩＩ） Ｇｄ（ＩＩＩ） Ｔｂ（ＩＩＩ）およびＤｙ（ＩＩＩ）からなる群から選ばれうる。一態様において、ランタニド金属イオンは、テルビウム（Ｔｂ）である。有機アンテナ部分は、ローダミン５６０、フルオレセイン５７５、フルオレセイン５９０、２−キノロン、４−キノロン、４−トリフロロメチルクマリン（ＴＦＣ）、７−ジエチル−アミノ−クマリン−３−カルボヒドラジド、７−アミノ−４−メチル−２−クマリン（カルボスチリル１２４）、７−アミノ−４−メチル−２−クマリン（クマリン１２０）、７−アミノ−４−トリフロロメチル−２−クマリン（クマリン１２４、）およびアミノメチルトリメチルプソラレンからなる群から選ばれうる。金属連結部分は、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＴＴＨＡ、ＤＯＴＡ、ＮＴＡ、ＨＤＴＡ、ＤＴＰＰ、ＥＤＴＰ、ＨＤＴＰ、ＮＴＰ、ＤＯＴＰ、ＤＯ３Ａ、ＤＯＴＡＧＡおよびＮＯＴＡからなる群から選ばれる金属キレート部分でありうる。

幾つかの態様において、ランタニド金属錯体は、−Ｌ_ｎ−Ａ−Ｓ_ｎ−Ｃ_Ｍ，または、−Ｌ_ｎ−Ｃ_Ｍ−Ｓ_ｎ−Ａの構造を有し、式中、Ａは有機アンテナ部分を表し、Ｌはリンカーを表し、Ｓはスペーサを表し。ｎは０または１であり、Ｃは金属キレート化部分を表し、ＭはＣに配位されるランタニド金属イオンを表す。

別の局面においては、本発明は、酵素活性のモジュレータを同定する方法の提供に関する。一態様において、当該方法は、酵素（キナーゼ、プロテアーゼ、脱ユビキチン化酵素、ユビキチン化酵素等）の基質に当該酵素を接触させ、酵素生成物を測定することを含んでなる。一態様において、当該酵素反応は、酵素活性のモジュレータまたは潜在的モジュレータの存在下で実施される。一態様において、酵素、基質および潜在的モジュレータは、次いで、第１の結合パートナーおよびトレーサと接触して被験試料を形成する。第１の結合パートナーは、酵素活性の酵素生成物または基質に対する結合特異性を有する。一態様において、第１の結合パートナーはトレーサに結合しうる。

トレーサは、非標識であってもよく、またはルミネッセンス金属錯体若しくは「蛍光トレーサ」等の蛍光アクセプター部分を含みうる。例えば、当該方法の一態様において、第１の結合パートナーまたはトレーサの一方はルミネッセンス金属錯体（テルビウム等）を含んでなり、他方は蛍光アクセプター部分を含んでなる。他の態様において、第１の結合パートナーおよび基質はルミネッセンス金属錯体を含んでなり、他方は蛍光アクセプター部分（フルオレセインまたはＧＦＰ等）を含んでなる。

次いで被験試料を光に曝露し、被験試料からの蛍光放出を測定する。一態様において、被験試料は、１波長の光または一定の波長範囲（例えば、１０ｎｍ、１５ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍまたは５０ｎｍの波長帯または波長範囲）の光に曝露する。一態様において、被験試料は１００ｎｍから２０００ｎｍまで範囲の少なくとも１つの波長を有する光（例えば２５０ｎｍ〜７５０ｎｍ、２５０ｎｍ〜３００ｎｍ、２５０ｎｍ〜４００ｎｍ、２５０ｎｍ〜５００ｎｍ、２５０ｎｍ〜６００ｎｍ、２５０ｎｍ〜７００ｎｍ、３５０ｎｍ〜７００ｎｍ、４５０ｎｍ〜７００ｎｍ、５００ｎｍ〜１０００ｎｍ、１０００ｎｍ〜２０００ｎｍ、１００ｎｍ〜４００ｎｍ、他の範囲の光の波長）に曝露することも可能であり、被験試料からのそれによる蛍光放射が測定される。一態様において、潜在的モジュレータは、被験試料の蛍光放出の測定値が、対応する対照試料（当該潜在的モジュレータを欠いているかまたは含有量がより少ない）の蛍光放出測定値と異なるときに、酵素活性のモジュレータとして同定される。被験試料または対照試料の蛍光放出は、２以上の波長において測定しうる。一態様において、２波長における被験試料または対照試料の蛍光放出計測の比率が算出される。

酵素活性は、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、グルクロニダーゼ活性、プレニル化、グリコシレーション、メチル化、脱メチル反応、アシル化、アセチル化、ユビキチン化、脱ユビキチン化、硫酸化、タンパク質分解、ヌクレアーゼ活性、核酸ポリメラーゼ活性、核酸逆転写酵素活性、ヌクレオチジル転移酵素活性およびポリヌクレオチド翻訳活性からなる群から選択しうる。

本発明の幾つかの局面において、アッセイの構成成分は、精製、部分的精製および／または細胞溶解物等の種々の原料に由来しうる。各構成成分は、同一、異種または種々の原料の組み合わせに由来してもよい。一態様において、酵素（キナーゼ、ユビキチナーゼ（ユビキチン化酵素）、またはＤＵＢ、およびプロテアーゼ）は細胞溶解物に由来する。一態様において、酵素のための基質または潜在的基質は、細胞溶解物に由来する。

本発明の幾つかの態様のように、遺伝子コードしたアクセプター蛍光原子団を有するプロテアーゼ（ＤＵＢ等）基質を調製することにより、単一のタンパク質中に部位特異的に２つの蛍光原子団をそれぞれ取り込ませる、困難な「交差」標識ストラテジーの必要がなくなる。全長のタンパク質キナーゼ基質の場合、典型的には、標識タンパク質は、表面アクセス可能なアミン基をランダム標識して調製される。本発明の一態様のように、蛍光タンパク質との融合タンパク質として酵素基質を調製することにより、ロットごとの基質の一貫性が改善され、これはハイスループットのスクリーニング応用のための試薬開発における考慮事項である。

本発明の幾つかの態様は、細胞系アッセイの提供に関する。当該アッセイでは例えば、細胞内で標識（アクセプター標識、ドナー標識またはＧＦＰ等の蛍光タンパク質）を含んでなる融合タンパク質、および翻訳後修飾（ユビキチン化のための基質または潜在的ユビキチン化基質等）のための基質が発現され、翻訳後修飾の状態および／または潜在的ユビキチン化基質の翻訳後修飾速度を解析の対象とする。幾つかの態様において、優先的に修飾または無修飾の融合タンパク質基質と結合する結合パートナー（抗体等）が利用される。

幾つかの態様は、化合物が翻訳後修飾のモジュレータであるかどうかを決定する方法の提供に関する。幾つかの態様は、細胞中において融合タンパク質を発現させ、当該細胞を可溶化し、細胞溶解物（例えば、粗製の、部分的に精製された、または精製された細胞溶解物）を、翻訳後修飾により結合が調節される結合パートナーと接触させること含んでなる、翻訳後修飾を計測、モニターまたは定量化するアッセイの提供に関する。例えば、当該結合パートナーは、翻訳後修飾されたタンパク質と比較して、無修飾のものに対してより高いアフィニティを有してもよく、またその逆であってもよい。幾つかの態様において、当該結合パートナーは、翻訳後修飾の一部として融合タンパク質基質に付加、結合または会合する化合物（ペプチドまたはポリペプチド等）に結合する。幾つかの態様において、当該結合パートナーは、翻訳後修飾の一部として融合タンパク質基質から除去または分離される化合物（ペプチドまたはポリペプチド等）に結合する。

幾つかの態様において、当該結合パートナーは標識される。幾つかの態様において、当該結合パートナーは、融合タンパク質上の標識とＲＥＴペアを形成しうる標識を含んでなる。幾つかの態様において、当該結合パートナー（抗体等）は標識されない。本発明の幾つかの局面において、当該結合パートナーを利用して、修飾または無修飾の基質／標識融合タンパク質を優先的に固定する。それにより、例えば融合タンパク質の標識を励起して検出することにより、当該結合を検出できる。

ユビキチン化アッセイの全てではないがほとんどは、インタクトな／生存する細胞を含まない系、若しくは可溶化した細胞を開始成分とする系で実施されるか、または半精製された系を用いてタンパク質のユビキチン化をアッセイするかのいずれかである。発明者は、本願明細書において生細胞（開始成分）を利用するアッセイを記載する。加えて、これらの細胞系アッセイは、とりわけ、化合物が生細胞に拡散するかまたは細胞表面で作用（受容体に結合および／またはブロックする）し、生細胞の内部におけるユビキチン化機構または経路の活性を阻害、強化／上方制御する能力を試験するために使用できる。これにより、例えば他の技術よりも「人工的」ではない条件において、ユビキチン関連の経路を解析するための手段がユーザに提供される。本発明の細胞アッセイは、ハイスループットへの応用が可能であり、幾つかの態様において、現状のＴＲ−ＦＲＥＴアッセイのユーザーフレンドリーな特性を利用しうる。

本発明の幾つかの態様は、ユビキチン化および脱ユビキチン化のためのジェエネリックなＴＲ−ＦＲＥＴユビキチン試薬セットを利用する。ＴＲ−ＦＲＥＴドナー（テルビウム等）およびアクセプター（フルオレセインまたは蛍光タンパク質等）をユビキチン上に選択的に組み込むことにより、速度論的測定またはエンドポイント測定のいずれにおいても高いＺ’値（＞０．７）を有する正確なＨＴＳアッセイを可能にする、汎用性の高いハイスループットスクリーニングの試薬が得られた。加えて、テルビウムドナー由来のシグナルの時間分解により、化合物ライブラリに存在しうる減色剤および自己蛍光物質による干渉の程度が減少した。本発明の幾つかの態様において、本願明細書ではＴＲ−ＦＲＥＴユビキチンのプラットフォームを、ユビキチンにコンジュゲートして脱ユビキチン化する酵素の特異的阻害剤を同定するための、化合物スクリーニングを高速化する単純でフレキシブルな試薬セットとして提供する。

本発明はまた、製品の提供に関する。キット等の製品には、パッケージ材；ならびに、第１の結合パートナーおよび／または第２の結合パートナーを含めることができ、当該第２の結合パートナーは当該第１の結合パートナーに結合することができる。一態様において、当該結合パートナーは、ルミネッセンス金属錯体または蛍光アクセプター部分を含みうる。一態様において、当該製品は、蛍光ペプチドドメイン（ＧＦＰ等）とユビキチンドメインを有する融合タンパク質を含んでなり、前記ユビキチンドメインはルミネッセンス金属錯体（テルビウム等）に連結されている。

別の局面においては、本発明は組成物の提供に関する。一態様において、当該組成物は、第１の結合パートナー、第２の結合パートナーまたはそれらの混合物でありうる。一態様において、当該結合パートナーは、蛍光アクセプター部分またはルミネッセンス金属キレートを含みうる。一態様において、当該組成物は蛍光ペプチドドメイン（ＧＦＰ等）およびユビキチンドメインを含んでなる融合タンパク質を含んでなり、前記ユビキチンドメインはルミネッセンス金属錯体（テルビウム等）に連結される。

特に定義のない限り、本願明細書に用いる全ての科学技術用語は、本発明の属する技術分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。本発明の実施または試験において、本願明細書の記載と同様または同等の方法および材料を使用できるが、以下に適切な方法および材料を記載する。加えて、材料、方法および実施例は例示のみを目的とし、限定するためのものではない。本願明細書に記載の全ての出版物、特許出願、特許および他の参照は、その全開示内容を援用する。矛盾する場合は、定義を含めて本明細書が優先する。

本発明の１つ以上の態様の詳細を、添付の図面および以下の詳細な説明を参照しながら説明する。本発明の他の特徴、目的および効果は、記載および図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかである。

定義
一般的に、本願明細書に用いる命名法、および本願明細書に記載の蛍光、ルミネッセンス、コンピュータ、検出、化学および実験手順は、当技術分野において共通に用いられる。化学合成、蛍光またはルミネッセンスのモニタリングおよび検出、光学、分子生物学、ならびにコンピュータソフトウェアおよび統合において、標準的な技法が用いられる。化学反応、細胞アッセイおよび酵素反応は、通常は製造メーカーの取扱説明書に従い適切に実施される。一般的に、蛍光の技術については、Ｊ．Ｒ．Ｌａｋｏｗｉｃｚ、Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（全３巻）、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、１９９１年、および、Ｊ．Ｒ．Ｌａｋｏｗｉｃｚ、Ｅｍｅｒｇｉｎｇ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｔｏ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍａｇｉｎｇ：ｌｉｆｅｔｉｍｅ ｉｍａｇｉｎｇ、 ｍｅｔａｌ−ｌｉｇａｎｄ ｐｒｏｂｅｓ、 ｍｕｌｔｉ ｐｈｏｔｏｎ ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｉｇｈｔ ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ、Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｓｃ．Ｓｕｐｐｌ．１０巻、１９９６年、２１３−２４ページ；分子生物学の方法については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、１９８９年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．；細胞生物学の方法については、Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第１版、１９９８年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．；ならびに、一般的な光学の方法については、Ｏｐｔｉｃｓ Ｇｕｉｄｅ、５ Ｍｅｌｌｅｓ Ｇｒｉｏｔ（登録商標） Ｉｒｖｉｎｅ ＣＡ、およびＯｐｔｉｃａｌ Ｗａｖｅｇｕｉｄｅ Ｔｈｅｏｒｙ、Ｓｎｙｄｅｒ＆Ｌｏｖｅ（Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ出版）を参照。これらは全て参照により本願明細書に援用される。

ルミネッセンス材料における種々の蛍光またはルミネッセンスアッセイを実施するための一般的な方法は当業に公知であり、例えば、Ｊ．Ｒ．，Ｌａｋｏｗｉｃｚ、Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、１〜３巻、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、１９９１年；Ｂ．，Ｈｅｒｍａｎ、Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｏｆ Ｌｉｖｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ、 Ｐａｒｔ Ｂ、 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、３０巻掲載）、Ｄ．Ｌ．ＴａｙｌｏｒおよびＹ．−Ｌ．，Ｗａｎｇ編集、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８９年、２１９−２４３ページ；Ｎ．Ｊ．，Ｔｕｒｒｏ、Ｍｏｄｅｒｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｌ， Ｉｎｃ．、１９７８年、２９６−３６１ページ；ならびに、Ｂｅｒｎａｒｄ Ｖａｌｅｕｒ、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”、Ｗｉｌｅｙ、ＶＣＨ、２００２年に記載されている。特定の共鳴アクセプター部分を選択および使用における案内としては、例えば、Ｉ．Ｂ．，Ｂｅｒｌｍａｎ、Ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｏｆ ａｒｏｍａｔｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ａｎｄ Ｌｏｎｄｏｎ、１９７３年に、共鳴エネルギー移動ペアの選択に対するスペクトルの重なり積分の表が含まれている。さらなる情報源としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｃａｔａｌｏｇ（２００３）およびウェブサイト；ならびに、Ｔｓｉｅｎら、１９９０年、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、１６９−１７８ページが含まれる。ＦＰおよび／またはＲＥＴの実施に役立つ計測機器およびＴＲ−ＲＥＴアプリケーションは、Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｔｄ．（スイス）（Ｕｌｔｒａ、Ｕｌｔｒａ ３８４、Ｕｌｔｒａ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ（Ｂｏｓｔｏｎ、米国マサチューセッツ州）（Ｆｕｓｉｏｎ、ＥｎＶｉｓｉｏｎ、Ｖｉｃｔｏｒ Ｖ、およびＶｉｅｗＬｕｘ）、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、米国ニュージャージー州）（ＬｅａｄＳｅｅｋｅｒ）；およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、米国カリフォルニア州）（Ａｎａｌｙｓｔ ＡＤ、ＧＴ、ＨＴ）から入手可能である。

本開示書に厳密に定義していない、一般的に用いられる化学の略語は、Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｓｔｙｌｅ Ｇｕｉｄｅ、第２版、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ、１９９７年、“２００１ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ Ａｕｔｈｏｒｓ”、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、６６巻１号、２４Ａ、２００１年、ならびに、“Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ａｂｂｒｅｖｉａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ”、Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ．Ｓｃｉ．、５巻、４６５−４７１ページ、１９９９年に見られる。

略語：
ｔ−Ｂｏｃ、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル；Ｂｚｌ、ベンジル；ＰＴＫ、タンパク質チロシンキナーゼ；Ｆｍｏｃ、フルオレニルメチルオキシカルボニル；ＥＬＩＳＡ、酵素結合免疫吸着アッセイ；ＦＰ、蛍光偏光；ＦＩＴＣ、フルオレセインイソチオシアネート；ＲＥＴ、共鳴エネルギー移動；ＦＲＥＴ、蛍光共鳴エネルギー移動またはフォースター共鳴エネルギー移動；ＴＲ、時間分解；ＦＡＭ、カルボキシフルオレセイン。

本開示書全体に用いるように、下記用語は、特に明記しない限り次の意味に理解されたい。

用語「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化またはキメラ抗体、単鎖Ｆｖ抗体フラグメント、ＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ）_２フラグメントが包含される。ポリクローナル抗体は、特定の抗原に対する特異性を有する抗体分子の不均一な集合であり、一方で、モノクローナル抗体は抗原に含まれる特定のエピトープに対する抗体の均一な集合である。キメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体由来可変ドメインおよびヒト免疫グロブリン定常ドメインを有するもののように、異なる部分が異なる動物種に由来する分子である。用語「エピトープ」は、抗体が結合する抗原上の抗原決定基を指す。エピトープは、通常、アミノ酸、糖側鎖または化学部分（例えば有機化合物由来）等の化学的に活性な表面群からなり、通常は、特異的な三次元構造の特徴、ならびに特定の電荷特性を有する。エピトープは、一連の隣接するアミノ酸（例えば５つの隣接アミノ酸）から成りうる。他の態様において、エピトープは不連続なエピトープである場合もあり、例えば、エピトープはタンパク質またはポリペプチドの２次構造、３次構造、および／または、４次構造的なフォールディングから生じる、特定の空間的なアミノ酸配置が挙げられる。さらに他の態様において、エピトープは、リン酸化チロシン、セリンまたはトレオニン等の、組み換えアミノ酸側鎖から成りうる。モノクローナル抗体は、特に本発明に有用である。

用語「ＲＥＴ」は共鳴エネルギー移動を意味し、ドナーおよびアクセプター種の間の共鳴相互作用により、原子間よりもかなり長距離にわたって、実質的に熱エネルギー変換を伴わずに、且つドナーおよびアクセプターの力学的衝突を伴わずに、分子内または分子系における吸収サイト（トナー）から利用サイト（アクセプター）へのエネルギー量子の無放射の透過を指す。ドナーは、最初にエネルギー（光学エネルギーまたは電子エネルギー等）を吸収する部分である。本願明細書に記載のように、ルミネッセンス金属錯体は２つのドナーを含みうる。１）光学エネルギー（例えば光量子からの）を吸収する有機アンテナ部分；および、２）電子エネルギー（例えば、有機アンテナ部分から移動する）を吸収するランタニド金属イオン。ＲＥＴは、蛍光共鳴エネルギー移動またはフォースター共鳴エネルギー移動（両方の省略ＦＲＥＴ）と呼ばれることもある。ＦＲＥＴは、蛍光分子間の近接度の検出に使用できる。ドナーの発光スペクトルがアクセプターの励起スペクトルと重複する場合（例えば、テルビウムキレートおよび蛍光タンパク質またはポリペプチドの場合）、分子が近接するとエネルギー移動が起こる。テルビウムキレートの蛍光寿命は長いため、エネルギー移動は、他の蛍光分子からの干渉後に、または散乱光の消失から検出しうる。

用語「アクセプター」は、共鳴エネルギー移動を介してエネルギーを受け取る、化学的または生物学的部分を指す。ＲＥＴアプリケーションにおいて、アクセプターは、ドナー蛍光部分または蛍光としてのルミネッセンス部分から移動（ＲＥＴまたはＴＲ−ＲＥＴ等）したエネルギーを再放出してもよく、「蛍光アクセプター部分」ということである。本願明細書に用いるように、このようなドナー蛍光部分またはルミネッセンス部分、ならびにアクセプター蛍光部分を、「ＲＥＴペア」と呼ぶ。アクセプターの例は、クマリンおよび関連蛍光原子団；フルオレセインおよびフルオレセイン誘導体等のキサンテン；ＧＦＰおよびＧＦＰ誘導体等の蛍光タンパク質；ロドール、ローダミンおよびその誘導体；レゾルフィン；シアニン；ジフロロボラジアザインダセン；およびフタロシアニンを含んでなる。

用語「標識」「標識された」は、本願明細書に記載のように、第１の結合パートナー、第２の結合パートナー、トレーサ、被験化合物、潜在的モジュレータ、基質、または生成物におけるルミネッセンス金属錯体または蛍光アクセプター部分を指す。標識導入の方法は、融合タンパク質としての発現、化学的連結による共有結合的付加、およびビオチン−アビジンまたはＦＫＢＰリガンドおよびＦＫＢＰ、若しくは抗体標的への抗体を介する相互作用等のリガンド−タンパク質ドメインの相互作用等の非共有結合的付加を含んでなる。

用語「調節」は、活性またはプロセスの（速度または効率の減衰等）、部分的または完全な促進または阻害を指す。

用語「モジュレータ」は、生物学的巨大分子（ポリヌクレオチド、タンパク質またはポリペプチド、ホルモン、多糖類、脂質等）、有機分子（低分子有機分子等）、若しくは、細菌、植物、菌または動物（特に、ヒトを含む哺乳類）細胞または組織等の生体試料由来抽出物等の化合物（自然発生または非自然発生）を指す。モジュレータは、生物学的過程または複数の過程の阻害剤または促進剤（アゴニスト、部分的アンタゴニスト、部分的アゴニスト、逆アゴニスト、アンタゴニスト、抗悪性腫瘍薬、細胞毒性剤、腫瘍転化または細胞増殖の阻害剤、等）としての潜在的な活性を評価（直接的または間接的に）してもよい。モジュレータの活性は公知でもよく、未知または部分的に公知でもよい。

用語「非自然発生」は、目標、化合物または化学物質が自然界に見られないことを指す。例えば、自然界の起源から単離可能で、実験室において人の手により意図的に改変されていない生体中（ウィルスを含む）に存在するポリペプチド、タンパク質またはポリヌクレオチドは自然発生であり、一方、人の手により意図的に改変されたそうしたポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、非自然発生である。

用語「有機分子」は、典型的には１００００ダルトン未満の分子量を有し、１以上のＣ、Ｎ、Ｈ、Ｏ、ＳおよびＰ元素の共有結合性の構造を含んでなる分子骨格を有する化合物を指す。５０００ダルトン未満の分子量を有する有機分子は、「低有機分子」と呼んでもよい。

用語「ポリペプチド」は、アミド結合で連結された２以上のアミノ酸ポリマーを指す。ポリペプチドは、タンパク質（自然起源または発現系から単離されたもの等）全体、タンパク質断片、タンパク質またはタンパク質断片の酵素的または化学的合成および／または組み換え版、若しくは新規設計（公知のタンパク質配列に基づかない）のアミノ酸配列でありうる。ポリペプチドは、長さが２−１０００アミノ酸（例えば、長さが２−９００、２−８００、２−７００、２−６００、２−５００、２−４８０、２−４５０、２−３００、２−２００、２−１００、２−５０、２−２５、５−９００、５−８００、５−７００、５−６００、５−５００、５−４５０、５−３００、５−２００、５−１００、５−５０、５−２５、１０−９００、１０−８００、１０−７００、１０−６００、１０−５００、１０−４５０、１０−３００、１０−２００、１０−１００、１０−５０、２０−９００、２０−８００、２０−７００、２０−６００、２０−５００、２０−４５０、２０−３００、２０−２００、２０−１００または２０−５０のアミノ酸）でありうる。アミノ酸は、例えば、ベータアラニン、フェニルグリシン、およびホモアルギニンを含んでなる、天然のアミノ酸でもよく、非天然アミノ酸でもよい。総説としては、Ａ．Ｆ．Ｓｐａｔｏｌａ、ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ、 Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、 Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ編集、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２６７ページ、１９８３年を参照されたい。本発明において使用するアミノ酸は、全てＤ−体またはＬ−体のいずれでもよい。特に、リン酸化（例えば、ホスホセリン（側鎖水酸基へのリン酸化）、ホスホチロシン（側鎖フェニル環ＯＨへのリン酸化）、およびホスホトレオニン（側鎖水酸基へのリン酸化））、硫酸化、メチル化、またはプレニル化アミノ酸を含んでなる、化学的修飾または置換アミノ酸が有用である。

用語「翻訳後修飾」および「翻訳後タイプの修飾」は交換可能に用いられ、タンパク質またはポリペプチド中の１以上のアミノ酸残基の酵素的または非酵素的修飾を指す。定型的な修飾は、リン酸化、脱リン酸化、グリコシル化、メチル化、硫酸化、ユビキチン化、アシル化、アセチル化、プレニル化およびＡＤＰリボシル化を含有する。好適な翻訳後タイプの修飾は、リン酸化および脱リン酸化を含んでなる。翻訳後修飾という用語は、ポリペプチド−ポリペプチド相互作用、若しくは、リガンド、アロステリックモジュレータ、他のモジュレータ、またはカルシウム、ｃＡＭＰ、またはリン酸イノシトール等の第２のメセンジャの結合等の、タンパク質またはポリペプチド活性、構造または機能に影響しうる非共有結合性の修飾を含んでなる。

用語「被験化合物」は、例えばキナーゼ活性等の酵素活性のモジュレータが推測される場合にこれを計測するための、本発明の１以上のスクリーニング法により試験される化合物を指す。被験化合物は、無機化合物、有機分子、タンパク質またはポリペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、多糖類、脂質、リン脂質またはこれらの組み合わせ等の、任意の化学物質でありうる。通常は、被験化合物の様々な予め定められた濃度（例えば様々な希釈度）が、ふるい分け（例えばマイクロモル濃度の０．０１、マイクロモル濃度の１またはマイクロモル濃度の１０）のために使われる。被験化合物に対する実験上の対照は、被験化合物なしに実行するアッセイに対してシグナルを測定するか、または、標的の活性を変調することが公知である化合物を用いて得られるシグナルと、被験化合物を有して得られるシグナルとを比較することを含んでなる。被験化合物は、実質的に、または、部分的に精製された細胞溶解物でありうる。

用語「ユビキネーション」および「ユビキチン化」は交換可能に用いられる。

キナーゼアッセイ
ＴＲ−ＦＲＥＴキナーゼアッセイは、しばしば蛍光原子団で標識されたペプチド基質を用いて実施される。チロシンキナーゼによってはこの種の基質をリン酸化するが、多くは（セリン／トレオニンキナーゼ等）この種の基質に対して弱い活性を示し、未変性タンパク質基質に対してより高い活性を示す。発明者らは、蛍光タンパク質（ＧＦＰ等）融合として未変性タンパク質キナーゼ基質を発現することにより、受け入れないかまたは作用効率の低いペプチド系の基質に対しても強力なキナーゼアッセイを開発した。このようなアッセイは、「難しい」キナーゼのルーチン分析を可能にし、基質上で作用する（キナーゼそれ自体よりもむしろ「ドッキング」サイトに実質的に結合する等）化合物の同定に有用である。本発明の一実施例は、基質の蛍光ポリペプチド融合を用いてキナーゼ活性を検定する方法の提供に関する。一態様において、本発明は、ＧＦＰ融合基質を用いるてキナーゼ活性を検定する方法の提供に関する。基質部分は、ポリペプチド配列、タンパク質またはタンパク質ドメインでありうる。一態様において、タンパク質またはタンパク質ドメインは、リン酸化のための部位を含んでなる。本発明の幾つかの態様において、２０を超える残基のＧＦＰ融合タンパク質が、基質として使われる。このような基質は、細菌または昆虫細胞中に遺伝子組み換えで産出しうる。こうしたより大きな基質（全タンパク質またはタンパク質ドメイン）は、「生理学的に関連」しうる（例えば、それらは生物学的に関連した経路のキナーゼの「天然型」基質でありうる）。このように、本発明は低分子ペプチド基質に限定しないため、本発明は検定可能なキナーゼ数を増加し、キナーゼ活性研究の潜在な生物学的関連性を増加させうる。

図２８に、本発明の蛍光タンパク質系ＴＲ−ＦＲＥＴキナーゼアッセイを示す。当該キナーゼのタンパク質基質（またはリン酸化部位を含むその断片）は、蛍光タンパク質（ＧＦＰ等）の融合として産出する。基質がリン酸化される場合は、これはリン酸化基質に対する特異的抗体と結合しうる。一態様において、この抗体は、蛍光タンパク質／ペプチドを有するＲＥＴパートナーとして作用可能で、基質融合タンパク質の一部である、蛍光および／またはルミネッセンス標識で標識される。本発明の幾つかの局面において、抗体はランタニド金属で標識される。幾つかの態様において、ランタニド金属はテルビウムまたはユーロピウムである。本発明の幾つかの局面において、抗体は特異的に非リン酸化基質に結合する。この場合、より多くの基質がリン酸化されるに従いＲＥＴシグナルは減少する。リン酸化基質に対して抗体が特異性である場合は、より多くの基質がリン酸化されるに従いＦＲＥＴシグナルは増加する。本発明の幾つかの局面において、ＴＲ−ＦＲＥＴシグナルを測定する。

蛍光標識は、例えば、Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）またはＧＦＰ変異種と互換の蛍光タンパク質またはポリペプチドでありうる。基質タンパク質またはポリペプチドは、遺伝子組み換え的に発現してもよく、ＧＦＰタンパク質またはポリペプチドを有する融合として単離されてもよい。基質タンパク質またはポリペプチドは、細胞中で発現し、次いで細胞溶解物から未精製の形態で用いられてもよく、実質的に純粋な形態で用いられてもよい。一態様において、キナーゼによりリン酸化された基質は、ランタニド金属錯体（Ｔｂ含有等）で標識されたリン酸特異的標識抗体により認識される。この関連は、テルビウムおよび蛍光標識の間のＲＥＴ増加により検出される。本発明は、酵素活性（キナーゼのもの等）評価に使用できる。キナーゼおよび／またはキナーゼのタンパク質基質は、精製されるか、または細胞溶解物等の複合体マトリクス中に存在しうる。さらに、本発明は、精製キナーゼまたは被験化合物を含んでなる細胞の処理後等、酵素活性に影響する化合物の能力の評価に使用できる。幾つかの態様において、アッセイは、細胞により発現したキナーゼ基質融合タンパク質を有する細胞系である。

非放射性キナーゼアッセイの大部分は、約２０残基以下の化学合成ペプチド基質のリン酸化に依存する。このアッセイフォーマットは、例えば、基質として２０残基を超えるＧＦＰ融合タンパク質を使用する。

本発明の一態様において、基質は細菌または昆虫細胞中に遺伝子組み換えで産出しうる。こうしたより大きな基質（全タンパク質またはタンパク質ドメイン）は、「生理学的に関連」しうる（例えば、それらは生物学的に関連した経路のキナーゼの「未変成」基質でありうる）。キナーゼアッセイの熟練ユーザの多くにとっての好適な特徴は、「未変成」基質を用いることである。例えば、リン酸化のためにリン酸化部位からはるかに離れた「ドッキング」部位を必要とするキナーゼが知られている。多くの場合、より低分子のペプチド基質は基質として機能しない場合がある。関連アッセイフォーマットおよび組成物の実施例としては、図９を参照されたい。幾つかの態様において、「未変成」基質またはその断片は、蛍光ポリペプチドを含んでなる融合として発現する。

本発明の一実施例は、ａ）化合物および融合タンパク質を接触させて被験試料を生成する段階であって、ここに、融合タンパク質は蛍光タンパク質またはポリペプチドおよびキナーゼ基質ポリペプチドを含んでなる段階と；ｂ）前記融合タンパク質をルミネッセンス金属錯体で標識された結合分子と接触させる段階であって、ここに、前記結合分子は非リン酸化基質またはリン酸化基質と特異的に結合する段階と；前記被験試料を光（例えば、２５０ｎｍから７５０ｎｍまで範囲の波長を有する）に曝露し、前記被験試料からの蛍光放射を測定する段階、を含んでなる、化合物のキナーゼ活性を測定する方法の提供に関する。

本発明の他の態様は、ａ）キナーゼおよび融合タンパク質を接触させて被験試料を生成させる段階であって、ここに、融合タンパク質は蛍光タンパク質またはポリペプチドおよびキナーゼ基質ポリペプチドを含んでなり、前記接触は前記キナーゼ活性の潜在的モジュレータの存在下で実施される段階と；ｂ）前記融合タンパク質をルミネッセンス金属錯体で標識された結合分子と接触させる段階であって、ここに、前記結合分子は非リン酸化基質またはリン酸化基質と特異的に結合する段階と；ｃ）前記被験試料を光（例えば、２５０ｎｍから７５０ｎｍまで範囲の波長を有する）に曝露し、前記被験試料からの蛍光放射を測定する段階、を含んでなる、キナーゼ活性モジュレータを同定するための方法の提供に関する。

本発明の他の態様は、ａ）化合物および少なくとも１つの融合タンパク質を接触させて被験試料を生成させる段階であって、ここに、融合タンパク質は蛍光タンパク質またはポリペプチドおよびキナーゼ基質ポリペプチドを含んでなる段階と；ｂ）融合タンパク質をルミネッセンス金属錯体で標識された結合分子と接触させる段階であって、ここに、前記結合分子は非リン酸化基質またはリン酸化基質と特異的に結合する段階と；ｃ）被験試料を少なくとも１つの波長の光に曝露する段階と；ｄ）被験試料からの蛍光放出を測定する段階、を含んでなる、少なくとも１つの化合物のキナーゼ活性を測定する方法を提供する。

幾つかの態様において、キナーゼは細胞溶解物から測定される。細胞溶解物は粗製、部分的に精製されたまたは実質的に精製された細胞溶解物でありうる。実質的な精製は、約９５％の純度を指す。幾つかの態様において、キナーゼ（または本発明の特定の態様による他の酵素、例えば脱ユビキチン化酵素またはユビキチン化酵素）は、約９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９９、９９．９または１００％の純度であり、例えば９０％〜９９．９％、９３％〜９９．９％、９５％〜９９．９％または９０％〜９６％の純度である。幾つかの態様において、酵素は、細胞破片の除去のため遠心分離された細胞溶解物に由来する。幾つかの態様において、酵素は、例えば細胞溶解物中、または生成中の分解を減らすために、少なくとも１つのプロテアーゼインヒビターの存在下にある。

本発明の他の態様は、ａ）キナーゼおよび融合タンパク質を接触させて被験試料を生成させる段階であって、ここに、融合タンパク質は蛍光タンパク質またはポリペプチドおよびキナーゼ基質ポリペプチドを含んでなり、接触はキナーゼ活性の少なくとも１つの潜在的モジュレータの存在下で実施される段階と；ｂ）融合タンパク質をルミネッセンス金属錯体で標識された結合分子と接触させる段階であって、ここに、結合分子は非リン酸化基質またはリン酸化基質と特異的に結合する段階と；ｃ）被験試料を少なくとも１波長の光に曝露する段階と；ｄ）被験試料からの蛍光放出を測定する段階、を含んでなる、キナーゼ活性のモジュレータを同定するための方法を提供する。

本発明の他の態様は、ａ）少なくとも１つの化合物および少なくとも１つの融合タンパク質を接触させて被験試料を生成させる段階であって、ここに、融合タンパク質は蛍光タンパク質またはポリペプチドおよびキナーゼ基質ポリペプチドを含んでなる段階と；ｂ）キナーゼ活性に適切な条件下で被験試料をインキュベートする段階と；ｃ）（ｂ）の前で、期間中に、後で、被験試料をルミネッセンス金属錯体で標識された結合分子と接触させる段階であって、ここに、前記結合分子は非リン酸化基質またはリン酸化基質を含有する少なくとも１つの融合タンパク質と特異的に結合し、蛍光ポリペプチドおよび標識はＲＥＴペアである段階と；ｄ）被験試料を少なくとも１つの波長の光に曝露する段階と；ｅ）被験試料からの蛍光放出を測定する段階、を含んでなる、少なくとも１つの化合物のキナーゼ活性を測定する方法を提供する。

本発明の他の態様は、ａ）少なくとも１つの化合物、少なくとも１つのキナーゼ、および少なくとも１つの融合タンパク質を接触させて被験試料を生成させる段階であって、ここに、融合タンパク質は蛍光タンパク質またはポリペプチドおよびキナーゼ基質ポリペプチドを含んでなる段階と；ｂ）キナーゼ活性に適切な条件下で被験試料をインキュベートする段階と；ｃ）（ｂ）の以前、期間中、以後に、被験試料をルミネッセンス金属錯体で標識された結合分子と接触させる段階であって、ここに、前記結合分子は非リン酸化基質またはリン酸化基質を含有する少なくとも１つの融合タンパク質と特異的に結合し、蛍光ポリペプチドおよび標識はＲＥＴペアである段階と；ｄ）被験試料を少なくとも１つの波長の光に曝露する段階と；ｅ）被験試料からの蛍光放出を測定する段階、を含んでなる、少なくとも１つの化合物がキナーゼ活性を調節するかどうかを計測する方法を提供する。

本発明の他の態様は、以下を含んでなる製品を提供する。ａ）パッケージ材料と；ｂ）蛍光タンパク質またはポリペプチドおよびキナーゼ基質ポリペプチドを含んでなる、少なくとも１つの融合タンパク質と；ｃ）ルミネッセンス金属錯体で標識された少なくとも１つの結合分子。本発明の他の態様は、以下を含んでなる融合タンパク質を提供する。ｉ）蛍光タンパク質またはポリペプチドと；ｉｉ）キナーゼ基質ポリペプチド。

本発明の他の態様は、以下を含んでなる製品を提供する。ａ）パッケージ材料と；ｂ）蛍光タンパク質またはポリペプチドおよびキナーゼ基質ポリペプチドを含んでなる、少なくとも１つの融合タンパク質と；ｃ）錯体を含んでなる少なくとも１つの結合分子であって、ここに蛍光ポリペプチドおよび標識はＲＥＴペアである。

一態様において、蛍光タンパク質またはポリペプチドは、ＧＦＰである。幾つかの態様において、蛍光タンパク質またはポリペプチドは、本願明細書に記載のように、任意の蛍光ポリペプチド配列のアミノ酸配列である、蛍光ポリペプチドである。幾つかの態様において、蛍光タンパク質またはポリペプチドは、本願明細書に記載のように、任意の蛍光ポリペプチド配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の相同性のアミノ酸配列を有する蛍光ポリペプチドである。一態様において、ルミネッセンス金属錯体は、テルビウムを含んでなる。一態様において、結合分子は抗体または抗体フラグメントである。一態様において、結合分子は、融合タンパク質の非リン酸化形態に結合する。一態様において、結合分子は、融合タンパク質のリン酸化形態に結合する。一態様において、ルミネッセンス金属錯体は、有機アンテナ部分、金属連結部分およびテルビウム金属イオンを含んでなる。一態様において、ルミネッセンス金属錯体は、Ｔｂ（ＩＩＩ）を含んでなる。一態様において、ルミネッセンス金属錯体は、有機アンテナ部分、金属連結部分およびテルビウム金属イオンを含んでなる。一態様において、ルミネッセンス金属錯体は、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＴＴＨＡ、ＤＯＴＡ、ＮＴＡ、ＨＤＴＡ、ＤＴＰＰ、ＥＤＴＰ、ＨＤＴＰ、ＮＴＰ、ＤＯＴＰ、ＤＯ３Ａ、ＤＯＴＡＧＡおよびＮＯＴＡからなる群から選ばれる金属キレート部分を含んでなる。一態様において、化合物は細胞溶解物中にある。一態様において、化合物は実質的に精製される。一態様において、潜在的モジュレータは細胞溶解物中にある。一態様において、潜在的モジュレータは、実質的に精製される。一態様において、化合物はキナーゼ酵素である。一態様において、キナーゼ酵素は細胞溶解物中にある。一態様において、キナーゼは精製される。一態様において、融合タンパク質は実質的に精製される。一態様において、融合タンパク質は細胞溶解物中にある。一態様において、被験試料からの蛍光放射測定は、時間分解蛍光測定を含んでなる。一態様において、方法はさらにキナーゼおよび融合タンパク質を接触させて対照試料を生成する段階を含んでなり、ここに、キナーゼ活性の潜在的モジュレータ濃縮は被験試料の濃度未満である。他の態様において、キナーゼ活性の潜在的モジュレータは、対照試料には無い。一態様において、蛍光放出測定は比率計測を含んでなる。

ルミネッセンス金属錯体を用いるほとんどの場合において、これは、アクセプター部分（フルオレセインまたはＧＦＰ）と共にＲＥＴペアを生成する任意のドナー部分に置き換えうるものと理解される。

Ｒｉｄｄｌｅら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２００６年、３５６巻、１号、１０８−１１６ページも参照されたい。

脱ユビキネーションアッセイ
本発明の他の態様は、脱ユビキチン化酵素（ＤＵＢ）活性の高感度検出を可能にする、タンパク質系基質を伴うＴＲ−ＲＥＴの使用を提供する。本発明の方法は、標準的なＲＥＴ（共鳴エネルギー移動）時間分解共鳴エネルギー移動（ＴＲ−ＲＥＴ）の両者の利用を可能にする。例えば、ＴＲ−ＲＥＴまたはＲＥＴを用いることにより、例えばモジュレータ、活性剤または阻害剤のスクリーニングにおける使用等、この種の酵素活性の高感度検出が可能になる。ＴＲ−ＲＥＴを用いることは、アッセイシグナルが強力で被験化合物からの干渉に対して抵抗性であるため、ハイスループットスクリーニングにおいて特に便利である。ユビキチン等の全タンパク質（またはドメイン）を含むインタクトなタンパク質基質を用いることにより、通常のペプチド系基質では不可能な場合もあるＤＵＢ活性の高感度測定が可能になる。本発明は、脱ユビキチン化酵素により切断されるアミノ酸配列等の、脱ユビキチン化ドメイン（例えば、脱ユビキチン化タンパク質またはポリペプチド基質）を含んでなるタンパク質断片またはペプチドの使用も含んでなる。さらに、緑色蛍光タンパク質等の遺伝子コードされた蛍光原子団を用いることにより、標識基質の容易な生産が可能になる。本願明細書に記載の方法において用いる適切な組成物も、組成物の混合物を含み、記載する。

本発明の幾つかの態様は、多くのプロテアーゼは特異的なアミノ酸配列を切断するが、アミノ酸配列中の遠方の基質を認識し、これにより通常の短いペプチド基質よりもむしろフォールディングされたタンパク質基質を優先的に切断するという事実に基づく。プロテアーゼ認識部位は、ユビキチン、ユビキチン様タンパク質（例えばＳＵＭＯ）、Ｎｅｄｄ８、ＩＳＧ１５または他のものにありうる。

一態様において、ＤＵＢ活性の測定および検出は、共有結合付加したドナーおよびアクセプター蛍光原子団の両者を有するタンパク質基質を用いて行われうる。一態様において、方法は、共有結合付加した１つのドナーまたはアクセプター蛍光原子団のいずれかを有するタンパク質基質、ならびにこれが結合パートナーに会合してもたらされる他のタンパク質基質を用いて行われうる。同様に、ドナーおよびアクセプター蛍光原子団は、結合パートナ上に存在しうる。例えば、図１０および１１を参照されたい。幾つかの態様において、ドナーおよびアクセプター蛍光原子団は、標準的な有機蛍光原子団、ルミネッセンス分子、ランタニドキレートまたは遺伝子コードされた蛍光タンパク質またはポリペプチドでありうる。結合パートナーは、抗体、ストレプトアビジン、蛍光原子団（トレーサ）に付加した低分子、または他の分子でありうるが、これらに限定しない。一態様において、蛍光原子団は、インタクトな基質でＲＥＴが起きるように選択される。しかしながら、ユビキチンに特有のタンパク質（例えばＤＵＢまたはＤＣＥ）の切断後は、ＲＥＴは乱される。本発明の幾つかの態様は、テルビウムキレートおよび適切なアクセプター蛍光原子団（ＧＦＰ等）を使用する。本発明の幾つかの態様は、テルビウム標識がしたユビキチンを利用する。一態様において、テルビウムは、システイン残基または複数残基への付加を介して標識される。システイン残基は、ユビキチンに自然に見出されるシステイン残基でもよく、ユビキチンタンパク質に遺伝子工学されるシステイン残基でもよい。本発明の幾つかの態様は、テルビウムキレートで標識された遺伝子工学されたシステイン残基を含んでなる、短いＣ−末端延長を伴う、ユビキチンのＮ−末端融合を利用する。これらの態様において、インタクトな基質のＦＲＥＴ強度は高いが、ＤＵＢ依存またはＤＣＥ依存の切断は、ＦＲＥＴ強度を低下させる。種々の基質および本発明の方法の例は、図１１を参照されたい。

一態様において、本発明は、ａ）化合物および融合タンパク質を接触させて被験試料を生成させる段階であって、ここに融合タンパク質はｉ）蛍光タンパク質またはポリペプチドと；ｉｉ）脱ユビキチン化酵素ポリペプチド基質と；ｉｉｉ）ルミネッセンス金属錯体を含んでなり、ここにｉｉ）はｉ）およびｉｉ）の間に位置する段階と；ｂ）前記被験試料をある波長を有する光（例えば、２５０ｎｍから７５０ｎｍの範囲）に曝露し、前記被験試料からの蛍光発光を測定する段階、を含んでなる、化合物の脱ユビキチン化活性を測定する方法を提供する。

本発明の他の態様は、ａ）脱ユビキチン化化合物および融合タンパク質を接触させて被験試料を生成する段階であって、前記接触は前記キナーゼ活性の存在下において実施され、ここに融合タンパク質は、ｉ）蛍光タンパク質またはポリペプチドと；ｉｉ）ユビキチンまたはユビキチン様タンパク質またはポリペプチドと；ｉｉｉ）ルミネッセンス金属錯体を含んでなり、ここにｉｉ）はｉ）およびｉｉｉ）の間に位置する段階と；ｃ）前記被験試料をある波長を有する光（例えば、２５０ｎｍから７５０ｎｍの範囲）に曝露し、前記被験試料からの蛍光発光を測定する段階、を含んでなる、脱ユビキチン化活性のモジュレータを同定する方法を提供する。

本発明の他の態様は、ａ）化合物および融合タンパク質を接触させて被験試料を生成させる段階であって、ここに融合タンパク質は、ｉ）蛍光タンパク質またはポリペプチドと；ｉｉ）脱ユビキチン化酵素ポリペプチド基質と；ｉｉｉ）ルミネッセンス金属錯体を含んでなり、脱ユビキチン化酵素ポリペプチド基質の切断により（ｉ）と（ｉｉｉ）の間の共鳴エネルギー移動は減少する段階と；ｃ）前記被験試料を少なくとも１つの波長に曝露する段階と、ｄ）被験試料からの蛍光発光を測定する段階、を含んでなる、少なくとも１つの化合物の脱ユビキチン化活性を測定する方法を提供する。一態様において、少なくとも１つの化合物は、脱ユビキチン化酵素である。

本発明の他の態様は、ａ）化合物および少なくとも１つの融合タンパク質を接触させて被験試料を生成させる段階であって、ここに少なくとも１つの融合タンパク質は、ｉ）蛍光ポリペプチドと；ｉｉ）脱ユビキチン化酵素ポリペプチド基質；ｉｉｉ）標識を含んでなり、ここに蛍光ポリペプチドおよび標識はＲＥＴペアであり、脱ユビキチン化酵素ポリペプチド基質の切断により（ｉ）と（ｉｉｉ）の間の共鳴エネルギー移動は減少する段階と；ｂ）前記被験試料を少なくとも１つの波長に曝露する段階と、ｃ）被験試料からの蛍光発光を測定する段階、を含んでなる、少なくとも１つの化合物の脱ユビキチン化活性を測定する方法を提供する。

本発明の他の態様は、ａ）少なくとも１つの化合物、少なくとも１つの脱ユビキチン化酵素、および少なくとも１つの融合タンパク質を接触させて被験試料を生成させる段階であって、ここに融合タンパク質は、ｉ）蛍光ポリペプチドと；ｉｉ）脱ユビキチン化酵素ポリペプチド基質；ｉｉｉ）標識を含んでなり、ここに蛍光ポリペプチドおよび標識はＲＥＴペアであり、脱ユビキチン化酵素ポリペプチド基質の切断により（ｉ）と（ｉｉｉ）の間の共鳴エネルギー移動は減少する段階と；ｂ）前記被験試料を少なくとも１つの波長に曝露する段階と、ｃ）被験試料からの蛍光発光を測定する段階、を含んでなる、少なくとも１つの化合物が脱ユビキチン化活性を調節するかどうかを計測する方法を提供する。

本発明の他の態様は、ａ）少なくとも１つの脱ユビキチン化酵素および少なくとも１つの融合タンパク質を、脱ユビキチン化酵素活性の潜在的モジュレータの存在下で接触させて被験試料を形成する段階であって、ここに融合タンパク質は、ｉ）蛍光タンパク質またはポリペプチドと；ｉｉ）脱ユビキチン化酵素ポリペプチド基質と；ｉｉｉ）ルミネッセンス金属錯体を含んでなり、少なくとも１つの脱ユビキチン化酵素の切断により（ｉ）と（ｉｉｉ）の間の共鳴エネルギー移動は減少する段階と；ｃ）被験試料を少なくとも１つの波長に曝露する段階と、ｄ）被験試料からの蛍光発光を測定する段階、を含んでなる、少なくとも脱ユビキチン化活性のモジュレータを同定する方法を提供する。

本発明の他の態様は、ａ）パッケージ材料と；ｂ）ｉ）蛍光タンパク質またはポリペプチドと；ｉｉ）脱ユビキチン化酵素ポリペプチド基質と；ｉｉｉ）ルミネッセンス金属錯体を含んでなる少なくとも１つの融合タンパク質であって、ここに、少なくとも１つの脱ユビキチン化酵素の切断により（ｉ）と（ｉｉｉ）の間の共鳴エネルギー移動は減少するもの、を含んでなる製品を提供する。本発明の他の態様は、ａ）パッケージ材料と；ｂ）ｉ）蛍光ポリペプチドと；ｉｉ）脱ユビキチン化酵素ポリペプチド基質と；ｉｉｉ）標識を含んでなる少なくとも１つの融合タンパク質であって、ここに、蛍光ポリペプチドおよび標識はＲＥＴペアであり、脱ユビキチン化酵素ポリペプチド基質の切断により、（ｉ）と（ｉｉｉ）の間の共鳴エネルギー移動は減少するもの、を含んでなる製品を提供する。

一態様において、前記製品はさらに少なくとも１つの脱ユビキチン化酵素を含んでなる。一態様において、前記脱ユビキチン化酵素は、ＰＯＨ１（別名Ｒｐｎ１１）；ＵＣＨＬ３；ユビキチンカルボキシル末端エステラーゼＬ１（ＵＣＨＬ１）；ＳＵＭＯ１／セントリン特異的プロテアーゼ１（ＳＥＮＰ１）；ユビキチンカルボキシル末端エステラーゼＬ１（ＵＣＨＬ１）；ユビキチン特異プロテアーゼ１（ＵＳＰ１）；ユビキチン特異プロテアーゼ１０（ＵＳＰ１０）；ユビキチン特異プロテアーゼ１２（ＵＳＰ１２）；ユビキチン特異プロテアーゼ１４（ＵＳＰ１４）；ユビキチン特異プロテアーゼ１５（ＵＳＰ１５）；ユビキチン特異プロテアーゼ１６（ＵＳＰ１６）；ユビキチン特異プロテアーゼ１８（ＵＳＰ１８）；ユビキチン特異プロテアーゼ２（ＵＳＰ２）；ユビキチン特異プロテアーゼ２８（ＵＳＰ２８）；ユビキチン特異プロテアーゼ３（ＵＳＰ３）；ユビキチン特異プロテアーゼ３０（ＵＳＰ３０）；ユビキチン特異プロテアーゼ３３（ＵＳＰ３３）；ユビキチン特異プロテアーゼ４（ＵＳＰ４）；ユビキチン特異プロテアーゼ４４（ＵＳＰ４４）；ユビキチン特異プロテアーゼ４５（ＵＳＰ４５）；ユビキチン特異プロテアーゼ４６（ＵＳＰ４６）；およびユビキチン特異プロテアーゼ４９（ＵＳＰ４９）；ならびに、ユビキチン特異プロテアーゼ５（イソペプチダーゼＴ）（ＵＳＰ５）。からなる群から選択される；

幾つかの態様において、ＤＵＢは、細胞溶解物から測定される。細胞溶解物は粗製、部分的に精製されたまたは実質的に精製された細胞溶解物でありうる。実質的な精製は、約９５％の純度を指す。幾つかの態様において、ＤＵＢは、約９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９９、９９．９または１００％の純度であり、例えば９０％〜９９．９％、９３％〜９９．９％、９５％〜９９．９％または９０％〜９６％の純度である。幾つかの態様において、酵素は、細胞破片の除去のため遠心分離された細胞溶解物に由来する。幾つかの態様において、酵素は、例えば細胞溶解物中、または生成中の分解を減らすために、少なくとも１つのプロテアーゼインヒビターの存在下にある。

本発明の他の態様は、ｉ）蛍光タンパク質またはポリペプチドと；ｉｉ）脱ユビキチン化酵素ポリペプチド基質と；ｉｉｉ）ルミネッセンス金属錯体を含んでなる融合タンパク質を提供し、ここに、少なくとも１つの脱ユビキチン化酵素の切断により（ｉ）および（ｉｉｉ）の間の共鳴エネルギー移動は減少する。本発明の幾つかの態様は、テルビウムキレートで標識された遺伝子工学的システイン残基を含んでなる短いＣ末端延長を有する、ユビキチンＮ末端の蛍光タンパク質（ＧＦＰ等）融合を含んでなる。幾つかの態様において、インタクトな基質はＦＲＥＴを示すが、ＤＵＢに依存する切断によりＦＲＥＴは減少する。本発明の他の態様は、ｉ）蛍光ポリペプチドと；ｉｉ）脱ユビキチン化酵素ポリペプチド基質と；ｉｉｉ）標識を含んでなる融合タンパク質を提供し、ここに、前記蛍光ポリペプチドおよび前記標識はＲＥＴペアであり、前記脱ユビキチン化酵素ポリペプチド基質の切断により（ｉ）および（ｉｉｉ）の間の共鳴エネルギー移動は減少する。

一態様において、化合物は、脱ユビキチン化酵素である。一態様において、脱ユビキチン化酵素ポリペプチド基質は、ユビキチンタンパク質またはポリペプチド、ユビキチン様ポリペプチド、タンパク質またはその断片である。一態様において、被験試料からの蛍光発光の測定は、比率測定の計測を含んでなる。一態様において、方法はさらに、脱ユビキチン化および融合タンパク質を接触させて対照試料を生成する段階を含んでなり、ここに、脱ユビキチン化活性の潜在的モジュレータの濃度は被験試料における濃度よりも低い。他の態様では、脱ユビキチン化活性の潜在的モジュレータは、対照試料には無い。一態様において、蛍光放出測定は、比率測定の計測を含んでなる。

ユビキチン化のための種々のアッセイおよび方法を本願明細書に記載する。これらのユビキチン化アッセイおよび方法は、本願明細書に記載の脱ユビキチン化アッセイと組み合わせてもよく、結合してもよい。例えば、細胞系（例えば生細胞）アッセイおよび方法は本願明細書に記載されている。一態様において、融合タンパク質は細胞中に発現し、ここに融合タンパク質は標識（ＧＦＰ等）およびユビキチン化基質を含んでなる。この種のアッセイまたは方法は、本発明の脱ユビキチン化アッセイに結合しうる。一態様において、融合タンパク質はユビキチン化が生じる条件下において細胞中に発現し、次いで細胞は可溶化され、ユビキチン化融合タンパク質を脱ユビキチン化アッセイおよび本願明細書に記載の方法に使用できる。

他の態様では、融合タンパク質は、ユビキチン化が生じる条件下で、細胞中に発現しうる。次いで、細胞を、関心化合物および／または条件に曝露する。幾つかの態様において、次いで細胞を溶解し、本願明細書に記載のように、例えば、いくつかの細胞系ユビキチン化アッセイにおける記載のように、ユビキチン化／脱ユビキチン化を測定する。例えば、次いで細胞溶解物を、ユビキチン化される基質またはユビキチン化されない基質に優先的に結合する標識結合パートナーと接触させうる。幾つかの態様において、標識結合パートナーは、融合タンパク質の標識（ＧＦＰ等）と互換性のあるＲＥＴパートナー（例えば、テルビウムを含んでなる）で標識される。幾つかの態様において、標識結合パートナーは、ユビキチンまたはユビキチン様タンパク質（例えば、抗ユビキチンまたは抗ポリユビキチン）に結合する。幾つかの態様において、標識結合パートナーは、ポリユビキチン（例えば、抗ポリユビキチン）に結合する。幾つかの態様において、標識結合パートナーはユビキチン化されない基質に優先的に結合し、例えばユビキチン化によりＲＥＴ測定値は減少する。

幾つかの態様における、本発明の脱ユビキチン化アッセイおよび方法、蛍光タンパク質およびユビキチン融合タンパク質等の、標識としての蛍光タンパク質。幾つかの態様において、蛍光タンパク質は、ＧＦＰである。幾つかの１態様において、蛍光タンパク質は、ＹＦＰである。幾つかの態様において、融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列を含んでなる：

幾つかの態様において、融合タンパク質は、アミノ酸配列「ＡＣ」がＣ末端に付加されるアミノ酸配列を以前に含んでなる。幾つかの態様においてて、融合タンパク質は、本願明細書に記載の蛍光ポリペプチドに対して、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなる。幾つかの態様において、融合タンパク質は、ヒスチジンタグ等のタグを含まない。

本節では、一般的に、本発明の例示的な態様としての脱ユビキチン化を参照する。本発明は、基質にＳＵＭＯタンパク質を用いるプロテアーゼ等の、任意のプロテアーゼを利用する同様のアッセイおよび方法を提供する。換言すれば、本願明細書に記載の方法およびアッセイは、ＳＵＭＯ特異的プロテアーゼおよびＳＵＭＯタンパク質等、脱ユビキチン化アッセイ代替の別のタンパク質、およびユビキチン代替の別の基質タンパク質を用いても実施しうる。幾つかの態様において、ＳＵＭＯ特異的プロテアーゼは、Ｕｌｐ（例えば、カタログ番号１２５８８−０１８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、米国カリフォルニア州））である。ＳＵＭＯタンパク質を含む融合タンパク質は、本発明のアッセイおよび方法に遺伝子組み換えとして提供されうる。例えば、ＳＵＭＯタンパク質に対する融合として関心タンパク質を発現するために、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から入手可能なＣｈａｍｐｉｏｎ（商標）ｐＥＴ ＳＵＭＯ発現ベクター（カタログ番号Ｋ３００−０１）を使用できる。幾つかの態様において、ＳＵＭＯ融合タンパク質は、ポリヒスチジンタグを含んでなる。

Ｈｏｒｔｏｎら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００６年８月１０日（オンラインで入手可能）、ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｂ．２００６．０６．０３１．も参照されたい。

ユビキネーションおよびユビキネーション様酵素
ユビキネーション酵素は、Ｅ１、Ｅ２およびＥ３酵素を含んでなるが、これらに限定しない。Ｅ１およびＥ２は構造的に相関し、十分に特性分析された酵素である。Ｅ２には様々な分子種があり、そのいくつかは特定のＥ３酵素と共に好適なペアの状態で作用し、種々のタンパク質に対する特異性を供与する。Ｅ３酵素は、２つの別々の作用、すなわち、ユビキチンを基質にコンジュゲートさせ、イソペプチド結合を介してポリユビキチン鎖を生成するユビキチンリガーゼ活性、および、リガーゼおよび基質を物理的に一体化するターゲッティング活性を含んでなる。種々のＥ３酵素の基質特異性は、ユビキチンに依存するタンパク質分解プロセスの選択性における主要な決定要因である。

特徴付けられるＥ３リガーゼは、ＨＥＣＴ（Ｅ６−ＡＰカルボキシ末端に対して相同）タンパク質ドメインを含んでなり、腫瘍サプレッサｐ５３のためのユビキチンリガーゼとして機能する、哺乳類のＥ６ＡＰ−Ｅ６複合体により表され、子宮頸癌においてはパピローマウィルスにより活性化される（Ｈｕａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８６巻、１３２１−２６ページ、１９９９年）。１つのよく特性分析されたＥ３リガーゼはＡＰＣ（分裂後期を促進する複合体）であり、これは分裂後期への進行ならびに有糸核分裂からの脱出への両方に関与するマルチサブユニット複合体である（概要は、Ｋｉｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４巻、１６５２−５９ページ、１９９６年を参照）。ＡＰＣにより分解されることが公知のタンパク質の大部分は、ユビキチン化とそれに続く分解の標的となる「破壊ボックス」として知られる、保存された９つのアミノ酸モチーフを含む。しかしながら、Ｇ１サイクリン、ＣＤＫ阻害剤、転写因子およびシグナリング中間体を含んでなる、Ｇ１期間に分解されるタンパク質は、この保存されたアミノ酸モチーフを含まない。代わりに、ユビキチン化のためのＥ３リガーゼとの相互作用を標的にすることにおいては、基質リン酸化が重要な役割を果たすようである。（Ｈｅｒｓｈｋｏら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６７巻、４２９−７５ページ、１９９８年を参照されたい。）

Ｅ３複合体は、ユビキチンに依存するタンパク質分解過程によるタンパク質分解の重要な決定要因であるため、Ｅ３リガーゼ活性のモジュレータは、細胞情報伝達に関与する特定の分子をアップレギュレートまたはダウンレギュレートするために使用できる。このような、特定の細胞の応答性を増強または抑制する情報トランスデューサをアップまたはダウン調節することにより、疾病プロセスを処置しうる。この原理は、気道疾患および血管機能不全に対するホスホジエステラーゼ阻害剤、悪性の形質転換に対するキナーゼ阻害剤、および関節炎等の炎症症状に対するプロテアソーム阻害剤を含んでなる、多くの治療設計に用いられてきた。

細胞調節におけるユビキチン化は重要であり、ユビキチンに依存するタンパク質分解に可能性のある様々な構成要素は広範であるため、Ｅ３リガーゼ活性を検定するための迅速で単純な手段への需要がある。さらに、このようなアッセイがあれば、Ｅ３リガーゼのモジュレータの識別に非常に役立つ。従って、ユビキチンリガーゼ活性を検定する方法を提供することは本発明の目的であり、この方法はさらにユビキチンリガーゼ活性のモジュレータの同定に用いてもよい。

ユビキチンおよびユビキチン化酵素は、本発明の例示的な態様において本願明細書に記載する。本発明は、ユビキチン様タンパク質およびユビキチン様酵素の使用も想定し、これらの多くは、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、ＮＥＤＤ化およびＩＳＧ化に関連して本願明細書に記載する。本願明細書に記載のように、当業者であればユビキチン様タンパク質、酵素および経路に関連する同様のアッセイおよび方法を直ちに認識するであろう。

ユビキチンおよびユビキチン様タンパク質およびポリペプチド
ユビキチンおよびユビキチン様タンパク質は、まとめて「ユビキトン」として公知である。ユビキトンには、ユビキチンスーパーフォールドならびに低分子のコンジュゲート可能なタンパク質修飾物である、翻訳後修飾の中心構造要素を含んでなるものもあり、ユビキチンスーパーフォールドは一般的にはるかに大きなタンパク質の中に組み込まれるドメインでありうる。これらの構造上のフォールディングのそれぞれを包含する用語は「ユビキトン」である。ユビキトンは種々の官能基を有し、タンパク質分解と無関係のものもあり、ユビキチンとの相同性がほとんどないユビキトンもある。

多くのユビキチン様タンパク質があり、以下を含んでなるがこれらに限定しない。ＮＥＤＤ８；ＳＵＭＯ−１；ＵＣＨＬ３；ＳＵＭＯ−２；ＳＵＭＯ−３；ＳＵＭＯ４；ＩＳＧ１５ａ；ＩＳＧ１５ｂ；ＦＡＴ１０ａ；ＦＡＴ１０ｂ；ＦＵＢ１；ＵＢＬ５；ＵＲＭ１；ＡＴＧ８；Ｒｕｂ１；Ｓｍｔ３；Ｈｕｂ１；Ｕｒｍ１；および、ＡＴＧ１２。本発明の態様は、これらのタンパク質またはその活性断片のいずれかの、蛍光タンパク質−融合（ＧＦＰ等）を包含する。これらのユビキチン様ポリペプチド、タンパク質またはその断片は、全て本発明に包含する。一態様において、ユビキチン様ポリペプチド／タンパク質は、ＵＣＨＬ３である。

ユビキチンおよび／またはユビキチン様ポリペプチドをタンパク質基質からタンパク質分解性に除去するタンパク質は多数あり、以下を含んでなるがこれらに限定しない。ＰＯＨ１（別名Ｒｐｎ１１）；ＵＣＨＬ３；ユビキチンカルボキシル末端エステラーゼＬ１（ＵＣＨＬ１）；ＳＵＭＯ１／ｓｅｎｔｒｉｎ特異的プロテアーゼ１（ＳＥＮＰ１）；ユビキチンカルボキシル末端エステラーゼＬ１（ＵＣＨＬ１）；ユビキチン特異プロテアーゼ１（ＵＳＰ１）；ユビキチン特異プロテアーゼ１０（ＵＳＰ１０）；ユビキチン特異プロテアーゼ１２（ＵＳＰ１２）；ユビキチン特異プロテアーゼ１４（ＵＳＰ１４）；ユビキチン特異プロテアーゼ１５（ＵＳＰ１５）；ユビキチン特異プロテアーゼ１６（ＵＳＰ１６）；ユビキチン特異プロテアーゼ１８（ＵＳＰ１８）；ユビキチン特異プロテアーゼ２（ＵＳＰ２）；ユビキチン特異プロテアーゼ２８（ＵＳＰ２８）；ユビキチン特異プロテアーゼ３（ＵＳＰ３）；ユビキチン特異プロテアーゼ３０（ＵＳＰ３０）；ユビキチン特異プロテアーゼ３３（ＵＳＰ３３）；ユビキチン特異プロテアーゼ４（ＵＳＰ４）；ユビキチン特異プロテアーゼ４４（ＵＳＰ４４）；ユビキチン特異プロテアーゼ４５（ＵＳＰ４５）；ユビキチン特異プロテアーゼ４６（ＵＳＰ４６）；そして、ユビキチン特異プロテアーゼ４９（ＵＳＰ４９）；ユビキチン特異プロテアーゼ５（イソペプチダーゼＴ）（ＵＳＰ５）。当業者であれば、これらは広範にＵＣＨｓ（ユビキチン−ｃ末端部加水分解酵素）またはＵＳＰ（ユビキチン特異プロテアーゼ）ならびにＰＯＨ１をメンバーとするメタロプロテアーゼファミリーに定義されることを認識するであろう。ポリペプチド基質からユビキチンおよび／またはユビキチン様タンパク質をタンパク質分解性に除去するこれらのタンパク質は、全て本発明に包含する。これらは個々に用いてもよく任意の組み合わせで用いてもよい。

ＮＥＤＤ８／Ｒｕｂ１は、ユビキチン（Ｕｂ）様の翻訳後修飾因子である。ＮＥＤＤ８／Ｒｕｂ１は、ユビキチン化に類似の手法でカリン（Ｃｕｌ）ファミリータンパク質に共有結合すると考えられる。ＮＥＤＤ８は、ＳＣＦ複合体（Ｓｋｐ１、Ｃｕｌ−１、ＲＯＣ１およびＦ−ボックスタンパク質から成る）のユビキチン化活性を強化すると考えられる。Ｃｕｌ−１のＮＥＤＤ８修飾は、ＳＣＦ複合体へのＵｂコンジュゲート酵素Ｕｂｃ４（Ｅ２）の補充を強め、ＮＥＤＤ８修飾された系はＥ２−Ｅ３複合体の生成を加速し、これによりタンパク質のポリユビキチン化が刺激される。ＮＥＤＤ８系は、おそらくＥ２−Ｅ３複合体形成を促進するＣｕｌ−１のコンホメーション変化を通じて、ＳＣＦ活性をポジティブに調節すると考えられる。ＮＥＤＤ８、ＮＥＤＤ化、または脱ＮＥＤＤ化の詳細は、例えば、Ｋａｗａｋａｍｉら、ＥＭＢＯ Ｊ．、２００１年８月１日、２０巻、１５号、４００３−１２ページ；Ｏｓａｋａら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、１２巻、１５号、２２６３−２２６８ページ、１９９８年；Ｗｈｉｔｂｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７３巻、５２号、３４９８３−３４９９１ページ、１９９８年；Ｋｉｔｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６巻、２３号、２０６０３−２０６０９ページ、２００１年を参照されたい。

ユビキチンのＣ末端グリシンはＥ１による活性化に利用され、通常はグリシン残基は、ＳＵＭＯ、ＮＥＤＤ８およびＩＳＧ１５等のユビキチン様タンパク質のＣ末端に見られる。このＣ末端残基は、最終的に標的タンパク質のリジルｅアミノ基にコンジュゲートしてイソペプチド結合および後続のコンジュゲートを生成しうる。

複数のユビキチン化様酵素により、時には同一のリジン残基が修飾されうるタンパク質もあるため、種々のコンジュゲート経路の間には交差する調節がありうる。

幾つかの例においては、ＳＵＭＯ修飾はユビキチン化に拮抗的に作用する。幾つかの例においては、ＳＵＭＯ修飾は、タンパク質基質を安定化するのに役立つ。

ユビキチン様タンパク質の付加により基質コンフォメーションが変化し、リガンドまたは他の相互作用分子に対する親和性に影響し、基質位置を変化させ、タンパク質の安定性に影響する場合がある。

ユビキチン化タンパク質、酵素および経路、ならびにユビキチン化様タンパク質、酵素および経路に関連するアッセイ
本発明は、図２２、２６および２７等に示すように、ユビキチン化の検出のための種々の方法、および、ユビキチン化反応のモジュレータを同定するための種々の方法を提供する。本発明の方法およびアッセイは、ハイスループットフォーマット、細胞系、インビトロ系、またはこれらの組み合わせでありうる。ユビキチン化酵素は、Ｅ１、Ｅ２およびＥ３酵素を含んでなるが、これらに限定しない。

ユビキチン化にはいくつかの異なるクラスがある。その１つは、通常はタンパク質に付加するユビキチン鎖またはユビキチン様分子に生じるポリユビキチン化である。モノユビキチン化は、１つのユビキチンまたはユビキチン様分子のみがタンパク質に付加する場合に生じる。多ユビキチン化は、ユビキチンまたはユビキチン様分子がタンパク質の異なる部位に付加する場合に生じる。Ｎ末端ユビキチン化は、ユビキチンまたはユビキチン様分子がタンパク質のＮ末端に付加する場合に生じる。

本発明の一態様は、タンパク質のポリユビキチン化速度または量の変化をモニタするための、高感度スクリーニングアッセイを提供する。一態様において、アッセイはＨＴＳアッセイである。一態様において、アッセイは、ユビキチン介在のタンパク質分解が疾病過程に関与する障害（例えば、タンパク質のミスフォールディングに関連する疾病）を治療するための医薬品の同定および開発に用いる。

本発明に関し、ユビキチン化アッセイおよび関連方法を、翻訳後修飾アッセイの実施例として開示する。本発明は、ＳＵＭＯ化関連物等の、関連アッセイおよび方法も包含する。

ＳＵＭＯ化は、標的タンパク質の配列（例えばコンセンサス配列）内に見出されるリジン残基にコンジュゲートしたＳＵＭＯアイソフォームを含む。例えば、コンセンサス配列は、ΨΚＸΕを含んでもよく、式中、Ψは大きな疎水性アミノ酸を、Ｘは任意のアミノ酸を表す。しかしながら、このコンセンサス配列に合致する付加部位は多くはない。ＳＵＭＯ化モチーフはＳＵＭＯ−２および−３のＫ１１周辺に見られるが、ＳＵＭＯ−１には無い。そのため、ユビキチンのように、ＳＵＭＯ−２および−３はポリＳＵＭＯ鎖を生成しうる。ＳＵＭＯ−１はＳＵＭＯ−２および−３にコンジュゲートしうるが、連鎖停止剤として機能する。

Ｎｅｄｄ８コンジュゲートプロセスは、ＮＥＤＤ化と呼ばれ、ユビキチン化と類似する。ＮＥＤＤ化は、２つのサブユニットを含んでなるＥ１活性化酵素複合体、ＡＰＰ−ＢＰ１およびＵＢＡ３、ならびにＥ２コンジュゲート酵素、ＵＢＣ１２を利用しうる（例えば、Ｙｅｈら、２０００年）。公知のＮＥＤＤ化基質は、Ｃｕｌｌｉｎファミリータンパク質、Ｃｕｌ１、Ｃｕｌ２、Ｃｕｌ３、Ｃｕｌ４Ａ、Ｃｕｌ４ＢおよびＣｕｌ５を含んでなるが、これらに限定しない（例えば、Ｏｓａｋａら、１９９８年；Ｈｏｒｉら、１９９９年）。ＮＥＤＤ８および関連タンパク質は、Ｒｕｂ１、ＩＳＧ１５（ＵＣＲＰ）ＡＰＧ８、ＡＰＧ１２、ＦＡＴ１０、ＵＲＭ１、Ｈｕｂ１、ＭＧＣ１０４３９３、ＭＧＣ１２５８９６およびＭＧＣ１２５８９７として公知でもある。Ｎｅｄｄ−８遺伝子は、第１４染色体、部位：１４ｑ１２（ＭＩＭ：６０３１７１ ＧｅｎｅＩＤ：４７３８）に見られる。

幾つかの態様において、本発明のアッセイおよび方法は、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化等の翻訳後修飾として、１つのタンパク質を別のものに付加する。幾つかの態様において、ＳＵＭＯタンパク質からエピトープに結合する標識抗体を利用する。

ユビキトンに関連した詳細な情報は、Ｒｅｂｅｃｃａ Ｌ．Ｗｅｌｃｈｍａｎ、Ｃｏｌｉｎ ＧｏｒｄｏｎおよびＲ．Ｊｏｈｎ Ｍａｙｅｒ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、２００５年８月、６巻、８号、５９９−６０９ページの概説を参照されたい。

本発明の一態様において、アッセイは、分子鎖内ＴＲ−ＦＲＥＴユビキチンアッセイである。一態様において、反応中ユビキチン（Ｕｂ）の一部分はＲＥＴドナーで標識され、別の部分はＲＥＴアクセプターで標識され、ここにドナーおよびアクセプターはＲＥＴに互換性がある。一態様において、反応中ユビキチン（Ｕｂ）の一部分はフルオレセインで標識され、別の部分はテルビウムキレートで標識される。一態様において、反応中ユビキチン（Ｕｂ）の一部分は蛍光タンパク質で標識され、そして、別の部分はテルビウムキレートで標識される。フルオレセインおよびテルビウムユビキチン部分は、ユビキチン化酵素（Ｅ１、Ｅ２およびＥ３）、ユビキチン化される標的タンパク質および反応を駆動するＡＴＰ溶液と混ぜられる。一態様において、標的タンパク質は、ユビキチンタンパク質またはポリペプチドである。他の態様では、標的タンパク質はユビキチンでない。一態様において、ユビキチン化酵素は、フルオレセイン標識ユビキチンおよびテルビウム標識ユビキチンを標的タンパク質上のポリユビキチン鎖に組み込む。図２２を参照されたい。関心タンパク質のユビキチン化後、ＲＥＴドナーおよびアクセプターの両者はユビキチン鎖それ自体の上に存在しており、ＲＥＴペア形成の完了のために第２の試薬を追加する必要なく、ユビキチン化のイベントを検出可能にする。フルオレセインおよび標的タンパク質上のテルビウムユビキチンの取り込みの割合は、反応の開始時に各ユビキチン類縁体の処方度によって部分的に制御してもよい。一態様において、ユビキチン化した標的タンパク質の割合は、反応混合物を３４０ｎｍで励起し、４９５ｎｍでの放射光に対する５２０ｎｍでの放射光の強度を測定し、ＲＥＴ比率を測定することにより計測される。ＲＥＴ比率の顕著な増加は標的タンパク質のユビキチン化を表し、ＲＥＴ比率が顕著には増加しなければ標的タンパク質はユビキチン化されなかったことを示す。

一態様において、基質はポリユビキチン化されるが、ポリユビキチン鎖の生成にはよらない。例えば、多ユビキチン化のように、複数のユビキチン分子が基質上の少なくとも２つの部位に付加する。

ＨＴＳアッセイにおいて、標的タンパク質のユビキチン化を阻害または促進する化合物の有効性を測定するために、化合物（例えば薬物または候補薬物）を導入する。幾つかの態様において、化合物がユビキチン化反応を阻害する場合には、標的タンパク質のユビキチン化が減少するにつれてＲＥＴ比率の減少が観測される（例えば、対象ウェルと比較して）。逆にいえば、化合物が標的タンパク質のユビキチン化を促進する場合、ＴＲ−ＦＲＥＴ比率の増加が観測される。

ＲＥＴドナーおよびアクセプターはユビキトン上に配置されるので、分子鎖内ユビキチン化アッセイは、コードするＤＮＡ配列が未知（従って、エピトープタグをコードできない）または、選択的に標的タンパク質を標識する抗体をもたない標的タンパク質と共に使用できる。アッセイは、リアルタイムで標的タンパク質のユビキチン化の動力学をモニタするためにも使用できる。幾つかの態様において、分子鎖内ＴＲ−ＦＲＥＴユビキチン化アッセイはＴＲ−ＦＲＥＴパートナーの両者（例えば、フルオレセイン−ユビキチンおよびテルビウム−ユビキチン）をユビキチン鎖に取り入れ、分析のための第２の試薬追加を不要とする。

幾つかの態様において、例えば、野生型タンパク質Ｎ末端に４つのアミノ酸（メチオニン−システイン−グリシン−グリシン等）を付加することにより、ユビキチン付加ミュータントが合成される。一態様において、フルオレセインまたはテルビウムキレートのチオール反応性形態を有するユビキチンミュータントを部位特異的に標識しうるために、システインを導入する。細胞ホモジネートからのユビキチン精製後に、ユビキチン付加ミュータントはフルオレセインまたはテルビウムキレートチオール反応色素で標識され、対応するフルオレセイン−ユビキチンまたはテルビウム−ユビキチンを生成する。

標的タンパク質を認識する結合パートナー（抗体等）が利用できる場合は、１）ドナー標識（テルビウム等）されたユビキチンを有するアクセプター標識（フルオレセイン標識等）された結合パートナー（抗体等）、または、２）アクセプター標識（フルオレセイン標識等）されたユビキチンを有するドナー標識（テルビウム等）された結合パートナー（抗体等）を利用するユビキチン化アッセイを確立しうる。図２７に、これらのアッセイフォーマットの基本的な概略を示す。一態様において、標識抗体は、ユビキチン化されるタンパク質の天然型のエピトープに結合する。幾つかの態様において、標識結合パートナーは、ＧＳＴ等のタグのように、ユビキチン化されるタンパク質の非天然型のエピトープに結合する。

本願明細書に記載のような関連アッセイおよび方法に関し、当業者であればユビキチンおよび／またはユビキチン鎖に結合する適切な結合分子（抗体等）を認識し選択しうる。いくつかの方法において、ユビキチンに結合する抗体の全てが有用というわけではなく、最適であるわけではない。例えば、抗体によっては、例としては、１）ユビキトン化されたタンパク質の一部であるユビキトンと比較してフリーのユビキトンにより高い親和性を有し、２）ユビキトン化されたタンパク質の一部であるユビキトンと比較してフリーのユビキトンにより低い親和性を有し、または、３）ユビキトン化されたタンパク質の一部であるユビキトンと比較してフリーのユビキトンに比較的同一の親和性を有する場合がある。フリーのユビキトンに結合する抗体によっては、ユビキトンがユビキトン化されたタンパク質／基質の一部であるときに、利用できないかまたは変化しないエピトープと結合する場合もある本発明の幾つかの態様において、ユビキトン化されたタンパク質／基質の一部であるユビキトンまたはユビキトン鎖に結合する結合分子（抗体等）を利用する。幾つかの態様において、結合分子は抗体である。幾つかの態様において、抗体は、ユビキトン化されたタンパク質／基質を伴うユビキチンまたはユビキトンに優先的に結合する。幾つかの態様において、抗体は、例えばユビキトン化されたタンパク質／基質を伴わない、フリーのユビキチンまたはユビキトンに優先的に結合する。本発明の幾つかの態様において、抗体は、ＦＫ１またはＦＫ２抗体であるか、若しくは同じエピトープに結合する。（Ｆｕｊｉｍｕｒｏら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、３９９巻、７５−８６ページ、２００５年）本発明の幾つかの態様において、抗体はＦＫ−１（例えば、ポリユビキチン鎖を認識する）であり、例えば、ＢｉｏＭｏｌ社カタログ番号ＰＷ８８０５またはこの抗体のＣＤＲｓを含んでなる抗体である。本発明の幾つかの態様において、抗体はＦＫ−２（例えば、ユビキチンを認識する）であり、例えば、ＢｉｏＭｏｌ社（Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ、米国ペンシルバニア州）カタログ番号ＰＷ８８１０またはこの抗体のＣＤＲｓを含んでなる抗体である。

本発明の一態様は、ＴＲ−ＦＲＥＴペアを完成するために、アクセプター標識（フルオレセイン等）されたユビキチンおよびドナー標識（テルビウム等）された抗エピトープ抗体を利用する、抗エピトープユビキチン化アッセイを提供する。本発明の一態様は、ＴＲ−ＦＲＥＴペアを完成するために、ドナー標識（テルビウム等）されたユビキチンおよびアクセプター標識（フルオレセイン等）された抗エピトープ抗体を利用する、抗エピトープユビキチン化アッセイを提供する。抗エピトープフォーマットは、標的タンパク質のモノおよびポリユビキチン化を検出しうる。抗エピトープユビキチン化アッセイは、対照と比較して許容しうるシグナル対バックグラウンドを有し、メチル化ユビキチンはＧＳＴ−ＵｂｃＨ１への付加においてフルオレセイン−ユビキチンと競合する。

本発明の一態様は、ポリユビキチン鎖生成の検出を提供する。ＴＲ−ＦＲＥＴドナー（Ｔｂ−ユビキチン等）およびアクセプター（フルオレセイン−ユビキチン等）はポリユビキチン鎖に存在するため、分子鎖内アッセイにおいては現像段階は不要である。これにより、ユビキチン化におけるリアルタイム動力学の情報が必要なときに、分子鎖内アッセイは特に有用になる。エピトープ法と同様に、分子鎖内ユビキチン化アッセイは対照と比較して許容しうるシグナル対バックグラウンドを有し、メチル化ユビキチンはテルビウムおよびフルオレセイン−ユビキチンと競争して反応を阻害する。

他の態様では、ユビキチン化アッセイは、蛍光タンパク質またはポリペプチド（ＧＦＰ等）と、ユビキチン化される標的タンパク質またはポリペプチドとの融合であるタンパク質を利用する（図２６参照）。蛍光タンパク質またはポリペプチド（ＧＦＰ等）は、分子鎖内ユビキチン化反応に代替物を供する標的タンパク質またはポリペプチドに融合する。図２６に、ｐ５３およびテルビウム−ユビキチンを伴いＧＦＰ融合タンパク質またはポリペプチドを有するユビキチン化アッセイの実施例の概要を示す。この態様においては、モノユビキチン化およびポリユビキチン化タンパク質が検出および／または測定可能である。標的タンパク質のユビキチン化のリアルタイム動態分析も収集しうる。このアッセイは、ユビキチン化酵素の機能を調節（抑制、維持または強化等）しうる化合物、または、ユビキチン化酵素（Ｍｄｍ２、ユビキチンリガーゼ酵素（Ｅ３）等）と標的タンパク質（Ｍｄｍ２およびｐ５３等）との相互作用を調節しうる化合物を同定するためのハイスループットスクリーニングフォーマットに使用できる。

幾つかの態様において、ユビキチン化酵素は、細胞溶解物から測定される。

細胞溶解物は粗製、部分的に精製されたまたは実質的に精製された細胞溶解物でありうる。実質的な精製は、約９５％の純度を指す。幾つかの態様において、ユビキチン化酵素は、約９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９９、９９．９または１００％の純度であり、例えば９０％〜９９．９％、９３％〜９９．９％、９５％〜９９．９％または９０％〜９６％の純度である。幾つかの態様において、酵素は、細胞破片の除去のため遠心分離された細胞溶解物に由来する。幾つかの態様において、酵素は、例えば細胞溶解物中、または生成中の分解を減らすために、少なくとも１つのプロテアーゼインヒビターの存在下にある。

本発明の幾つかの局面は、細胞系アッセイを提供する。本発明の態様は、融合タンパク質を発現する細胞を提供し、ここに融合タンパク質は酵素活性（ユビキチン化等）のための基質および標識（例えば、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質）を含む融合タンパク質を含んでなるする。幾つかの態様において、標識は、ＲＥＴのためのドナーまたはアクセプター標識として作用しうる。幾つかの態様において、酵素活性はユビキチン化である。幾つかの態様において、ユビキチン化はポリユビキチン化である。幾つかの態様において、ユビキチン化はモノユビキチン化である。融合タンパク質は、真核生物または哺乳類細胞等の、任意の細胞中に発現しうる。

内部にＧＦＰ／ユビキチン化基質融合タンパク質を発現する能力を有する細胞は、その細胞自身のユビキチン機構により標的タンパク質の修飾が可能になる。これは、特に、ＡＰＣ等の複数のサブユニットから成り、アッセイ（インビトロアッセイ等）に対しての発現および精製が困難であろうユビキチン−タンパク質リガーゼ（Ｅ３等）について特に有用である。細胞系ユビキチン化アッセイに関する本発明の一態様は、例えば２９３細胞等、ＩκＢαのＧＦＰ融合を内因性に発現する細胞を利用する。幾つかの態様において、ＴＮＦＲ受容体はＴＮＦαに刺激され、ＧＦＰ−ＩκＢαのユビキチン化を誘導しうる。幾つかの態様において、ユビキチン化された融合タンパク質（ＧＦＰ−ＩκＢα等）を放出させるための細胞溶解後に、標識（テルビウム等）した抗ユビキチン抗体を導入して、例えばＦＲＥＴペアを完成させることにより、ユビキチン化融合タンパク質を検出し、場合によってはアクセプター（ＧＦＰ等）由来の発光を誘導し、および／またはドナー由来の発光を減少させる。

本発明の一態様、例えば本願明細書に記載の細胞系アッセイは、細胞環境における標的タンパク質のユビキチン化の状態をモニタするために使用できる。これによりユーザは、例えば、関連するユビキチン経路の機能をテストするためのハイスループットスクリーニングを実行しうる。幾つかの態様において、本発明は、例えば、細胞透過性のための化合物、ならびに細胞環境におけるユビキチン化を有効に抑制する化合物をスクリーニングする手段を提供する。

本発明の細胞系アッセイにより、ユビキチン化等の、酵素活性に関する種々の経路の局面を検討または計測することが可能になる。例えば、ユビキチン化のため基質である特定のポリペプチドのユビキチン化に影響する、化合物および／または条件（例えば、放射、温度変化、酸素濃度の変化、他）をスクリーニングしうる。化合物は、ユビキチン化酵素上で直接にその効果を及ぼしてもよく、ユビキチン化に関連する他の経路において別のタンパク質に影響することにより間接的にその効果を及ぼしてもよい。一態様において、化合物または条件が及ぼす効果は、少なくとも１つのタンパク質基質のユビキチン化速度を調節することである。幾つかの態様において、基質のユビキチン化速度を減少する。幾つかの態様において、基質のユビキチン化速度を上昇する。ユビキチン化に関連する任意の細胞経路は、本発明のアッセイに利用および検討しうる。

幾つかの態様において、細胞により融合タンパク質（例えば、ユビキチン化基質および標識（ＧＦＰ等）を含んでなる）を発現する。本発明の幾つかの局面において、これらの細胞は本発明のアッセイに利用される。幾つかの態様において、条件および／または化合物に曝露された後に、細胞は溶解される。本願明細書に記載のように、細胞溶解物は適宜精製してもよく、例えば、標識ユビキチン化基質融合タンパク質に関して、部分的に精製してもよい。次いで、細胞溶解物は、ユビキチン化基質に結合する標識結合パートナーと接触しうる。幾つかの態様において、標識結合パートナーは、融合タンパク質の標識（ＧＦＰ等）と互換性のあるＦＲＥＴパートナー（例えば、テルビウムを含んでなる）で標識される。幾つかの態様において、標識結合パートナーは、ユビキチンまたはユビキチン様タンパク質（例えば抗ユビキチンまたは抗ポリユビキチン）に結合する。幾つかの態様において、標識結合パートナーは、ポリユビキチン（例えば抗ポリユビキチン）に結合する。幾つかの態様において、標識された結合パートナーは、ユビキチン化されない基質に優先的に結合し、例えば、ユビキチン化によりＲＥＴ計測あたいは減少する。

幾つかの態様において、ユビキチン化されたＧＦＰ−ＩκＢαの量は、ＴＮＦα（公知のＴＮＦＲ活性剤）への用量応答として測定される。幾つかの態様において、Ｔｂ−抗ポリユビキチンおよび／またはＴｂ−抗ユビキチンのいずれかが、ＦＲＥＴペアの完成等、細胞溶解物由来のユビキチン化された融合タンパク質（ＧＦＰ−ＩκＢα等）と結合するために用いられる。

幾つかの態様において、ユビキチン化に関連する経路はＮＦ−κＢ経路である。例えば、ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）への刺激は、ＴＮＦＲ関連因子（ＴＲＡＦ）およびその後のＴＧＦｂ活性化キナーゼ１（ＴＡＫ１）を活性化する。活性ＴＡＫ１は、ＩκＢαリン酸化に対して反応性であるＩＫＫβのリン酸化を調節する。ユビキチン−リガーゼ複合体であるＳＣＦ−ｂＴｒＣＰは、リン酸化されたＩκＢαをポリユビキチン化し、このタンパク質を分解するための情報を伝達する。

本発明の一態様は、化合物が翻訳後修飾のモジュレータであるか否かを判定する方法を提供し、当該方法は以下を含んでなる。（ａ）化合物と少なくとも１つの融合タンパク質を発現する細胞とを接触させる段階、ここに、前記融合タンパク質は翻訳後修飾のための第１の標識および基質を含んで被験試料を生成し；（ｂ）前記被験試料を、前記翻訳後修飾の有無に基づいて識別して結合を示す結合パートナーと接触させる段階、ここに前記結合パートナーは第２の標識を含んでなり、前記第１および第２の標識はＲＥＴペアであり；（ｃ）前記被験試料からの蛍光発光を測定する段階。幾つかの態様において、方法はさらに、例えば化合物または融合タンパク質を欠乏する、対照試料を含んでなる。幾つかの態様において、被験試料の蛍光特性は、対照試料の蛍光特性と比較される。

本発明の一態様は、少なくとも１つの化合物のユビキチン化活性を測定する方法を提供し、当該方法は以下を含んでなる。ａ）少なくとも１つのタンパク質と標識されたユビキトンとを接触させて被験試料を生成させる段階であって、ここに、前記標識されたユビキトンは少なくとも２個を含んでなり、第１個はＲＥＴペアと互換性のあるアクセプターで標識され、第２個はＲＥＴペアと互換性のあるドナーで標識される段階と；ｂ）前記被験試料を少なくとも１つの波長の光に曝露する段階と；ｃ）被験試料からの蛍光発光を測定する段階。

本発明の他の態様は、ユビキチン化活性の少なくとも１つのモジュレータを同定するための方法を提供し、当該方法は以下を含んでなる。ａ）ユビキチン化活性の少なくとも１つの潜在的モジュレータ、少なくとも１つのタンパク質、および標識されたユビキトンを接触させて被験試料を生成させる段階であって、ここに前記標識されたユビキトンは少なくとも２個を含んでなり、第１個はＲＥＴペアと互換性のあるアクセプターで標識され、第２個はＲＥＴペアと互換性のあるドナーで標識される段階と；ｂ）前記被験試料を少なくとも１つの波長の光に曝露する段階と；ｃ）被験試料からの蛍光発光を測定する段階。一態様において、方法はさらに、少なくとも１つのタンパク質と標識されたユビキチンとを接触させて対照試料を生成する段階を含んでなり、ここに、前記ユビキチン化活性の潜在的モジュレータの濃縮は前記被験試料の濃縮よりも低い。一態様において、ユビキチン化活性の潜在的モジュレータは、対照試料には無い。

本発明の他の態様は、ａ）パッケージ材料と；ｂ）少なくとも２集団の標識されたユビキトンを含んでなる製品を提供し、ここに第１集団はＲＥＴペアと互換性のあるアクセプターで標識され、第２集団はＲＥＴペアと互換性のあるドナーで標識される。一態様において、前記製品は、さらに少なくとも１つのユビキチン化酵素を含んでなる。一態様において、前記製品は、さらに、Ｅ１、Ｅ２およびＥ３から選ばれる、少なくとも１つのユビキチン化酵素を含んでなる。一態様において、前記製品は、さらにユビキチン化酵素Ｅ１、Ｅ２およびＥ３を含んでなる。

本発明の他の態様は、少なくとも１つの化合物のユビキチン化活性を測定するための方法を提供し、当該方法は以下を含んでなる。ａ）ｉ）少なくとも１つの化合物をｉｉ）ユビキチンおよびｉｉｉ）タンパク質と接触させて被験試料を生成させる段階であって、ここに前記タンパク質はユビキチン化基質およびＲＥＴペアの第１の部分を含んでなる段階と；ｂ）被験試料をユビキチン化に適切な症状下でインキュベートする段階と；ｃ）（ｂ）の前で、期間中に、後で、被験試料をユビキチンに結合する結合分子と接触させる段階であって、ここに、前記結合分子はＦＲＥＴペアの第２の部分で標識される段階と； ｄ）被験試料を少なくとも１つの波長の光に曝露する段階と；ｅ）被験試料からの蛍光放出を測定する段階。

本発明の他の態様は、少なくとも１つの化合物がユビキチン化活性のモジュレータであるか否かを判定するための方法を提供し、当該方法は以下を含んでなる。ｉ）少なくとも１つの化合物をｉｉ）ユビキチン、ｉｉｉ）タンパク質、およびｉｖ）ユビキチン化酵素と接触させて被験試料を生成させる段階であって、ここに前記タンパク質はユビキチン化基質およびＲＥＴペアの第１の部分を含んでなる段階と；ｂ）被験試料をユビキチン化に適切な症状下でインキュベートする段階と；ｃ）（ｂ）の前で、期間中に、後で、被験試料をユビキチンに結合する結合分子と接触させる段階であって、ここに、前記結合分子はＦＲＥＴペアの第２の部分で標識される段階と；ｄ）被験試料を少なくとも１つの波長の光に曝露する段階と；ｅ）被験試料からの蛍光放出を測定する段階と；および、ｆ）対照試料からの蛍光と比較する段階。

本発明の他の態様は、テルビウム金属イオンで標識された、ユビキチン、若しくはユビキチン様タンパク質またはポリペプチドを提供する。一態様において、前記テルビウム金属イオンで標識された、ユビキチンまたはユビキチン様ポリペプチドは、下記実施例１７の記載のようなものである。

一態様において、第２個の標識ユビキチンは、ランタニド金属錯体で標識される。一態様において、前記ランタニド金属錯体は、テルビウムを含んでなる。一態様において、前記ランタニド金属錯体は、有機のアンテナ部分、金属を連結する部分およびランタニド金属イオンを含んでなる。一態様において、前記ランタニド金属錯体は、Ｔｂ（ＩＩＩ）を含んでなる。一態様において、前記ランタニド金属錯体は、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＴＴＨＡ、ＤＯＴＡ、ＮＴＡ、ＨＤＴＡ、ＤＴＰＰ、ＥＤＴＰ、ＨＤＴＰ、ＮＴＰ、ＤＯＴＰ、ＤＯ３Ａ、ＤＯＴＡＧＡおよびＮＯＴＡからなる群から選ばれる金属キレート部分を含んでなる。

一態様において、少なくとも１つの波長の光は、２５０ｎｍから７５０ｎｍの範囲である。一態様において、第１個の標識ユビキチンはフルオレセインまたは蛍光タンパク質またはポリペプチドで標識される。一態様において、蛍光タンパク質またはポリペプチドはＧＦＰである。一態様において、少なくとも１つのタンパク質は、ユビキチンである。一態様において、少なくとも１つのタンパク質はユビキチンでない。一態様において、化合物について選ばれた群に由来する少なくとも１つのメンバー、少なくとも１つのタンパク質および標識ユビキチンは細胞溶解物である、一態様において、化合物について選ばれた群に由来する少なくとも１つのメンバー、少なくとも１つのタンパク質および標識ユビキチンは、実質的に精製される。一態様において、潜在的モジュレータについて選ばれた群に由来する少なくとも１つのメンバー、少なくとも１つのタンパク質および標識ユビキチンは、細胞溶解物中にある。一態様において、潜在的モジュレータについて選ばれた群に由来する少なくとも１つのメンバー、少なくとも１つのタンパク質および標識ユビキチンは、実質的に精製される。一態様において、被験試料からの蛍光発光を測定する段階は、比率測定を計測する段階を含んでなる。

本発明のアッセイの反応体積
本願明細書に記載のアッセイは、種々の体積で稼動しうる。幾つかの態様において、反応体積は著しく減量しうる。幾つかの態様において、反応体積は約１ナノリットルから約２００μｌ；約１０ｎｌ〜約２００μｌ；約１００ｎｌ〜約２００μｌ；約１μｌ〜約２００μｌ；約１０μｌ〜約２００μｌ；約１０ｎｌ〜約１００μｌ；約１０ｎｌ〜約２０μｌ；約１００ｎｌ〜約２０μｌ；約１μｌ〜約２０μｌ；約１μｌ〜約１０μｌ；約１μｌ〜約５μｌ；約５μｌ〜約１０μｌ；または約１０μｌ〜約２０μｌである。幾つかの態様において、反応体積は約４または２０μｌである。

幾つかの態様においてて、本発明のアッセイは、比較的少ない反応体積で稼動しうる。これにより、供給が限られる場合もある検定用試薬の量およびコストを減らせるという利点をもたらす。アッセイの小型化は、例えばハイスループットの効率を向上し、同時にスクリーニングする試料数を増やすことも可能にする。

本発明のアッセイにおける蛍光計測および計算
場合によっては、比率測定アッセイおよび生物活性を有する化合物を高信頼度で同定する能力を確認するときには、アッセイ値の最大および最小の間の「折り返し変化」を見る傾向がありうる（しかし読み誤りもある）。実際には、比率測定アッセイの安定性は、これらの値における相対的な差異からではなく、実際はこれらの値に伴う誤差の大きさに関連する絶対値の差異の強度で決定する。特にＴＲ−ＦＲＥＴアッセイにおいては、こうした誤差の強度はＴＲ−ＦＲＥＴ値の最大最小の間と比較して極めて小さく、結果として、アッセイの安定性のためには大きな「ウィンドウ」は不要である。

競合平衡結合アッセイは、典型的には、トレーサおよび受容体の濃度を、トレーサの完全結合と完全競合の間の８０％のシグナルが生じる濃度として実施する。これは、シグナル強度の変化と、分析物濃度の変化をアッセイがレポートしうる能力との間の均衡を提供し、競合のない状態における複合体の濃度が上昇するとこの強度は減少する。例えば、ＴＲ−ＦＲＥＴキナーゼアッセイは、ＥＣ８０またはこの付近のキナーゼ濃度で（基質およびＡＴＰ濃度は所与のセットの下で）稼動し、その結果、存在する活性キナーゼ量が少し変化するとＴＲ−ＦＲＥＴ値のかなりの変化を生じる一方、活性および不活性キナーゼの間には適切な分離が維持される。

結合パートナー
本発明の一実施例は、２つの結合パートナーの間の分子相互作用（例えば、複合体生成または破壊）をモニターおよび／または測定することに基づく。「結合パートナー」は、化合物（例えば、第１の結合パートナー）であり、別の化合物（例えば、第２の結合パートナー）（またはこの逆）に対する親和性を有することで、２つの結合パートナーが結合すると複合体を生成しうる。２つの結合パートナは、特異的結合ペアのメンバーでありうる。例えば、第１の結合パートナーはモノクローナル抗体であり、第２の結合パートナーはそのモノクローナル抗体によって認識されるエピトープを有する組成物でありうる。

キナーゼまたはホスファターゼ活性に関する一実施例は、ランタニド金属錯体（例えば、Ｔｂキレートを含んでなる）で標識された抗ホスホ特異的抗体の後に、標準手順（例えば、市販のキレート試薬が供給される）を利用する。あるいは、ホスホ特異的抗体は、抗ホスホ特異的抗体に結合する分子種特異的抗体（例えば、Ｔｂ標識された抗ＩｇＧ）との会合を介し、「現場で」標識される。一態様において、これらの試薬は、ＧＦＰ−またはフルオレセイン標識されたタンパク質またはポリペプチド基質が用いられるキナーゼ反応に加えられる。ＧＦＰ融合は、標準的な分子生物学、組換えタンパク質発現およびタンパク質精製技術を用い、大腸菌で生産してもよい。手短にインキュベートした後、例えば「ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）ユーザーズガイド」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州）に記載のように、アッセイを標準的な「ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）」を用いて読み取ってもよい。

従って、一局面においては、本発明は結合パートナーを含んでなる組成物を提供する。結合パートナーは、ルミネッセンス金属錯体（Ｔｂまたはユーロピウム等）で標識されうる。あるいは、結合パートナーは、蛍光アクセプター部分で標識されうる。ルミネッセンス金属錯体または蛍光アクセプター部分で標識された結合パートナの例を、下記実施例に記載する。本発明は結合パートナの混合物も提供する。例えば、組成物は、第１の結合パートナーおよび第２の結合パートナーを含みうる。第１の結合パートナーはルミネッセンス金属錯体を含みうる一方、第２の結合パートナーは蛍光アクセプター部分を含みうる。あるいは、第１の結合パートナーは蛍光アクセプター部分を含みうる一方、第２の結合パートナーはルミネッセンス金属錯体を含みうる。

通常は、第２の結合パートナーに対する第１の結合パートナーの親和性（見かけのＫｄ）は約１ｍＭ以下であり、例えば約１０μＭ以下、約１μＭ以下、または約０．１μＭ以下、若しくは１０ｎＭ以下、または１ｎＭ以下、または０．１ｎＭ以下である。当業者であれば認識するように、条件および対費用効果の所望の組み合わせを得るため、第１の結合パートナーの第２の結合パートナーに対するＫ_ｄに依存して、アッセイ構成成分の濃度、反応時間、温度およびバッファ等の実験上のパラメータは系統的に調整しうる。

第２の結合パートナーは、第１の結合パートナーに対する最適の結合パートナーである必要はない。用語は、本発明の方法を用いて探索しうる結合相互作用を有する全ての結合パートナを包含する。第２の結合パートナーは、本願明細書においてしばしば「トレーサ」と呼び、これはルミネッセンス金属錯体または蛍光アクセプター部分を含む場合には、「蛍光トレーサ」と呼ぶ。

結合パートナーはタンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、リン脂質、多糖類または有機分子でありうる。特定のタンパク質のまたはポリペプチドに結合するパートナーの例は、抗体、タンパク質、酵素学的または化学的に合成されたまたは修飾されたポリペプチド配列（例えば、タンパク質由来、タンパク質から修飾された、または新規に遺伝子光学的に設計され合成されたポリペプチド配列）を含んでなる。タンパク質またはポリペプチドに結合するパートナーは直鎖でも環状でもよい。有機分子に結合するパートナーは、低分子有機分子でありうる。

複合体を生成する第１および第２の結合パートナの定型的な例は、抗体および当該抗体により認識されるエピトープまたはエピトープ模倣物を有する組成物；ポリペプチドおよびリガンド（例えば受容体−リガンド相互作用）；ポリペプチドおよび別のポリペプチド（例えばタンパク質−タンパク質相互作用）；ポリペプチドおよびポリヌクレオチド（例えばタンパク質−ＤＮＡまたはタンパク質−ＲＮＡ相互作用）；ポリヌクレオチドおよび別のポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡまたはＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用）；ポリペプチドおよび有機の分子（例えばタンパク質−薬物相互作用）；ポリペプチドおよび脂質（例えばタンパク質−リン脂質相互作用）；ポリヌクレオチドおよび有機分子；ならびに、有機分子および別の有機分子、を含んでなる。

結合パートナーは、ルミネッセンス金属錯体または蛍光アクセプター部分を含みうる。本願明細書に記載の方法の幾つかの態様において、一方の結合パートナーはルミネッセンス金属錯体を含んでなり、他方は蛍光アクセプター部分を含みうる。例えば、第１の結合パートナーはルミネッセンス金属錯体を含み、第２の結合パートナーは蛍光アクセプター部分を含んでなる。結合パートナーペア上のルミネッセンス金属錯体および蛍光アクセプター部分を含むことにより、第１および第２の結合パートナの相互作用は１以上の蛍光技術（ＴＲ−ＲＥＴまたは多重モード等）によりモニタしうる。例えば、第１の結合パートナーおよび第２の結合パートナーが互いに結合すると、通常、この複合体は特徴的なＴＲ−ＲＥＴシグナルを呈する。第１の結合パートナーと第２の結合パートナーとの分子相互作用が破壊されると（例えば、第２のパートナーに結合する競合物の追加により）、ＴＲ−ＲＥＴシグナルが変化するので、いずれかのＴＲ−ＲＥＴモードにおける分子相互作用をモニターしうる。

一態様において、抗体はルミネッセンス金属キレートで標識され、抗体に対するタンパク質またはポリペプチド結合パートナーは蛍光アクセプター部分で標識されうる。抗体およびポリペプチドが互いに結合すると、通常はこの試料はルミネッセンス金属キレートおよびアクセプター部分との間に、ＲＥＴに特有の蛍光発光が測定される。抗体に対して適切なＫ_ｄを有する競合物を適切な濃度で添加することにより第２の結合パートナーの入れ替えが生じ、抗体上のルミネッセンス金属キレートとタンパク質またはポリペプチド上の蛍光アクセプター部分とのＲＥＴが失われる結果、蛍光発光測定が変化する。

結合パートナは、当業者に公知の多くの方法によって調製および精製されうる。例えば、抗体は、モノクローナル抗体および抗体フラグメントを含んでなり、当業者に公知の数多くの方法により調製されうるか、またはＳｅｒｏｔｅｃ（Ｒａｌｅｉｇｈ、米国ノースカロライナ州）、Ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、米国マサチューセッツ州）、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、 Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ならびに、Ｃｏｖａｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｄｅｎｖｅｒ、米国コロラド州）を含んでなる様々な市販品ベンダーから購入可能である。

一般に、抗体が要求される抗原は、例えば、リコンビナント的に、化学合成により、または、未変性タンパク質の精製により調製され、次いで動物の免疫に用いられる。例えば、特定のアミノ酸配列および／または翻訳後修飾（例えばリン酸化）を含んでなるポリペプチドまたはタンパク質は、配列および／または翻訳後修飾に対する抗体の特異的を増すために、固相化学合成により調製しうる。例えば、ウサギ、鶏、マウス、モルモット、ヤギおよびラットを含んでなる種々の宿主動物は、関心抗原を注射して免疫化されうる。宿主生物種によっては、免疫学的応答を増すためにアジュバントが用いられ、これは、Ｆｒｅｕｎｄ’ｓアジュバント（完全および／または不完全）、水酸化アルミニウム等のミネラルゲル、リゾレシチン等の界面活性剤、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシニアンおよびジニトロフェノールを含んでなる。ポリクローナル抗体は、免疫動物の血清に含まれる。モノクローナル抗体は、標準ハイブリドーマ技術を使用して調製されうる。特に、モノクローナル抗体は、培地内の連続セルラインにより抗体分子の産出を提供する任意の手法で得られ、例えば、Ｋｏｈｌｅｒら、１９７５年、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻、４９５−４９７ページ；Ｋｏｓｂｏｒら、ｔｈｅ ｈｕｍａｎ Ｂ−ｃｅｌｌ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、１９８３年、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、４巻、７２ページ、ならびに、Ｃｏｔｅら、１９８３年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８０巻、２０２６−２０３０ページ、およびＣｏｌｅら、ｔｈｅ ＥＢＶ−ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．、７７−９６ページ、１９８３年等に記載がある。この種の抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびこれらの任意のサブクラスを含んでなる、任意の免疫グロブリンクラスでありうる。本発明のモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマは、インビトロでもインビボでも培養しうる。キメラ抗体は、標準技術によって生成しうる。

抗原に対する特異的結合アフィニティを有する抗体フラグメントは、周知の技術により発生しうる。この種の抗体フラグメントは、抗体分子のペプシン消化により生じうるＦ（ａｂ’）_２断片、およびＦ（ａｂ’）_２フラグメントのジスルフィド架橋を減らすことにより生じるＦａｂフラグメントを含んでなるが限定しない。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリを構築しうる。例えば、Ｈｕｓｅら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６巻、１２７５−１２８１ページを参照されたい。単鎖Ｆｖ抗体フラグメントは、アミノ酸架橋（例えば、１５〜１８アミノ酸）を介してＦｖ領域の重鎖および軽鎖フラグメントを連結することにより生成され、１本鎖ポリペプチドを生じる。単鎖Ｆｖ抗体フラグメントは、米国特許第４９４６７７８号等に開示の標準的技術により生成可能である。

生成後、これらの抗体または断片は、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）等を含んでなる標準的なイムノアッセイ法により、第２の結合パートナーの認識（およびアフィニティ）を試験しうる。Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編集、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９２年を参照されたい。通常、適切な抗体は、第２の結合パートナーに対するＫｄ値が約１ｍＭ以下であり、例えば、約１０μＭ以下、または約１μＭ以下、または約０．１μＭ以下、または約１０ｎＭ以下、または約１ｎＭ以下、または約０．１ｎＭ以下である。例えば、翻訳後に修正されたタンパク質が、特定の翻訳後修飾に対して特異的な抗体を生成する動物を免疫するために用いられる場合、第２の結合パートナーは同じ翻訳後修飾を含んでなるタンパク質またはポリペプチドでありうる。他の態様において、第２の結合パートナーは、免疫に用いられる抗原と同じ化学構造を有する。

抗体に加え、第１または第２の結合パートナとして有効であり、同様に標準的な方法により調製、分析しうる、他のポリペプチドがある。例えば、ポリペプチドまたはタンパク質は、自然由来の抽出物（例えば、単離した細胞、組織または体液）により、タンパク質またはポリペプチドをコードする組換え核酸の発現により、または化学合成により得られが、これらに限らない。例えば、ポリペプチドまたはタンパク質は、タンパク質またはポリペプチドをコード化している発現ベクターを用い、標準的な組換え技術により生成しうる。次いで、生じたポリペプチドを精製しうる。小スケールまたは大スケールのポリペプチド生成に使用できる発現系は、例えば組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミッドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換したバクテリア（例えばＥ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等の微生物；組換え酵母発現ベクターにより形質転換した酵母菌（例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）；組換えウイルス発現ベクター（例えばバキュロウィルス）に感染した昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えばタバコモザイクウイルス）に感染した、または組換えプラスミド発現ベクター（例えばＴｉプラスミド）により形質転換した植物細胞系；または、哺乳動物細胞ゲノム由来（例えば、メタロチオネインプロモータ）、または哺乳類ウイルス由来（例えば、アデノウイルス後期プロモータ、およびサイトメガロウイルスプロモータ）のプロモータを含んでなる組換え発現コンストラクトを収容している哺乳類細胞系（１次細胞、または、ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、２９３ヒト胚腎臓細胞および３Ｔ３ Ｌ１細胞等の固定セルライン）を含んでなるが、これらに限らない。

ポリペプチドまたはタンパク質を精製する本発明の適切な方法は、例えば、アフィニティークロマトグラフィ、免疫沈降、サイズ排除クロマトグラフィおよびイオン交換クロマトグラフィを含んでなる。例えば、Ｆｌｏｈｅら、１９７０年、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、２２０巻、４６９−４７６ページ、または、Ｔｉｌｇｍａｎｎら、１９９０年、ＦＥＢＳ、２６４巻、９５−９９ページを参照されたい。精製の程度は、カラムクロマトグラフィ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法または高性能液体クロマトグラフィを含んでなる任意の適切な方法で測定されうるが、これらに限定しない。

第１または第２の結合パートナとしてのポリペプチドおよびタンパク質は、固相合成方法を用いて調製しうる。ＷＯ ０３／０１１１５および６４１０２５５を参照されたい。合成の容易さおよびコストへの考慮のため、化学合成ポリペプチドは３〜５０アミノ酸を有するのが好適である（例えば、３〜３０、３〜２０、３〜１５、５〜３０、５〜２０、５〜１５、８〜２０、８〜１５、１０〜１０、１０〜１５または１０〜１２のアミノ酸長）。本発明のポリペプチドおよびタンパク質には、豊富な種類のアミノ酸を使用できる。好適なアミノ酸は、天然、非天然、および、修飾（例えば、リン酸化）アミノ酸が含まれる。ペプチド固相合成への即時使用に適する多種の保護基を有するアミノ酸は、市販入手可能である。

結合パートナーに使用できるポリヌクレオチドは、共通分子クローニングおよび化学核酸合成技術を含んでなる標準技術によって生成しうるが、これらに限らない。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）技術を使用できる。ＰＣＲとは、目標核酸が酵素学的に増幅される手順または技法を指す。通常は、関心ドメインまたは反対側の端からの配列情報を用い、増幅するテンプレートの逆のストランドと配列が同一であるポリヌクレオチドプライマを設計する。ＰＣＲは、全ゲノムＤＮＡまたは全細胞ＲＮＡを含んでなる、ＤＮＡならびにＲＮＡ由来の特定の配列を増幅するために用いられる。プライマは、通常は１４〜４０ヌクレオチド長であるが、１０ヌクレオチド長から数百ヌクレオチド長にわたりうる。一般的なＰＣＲ技術は、ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈおよびＤｖｅｋｓｌｅｒ編集、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９５年；テンプレート源としてＲＮＡを用いるときには、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）ストランド合成のために逆転写酵素を使用できる。単離した核酸を得るためには、リガーゼ連鎖反応、ストランド置換増幅、自続的配列複製（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、または核酸配列に基礎をおいた増幅法（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を使用できる。例えば、Ｌｅｗｉｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｎｅｗｓ、１２巻、９号、１ページ、１９９２年；Ｇｕａｔｅｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７巻、１８７４−１８７８ページ、１９９０年、および、Ｗｅｉｓｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５４巻、１２９２ページ、１９９１年、を参照されたい。

本発明のポリヌクレオチドは、１本鎖核酸分子（例えば、ホスホラミダイトを用いる３’から５’方向への自動ＤＮＡ合成を用いて）として、あるいはより低分子のポリヌクレオチドとして、化学的にも合成されうる。例えば、所望の配列を有し、ポリヌクレオチドペアをアニールすると２重鎖が生成するように各ペアが相補的な短いセグメント（例えば約１５ヌクレオチド）を伴う、１以上の長い（１００超のヌクレオチド等）ポリヌクレオチドのペアを合成しうる。ＤＮＡポリメラーゼはポリヌクレオチドを延長するために用いられ、１本鎖、２本鎖ポリヌクレオチドを生じる。

本発明のポリヌクレオチドは突然変異誘発によっても得られうる。例えば、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド特異的変異導入法および部位特異的変異導入法を含んでなる標準的な技法を用いて変異しうる。Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第８章、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ａｕｓｕｂｅｌら編集、１９９２年を参照されたい。

本発明の幾つかの態様において、結合パートナは、酵素学的反応を伴う関心基質を標識するために用いられる。
実施例としては、図９、１１ｂ−ｆおよび２７を参照されたい。

ルミネッセンス金属錯体
結合パートナーは、ルミネッセンス金属錯体を含みうる。ルミネッセンス金属錯体は、ＲＥＴまたはＴＲ−ＲＥＴアッセイのドナー蛍光原子団として作用しうる。ルミネッセンス金属錯体は、典型的には励起状態の寿命が、ナノ秒よりもむしろミリ秒オーダーまたは数百マイクロ秒オーダーであり、励起状態の寿命が長いことにより、光散乱由来のバックグラウンド蛍光の低下および／または光散乱に由来する干渉の後で、結合パートナとの分子相互作用の検出をモニターしうるため、本発明の方法において有用である。

種々の結合パートナにルミネッセンス金属錯体を共有結合して連結するための方法は、当業者に公知であり、例えば、ＷＯ９６／２３５２６；ＷＯ０１／０９１８８、ＷＯ０１／０８７１２およびＷＯ０３／０１１１１５；米国特許第５６３９６１５号；５６５６４３３；５６２２８２１；５５７１８９７；５５３４６２２；５２２００１２；５１６２５０８；および４９２７９２３を参照されたい。

ルミネッセンス金属錯体は、金属を連結する部分、１以上のランタニド金属イオン、ならびに、適宜リンカー、スペーサ、および有機アンテナ部分を含んでなる。

金属連結部分
金属を連結する部分は、１以上のランタニド金属イオンを配位して金属錯体を生成する。典型的には、金属連結部分は１以上の金属配位する部分Ｘを含んでなり、ここにＸは金属カチオンを配位しうるヘテロ原子電子供与基であり、例えばＯ⁻、ＯＨ、ＮＨ_２、ＯＰＯ_３ ^２−、ＮＨＲ、またはＯＲ等であり、ここにＲは脂肪族基である。

金属連結部分は、キレート部分またはクリプタンド部分でありうる。ランタニド金属イオンがキレート部分に配位する場合、この錯体は「金属キレート」と呼ばれる。ランタニド金属イオンがクリプタンド部分に配位する場合、この錯体は「金属クリプタンド」と呼ばれる。

金属キレートは、安定してランタニドイオンを交換しなければならない。金属キレートはの生成定数（Ｋ_ｆ）は、好適には１０^１０Ｍ^−１より大きい。種々の有用なキレート部分が当業者に公知である。キレート部分の定型的な実施例は、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＴＴＨＡ、ＤＯＴＡ、ＮＴＡ、ＨＤＴＡ、ＤＴＰＰ、ＥＤＴＰ、ＨＤＴＰ、ＮＴＰ、ＤＯＴＰ、ＤＯ３Ａ、ＤＯＴＡＧＡおよびＮＯＴＡを含んでなる。

幾つかの態様において、ルミネッセンス金属キレートは、次の構造を有し、
−Ｌ_ｎ−Ａ−Ｓ_ｎ−Ｃ_Ｍ、
または、
−Ｌ_ｎ−Ｃ_Ｍ−Ｓ_ｎ−Ａ、
式中、Ａは、有機アンテナ部分；
Ｌはリンカーを表し；
Ｓはスペーサを表し；
ｎは０または１であり；
Ｃは金属キレート部分を表し；
Ｍは、Ｃに配位するランタニド金属イオンを表す。

ルミネッセンス金属キレートの実施例は、図２および３を参照されたい。図３に、結合パートナ上のアミン部分（一番上の構造）またはチオール部分（一番下の構造）へのコンジュゲートに有用なルミネッセンス金属キレートを示す。

クリプテートは、３次元的な有機キャビティ中へのランタニドカチオンの包接により生成し、非常に安定な錯体を生成する。種々の有用なクリプタンド部分が当業者に公知である。本発明の方法に有用なクリプタンド部分の実施例は、トリスビピリジン（ＴＢＰ、例えば、ＴＢＰペンタカルボン酸塩）、およびピリジンビピリジン（例えば、ピリジンビピリジンテトラカルボン酸塩）を含んでなる。

キレートおよびクリプタンド部分は、当業者に公知の種々の方法により合成されるか、または市販購入可能である。米国特許第５６３９６１５号；第５６５６４３３号；第５６２２８２１号；第５５７１８９７号；第５５３４６２２号；第５２２００１２号；第５１６２５０８号；第４９２７９２３号；ＷＯ９６／２３５２６およびＷＯ０３／０１１１１５を参照されたい。

ランタニド金属イオン
金属連結部分は、１以上のランタニド金属イオンを配位して金属錯体を生成する。ランタニド金属イオンは、その特別な電子配置が光学活性な電子を保護し、特徴的な線状の発光を生じるので、有用である。金属イオンの電子遷移は量子力学の禁制であるため、通常、これらのイオンの発光寿命は長い（μｓからミリ秒まで）。

有用なランタニド金属イオンは、Ｓｍ（ＩＩＩ）、Ｒｕ（ＩＩＩ）、Ｅｕ（ＩＩＩ）、Ｇｄ（ＩＩＩ）、Ｔｂ（ＩＩＩ）およびＤｙ（ＩＩＩ）を含んでなる。キレートまたはクリプタンド部分に金属イオンで錯体形成する方法は、当業者に公知であり、ＷＯ９６／２３５２６およびＷＯ０３／０１１１１５を参照されたい。

有機アンテナ部分
ルミネッセンス金属錯体は、有機アンテナ部分を適宜含んでなる。有機アンテナ部分は、通常は光を吸収することができるように共役電子構造を有する。吸収光は、アンテナ部分の一重項から三重項励起状態への分子内の非放射過程により移動され、次いで三重項状態からランタニドイオンの発光レベルへ移動し、これは次いで特徴的な長寿命のルミネッセンスを発光する。図２および４を参照されたい。金属連結部分によっては、有機アンテナ部分を包接せずに光吸収しうるものがある点に留意する必要がある。例えば、三ビピリジンペンタカルボン酸塩等の、共役有機部分を含んでなる特定のクリプタンド部分は、別個の有機アンテナ部分の包接を必要としない。

幾つかの態様において、有機アンテナ部分は、多核ヘテロ環状芳香族化合物でありうる。多核ヘテロ環状芳香族化合物は、２以上の縮合環構造を有しうる。有用な有機アンテナ部分の例としては、ローダミン５６０、フルオレセイン５７５、フルオレセイン５９０、２−キノロン、４−キノロン、４−トリフルオロメチルクマリン（ＴＦＣ）７−ジエチル−アミノ−クマリン−３−カルボヒドラジド、７−アミノ−４−メチル−２−クマリン（カルボスチリル１２４、ＣＳ１２４）７−アミノ−４−メチル−２−クマリン（クマリン１２０）７−アミノ−４−トリフルオロメチル−２−クマリン（クマリン１２４）およびアミノメチルトリメチルプソラレンが挙げられる。図２および３を参照されたい。

有機アンテナ部分として有効な化合物は、当業者に公知の方法により合成されるか、または市販購入可能である。米国特許第５６３９６１５号；第５６５６４３３号；第５６２２８２１号；第５５７１８９７号；第５５３４６２２号；第５２２００１２号；第５１６２５０８号；第４９２７９２３を参照されたい。

リンカー、スペーサ
リンカーおよびスペーサは、ルミネッセンス金属錯体に適宜含まれうる。Ｌｉｎｋｅｒ（Ｌ）は、第１または第２の結合パートナーにルミネッセンス金属錯体を連結するように機能する。幾つかの態様において、Ｌは、第１または第２の結合パートナーに対する金属連結部分のアセテート、アミン、アミド、カルボン酸，またはメチレン官能基に連結する。

当業者であれば、アミン、アセテート、チオール、アルコール、エーテル、エステル、ケトンおよびカルボン酸塩を含んでなる数多くの官能基と結合パートナーを反応させるためにＬｓを設計しうるが、これらに限定するものではない。結合パートナーがタンパク質またはポリペプチドである態様において、Ｌは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＮ−およびＣ−末端の両方を、アミド部分としてキャップしうる。Ｌのキャプ部分の他例は、スルホンアミド、尿素、チオ尿素およびカルバメートを含んでなる。Ｌｓは、直鎖、分枝、若しくは環状のアルカン、アルケンまたはアルキン、ならびにリン酸ジエステル部分を含みうる。Ｌは、ケトン、エステル、アミド、エーテル、カルボン酸塩、スルホンアミドまたはカルバメート官能基を含んでなる、１以上の官能基で置換されてもよい。包含する特定のＬｓとしては、ＮＨ−−ＣＯ−ＮＨ−；−ＣＯ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＮＨ−、式中ｎ＝１〜１０；−ＮＨ−Ｐｈ−；−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｎ−、式中ｎ＝１〜１０；−ＣＯ−ＮＨ−；−（ＣＨ_２）_ｎ−ＮＨ−、式中ｎ＝１〜１０；−ＣＯ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＮＨ−、式中ｎ＝１〜１０；ならびに、−ＣＳ−ＮＨ−も含んでなる。さらなるＬｓの実施例およびこれらを金属錯体、特にポリペプチドまたはタンパク質に連結される金属錯体に組み込むための合成方法は、ＷＯ０１／０９１８８、ＷＯ０１／０８７１２およびＷＯ０３／０１１１１５に記載されている。

スペーサ（Ｓ）は、有機アンテナ部分を金属連結部分に接続しうる。幾つかの態様において、Ｓは、有機アンテナ部分に金属連結部分上のアセテート、アミンまたはメチレン官能基を連結しうる。当業者であれば、アミン、アセテート、チオール、アルコール、エーテル、エステル、ケトンおよびカルボン酸塩を含んでなる数多くの官能基と有機アンテナ部分を反応させるためにＳｓを設計しうるが、これらに限定するものではない。Ｓｓは、直鎖、分枝、若しくは環状のアルカン、アルケンまたはアルキン、ならびにリン酸ジエステル部分を含みうる。Ｓは、ケトン、エステル、アミド、エーテル、カルボン酸塩、スルホンアミドまたはカルバメート官能基を含んでなる、１以上の官能基で置換されてもよい。包含する特定のＳｓとしては、ＮＨ−−ＣＯ−ＮＨ−；−ＣＯ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＮＨ−、式中ｎ＝１〜１０；−ＮＨ−Ｐｈ−；−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｎ−、式中ｎ＝１〜１０；−ＣＯ−ＮＨ−；−（ＣＨ_２）_ｎ−ＮＨ−、式中ｎ＝１〜１０；−ＣＯ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＮＨ−、式中ｎ＝１〜１０；ならびに、−ＣＳ−ＮＨ−も含んでなる。

蛍光アクセプター部分
結合パートナーは蛍光アクセプター部分を含みうる。蛍光アクセプター部分は、ＲＥＴまたはＴＲ−ＲＥＴ系アッセイのアクセプターとして作用しうる。

一般に、最適な蛍光アクセプター部分は、良好な量子収率および大きな吸光係数を示す必要があり；衝突減衰や退色に耐える必要があり；当業者に公知の方法により、種々の第１および第２の結合パートナに容易に共役する必要がある。適切な蛍光原子団は、非限定的に、フルオレセイン、ローダミン、ＦＩＴＣ（例えば、フルオレセイン−５−イソチオシネート）５−ＦＡＭ、６−ＦＡＭ、５，６−ＦＡＭ、７−ヒドロキシクマリン−３−カルボキサミド、６−クロロ−７−ヒドロキシクマリン−３−カルボキサミド、ジクロロトリアジニルアミノフルオレセイン、テトラメチルローダミン−５−イソチオシネート、テトラメチルローダミン−６−イソチオシネート、５−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセインのスクシンイミジルエステル、５−カルボキシテトラメチルローダミン、６−カルボキシメチルローダミン、および７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸を含んでなる。他の適切な蛍光原子団は、蛍光原子団のＣｙファミリー（Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、米国ニュージャージー州から入手可能）；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒファミリー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、米国オレゴン州から入手可能）；ＢＯＤＩＰＹファミリー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、米国オレゴン州から入手可能）；カルボピロニン；スクアリン；シアニン／インドシアニン；ベンゾピリリウムヘテロ環；およびアミド架橋ベンゾピリリウムを含んでなる。

蛍光アクセプター部分として、蛍光ポリペプチド、タンパク質およびミュータントも使用できる。実施例は、ホタル、細菌、カブトムシルシフェラーゼ、エクオリンおよび他の発光タンパク質を含んでなる。（例えば、１９８９年６月２２日付けＴｈｏｍｐｓｏｎらの米国特許第５２２１６２３号、１９９７年１１月４日付けＣａｍｐｂｅｌｌの米国特許第５６８３８８８号；１９９７年９月７日付けＤｅＬｕｃａらの米国特許第５６７４７１３号；１９９７年７月２２日付けＷｏｏｄらの米国特許第５６５０２８９号；および１９９８年１２月１日付けＴａｔｓｕｍｉらの米国特許第５８４３７４６号に記載されている。）ＧＦＰおよびＧＦＰミュータントは、Ｔｂ（ＩＩＩ）を含む金属錯体を用いるアプリケーションに特に有用である。オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）由来ＧＦＰの種々のミュータントは、天然型のＧＦＰと比較して、異なるスペクトル特性、輝度の改良、発現の強化、および哺乳類細胞中で折り畳むものが創り出された。（例えば、米国特許第６４１０２５５号の表７、同様に、Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、第２章、１９−４７ページ、ＳｕｌｌｉｖａｎおよびＫａｙ編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；１９９７年４月２９日付けＴｓｉｅｎらの米国特許第５６２５０４８号；１９９８年７月７日付けＴｓｉｅｎらの米国特許第５７７７０７９号；１９９８年９月８日付けＣｏｒｍａｃｋらの米国特許第５８０４３８７号を参照されたい。）

蛍光タンパク質およびその呈色変異種は、細胞生物学の良好なツールであり、生化学ＨＴＳ（ハイスループットスクリーニング）アッセイ開発のための重要なツールである。本発明の幾つかの態様において、蛍光タンパク質は、例えばランタニド金属錯体により、ＦＲＥＴパートナーとして利用される。本発明のこれらの態様は、対応するものと共に利用するときにランタニド金属錯体がＦＲＥＴペアとして協働しうる、任意の蛍光タンパク質を利用しうる。例えば、ドナーの発光スペクトルがアクセプターの励起スペクトルと重複する場合（例えば、テルビウムキレートおよび蛍光タンパク質の場合）、分子が近接するとエネルギー移動が起こる。テルビウムキレートの蛍光寿命は長いため、他の蛍光分子または散乱光からの干渉の消失後に、エネルギー移動を検出しうる。本発明のいくつかの態様は、通常、蛍光タンパク質の実施例としてのＧＦＰに関して記載する。ＧＦＰは実施例のみのものであり、上記の基準を満たす任意の他の蛍光タンパク質を利用しうる。（例えば、対応するランタニド金属錯体とＦＲＥＴ可能なもの）。本発明の幾つかの態様において、ａｖＧＦＰ融合タンパク質またはポリペプチドは、テルビウムキレートと組み合わせ、キナーゼおよびユビキチン関連の経路に対する時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（ＴＲ−ＦＲＥＴ）アッセイのための一般的ストラテジを作成するために利用する。ユウロピウムとは異なり、テルビウムは、遺伝子工学的にコードされたアクセプター蛍光原子団を用いるＴＲ−ＦＲＥＴアッセイを可能にし、ＧＦＰとペアになりうる。本発明の幾つかの態様において、一般的なストラテジは、ＧＦＰと関心タンパク質またはポリペプチドとの間に融合を作製することを含んでなる。融合タンパク質の精製後、テルビウム標識抗体またはテルビウム標識融合タンパク質は、ＴＲ−ＦＲＥＴシグナルを出力する。最終的に、本アッセイは、ＧＦＰアクセプターを有するテルビウムドナーの破壊または会合により機能する。ＧＦＰは、例えば、１）容易にタンパク質精製するための可溶蛍光標識、２）全標識基質、３）ＴＲ−ＦＲＥＴのための適合性の高いアクセプター蛍光原子団を提供することにより、生化学アッセイ開発を可能にする。幾つかの態様において、Ｔｏｐａｚ ＧＦＰを利用する。ＧＦＰ融合としての標識キナーゼ基質は、アクセス可能なアミノ基を通じて基質タンパク質がランダム標識される場合と比較してバッチごとの整合性を改善し、アクセプター標識抗体を用いる場合と比較して低コストである等の利点を有する。

多重化アッセイに用いられる蛍光アクセプター部分は、ＲＥＴ／ＴＲ−ＲＥＴアプリケーションに有用な特徴を示す必要がある。ＴＲ−ＲＥＴアプリケーションのために、蛍光原子団の吸光スペクトル範囲はルミネッセンス金属キレートの発光範囲と重複する必要があり、一方、蛍光原子団の発光スペクトルは、好適にはルミネッセンス金属キレートの発光スペクトルと実質的に重複する。

Ｔｂ（ＩＩＩ）含有ルミネッセンス金属錯体を用いるＴＲ−ＲＥＴアッセイにおける適切なアクセプター蛍光原子団の実施例は、フルオレセイン（および誘導体）；ローダミン（および誘導体）；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒｓ ４８８、５００、５１４、５３２、５４６、５５５、５６８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社から入手可能）；ＢＯＤＩＰＹｓ ＦＬ、Ｒ６ＧおよびＴＭＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社から入手可能）；Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から入手可能）、およびＩＣ３（Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、米国ミズリー州から入手可能）を含んでなるが、これらに限定しない。Ｅｕ（ＩＩＩ）含有ルミネッセンス金属錯体を用いるＴＲ−ＲＥＴアッセイにおける適切なアクセプター蛍光原子団の実施例は：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒｓ ５９４、６１０、６３３、６４７、および６６０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社から入手可能）；ＢＯＤＩＰＹｓ ＴＲ、６３０／６５０および６５０／６６５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社から入手可能）；Ｃｙ５（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から入手可能）およびＩＣ５（Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から入手可能）を含んでなるが、これらに限定しない。

本発明に用いる適切な蛍光原子団は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ、米国オレゴン州）、Ａｔｔｏｔｅｃ（ドイツ）、ＡｍｅｒｓｈａｍおよびＢｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｎｏｖａｔｏ、米国カリフォルニア州）から市販されている。蛍光原子団を種々の結合パートナに取り込む無方法は、当業者に公知であり、米国特許第６４１０２５５号を参照されたい。

ＲＥＴおよびＴＲ−ＲＥＴ
本発明の方法は、ドナー部分（例えば、ルミネッセンス金属キレート）とアクセプター部分（例えば、蛍光アクセプター部分）との間の共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）も利用する。一態様において、ドナールミネッセンス金属キレートは、適切な波長および輝度の光により（例えば、ドナーアンテナ部分の励起スペクトル範囲内）、アクセプター蛍光原子団の直接励起が最小化される好適な条件下において、励起される。次いで、ドナールミネッセンスキレートは、吸収エネルギーを非放射手段によりアクセプター蛍光部分へ移動し、続いて、１以上の特性波長の蛍光発光として吸収エネルギーを再放出する。ＴＲ−ＲＥＴアプリケーションにおいて、再放出された放射は、例えば、マイクロタイタープレートに用いるプラスチックにより生じるバックグラウンド蛍光、光散乱または他のルミネッセンスが減衰しうる２５、５０、７５、１００、１５０、２００、または３００マイクロ秒等の、適切な遅延時間の後に初めて測定される。

いくつかのＲＥＴアプリケーションにおいて、第１の結合パートナーはルミネッセンス金属錯体または蛍光アクセプター部分の一方を含み、第２の結合パートナーは他方を含みうる。例えば、抗体の第１の結合パートナーはＴｂ（ＩＩＩ）−キレート−有機アンテナ部分（ルミネッセンス金属キレート）で標識され、一方、当該抗体が特異性を有するタンパク質またはポリペプチドはフルオレセイン（蛍光アクセプター部分）で標識されうる。この場合、抗体とタンパク質またはポリペプチドとで生成される複合体の破壊は（例えば、２者間の結合に影響する化合物により）、第１および第２の結合パートナの結合のモニタおよび測定に使用できる、抗体上のルミネッセンス金属キレートとポリペプチド上の蛍光アクセプター部分との間のエネルギー移動に、変化を生じる。第２の結合パートナー（またはトレーサ）の第１の結合パートナーへの結合に影響する化合物は、例えば、被験化合物、酵素製品（例えば、第１の結合パートナーが特異性を有するもの）または酵素基質（例えば、第１の結合パートナーが特異性を有するもの）でありうる。

他のＲＥＴ態様において、第２の結合パートナー（またはトレーサ）の第１の結合パートナーへの結合に影響する化合物は、ルミネッセンス金属キレートまたは蛍光アクセプター部分の一方を含み、第１の結合パートナーは他方を含みうる。これらの実施例では、結合に影響する標識化合物により、第１の結合パートナーと第２の結合パートナーが生成する複合体が破壊される結果、ＲＥＴの増加が生じうる。

ＲＥＴは、ドナールミネッセンス金属錯体か由来のルミネッセンスシグナルの輝度の減少および／またはアクセプター蛍光部分からの蛍光発光の増加として、顕在化しうる。例えば、ドナールミネッセンス金属錯体を有する抗体とアクセプター蛍光部分を有するタンパク質またはポリペプチドとの複合体が、例えば、無標識のタンパク質またはポリペプチド等、タンパク質またはポリペプチドに対する競合物により破壊されると、ドナールミネッセンス金属錯体およびアクセプター蛍光部分は物理的に分離し、ＲＥＴは減少または消失する。これらの状況下では、ドナールミネッセンス金属錯体からのルミネッセンス発光は増加し、アクセプター蛍光部分からの蛍光発光は減少する。従って、アクセプター蛍光部分に対するドナールミネッセンス金属錯体に特有の（例えば、発光最大）波長の発光振幅の比率は、ＲＥＴ条件下（例えば、ドナールミネッセンス金属錯体の発光がアクセプターによりクエンチされる）の同じ比率と比較して、増加しなければならない。

ＲＥＴの効率は、離間距離およびドナールミネッセンス金属錯体とアクセプター蛍光部分の配向、ドナー金属イオンのルミネッセンス量子収率、アクセプター蛍光部分とのスペクトルの重なり、ならびにドナーの発光スペクトルと重複する波長におけるアクセプター蛍光原子団の吸光係数に依存する。Ｆｏｒｓｔｅｒは次式の関係を導いた。
Ｅ＝（Ｆ°−Ｆ）／Ｆ°＝Ｒο^６／（Ｒ^６＋Ｒｏ^６）
式中、ＥはＲＥＴの効率、ＦおよびＦ°はそれぞれアクセプターの存在および不在におけるドナー蛍光強度であり、Ｒはドナーとアクセプターとの距離である。Ｒｏは、エネルギー移動効率が最大の５０％となる距離（オングストローム）であり次式で与えられる。
Ｒｏ＝９．７９×１０^３（Ｋ^２ＱＪｎ^−４）^１／６
式中、Ｋ^２はフリーの可動ドナーおよびアクセプターについての０．６７近傍の平均値を有する配向因子であり、Ｑはクエンチされていない蛍光ドナーの量子収率であり、ｎは介在する培地の屈折率であり、Ｊは重なり積分であり、これはスペクトル重複の度合いを定量的に表現する。ＲＥＴが５０％効率となる特性距離Ｒｏは、ドナーの量子収率、アクセプターの吸光係数、ドナーの発光スペクトルとアクセプターの励起スペクトルとの共通部分、および２つの蛍光原子団間の配向因子に依存する。

ＲＥＴの程度の変化は、「比演算（ｒａｔｉｏｉｎｇ）」と呼ばれる過程である、ドナーおよびアクセプター部分由来の蛍光量の比率の変化の関数として計測しうる。比率を計算することにより、アッセイは、例えばウェルごとの基質濃度、光退色および励起強度の変動に左右されにくくなり、アッセイはより安定となる。これは、生成データの品質が後続の解析および解釈において重要である、自動スクリーニングアプリケーションで特に重要である。米国特許第６４１０２５５号；第４８２２７３３号；第５５２７６８４号；第６３５２６７２号を参照されたい。

幾つかの態様において、ドナー部分からの発光を測定する。幾つかの態様において、アクセプター部分からの発光を測定する。幾つかの態様において、ＲＥＴの増加は、ドナー部分からの発光の減少により測定される。

例えば、本方法の一態様において、比率計測解析を実施し、ここに２つの異なる波長のルミネッセンス発光の比率を、被験試料および対照試料との間で比較する。典型的なＴＲ−ＲＥＴ系アッセイにおいて、２つの波長はルミネッセンス金属錯体および蛍光アクセプター部分の発光最大に対応しうる。幾つかの態様において、対照試料の発光比率は、被験試料の発光比率よりも、約１．５、２、３、４、５、７、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、または１００倍大きいか小さい。

ＲＥＴおよび関連する方法の更なる説明は、米国特許出願ＵＳ２００５００６４４８５号、ＵＳ２００５０１７０４４２号、ＵＳ２００５００５４５７３号、および米国仮出願６０／７３１３１０号、６０／７３５８１２号、６０／７５９５４５号、６０／７７４２３６号および６０／８３２１１４号を参照されたい。

結合パートナー間への結合に関する被験化合物の効果の測定法
本発明の方法は、第１の結合パートナーと第２の結合パートナーとの間の結合に関する、被験化合物の効果を測定するために使用できる。例えば、本発明の方法は、第１または第２の結合パートナーに対して競合する結合パートナーを同定するために用いてもよく、第１または第２の結合パートナーに物理的に（例えば、アロステリックに）または化学的に影響し、その結果、当該パートナーの結合に影響する化合物を同定するために用いてもよい。従って、タンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−リガンド相互作用、タンパク質−ＤＮＡ相互作用およびポリヌクレオチドハイブリダイゼーションのような結合パートナー相互作用に関して被験化合物の効果を同定するアッセイは、本発明の方法を用いて設計しうる。

一方法において、第１の結合パートナー、第２の結合パートナーおよび被験化合物は接触して被験試料を生成させる。幾つかの態様において、結合パートナの一方はルミネッセンス金属錯体を含んでなり、他方は蛍光アクセプター部分を含んでなる。図１を参照されたい。上記のように、第１および第２の結合パートナーは、結合して複合体を生成しうる。幾つかの態様において、被験試料は、通常は２５０ｎｍ〜７５０ｎｍの波長範囲の光に曝露され（例えば、ルミネッセンス金属錯体、またはアンテナ部分の吸光バンドの波長で）、被験試料由来の蛍光発光を測定する。実施例において、上記のように、蛍光発光は適切な遅延時間の後に測定され、時間分解蛍光発光測定が得られる。

他の態様において、前述のように、被験化合物はルミネッセンス金属錯体または蛍光アクセプター部分の一方を含み、第１の結合パートナーは他方を含みうる。例えば、第１の結合パートナー受容体はルミネッセンス金属キレートで標識され、第１の結合パートナー受容体に対する被験リガンドは蛍光アクセプター部分で標識されうる。標識した被験リガンドにより、第１の結合パートナー受容体と無標識の第２の結合パートナー（例えば、受容体のリガンド）とで生成した複合体が破壊されると、ＲＥＴが増大しうる。

被験化合物は、被験試料の蛍光発光測定が、被験試料を欠く対照試料の蛍光発光計測とは異なるときに、第１および第２の結合パートナーの間の結合に影響するものとして同定される。一般的に、対照試料と比較して、測定には統計的有意差がなければならない。当業者であれば、差異が統計的有意差であるか否かは、測定の種類および実験条件に依存することを認識するであろう。測定を比較するときに、統計的有意差により被験化合物が更なる研究を正当化する場合があることは理解されよう。通常は、χ２乗検定、スチューデントのｔ検定、マン・ホイットニー検定、またはＦ−検定等の、適切なパラメータまたはノンパラメトリックな統計により、ｐ＜０．０５における差異は統計的有意差と見なされる。幾つかの態様において、ｐ＜０．０１、ｐ＜０．００５またはｐ＜０．００１において、差異は統計的有意である。

酵素活性のモジュレータの同定法
本発明の方法は、酵素活性のモジュレータを同定するために使用できる。幾つかの態様において、第１の結合パートナーは、基質または酵素活性産物に対する特異性に基づいて選択される。例えば、無修飾チロシンと比較して、リン酸化チロシンに対する特異性を有する抗体は、チロシンキナーゼ活性産物に対する特異性を有する第１の結合パートナーでありうる。一態様において、次いで、基質または酵素活性産物に対する第１の結合パートナーの特異性に部分的に基づき、トレーサが選択される。例えば、トレーサは、抗体の第１の結合パートナーにより認識される目的エピトープ、若しくは、タンパク質またはポリペプチドの第１の結合パートナーにより認識される部位または化学構造を含みうる。他の態様において、トレーサは、動物を免疫して第１の結合パートナー抗体を生成するために用いる抗原と同一の化学構造を有しうる。通常は、第１の結合パートナーは、特異性を有する酵素生成物または基質に対するのと類似のＫ_ｄで、例えば、生成物または基質に対する第１の結合パートナーのＫ_ｄの、約０．００１から１０００倍、または０．０１から１００倍、または０．１から１０倍のＫ_ｄで、トレーサと結合する。

トレーサは標識してもよく（例えば、本願明細書において「ルミネッセンストレーサ」と呼ばれ、ルミネッセンス金属錯体または蛍光アクセプター部分を含んでなる）、またはトレーサは無標識でもよい。例えば、第１の結合パートナーがチロシンキナーゼ活性産物であるリン酸化チロシンに対する特異性を有する抗体である場合、ルミネッセンストレーサは、抗体（この場合、リン酸化チロシン）により認識されて抗体がルミネッセンストレーサと結合する、エピトープ（またはエピトープ模倣物）を含んでなるものから選択されうる。トレーサ上に蛍光アクセプター部分またはルミネッセンス金属錯体を包含することにより、トレーサに対する第１の結合パートナーのＫ_ｄに実質的な影響を及ぼしてはならない。

本アッセイは、酵素活性産物または基質に対して特異性を有する第１の結合パートナーの選択に基づくので、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、グルクロニダーゼ活性、プレニル化、グリコシレーション、メチル化、脱メチル反応、アシル化、アセチル化、ユビキチン化、脱ユビキチン化、硫酸化、タンパク質分解、ヌクレアーゼ活性、核酸ポリメラーゼ活性、核酸逆転写酵素活性、ヌクレオチジル転移酵素活性、ポリヌクレオチド転写活性およびポリヌクレオチド翻訳活性を含んでなる、酵素活性の広範な種類が探索されうるが、これらに限定しない。

本発明のいくつかの方法において、酵素は、基質から生成物を生成する酵素活性に効果的な条件下において、酵素のための基質と接触する。当業者が認識するように、酵素活性に効果的な条件は、選択される酵素、酵素活性および基質により変化する。キナーゼ反応に対し、通常、ＡＴＰを含有させる。接触段階のためのインキュベーション条件は、例えば、酵素濃度、基質濃度、温度および時間において変化しうる。一態様において、インキュベーション温度条件は通常は約１５から約４０°Ｃであり；幾つかの態様において、前記温度は約２０−２５°Ｃ等の室温付近でもよい。

接触段階は、酵素活性の潜在的モジュレータの存在下で実行される。幾つかの態様において、酵素、基質および潜在的モジュレータの混合物は、次いで、上記のように第１の結合パートナーおよびルミネッセンストレーサと接触して被験試料を生成させる。前述のように、これらの態様において、第１の結合パートナーまたはルミネッセンストレーサのいずれか一方はルミネッセンス金属錯体を含み、他方は蛍光アクセプター部分を含んでなる。

一態様において、酵素、基質および潜在的モジュレータの混合物は、第１の結合パートナーおよび適宜トレーサと接触して被験試料を生成させる。これらの実施例では、第１の結合パートナーまたは基質のいずれか一方はルミネッセンス金属錯体を含有み、他方は蛍光アクセプター部分を含んでなる。このような場合、酵素活性により、標識基質の標識生成物への転換が発生しうる。基質上に蛍光アクセプター部分またはルミネッセンス金属錯体を包含することにより、標識基質から生成物を生成する酵素の能力に実質的な影響を及ぼしてはならない。加えて、基質（または生成物）上に蛍光アクセプター部分またはルミネッセンス金属錯体を包含することにより、特異性を有する基質（または生成物）に対する第１の結合パートナーのＫ_ｄに実質的な影響を及ぼしてはならない。

幾つかの態様において、被験試料は、典型的には２５０ｎｍから７５０ｎｍの波長範囲の、少なくとも１つの波長の光（例えば、ルミネッセンス金属錯体の吸光バンドの波長）にも曝露され、被験試料からの蛍光発光が測定される。蛍光発光は、上記のように適切な知恵時間の後に測定され、時間分解蛍光発光測定の結果が得られる。

幾つかの態様において、例えば、第１の結合パートナーがルミネッセンス金属錯体で標識され、基質が蛍光アクセプター部分で標識される態様のように、トレーサは無標識でもよい。無標識トレーサと第１の結合パートナーとの結合に影響する適切な標識化合物（例えば、標識基質、標識生成物、標識被験化合物）により、無標識トレーサと標識された第１の結合パートナーとで生成した複合体が破壊されると、ＲＥＴの増大または低下が生じうる。

潜在的モジュレータは、被験試料の蛍光発光計測が、潜在的モジュレータの無い対照試料の蛍光発光計測と異なるときに、酵素活性のモジュレータであると同定される。上記のように、対照試料と比較して統計的有意差がなければならない。当業者であれば、差異が統計的有意差であるか否かは、測定の種類および実験条件に依存することを認識するであろう。計測を比較するときに、統計的有意差は潜在的モジュレータが更なる研究を正当化しうることを示すと理解されよう。通常は、χ２乗検定、スチューデントのｔ検定、マン・ホイットニー検定、またはＦ−検定等の、適切なパラメータまたはノンパラメトリックな統計により、ｐ＜０．０５における差異は統計的有意差と見なされる。幾つかの態様において、ｐ＜０．０１、ｐ＜０．００５またはｐ＜０．００１において、差異は統計的有意である。

本発明の方法は、いずれもハイスループットまたはウルトラハイスループットの手法における実施に変更しうる。例えば、酵素のモジュレータを同定する方法は、複数の基質のそれぞれを特定の酵素および潜在的モジュレータと接触させ、複数の酵素混合物を生成するように変更しうる。次いで、各酵素混合物は、適切な第１の結合パートナーおよびルミネッセンストレーサと接触して被験試料を生成し、前述のように励起および測定段階に供する。当業者であれば、この種のハイスループットの方法は、特にマルチウェルプレートまたは二次元配列パネルフォーマットに受け入れ可能であることを認識するであろう。マルチウェルプレートをインキュベートし、モニタする装置は、当業に公知である。

本発明の方法のダイナミックレンジ、品質および安定性は、統計学的に評価しうる。例えば、Ｚ′−Ｆａｃｔｏｒは、アッセイシグナルのダイナミックレンジおよびシグナル計測に伴う変動を反映するように設計された統計である。シグナル対ノイズ（Ｓ／Ｎ）またはシグナル対バックグラウンド（Ｓ／Ｂ）比は、試料およびバックグラウンド計測の可変性ならびにダイナミックレンジを考慮していないため、単独ではこの点に関しては満足できない。Ｚ′−Ｆａｃｔｏｒはこれらの因子を考慮しており、無次元であるため類似のアッセイを比較するために使用できる。通常は、本発明のアッセイでは０．５以上のＺ’因子が得られる。Ｚ’因子の測定法は、当業者に公知である。Ｚ’因子は、方法のダイナミックレンジを評価することにより決定してもよい。

製品および装置
本発明は、キットおよび記載した本発明の実施に有用な装置等の、製品も提供する。通常は、キットは、容器等のパッケージ材、および第１のおよび／または第２の結合パートナとして有用な１以上の組成物を含んでなる。幾つかの態様において、キットは、以下の１つ以上を含みうる：マルチウェルプレート、１以上の酵素、バッファおよびキット使用のための取扱説明。

本発明のキットは、本発明の１以上の方法を実施するよう設計してもよい。さらに、これらのキットは、本願明細書に記載の１以上の組成物を含んでもよい。付録Ａに、例えば、本発明のキットに含まれうる手順を収載する。

装置は、通常、試料室および試料室を少なくとも１つの波長の光（例えば、２５０ｎｍ〜７５０ｎｍの範囲）で照光する手段を含んでなる。加えて、装置は、試料室から放出される光（例えば蛍光）を検出する手段を含んでなる。

製品およびサービス提供方法
本発明は、さらに、本発明の種々の局面を他者（例えば顧客）に提供するための方法を提供する。これらの方法は、通常は次の段階の少なくとも１つを含んでなる：（ａ）製品またはサービスを広告する段階、（ｂ）前記製品またはサービスの１以上の注文を受け付ける段階、（ｃ）適宜有形の材料またはサービスから生じるデータを送達する段階を伴い、前記製品を供給する段階またはサービスを実施する段階、（ｄ）前記注文を発した団体に請求書を供給する段階、（ｅ）前記請求書の支払いが発生することを確認する段階、ならびに（ｆ）前記支払いを処理する段階（例えば、払い出しの現金化、銀行預金の借方記入、他）。

特定の局面において、本方法は、本願明細書に提供の製品またはサービスを購入するための購入機能を、顧客に対して供給することにより、収入を生成する方法である。例えば、前記購入機能は、電話注文システム、直接販売代理人、または本願明細書に開示の製品またはサービスを購入するためのリンクの視覚的表示をモニタ上に呈するコンピュータシステム利用を提供することを含んでなる本方法は、さらに、視覚的表示が選択されるときに起動する、コンピュータ発注機能を提供することをさらに含みうる。

特定の態様において、本発明は、サービス由来のデータを団体に提供し、サービスへの支払いを回収する、団体向けサービスの実施を部分的に指向する。こうしたサービスは、例えば本願明細書に記載の方法およびアッセイの利用のように、分子修飾の検出および／または同定に関連するアッセイに指向する場合がしばしばある。

タンパク質アレイを用いる方法
ユビキチン化酵素、またはユビキチン化酵素を基質上に固定されたポリペプチドに接触することによりユビキトンをポリペプチドにコンジュゲートする他の酵素のための基質を検出する方法を、本願明細書にて提供する。また、ユビキチン化様酵素を基質上に固定されたポリペプチドに接触ことによりユビキチン化様酵素（または、ユビキチン様タンパク質をポリペプチドにコンジュゲートする他の酵素）のための基質を検出する方法も、本願明細書にて提供する。当該方法は、基質上に固定された複数のポリペプチドを含んでなる位置アドレス指定可能なアレイを、検出可能部分を有するユビキチン（または検出可能部分を有するユビキチン様タンパク質）およびユビキチン化酵素と接触させる段階、および前記検出可能部分を検出する段階を含みうる。通常、前記検出する段階は、例えば、検出可能部分が検出されるアレイ上の位置を同定することにより、ユビキチン、ＳＵＭＯまたはＮＥＤＤ８等のユビキトンを伴う複数のポリペプチドのポリペプチドを同定する段階を含んでなる。ユビキチン化反応のための反応条件は本願明細書にて提供され、ユビキトンを基質へ追加する他の方法のためのものを含んでなる。図示の局面において、ユビキチン化酵素は、Ｅ１、Ｅ２およびＥ３を含有んでなる。

本発明の特定の局面は、基質が脱ユビキチン化酵素であることを同定する方法を提供する。従って、本方法は、さらに、位置的にアドレス指定可能なアレイを脱ユビキチン化酵素でインキュベートする段階、前記検出可能部分で標識されたポリペプチドを、前記脱ユビキチン化との接触の前後で比較することにより前記検出可能部分を検出して、前記脱ユビキチン化酵素のための基質を同定する段階を含みうる。通常は、前記接触させる段階は、酵素が基質からユビキチンを除去しうる有効な期間の間インキュベートする段階を含んでなる。明確に言えば、これらの方法は、ユビキチン様タンパク質を利用し、ユビキチン様タンパク質の除去を測定／検出して実施することもできる。本発明の方法は、例えば、脱ユビキチン化、脱ＳＵＭＯ化、脱ＮＥＤＤ化および脱ＩＳＧ化の測定に使用できる。

別の態様において、基質に固定された複数のポリペプチドを含んでなる位置的にアドレス指定可能なアレイを、検出可能部分およびサンプル（例えば細胞溶解物）を伴うユビキトンと接触させ、前記検出可能部分を検出することにより、試料（例えば、細胞溶解物）のユビキチン化活性を同定および／または測定する方法を、本願明細書にて提供する。幾つかの態様において、本方法は、例えば、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、ＮＥＤＤ化およびＩＳＧ化の活性を同定および／または測定するためのものである。

他の態様において、本願明細書にて、基質に固定された複数のポリペプチドを含んでなる位置的にアドレス指定可能なアレイを、検出可能部分を伴うユビキトンおよびユビキチン化酵素と接触させ、（検出可能部分を伴うポリペプチドを適宜検出し）、前記アレイを試料（例えば細胞溶解物）と接触させ、検出可能部分を検出し、例えば、細胞溶解物との接触の前後において検出可能部分を伴うポリペプチドを比較し、対照アレイと比較することにより、脱ユビキチン化基質を同定し、試料（例えば細胞溶解物）の脱ユビキチン化活性を同定する方法を、提供する。別の態様において、本願明細書にて、ポリペプチドがユビキトン（例えば、検出可能部分を伴う）を含む、基質に固定された複数のポリペプチドを含んでなる位置的にアドレス指定可能なアレイを、試料（例えば細胞溶解物）と接触させ、（検出可能部分を伴うポリペプチドを適宜検出し）、例えば、細胞溶解物との接触の前後において検出可能部分を伴うポリペプチドを比較して脱ユビキチン化基質を同定することにより、試料（例えば細胞溶解物）の脱ユビキチン化活性を同定する方法を提供する。幾つかの態様において、複数のポリペプチドのポリペプチドは、検出可能部分（例えば蛍光タンパク質）を伴う（例えば、融合タンパク質の一部として融合した）ユビキチンを含んでなる。

本発明は、例えば、バイオマーカの同定等、異なる試料（例えば、さらに細胞の分子的差異を特性分析するための、異なる集団の細胞溶解物）を比較するために使用できる試料（例えば細胞溶解物）の、ユビキチン化または脱ユビキチン化しない活性を同定する方法を提供する。一態様において、前記異なる試料は、（例えば、細胞溶解物である）異なる細胞集団に由来する。異なる細胞集合は、異なる生物体、異なる発生状態、癌対良性対通常等の異なる疾病状態、異なる症状への曝露、異なる化合物への曝露、異なる器官由来の細胞、および／またはこれらの組み合わせを含みうる。

検出可能部分は、非限定的な実施例として、ビオチン、アビジン、エピトープまたは蛍光部分を含みうる。検出可能部分は、ユビキチンを共有結合的に、または非共有結合的に伴いうる。幾つかの態様において、検出可能な標識は、例えばユビキチンまたはユビキチン様タンパク質に結合する標識抗体等、検出可能部分で標識される抗体により提供される。

本願明細書にて提供のポリペプチドアレイを含んである方法は、いずれも、ユビキチン化または脱ユビキチン化酵素との接触の期間中、酵素および／またはポリペプチドを被験化合物と接触させる段階を含んでなる。

本発明のタンパク質アレイの局面のためのポリペプチドは、各タンパク質が固定担体の異なる位置にあり、複数のポリペプチドを含んでなり、基質上に固定されて位置的にアドレス指定可能なアレイを生成しうる。ポリペプチドは、平方センチメートルあたり、例えば、少なくとも１００、２００、２５０、３００、４００、５００、１０００、２５００、５０００、または１０，０００ポリペプチドの密度でアレイに固定されうる。ポリペプチドは、少なくとも１００、２００、２５０、５００、１０００、２５００、５０００、７５００、１００００または単一生物種の全ての発現したポリペプチドを含みうる。ポリペプチドは、構造的に関連する、および／または、同じタンパク質ファミリーのメンバーでありうる。ポリペプチドは、第２の修飾を含みうる。特定の態様において、ポリペプチドの長さは少なくとも２０、２５、５０、１００、２５０、５００、または１０００アミノ酸でありうる。アレイは、当業に公知の方法により形成されうる。

本発明のプロトアレイは、検出手段としてＲＥＴを利用しうる。例えば、ＲＥＴ（ＦＲＥＴまたはＴＲ−ＦＲＥＴ等）可能な２つの部分を使用できる。幾つかの態様において、複数のポリペプチドは、例えばドナーまたはアクセプター部分等、ＲＥＴペアのメンバーを伴う。幾つかの態様において、複数のポリペプチドは、融合タンパク質として発現することにより、例えば蛍光タンパク質（ＧＦＰ等）を伴う。幾つかの態様において、ユビキチンまたはユビキチン様タンパク質は、例えばドナーまたはアクセプター部分等、ＲＥＴペアのメンバーを伴う。幾つかの態様において、ユビキチンまたはユビキチン様タンパク質は、ランタニド金属錯体で標識される。幾つかの態様において、ユビキチンまたはユビキチン様タンパク質は、ＲＥＴペアのメンバーで標識される抗体を利用し、間接的に標識される。

幾つかの態様において、本方法またはアッセイは、ユビキチンの２つの集団、ユビキチン様タンパク質の２つの集団またはユビキチンの集団およびユビキチン様タンパク質の集団を取り込み、ここに、１つの集団はドナー部分を伴い、第２の集団はアクセプター部分を伴う。関連する態様において、アレイのポリペプチドは、ユビキチンまたはユビキチン様タンパク質の２つの集団が付加することによりＲＥＴを生じる、充分な密度を有する。従って、本願明細書に記載の種々の方法およびアッセイは、このフォーマットを利用しうる。

ＲＥＴを利用するアッセイおよび方法は、ドナー部分由来の発光のＲＥＴの増強、低下、または変化のないこと、アクセプター部分由来の発光の増強、低下、または変化のないこと、またはこれらの組み合わせおよび／または比率を検出する段階を取り込んでもよい。

本発明の態様は、少なくとも１つのユビキチン化またはユビキチン化様酵素のための少なくとも１つの基質を検出するための方法を提供し、当該方法は、ａ）ｉ）少なくとも１つのユビキチン化またはユビキチン化様酵素を、ｉｉ）基質上に固定したポリペプチドおよびｉｉｉ）検出可能部分を含んでなる少なくとも１つのユビキチン化またはユビキチン化様酵素と接触させる段階、ｂ）（ａ）をユビキチン化またはユビキチン化様酵素が活性化しうる条件下でインキュベートする段階、ｃ）基質上の任意のポリペプチドを伴う前記検出可能部分を検出する段階、を含んでなる。本発明の態様は、試料の脱ユビキチン化活性を同定または測定する方法を提供し、当該方法は、ａ）ｉ）試料をｉｉ）基体上に固定した少なくとも１つまたは複数のポリペプチドと接触させる段階、ここに前記少なくとも１つまたは複数のポリペプチドは、検出可能部分を含むユビキチン化またはユビキチン化様酵素を含んでなり、前記脱ユビキチン化活性は基体からの検出可能部分の解離を生じ、ｂ）（ａ）を脱ユビキチン化の活性に適切な条件下でインキュベートする段階、ｃ）基体上の任意のポリペプチドを伴う前記検出可能部分を検出する段階、を含んでなる。

ホスホジエステラーゼ活性の検出
ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）は、製薬ターゲットとして重要な関心酵素の種類である。ホスホジエステラーゼは、ホスホジエステル結合を切断してリン酸および水酸基を生成する。ｃＡＭＰ等の環状ヌクレオチドモノリン酸基質の場合、水酸基およびリン酸は同一分子内にあり、リン酸ジエステルの切断により、図４２Ａに示すようにヌクレオチドモノホスリン酸（ＡＭＰ等）が生成する。

リン酸ジエステル合成は、科学文献に記載されている（例えば、Ｆｒｉｅｄｍａｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、７２巻、１号、６２４−６２５ページ、１９５０年）。一般に、塩化ホスホリルは、水酸基を含む化合物とピリジン／ベンゼン混合物中で反応してジクロロホスホリルエステルを生成し、これは水酸基を含む同一または異なる化合物の第２の当量と反応して、モノ−クロロリン酸ジエステルを生成し、次いで加水分解により対応するホスホジエステルを与える。図４２Ｂに、この実施例を模式的に示す。

ホスホジエステラーゼのための比色アッセイは、酵素的切断により、パラニトロフェノールおよびパラニトロフェノールリン酸塩を生成する基質として、ビス−（４−ニトロフェニル）リン酸塩の使用を含んでなる。（Ｋｅｌｌｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１４巻、２２号、４９８３−８ページ、１９７５年）次いで、パラニトロフェノールは４１０ｎｍの吸光度により検出される。ＢｅｒｋｅｓｓｅｌおよびＲｉｅｄｌ（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇ．、３６巻、１４８１−１４８３ページ、１９９７年）は、ナフタレン残基が蛍光原子団として作用し、アゾベンゼン部分が消光原子団として作用する、消光性蛍光基質の使用を記載している。ナフタレンおよびアゾベンゼンは、消光原子団を蛍光原子団から切り離すホスホジエステラーゼによって切断されるホスホジエステル結合を介して連結される。Ｔａｋａｋｕｓａおよび共同研究者らは、リン酸ジエステル部分で連結したＦＲＥＴペアを含む基質を用いるホスホジエステラーゼのための、ＦＲＥＴ系アッセイを記載した。（Ｔａｋａｋｕｓａら、Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．、１２４巻、８号、１６５３−７ページ、２００２年）．彼らが報告した基質ＣＰＦ４（クマリン−リン酸−フルオレセイン）は、クマリンとフルオレセインの間でインタクトな状態でＦＲＥＴが可能であり、蛇毒ホスホジエステラーゼＩによる切断によりＦＲＥＴは低下した。

本発明は、ホスホジエステラーゼ活性を検出する方法を提供する。幾つかの態様において、これらの方法は、抗体によるリン酸部分（リン酸モノエステル）の特異的認識に基づく。幾つかの態様において、本方法は、環状モノエステル／リン酸の特異的認識に基づく。幾つかの態様において、抗体は、リン酸化生成物に対するアフィニティに対し、未切断リン酸ジエステルへの低い結合アフィニティを示す。

ネオエピトープ系アッセイ
「ネオエピトープ」は、抗体により認識されるために、カバーを外されるか、マスクを外されるか、または他の方法で出現するエピトープを指す。幾つかの態様において、エピトープが抗体により結合されうイベントに先立ち、減少または検出不可能な結合が存在する。例えば、抗体は、反応生成物に対するアフィニティを示すが、出発化合物に対するアフィニティはより低いか全くない。幾つかの態様において、生成物はＲＥＴペアのメンバーを含み、抗体はＲＥＴペアの第２のメンバーを含み、抗体は生成物に対する結合特異性を有する。

本発明の態様は、ホスホジエステラーゼを介する切断により発生するリン酸が、抗体に対するエピトープとして作用するストラテジを利用する。本発明の態様は、例えば、図４２Ｄおよび図４２Ｅに示すように、ＲＥＴペアの第１のメンバー（例えば蛍光原子団）にフリーのリン酸を結合することにより、およびＲＥＴペアの第２のメンバー（例えばテルビウムキレート）を有する抗体を標識することにより、ホスホジエステラーゼを測定／検出する方法を提供する。幾つかの態様において、蛍光性を改変したｃＡＭＰを基質として用いる。幾つかの態様において、ｃＡＭＰに類似しない、またはこれではない蛍光標識リン酸ジエステルを基質として用いる。

２、６、８または２’位置（図４２Ｃ）に付加したアミノアルキルリンカーを含んでなるサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）類縁体は、Ｂｉｏｌｏｇ社（Ｂｒｅｍｅｎ、ドイツ）から市販入手可能である。本発明の態様は、ホスホジエステラーゼ基質として、ｃＡＭＰのフルオレセイン標識バージョンを利用する。理想的には、ホスホジエステラーゼのための基質として利用しうる能力、または抗ＡＭＰ抗体等の、ＲＥＴアッセイにおける性能を比較するために、多くの類縁体を調製してもよい。図４２Ｄに、実施例も示す。

一態様において、標識（例えばフルオレセイン）ホスホジエステラーゼ基質を、標識（例えばテルビウム）抗ＡＭＰ抗体の存在下で、ホスホジエステラーゼと共にインキュベートする。幾つかの態様において、リン酸ジエステルが切断されると、ＡＭＰは抗体により認識され、抗体の標識（Ｔｂ）およびフルオレセインは近接してＦＲＥＴまたはＴＲ−ＦＲＥＴが発生する。抗体は、反応の前、期間中、または後に加えうる。抗体が反応の期間中に存在する場合には、反応はリアルタイムで、または動力学モードで読み取られうる。このようにして、反応の進行および／または速度を測定しうる。

Ｈｏｈｍａｎら（ＰＮＡＳ、７７巻、１２号、７４１０−７４１４ページ、１９８０年）は、ＡＭＰ特異的な抗体を記載している。

ホスホチロシンのアンマスキング
本発明の態様は、公知で直ちに利用しうる抗体を用いるホスホジエステラーゼ活性において発生するエピトープとしての、ホスホチロシンの使用に基づく。

一態様において、基質は、ホスホジエステル結合を介して他の官能基に結合するＲＥＴペア（例えばフルオレセイン）の第１のメンバーで標識されるホスホチロシンを含んでなる。「別の」官能基の正確な同定は重要ではないが、異なる官能基が基質として性能の差を導きうるか、または基質溶解度等を増加しうることも期待できる。図４２Ｅに、このタイプのアッセイの実施例を示す。酵素の特異性により、４以下の生成物をエステル加水分解の部位に応じて生成しうる。チロシン部分に付加しないホスホエステル部位で切断が発生するときは、このアッセイは生成物を検出し、これにより、フルオレセイン標識が付いたホスホチロシンは酵素活性の後にインタクトのままとなる。次いで、この分子は、ＲＥＴペア（例えばテルビウム）の第２のメンバーで標識された抗ホスホチロシン抗体（例えば、ＰＹ２０等）により検出される。標識抗体がフルオレセイン標識ホスホチロシンに結合すると、ＲＥＴが可能となる。

フルオレセイン標識ホスホチロシンは、テルビウム標識ＰＹ２０に高いアフィニティを有して認識され、この相互作用において高ＴＲ−ＦＲＥＴシグナルが発生する（データ呈示なし）。フルオレセイン標識ホスホチロシン基質のための幾つかの態様において酵素的切断部位がチロシンに付加した酸素である場合は、生成したフルオレセイン標識分子は抗体により認識されず、従って、ＲＥＴ（例えばＴＲ−ＦＲＥＴ）シグナルは発生しない。

本発明の幾つかの態様において、図４２Ｆに示すように、ホスホチロシンのアンマスキングによってホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）活性を検出するために、基質を使用できる。この基質、すなわち、ビス−（フルオレセイン−チロシン）リン酸は、２つの生成物を生じ、その１つは抗体により認識される。本実施例において、生成物の両者は蛍光を有し、従って、余剰フルオレセインが存在するために蛍光バックグラウンドが増加する場合がある。幾つかの態様において、２つの抗体を使用できる。一方はホスホチロシンに向かい、他方はチロシンに向かう。

２、６、８またはｃＡＭＰの２’位置を修飾する蛍光標識ｃＡＭＰ類縁体は、市販入手可能な出発材料型直ちに合成可能であるか、または、市販入手可能な製品である（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、８−（６−アミノヘキシル）アミノアデノシン３’，５’−サイクリックモノフォスファート、ｂｉｓ（トリメチルアンモニウム）塩（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ ｃＡＭＰ）、パーツ番号Ａ３５７７５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社から入手可能）。

テルビウムキレート標識抗体は、標準的な抗体標識技術および市販のアミン反応性テルビウムキレートを用いて直ちに調製される（例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）Ａｍｉｎｅ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｔｂ Ｃｈｅｌａｔｅ、パーツ番号ＰＶ３５８１）。

本発明の関連した態様は、適切なシグナル変化の発生に必要な酵素量に関し、より高感度なアッセイを提供する。

本発明のいくつかの態様は、次式の構造の基質を含んでなる。

式中、ＡまたはＤのいずれか（または両方）は蛍光部分であり、加水分解酵素により切断されると、ＲＥＴアッセイにおいて蛍光部分ＡまたはＤと共にパートナーとして作用しうるルミネッセンスプローブが付加した抗体によって認識される生成物を生じる。

本節「ホスホジエステラーゼ活性の検出」に記載のアッセイおよび方法は、これらの反応を調節する化合物／試料を同定するためにも使用できる。例えば、化合物を反応に加え、例えば、化合物が反応を調節するかどうかを計測するために、その反応を対照と比較する。調節には、反応の阻害または活性化を含んでなる。

本節「ホスホジエステラーゼ活性の検出」に記載のアッセイおよび方法は、本願明細書に適切であると記載した、他のアッセイおよび方法に類似したフォーマットにおいて稼動しうる。また、本願明細書に記載のアッセイまたは方法が抗体を用いる場合、本発明は基本的に、この抗体と置き換えてまたは追加して使用できる、同じ特性を有する任意の結合分子を含んでなることを理解されたい。

本発明は、ホスホジエステラーゼ基質がＲＥＴペアの第１のメンバーで標識されるホスホジエステラーゼアッセイを提供し、ここにホスホジエステラーゼによる切断により、抗体が結合するエピトープが曝露／作製される。ＲＥＴペアの第２のメンバーで標識される抗体は反応生成物と接触し、ここに抗体はエピトープおよびＲＥＴペアの第１のメンバーを含んでなる生成物と結合する。このようにして、適切な波長の光に曝露すること等により、ＲＥＴペア部分の間にＲＥＴが可能になる。幾つかの態様において、ホスホジエステラーゼによる切断が抗体のためのエピトープを除去／破壊することを除いては、同様のフォーマットに従う。

本発明のいくつかの態様は、ホスホジエステラーゼ活性を検出する方法を提供し、当該方法は以下を含んでなる。ａ）ｉ）試料を、ｉｉ）基質がＲＥＴペアの第１のメンバーを含むホスホジエステラーゼのための基質と接触させて被験試料を生成させる段階と、ｂ）ホスホジエステラーゼ活性に適する条件下で（ａ）をインキュベートする段階と；ｃ）被験試料を（ｂ）の前、期間中、後で、ホスホジエステラーゼの切断生成物について特異性を有する結合分子と接触させる段階であって、ここに前記結合分子はＲＥＴペアの第２のメンバーを含んでなり、前記切断生成物はＲＥＴペアの第１のメンバーを含んでなる段階と；ｄ）被験試料を少なくとも１つの波長の光に曝露する段階と；および、ｅ）被験試料からの蛍光発光を測定する段階。幾つかの態様において、被験試料からの蛍光発光は、対照試料／反応物のものと比較される。

実施例
以下、下記実施例を参照して本発明を説明する。下記実施例は説明を意図するものであり、本発明を限定するものではない。これらの実施例は説明を目的としてのみ提供され、本発明がこれらの実施例に限定されるとは決して解釈すべきでなく、むしろ、本明細書で提供された教示の結果、明らかになる任意のおよび全ての変更を包含すると解釈すべきである。

実施例１：発光金属キレートによる抗体標識
１２〜１４０００ＭＷＣＯの透析膜を用いて１００ｍＭの重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）中、リン酸化チロシン（例えば、タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）によりリン酸化された配列）を含有するアミノ酸配列を優先的に結合する抗体である、精製ＰＹ７２（抗ホスフォチロシン）ＩｇＧ抗体１ｍｇを１．５時間透析した。（ＰＹ７２ハイブリドーマ細胞はソーク研究所から入手したが；免疫原はＫＬＨにコンジュゲートしたホスフォチロシンだった。腹水は、インディアナ州インディアナポリスのハーランバイオプロダクツフォーサイエンスによって製造された。プロテインＧカラム（ピアース）によって腹水を精製した。精製抗体はまた、カリフォルニア州バークレーのコバンスからも入手可能である（品番ＭＭＳ４１４Ｐ））。次いで抗体を透析膜から取り出し、セントリコンＹＭ５０（ミリポア）濃縮器を用いて４８．８μＭ（７．３ｍｇ／ｍＬ）に濃縮した。この抗体溶液１００μＬを、１００ｍＭ重炭酸ナトリウム（ｐＨ９．５）中の１０ｍＭのリン酸フェニルおよび６６０μＭのカルボスチリル１２４−ジエチレントリアミンペンタ酢酸−フェニルアラニン−イソチオシアネート（ＣＳ１２４−ＤＴＰＡ−Ｐｈｅ−ＮＣＳ^＊Ｔｂ、図３を参照）（最終濃度）から成る標識反応物で５ｍｇ／ｍｌ（３３．４μＭ）に希釈した。３０分ごとに軽く撹拌しながら、室温にて反応物を４時間インキュベートし、次いで、それぞれトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）で１．５時間、２回透析し、未反応および／または加水分解キレートを除いた。３４３ｎｍにおけるＣＳ１２４部分の吸収（Ｅ_３４０＝１１，４４０Ｍ^−１ｃｍ^−１）により、抗体に結合したキレートの量を定量し、２８０ｎｍにおける吸収（Ｅ_２８０＝２１０，０００Ｍ^−１ｃｍ^−１）により抗体量を定量し、２８０ｎＭでのＣＳ１２４の吸収を補正した（３４３ｎＭでの吸収の１．１倍）。これらの測定から、反応により抗体当たり平均５．８のキレートで標識された抗体を生成することが判明した。

リン酸化セリンに特異性を有するモノクローナル抗体（抗−ｐＳｅｒ；リン酸化セリンは、セリン／スレオニンキナーゼ活性の産物である）も調製し、上述のように発光金属キレートで標識した。

実施例２：タンパク質チロシンキナーゼ産物トレーサ（ＰＴＫトレーサ）と抗ＰＴＫ産物（ＰＹ７２）抗体の結合曲線実験
ＦＰ希釈緩衝液（品番Ｐ２８３９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、米国カリフォルニア州）中、連続希釈した標識抗体（１０ｎＭ〜９．８ｐＭの２倍希釈）を１ｎＭの蛍光アクセプター標識トレーサ（ＰＴＫ標識トレーサ；配列Ｆ−ＡＤＥ（ｐＹ）ＬＩＰＱＱＳでＦはフルオレセイン、ｐＹはリン酸化チロシン、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と共にインキュベートし、直接結合曲線（蛍光アクセプター標識トレーサに結合する発光金属キレートで標識したＰＹ７２抗体を示す）を作成した。（トレーサはタンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）の基質のリン酸化されたチロシン誘導体であることに留意されたい）３０分間インキュベートした後、４８５ｎｍ励起フィルタ（２０ｎｍバンドパス）および５３５ｎｍ発光フィルタ（２５ｎｍバンドパス）を用い、Ｔｅｃａｎ Ｕｌｔｒａプレートリーダで、プレートにおける各組成の蛍光偏光を読み取った。ウェル当たり１０回の閃光および４０μｓの積算時間を用いてデータを集めた。抗体は、１ｎＭよりやや高いＥＣ５０値でトレーサに結合することが分かった。

発光金属キレートで標識した抗ｐＳｅｒ抗体と蛍光アクセプター標識トレーサ（ＳＴＫ標識トレーサ、配列、Ｆ−ＧＲＰＲＴＳ（ｐＳ）ＦＡＥＧでＦはフルオレセイン、ｐＳは、リン酸化セリンであり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）によって同様の結合曲線を作製した。（トレーサは、Ｓ／Ｔキナーゼ（ＳＴＫ）の基質のリン酸化セリン誘導体であることに留意されたい）

実施例３：標識キナーゼ産物トレーサと非標識キナーゼ産物との間の競合曲線
上述のような１０ｎＭＴｂ−キレート標識ＰＹ７２抗体および１ｎＭ標識ＰＴＫ標識トレーサの存在下、連続希釈した（１０μＭ〜１９．５ｎＭの２倍希釈）ペプチド競合物（ＡＤＥ（ｐＹ）ＬＩＰＱＱＳ、ｐＹはリン酸化チロシン、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を含有する非標識ホスフォチロシンをインキュベートし、抗体−トレーサ相互作用の崩壊が、同一試料からの蛍光偏光および時間分解ＲＥＴの双方によってモニターできたことを示す競合曲線を作製した。３０分間インキュベートした後、Ｔｅｃａｎ Ｕｌｔｒａプレートリーダでプレートを読み取った。４８５ｎｍ励起フィルタ（２０ｎｍバンドパス）および５３５ｎｍ発光フィルタ（２５ｎｍバンドパス）を用いて蛍光偏光を測定した。３４０ｎｍ励起フィルタ（３５ｎｍバンドパス）および４９５ｎｍ（１０ｎｍバンドパス）と５２０ｎｍ（２５ｎｍバンドパス）のフィルタを用い、ウェル当たり１０回の閃光で１００μｓの閃光後遅延の後、２００μｓの積算窓を用いて、時間分解ＲＥＴを測定した。５２０ｎｍのシグナルを４９５ｎｍのシグナルで割ることにより、時間分解ＲＥＴ値（比）を算出した。ＴＲ−ＲＥＴまたはＦＰにより生成した曲線の形状はほとんど重なって見え、これはＦＰまたはＴＲ−ＲＥＴまたは双方を用いてホスフォペプチド（例えば、キナーゼ反応によって生成するもの）の存在が検出できたことを示している。

実施例４：マルチモードＦＰおよびＴＲ−ＲＥＴ測定を用いたキナーゼ活性のモジュレータとしての試験化合物のスクリーニング
タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）酵素のＳＲＣファミリーの一員であるＬｙｎＢキナーゼの阻害剤を同定するための化学物質ライブラリーのスクリーニングを行った。１０μＭＰｒｅｓｔｗｉｃｋライブラリー化合物（試験化合物；ワシントンＤＣのＰｒｅｓｔｗｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｉｎｃ．社から入手可能なＰｒｅｓｔｗｉｃｋライブラリー）の存在下で、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１５０ｎＭ ポリ（Ｇｌｙ：Ｔｙｒ、４：１）タンパク質チロシンキナーゼ基質、および１０μＭ ＡＴＰ中にて、反応当たり１ｎｇ ＬｙｎＢキナーゼを用いてキナーゼ反応を行った。キナーゼ反応を室温で１時間進行させ、次いで総量４０μｌにて最終濃度５ｍＭになるように１００ｍＭのＥＤＴＡを加えて反応を停止させた。ホスフォペプチド産物の存在を検出するため、２０ｎＭのＴｂ−キレート標識ＰＹ７２抗体および１０ｎＭのＰＴＫ標識トレーサを含有する溶液１０μｌを各ウェルに加え、さらに３０分間インキュベートした。次いで、蛍光偏光および時間分解ＲＥＴ双方の測定モードでのＴｅｃａｎ Ｕｌｔｒａプレートリーダでプレートを読み取った。４８５ｎｍ励起フィルタ（２０ｎｍバンドパス）および５３５ｎｍ発光フィルタ（２５ｎｍバンドパス）を用いて蛍光偏光を測定した。３４０ｎｍ励起フィルタ（３５ｎｍバンドパス）および４９５ｎｍ（１０ｎｍバンドパス）と５２０ｎｍ（２５ｎｍバンドパス）のフィルタを用いて、ウェル当たり１０回の閃光で１００μｓの閃光後遅延の後、２００μｓの積算窓を用いて、時間分解ＲＥＴを測定した。５２０ｎｍのシグナルを４９５ｎｍのシグナルで割ることにより時間分解ＲＥＴ値（比）を算出した。キナーゼ阻害剤は、高い偏光または５２０：４９５のＴＲ−ＲＥＴ比を示すウェルにより同定した。約７５０の化合物のスクリーニング結果を示す。

実施例５：多重化ＦＰ／ＴＲ−ＲＥＴアッセイへのＦＰアッセイの変換
テルビウム−キレートはＴＲ−ＲＥＴアッセイにおいてフルオレセインまたはローダミン（およびその誘導体）のような蛍光色素分子に対してドナーとして役立つことができるので、又、フルオレセインおよびローダミンはＦＰアッセイでの使用に優れた特性を有するので、例えば、受容体タンパク質または抗体のような結合パートナーを蛍光テルビウムキレートで標識することによって二重モードのＦＰ／ＴＲ−ＲＥＴ様式で読み取ることができるようにＦＰアッセイを改変することは簡単なことである。多重化モード（例えば、ＦＰおよびＴＲ−ＲＥＴの双方）の使用によって、データの検証ができ、偽陽性または偽陰性の結果を除くことができる。さらに、ＦＰモードまたはＴＲ−ＲＥＴモードのいずれかで問題のあるアッセイは、他のモードを用いて確実なアッセイに変換してもよい。

ＣＲＥＢキナーゼ（セリンキナーゼ）によるサイクリック−ＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質（ＣＲＥＢ）上のＳｅｒ１３３のリン酸化を検出するＦＰアッセイを設計した。アッセイは、リン酸化されたセリンを含有するフルオレセイン標識されたキナーゼ産物トレーサの同定を必要とした。さらに、アッセイは、トレーサを結合することが可能である抗ＣＲＥＢｐＳｅｒ１３３抗体（米国マサチューセッツ州Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から入手可能）を必要とした。以下に示すような４つの候補トレーサペプチドを調製し、抗ｐＳｅｒ１３３抗体への結合について調べた。トレーサは、その長さおよびペプチド上での蛍光色素分子の位置が異なった。
トレーサ１：フルオレセイン−ＬＲＲＥＩＬＳＲＲＰ（ｐＳ）ＹＲＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）；
トレーサ２：フルオレセイン−ＲＥＩＬＳＲＲＰ（ｐＳ）ＹＲＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）；
トレーサ３：フルオレセイン−ＩＬＳＲＲＰ（ｐＳ）ＹＲＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）；および
トレーサ４：ＬＲＲＥＩＬＳＲＲＰ（ｐＳ）ＹＲＫ−フルオレセイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）。

ＦＰモードにて抗体への直接結合で調べると、２つのトレーサは、およそｎＭ Ｋｄの親和性で結合することが分かったが、遊離状態と結合状態の間で１００ｍＰを超える偏光ではどちらも変化を示さなかった。ＦＰアッセイの安定度は、部分的には偏光におけるこの差異の大きさの関数である。３０ｍＰより大きいまたは５０ｍＰより大きいまたは１００ｍＰより大きい偏光変化が一般に好まれるので、アッセイをＴＲ−ＲＥＴアッセイに変換する試みを行った。

ＣＳ１２４−ＤＴＰＡ−Ｐｈｅ−ＮＣＳ^＊Ｔｂ（上記実施例１を参照）で抗ｐＳｅｒ１３３抗体を標識し、抗体当たり平均６．２のキレート分子を有する抗体を得た。４つの候補トレーサペプチドをこの標識抗体に対して別々に滴定した場合、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７は、およそｎＭの親和性で、且つ遊離形態と結合形態の間でＴＲ−ＲＥＴの値に３２倍の変化をもって結合することが分かった。

実施例６：ＴＲ−ＲＥＴアッセイのＺ’−因子を明らかにするＰＫＡ酵素の滴定
３８４穴プレートの２４ウェルにわたってＰＫＡ（セリンキナーゼ）を連続希釈し、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０μＭのＮａＶＯ_４および５μＭのＡＴＰを含有する５０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）中にて１μＭのペプチドＰＫＡ基質（ＬＲＲＥＩＬＳＲＲＰＳＹＲＫ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）と反応させた。最終反応容量は、ウェル当たり１０μＬだった。室温にて９０分間反応を進行させ、その後、１０μＬの反応停止／検出溶液（上記実施例５で同定された標識トレーサ、Ｔｂ−キレート標識の抗ｐＳｅｒ１３３抗体およびＥＤＴＡを含有する）を加えた。プレートに蓋をして、室温で２時間インキュベートした。次いで、３４０／３５ｎｍ励起フィルタおよび５２０／２５、４９５／１０ｎｍ発光フィルタ（クロマテクノロジー社）を用いたＴＥＣＡＮ Ｕｌｔｒａ３８４蛍光プレートリーダでプレートを読み取った。１００μｓの遅延および２００μｓの積算窓によりウェル当たり１０回の閃光を用いてデータを集めた。

アッセイの安定度を評価するため、２．５μＭ非標識トレーサの存在下（２４ウェル；「低シグナル」対照）または非存在下（２４ウェル、「高シグナル」対照）にてＴｂ−キレートで標識した抗ｐＳｅｒ１３３抗体および標識トレーサ（上記を参照）を含有する４８の２０μＬのウェルからＺ’値を決定した。プレートに蓋をして室温で２時間インキュベートした。次いで、上述のパラメータを用いてＴＥＣＡＮ Ｕｌｔｒａ３８４蛍光プレートリーダでプレートを読み取った。Ｚ’値は０．９２だった。

実施例７：多重化ＦＰ／ＴＲ−ＲＥＴアッセイへの核受容体ＦＰアッセイの変換
テルビウムキレートを用いてＦＰアッセイをＦＰ／ＴＲ−ＲＥＴアッセイに変換しうる汎用性を示す。エストロゲン受容体β（ＥＲ−β）をアミン反応性テルビウムキレート（上記実施例１を参照）で直接標識することによりＥＲ ＦＰ競合アッセイを変換した。ＦＰアッセイでは、競合物によりフルオレセイン標識のトレーサが置き換わると、偏光観測は高いほうから低いほうへの変化を生じる。ＴＲ−ＲＥＴアッセイでは、受容体上のテルビウムキレートとトレーサ上のフルオレセインの間のＲＥＴにより、受容体に結合した標識トレーサ量を測定する。競合物の非存在下ではＲＥＴシグナルは高く、競合物がトレーサを置き換えるにつれてこのシグナルは低下する。１２．５ｎＭの非標識またはＴｂ−キレート標識ＥＲ−βタンパク質を１ｎＭの標識トレーサ（Ｆｌｕｏｒｍｏｎｅ ＥＳ２、品番Ｐ２６１３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、米国カリフォルニア州）と共にインキュベートし、連続希釈した非標識エストラジオール、既知ＥＲ−βリガンドにより滴定した。ＦＰアッセイおよびＴＲ−ＲＥＴアッセイは双方共、競合曲線について似たようなＥＣ５０値を示した。さらに、ＴＲ−ＲＥＴアッセイは、限られた濃度の受容体と過剰濃度のトレーサを用いて、類似の結果が期待できる再フォーマットが可能であるという利点を提供する。

実施例８：ＥＧＦＲキナーゼのＦＰアッセイの多重化ＦＰ／ＴＲ−ＲＥＴアッセイへの変換
実施例７で同定された一般的な方法を用いて、ＬＯＰＡＣ（Ｓｉｇｍａ、＃ＬＯ１２８０）化合物ライブラリーを用いて上皮増殖因子アクセプター（ＥＧＦＲ）キナーゼ（タンパク質チロシンキナーゼ）阻害剤をスクリーニングした。双方の読み取りモードで同定されたヒットは全て真のヒットであることが分かったが、読み取りモード間で矛盾を示すヒットは偽りであることが分かった。これらの結果は、読み取りモードをアッセイの範囲内で多重化することによって判定された結果の整合性を有意に改善できることを示している。

１００ｍＭ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）中にて抗ｐ−Ｔｙｒ抗体（Ｚｙｍｅｄ社から入手可能な抗−ｐＹ２０）を５ｍｇ／ｍＬに濃縮した。抗体に対して５〜４０倍のモル過剰量にてＣＳ１２４−ＤＴＰＡ−Ｐｈｅ−ＮＣＳ^＊Ｔｂ（Ｔｂ−キレート）を加え、３０分ごとに軽く撹拌しながら、室温にて反応物を４時間インキュベートした。４時間後、ＰＢＳで２回抗体を透析し、未反応および／または加水分解キレートを除いた。３４３ｎｍにおけるＣＳ１２４部分の吸収（Ｅ_３４０＝１１，４４０Ｍ^−１ｃｍ^−１）により、抗体に結合したキレート量を定量し、２８０ｎｍにおける吸収（Ｅ_２８０＝２１０，０００Ｍ^−１ｃｍ^−１）により抗体量を定量し、２８０ｎＭでのＣＳ１２４の吸収を補正した（３４３ｎＭ吸収の１．１倍）。

抗体標識がフルオレセイン標識のホスフォペプチドトレーサ（実施例２を参照）への親和性に影響するかどうかを判定するため、以前記載したように結合曲線を作製した。抗体当たり９未満のキレート標識比では、トレーサへの親和性は２倍未満しか変化しないことが分かった。

Ｃｏｒｎｉｎｇ社製低容量３８４穴プレート（品番３６７６）中、反応容量１０μＬ（検出容量２０μＬ）において、ＬＯＰＡＣ^１２８０（商標）（Ｓｉｇｍａ、＃ＬＯ１２８０）ライブラリー（１２８０の化合物を含有する）に対する活性に対し、上皮増殖因子アクセプター（ＥＧＦＲ）チロシンキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、米国カリフォルニア州、＃Ｐ２６２８）をスクリーニングした。以下の反応条件下で、ライブラリー化合物１０μＭ存在下にてキナーゼ反応を行った。反応当たりキナーゼ０．１ユニットを用い、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２ｍＭ ＭｎＣｌ_２、０．０５ｍＭ Ｎａ_３ＶＯ_４、１ｍＭ ＤＴＴ、１５０ｎＭ ポリ（Ｇｌｙ／Ｔｙｒ）４：１、ポリ−ＧＴチロシンキナーゼ基質および１０μＭのＡＴＰ。３０℃で９０分間反応を進行させ、その後、ＴＲ−ＲＥＴ希釈緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、米国カリフォルニア州、品番ＰＶ３１５２）中、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、８ｎＭ Ｔｂ−標識抗ｐＴｙｒ（抗ｐＹ７２抗体；実施例１および２を参照）および４ｎＭ ＰＴＫ標識トレーサ（上記実施例２を参照）の溶液１０μＬを加えた。次いで、クエンチした反応物を室温で１時間インキュベートした後、Ｔｅｃａｎ Ｕｌｔｒａプレートリーダで読み取った。４８５ｎｍ励起フィルタ（２０ｎｍバンドパス）および５３５ｎｍ発光フィルタ（２５ｎｍバンドパス）を用いて蛍光偏光を測定した。３４０ｎｍ励起フィルタ（３５ｎｍバンドパス）および２つの発光フィルタ（１０ｎｍバンドパス４９５ｎｍ参照ピーク用、２５ｎｍバンドパス５２０ｎｍシグナル変化測定用）を用い、１００μｓの閃光後遅延に続いて２００μｓの積算窓を用いて時間分解ＲＥＴを測定した。ＴＲ−ＲＥＴフィルタはＣｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製である。ＴＲ−ＲＥＴ値（比）は、５２０ｎｍの試料強度を４９５ｎｍの試料強度で割ることにより決定した。

ＦＰおよびＴＲ−ＲＥＴ読み取りデータを正規化し、直交軸上にプロットした。ＦＰおよびＴＲ−ＲＥＴにより決定した阻害比率において、差異を決定した。この平均から３標準偏差を超える４つの化合物（ＣＢ１９５４、ＧＷ２９７４、エルゴクリスチン、ピロカテコール）をさらなる分析のために同定した。さらに、検出モードと強い阻害の間で強い相関を示す２つの化合物（チロホスチンＡＧ１４７８、ＧＷ２９７４）も追跡プロファイリングのために選択した。

ライブラリーのスクリーニングで記載した条件下で、ＥＧＦＲキナーゼに対し、２つの同定された阻害剤（ＥＧＦＲキナーゼの既知の阻害剤であるチロホスチンＡＧ１４７８およびＧＷ２９７４）を３倍連続希釈にて、相関の低い４つの化合物を２倍連続希釈にてアッセイした。追跡スクリーニングにより、ＡＧ１４７８で見られたものよりも約１０倍低いＥＣ５０を有する、さらに強力な阻害剤としてＧＷ２９７４が同定された。

干渉するバックグランド蛍光の存在下においてもＴＲ−ＲＥＴ検出モードが真のヒットを同定しうることを実証するために（本質的に蛍光であるいずれかのヒットを同定する場合、またはライブラリーにプールされた化合物のスクリーニングにおいて蛍光化合物の存在がヒットの存在を隠す可能性がある場合に有用な判定基準）、１０ｎＭのフルオレセインの存在下、連続希釈した阻害剤、チロホスチンＡＧ１４７８に対してアッセイを行った。ＴＲ−ＲＥＴデータはバックグランド蛍光シグナルに影響されないことが分かったが、ＦＰのデータは大幅に損なわれた。

ＦＰ検出モードとＴＲ−ＲＥＴ検出モードの間で低い相関を示した２つの化合物、ＧＷ５０７４およびエルゴクリスチンは沈殿することが分かり、ＦＰ検出モードにおける見せかけのシグナルが光散乱の人為的な結果である可能性があることを示唆している。散乱によるシグナルは寿命が短いので、ＴＲ−ＲＥＴの読み取りモードに影響することはない。

低い相関を示した他の２つの化合物、ＣＢ−１９５４およびピロカテコールは、アッセイし直し、いずれも阻害剤ではないことが分かった。スクリーニング検査により、これらの化合物がアッセイプレートの隣接するウェルにあることが示され、見せかけの結果を招く系統的誤差を示唆している。

シグナルに検出可能な変化を与えるのに必要とされるリン酸化キナーゼ産物の濃度を評価するため、ＴＲ−ＲＥＴ希釈緩衝液（上記を参照）にて４ｎＭのＴｂ−キレート標識された抗ｐＴｙｒ抗体および２ｎＭのフルオレセイン標識されたＰＴＫトレーサと共に連続希釈した非標識のリン酸化ＰＴＫトレーサ（トレーサに対する競合物産物）をインキュベートした。次いで以前記載したように、ＦＰおよびＴＲ−ＲＥＴ双方のモードでプレートを読み取った。最大半量のシグナル変化に必要とされる競合物量はアッセイモード間でほぼ同一であることが分かり、双方のアッセイは類似する感度を有したことを示している。

アッセイの安定度を評価するため、４ｎＭ Ｔｂ−キレート標識抗ｐＴｙｒ抗体と２ｎＭフルオレセイン標識トレーサ（「高い値」の対照）を含有する６０ウェル、ならびに１μＭ競合ペプチド（「低い値」の対照）に加えて同じ成分を含有する６０ウェルを、以前記載されたようにＦＰおよびＴＲ−ＲＥＴ双方の検出モードで読み取った。Ｚ’値は、Ｚｈａｎｇら、“Ａ Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｐａｒａｍｅｔｅｒ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ａｓｓａｙｓ”、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ、第４巻、２号、６７−７３ページ、１９９９年、に従って計算した。Ｚ’因子は、各アッセイモードについて＞０．８であることが分かった。

実施例９：Ｅｕ（ＩＩＩ）−キレート標識結合パートナーを用いる多重化ＦＰ／ＴＲ−ＲＥＴアッセイ
Ｅｕ−キレート標識結合パートナーも本発明の方法で使用することができる。

ユーロピウム（ＩＩＩ）−キレート標識ＰＹ７２（抗ホスフォチロシン）抗体（実施例１を参照）は、以下のように調製した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、ＰＹ７２抗体２８．４μＭ溶液５０μＬに、ＤＭＳＯ中２１．２５ｍＭ ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）１μＬを加えた。室温にて１時間反応した後、１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）中５０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）５０μＬを加え、反応物を室温にてさらに３０分間インキュベートした。次いで、それぞれ脱気したＰＢＳ緩衝液１Ｌに対して２時間、２回、反応物を透析した。透析後、１Ｍトリス（ｐＨ８．０）中４．２ｍＭ ＴＴＨＡ−ＡＭＣＡ−（２−アミノエチル）マレイミドおよび１０ｍＭ ＥｕＣ１_３を含有する溶液８μＬを抗体溶液に加え、室温にて２時間インキュベートした。次いで標識された抗体を２回（最初は２時間、次いで一晩）透析し、過剰および未反応キレートを除いた。

ＳＰＤＰおよびＴＴＨＡ−ＡＭＣＡ−（２−アミノエチル）マレイミドを用いるＰＹ７２抗体標識

ＦＰ希釈緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、米国カリフォルニア州、品番Ｐ２８３９）中、５ｎＭ Ｅｕ−キレート標識ＰＹ７２抗体および１ｎＭ発光トレーサの存在下で、ペプチド競合物（２μＭ〜１ｎＭの２倍希釈）を含有する連続希釈の非標識ホスフォチロシンをインキュベートすることにより、非標識ホスフォペプチド（例えば、タンパク質キナーゼの酵素反応の産物）によりＥｕ−キレート標識抗体で標識したトレーサの相互作用の破壊が、同一試料の蛍光偏光および／または時間分解ＲＥＴによって測定しうることを示す競合曲線を作製した。発光標識トレーサは、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６３３−ＣＡＤＥ（ｐＹ）ＬＩＰＱＱＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）であり、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６３３（オレゴン州ユージーンのモレキュラープローブズ、品番Ａ２０３４２）Ｃ５マレイミド誘導体が常法（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ染料を含むプロトコルに続いて）を用いてペプチドの末端システインに結合され、常法によってＨＰＬＣで精製されたペプチドである。ペプチド（ＣＡＤＥ（ｐＹ）ＬＩＰＱＱＳ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）は、ＡｎａＳｐｅｃ社、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、米国カリフォルニア州に注文した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６３３は、水溶液中にて最大励起波長６２２ｎｍを有し、およそ６４０ｎｍの最大発光波長を有する。３０分インキュベートした後、ＦＰおよびＴＲ−ＲＥＴ双方の形式でのＴｅｃａｎ Ｕｌｔｒａプレートリーダでプレートを読み取った。５９０ｎｍ励起フィルタ（２０ｎｍバンドパス）および６５０ｎｍ発光フィルタ（４０ｎｍバンドパス）を用いて蛍光偏光を測定した。３４０ｎｍ励起フィルタ（３５ｎｍバンドパス）および６１５ｎｍ（１０ｎｍバンドパス）と６６５ｎｍ（１０ｎｍバンドパス）の発光フィルタを用いて、ウェル当たり１０回の閃光で１００μｓの閃光後遅延の後、２００μｓの積算窓を用いて、時間分解ＲＥＴを測定した。時間分解ＲＥＴの値（比）は、６６５ｎｍのシグナルを６１５ｎｍのシグナルで割ることにより算出した。ＴＲ−ＲＥＴまたはＦＰにより生成した曲線の形状はほぼ重なることが分かり、競合物ホスフォペプチド（例えば、キナーゼ反応によって生成するもの）の存在がＦＰまたはＴＲ−ＲＥＴのモードのいずれかを用いて検出、定量しうることを示している。

実施例１０：多重化モードを用いるヒスチジンタグタンパク質検出
Ｈｉｓタグタンパク質またはペプチドの検出のための多重システムを開発した。ヒスチジンをタグにした検体タンパク質と、テルビウム−キレート標識抗Ｈｉｓ−タグ抗体のためのヘキサヒスチジンペプチドに連結したフルオレセインから成るトレーサとの間の競合に基づいてアッセイした。検体タンパク質またはペプチドの非存在下では、抗Ｈｉｓタグ抗体に会合したフルオレセイン標識ヘキサヒスチジンペプチドおよびこの相互作用はＴＲ−ＲＥＴまたはＦＰによって検出しうる。多量の検体タンパク質の存在下では、このトレーサと抗体の相互作用は破壊され、トレーサのＴＲ−ＲＥＴシグナルまたは蛍光偏光は低下する。フルオレセイン−Ｈｉｓ６ペプチド（フルオレセイン−ＨＨＨＨＨＨ、「発光トレーサ」、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）は、供給業者（ＲｅｓＧｅｎ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、米国アラバマ州）によって合成および供給されたとおりに用いた。ヘキサヒスチジンタグに特異的な市販モノクローナル抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｒａｌｅｉｇｈ、米国ノースカロライナ州、品番ＭＣＡ１３９６）を購入し、追加精製せず供給されたとおりに使用した。抗体０．２５ｍｇを１００ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）中にて最終容量５０μＬ（抗体の最終濃度、５ｍｇ／ｍＬ）まで濃縮した。抗体を標識するため、ＣＳ１２４−ＤＴＰＡ−Ｐｈｅ−ＮＣＳ−Ｔｂ（抗体に対して２０倍モル過剰）３０μｇを加え、３０分ごとに軽く撹拌しながら室温にて反応を４時間進行させた。４時間後、ＰＢＳに対して抗体を２回透析して未反応および／または加水分解キレートを除いた。３４３ｎｍにおけるＣＳ１２４部分の吸収（Ｅ_３４０＝１１，４４０Ｍ^−１ｃｍ^−１）により、抗体に結合したキレート量を定量し、２８０ｎｍにおける吸収（Ｅ_２８０＝２１０，０００Ｍ^−１ｃｍ^−１）により抗体量を定量し、２８０ｎＭでのＣＳ１２４の吸収を補正した（３４３ｎＭ吸収の１．１倍）。これらの測定から、抗体当たり平均７．７のキレートが割り出された。標識抗体は、性能に顕著な損失を生じることなく少なくとも６箇月間安定であることが分かった。

２０ｎＭの抗体と２ｎＭのトレーサで競合結合アッセイを実施し、Ｈｉｓタグペプチド（配列：ビオチン−ＫＧＧＨＨＨＨＨＨ、供給源：ＲｅｓＧｅｎ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）の増加量を２倍希釈で３μＭ〜１．５ｎＭの範囲内で滴定した。ＦＰ希釈緩衝液（上記を参照）中にてアッセイ成分を混合し、３０分間インキュベートした後、３４０ｎｍ励起フィルタ（３５ｎｍバンドパス）および５２０ｎｍ発光フィルタ（２５ｎｍバンドパス）を用いたＴｅｃａｎ Ｕｌｔｒａプレートリーダで読み取った。１００μｓの遅延の後２００μｓの積算窓を用いてウェル当たり１０回の閃光によってデータを集めた。

実施例１１：ユビキチン融合タンパク質
ｐＲＳＥＴ（Ｂ）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｖ３５１−２０）を用い、２つの脱ユビキチン化（ＤＵＢ）基質のための大腸菌発現プラスミドを構築し、コードされる融合タンパク質が（Ｎ末端からＣ末端へ）Ｈｉｓ−タグ、エメラルドグリーン蛍光タンパク質（ＥｍＧＦＰ）、ユビキチン、可変配列のリンカーおよびＣ末端のシステイン残基を含んでなるようにした。構築した２つの当該基質アミノ酸配列は、

である。これらのコンストラクトは、基質、ＥｍＧＦＰ−Ｕｂ−ＡＣ−ＴｂおよびＥｍＧＦＰ−Ｕｂ−ＦＦＧ−Ｘ−Ｔｂのそれぞれの作製に用いた。

ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（商標）（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｃ６０２０−０３）をＤＵＢ基質用の発現プラスミドで形質転換し、アンピシリンおよびクロラムフェニコールと共にＬＢ寒天上に播いた。単一コロニーを選抜し、アンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）およびクロラムフェニコール（３４ｍｇ／Ｌ）と共に３７℃および２２５ｒｐｍにて５０ｍＬのＬＢ（ルリアブロス）中で一晩増殖させた。各一晩培養物５ｍＬをＴｕｒｂｏ Ｐｒｉｍｅ（商標）ブロス（Ａｔｈｅｎａ Ｅｎｚｙｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、０１１０）５００ｍＬに植菌し、３７℃、２２５ｒｐｍにてＯＤ_５９５がおよそ０．３に達するまで増殖させた。次いで、培養物を２５℃に移し、１時間増殖させた後、０．５ｍＭのＩＰＴＧによって誘導した。４時間の追加増殖後、遠心分離により細胞を回収し、−８０℃で保存した。５００ｍＬ培地由来の細胞ペレットを２００ｍＬ溶解緩衝液（２５ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ）にサスペンドした。サスペンドを１０〜１５，０００ポンド／平方インチ（ＰＳＩ）で冷却高圧ホモゲナイザー（アベスチンＥｍｕｌｓｉｆＦｌｅｘ Ｃ５０）に２回通して細胞粉砕し、氷上で回収した。次いで、４℃にて２８，０００×ｇで３０分間遠心分離することにより細胞溶解物を透明に化した。上清を２ｍＬのＮｉＮＴＡアガロース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に４℃にて１時間、バッチ結合させた。次いで、１５３×ｇにて５分間遠心分離して樹脂を回収した。上清を捨て、約５ｍＬ溶解緩衝液に樹脂をサスペンドし、使い捨てのカラムに移した。カラムの水を抜き、次いで２０ｍＬ溶解緩衝液でカラムを洗浄し、その後、５０ｍＭイミダゾール入りの溶解緩衝液１０ｍＬを重力で落とした。次いで、１２．５ｍＭトリス、５０ｍＭ ＮａＣｌおよび５００ｍＭイミダゾール（ｐＨ７．０）４ｍＬでカラムを溶出し、例えば、明るい緑色の単一分画を回収した。溶出したタンパク質にジチオスレイトール（ＤＴＴ）を加え、最終濃度を１０ｍＭとして室温にて２時間インキュベートした。次いで、ＮＡＰ−５カラム（ＧＥヘルスケア１７−０８５３−０１）を用いてＨＢＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌおよび１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．５）でタンパク質５００μＬ部分を脱塩し、タンパク質試料当たり、単一の１ｍＬ分画に回収した。次いでチオール反応性テルビウムキレート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＰＶ３５８０）を水に１ｍｇ／ｍＬで溶解し、６０〜８０μＭの脱塩したタンパク質に２倍のモル過剰で加えた。室温にて３時間、標識反応を進行させ、ＮＡＰ−５カラムにて生成物をＨＳＢで脱塩した。４８０ｎｍで４０，０００Ｍ^−１ｃｍ^−１のＧＦＰに対して経験的に決定された減衰係数を用い、これらの精製ＤＵＢ基質を定量し、−８０℃で保存した。１２，５７０Ｍ^−１ｃｍ^−１でのテルビウムキレートの減衰係数に基づき標識効率を算出した。

プロテアーゼ反応
３８４穴低容量プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３６７６）にて、５０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．５ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）中、ＤＵＢ基質、ＥｍＧＦＰ−Ｕｂ−ＡＣ−ＴｂまたはＥｍＧＦＰ−Ｕｂ−ＦＦＧ−Ｘ−Ｔｂを用い、プロテアーゼ反応を実施した。２００ｎＭ ＤＵＢ基質１０μＬを、種々の濃度のＵＣＨ−Ｌ３（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｅ−３２５）１０μＬに加えて反応を開始した。室温にて１時間インキュベートした後、Ｔｅｃａｎ Ｕｌｔｒａプレートリーダで蛍光測定を取り込んだ。３４０ｎｍ（バンド幅３０ｎｍ）で励起し、５２０ｎｍ（バンド幅２０ｎｍ）および４９５ｎｍ（バンド幅１０ｎｍ）で強度を測定した。プロテアーゼ活性は、５２０ｎｍでの発光強度の減少に相関した。図１０、１１および１２を参照されたい。

実施例１２：ＤＵＢ基質を用いるプロテアーゼ反応
ＹＦＰ−ユビキチン−ＡＣ−テルビウムの調製
Ｃ末端にアラニン−システイン（ＡＣ）付加を有するｈｉｓタグＹＦＰ（「Ｔｏｐａｚ」（Ｃｕｂｉｔｔら、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、５８巻、１９−３０ページ、１９９９年）変異体）ユビキチン融合体（ＹＦＰ−Ｕｂ−ＡＣ）をコードする発現プラスミドを発現させ、常法を用いて大腸菌から精製した。コード配列は、

だった。

ＹＦＰ−Ｕｂ−ＡＣの発現：
ＹＦＰ−Ｕｂ−ＡＣの発現プラスミドは、ＹＦＰ（Ｔｏｐａｚ）−ユビキチンＣ末端へのアラニン−システイン（ＡＣ）付加変異体をコードする。業者供給の方法を用い、化学的に形質転換受容性のＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３） ｐＬｙｓＳ細胞に発現プラスミドを移し、次いで、０．１ｍｇ／ｍＬアンピシリンおよび０．０５ｍｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含有するＬＢ寒天上に播いた。コロニーを選抜し、０．１ｍｇ／ｍＬアンピシリンおよび０．０５ｍｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含有するＬＢブロス５０ｍＬに植菌し、３７℃にて一晩増殖させた。一晩の培養物から５ｍＬを用い０．１ｍｇ／ｍＬアンピシリンおよび０．０５ｍｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含有するＬＢブロス５００ｍＬに植菌し、６００ｎｍでの最適密度が０．２となるまで３７℃で増殖させた。インキュベータの温度を２５℃に下げ、６００ｎｍでの最適密度の０．６となるまで培養物を増殖させ続けた。この時点で、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を１ｍＭ濃度で加え、発現プラスミドでＴ７プロモータを誘導し、ＹＦＰ−Ｕｂ−ＡＣの産生を刺激した。２５℃にて４時間、細胞を誘導した。４℃にて４２００ｒｐｍ（ＪＳ−４．２ロータにて）で２０分間遠心分離して細胞を回収した。上清を捨て、細胞ペーストを−８０℃で保存した。

ＹＦＰ−Ｕｂ−ＡＣの抽出および精製：
手持ち式のポリトロンバイオホモゲナイザーによりＹＦＰ−Ｕｂ−ＡＣの細胞ペーストを、１００ｍＭ ＮａＣｌと３０ｍＭのイミダゾール入りの２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に再サスペンドした。４℃、１０，０００〜１５，０００ポンド／平方インチ（ｐｓｉ）で、アベスチンＥｍｕｌｓｉｆＦｌｅｘ Ｃ５０に通すことにより、再サスペンドした細胞を溶解した。ＪＡ−１４ロータにて４℃、１３，５００ｒｐｍ（約２８，０００×ｇ）で３０分間ホモジネートした細胞を遠心分離した。上清を回収し、穏やかに撹拌しながら、４℃にて１時間、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースにバッチ結合した。Ｎｉ−ＮＴＡアガロースを使い捨てのカラムに移し、５カラム容量の溶解緩衝液で洗浄して混入しているタンパク質を除いた。１００ｍＭ ＮａＣｌ、４００ｍＭイミダゾールを有する２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）によりＮｉ−ＮＴＡカラムからＹＦＰ−Ｕｂ−ＡＣを溶出した。ＹＦＰ−Ｕｂ−ＡＣを保存緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌと５％（ｖ／ｖ）のグリセロール入りの２５ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）で５ｍｇ／ｍＬに希釈し、（２８０ｎｍ吸収、ε_２８０＝３３，３５０Ｍ^−１ｃｍ^−１に基づいて）、最終濃度１０ｍＭでＤＴＴを加えた。中間体は、標識を必要とするまで−８０℃で保存した。

ＹＦＰ−Ｕｂ−ＡＣの標識：
１ｍＬ ＹＦＰ−Ｕｂ−ＡＣ中間体（５ｍｇ／ｍＬ）を解凍し、Ｎａｐ（商標）１０脱塩カラムに負荷してＤＴＴを除いた。溶出タンパク質を直ちに２００μｇチオール反応性Ｔｂ−キレート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、米国カリフォルニア州社）と混ぜ合わせ、室温にて２時間反応させた。反応混合物をＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（１０，０００ ＭＷＣＯ）に負荷し、Ｈｅｐｅｓ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）に対して透析して未反応のＴｂキレートを除いた。透析したＹＦＰ−Ｕｂ−ＡＣをＨＢＳにより最終濃度２０μＭに希釈し（２８０ｎｍでの吸収に基づいて）、−８０℃で保存した。

プロテアーゼアッセイのプロトコル
プロテアーゼ（ＵＣＨ−Ｌ１、ＵＣＨ−Ｌ３、ＵＳＰ−５およびＵＳＰ−１４）ならびにユビキチンアルデヒドはＢｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ社（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、米国マサチューセッツ州）から購入した。ＹＦＰ−ユビキチン−Ｔｂ基質に対する各ＤＵＢの相対的活性を測定するため、黒色３８４穴低容量プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｎｏ．３６７６）にて、アッセイ緩衝液（２０ｍＭトリス、ｐＨ７．４、０．０１％ノニデット−Ｐ４０、１０ｍＭ ＤＴＴ）１０μＬ中で酵素の連続稀釈を調製した。次いで、同一緩衝液中のＹＦＰ−ユビキチン−Ｔｂ基質の２０ｎＭ溶液１０μＬを各ウェルに加えた。５０分後、ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎフィルタモジュールを用いたＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ Ｐｈｅｒａｓｔａｒプレートリーダでプレートを読み取った。１００μｓの遅延に続いて２００μｓのシグナル積算窓を用いて測定した場合、生のドナー強度で割った生のアクセプター強度として発光比を算出した。バックグランド減算またはクロストーク補正は不要だった。９０分間を通しての反応の読み取りと共に、種々の濃度のＵＣＨ−Ｌ３に対して同様に動態の読み取りを行った。阻害剤としてのユビキチンアルデヒドまたはユビキチンの連続稀釈に対する１時間の反応において、１５ｐＭ ＵＣＨ−Ｌ３および１０ｎＭ ＹＦＰ−ユビキチン−Ｔｂを用い、阻害剤の滴定を行った。異なる濃度のＵＣＨ−Ｌ３を用い、基質の種々の比率の変換で、Ｚ’値を決定した。これらの実験では、２４個の陽性対照ウェルおよび２４個の陰性対照ウェルを測定し、方程式（Ｚｈａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．、４巻、６７−７３ページ、１９９９年）に従ってＺ’を算出した。Ｚ’＝１−［３σ_ｃ＋＋３σ_ｃ−）／｜μ_ｃ＋−μ_ｃ−｜］式中、σ_ｃ＋およびσ_ｃ−はそれぞれ、アッセイプレートの陽性および陰性の対照ウェルの標準偏差であり、μ_ｃ＋およびμ_ｃ−は、はそれぞれ、アッセイプレートの陽性および陰性の対照ウェルの平均値である。陰性対照ウェルは、ＵＣＨ−Ｌ３を阻害するために５０ｎＭのユビキチン−アルデヒドを含有した。最大および最小のＦＲＥＴシグナルを含有するウェルに対して正規化した発光比を算出し、次いで１００を掛けた。

インタクトおよび切断ＹＦＰ−Ｕｂ−ＡＣ−Ｔｂの時間分解スペクトルおよび発光シグナルの減衰
Ｔｅｃａｎ Ｓａｆｉｒｅ２プレートリーダを用いて、過剰のＵＣＨ−Ｌ３の存在下または非存在下でインキュベートした１０ｎＭのＹＦＰ−ユビキチン−Ｔｂの時間分解スペクトルを測定した。試料は、２０μＬであり、白色の３８４ウェル低容量プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にて読み取った。励起を３３２ｎｍ（バンド幅２０ｎｍ）に設定し、１００μｓの遅延に続く２００μｓのシグナル積算窓を用いて４７５〜６８０ｎｍまで１ｎｍの増分から発光の測定を回収し、平均して波長当たり１００回の測定（閃光）を超えた。ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ Ｐｈｅｒａｓｔａｒプレートリーダを用いて発光シグナルの減衰を測定した。

ＵＣＨ−Ｌ３に対するＹＦＰ−ユビキチン−Ｔｂ ＤＵＢ基質の滴定
アッセイ緩衝液（１０ｍＭ ＤＴＴ入りのＴＲ−ＦＲＥＴ稀釈緩衝液（ＰＶ３５７４））中のＵＣＨ−Ｌ３（Ｂｏｓｔｏｎｂｉｏｃｈｅｍ；カタログ＃Ｅ−３２５）４００ｎＭ溶液を調製した。Ｃｏｒｎｉｎｇ黒色３８４低容量プレート（＃３６７６）の第１の列に２０μＬの酵素溶液を加え、アッセイ緩衝液（１０μＬ）でプレートを横切って連続稀釈を行った。アッセイ緩衝液によってＹＦＰ−ユビキチン−Ｔｂ基質の２０ｎＭ溶液を調製し、この溶液１０μＬを各ウェルに加えた。第１のウェルにおけるＵＣＨ−Ｌ３の最終濃度は２００ｎＭである。アッセイにおけるＹＦＰ−ユビキチン−Ｔｂ基質の最終濃度は、１０ｎＭである。室温にて４０〜５０分間、プレートを平衡化させ、次いで、ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）用に適当に設定したＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ ＰＨＥＡＲｓｔａｒで読み取った。回収したデータをグラフ化し、Ｓ字状（変動する傾き）の用量反応に適合させてＥＣ_５０値を得た（図４１Ｃ）。

結果
ＵＣＨ−Ｌ３、ＵＳＰ−２、ＵＳＰ−１５、ＵＣＨＬ１、ＵＳＰ−５およびＵＳＰ−１４に対する基質（１０ｎＭで）としてＹＦＰ−ユビキチン−Ｔｂを調べた。ＵＳＰ−１４は、２６Ｓプロテアソームの成分との会合の非存在下では活性を示さないことが予想される。ＵＳＰ−２とＵＳＰ−１５は本質的に区別がつかない（図４１Ａ）。

図４１Ｃは、Ｓ字状（変動する傾き）の用量反応を示してＹＦＰ−ユビキチン−Ｔｂ基質の滴定についてＥＣ_５０値が得られる。相当するベストフィット値は、最低＝０．１６５９；最高＝５．５９５；ＬｏｇＥＣ_５０＝−１．７６５；傾き＝−１．１１７；およびＥＣ_５０＝０．０１７１７、であった。

実施例１３：ＭＥＫ１コンジュゲートの調製
ＭＥＫ１（不活性）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｐ３０９３）からフルオレセイン−ＭＥＫ１コンジュゲートを調製した。先ず、ＨＢＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌおよび１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５）に対してＭＥＫ１試料を透析する。次に、５−ＩＡＦ（５−ヨードアセトアミノフルオレセイン）または５−ＦＡＭ、ＳＥ（５−カルボキシフルオレセイン、スクシンイミジルエステル）を１０倍または５０倍のモル過剰のいずれかで１０μＭのＭＥＫ１に加え、室温にて１時間４０分間、反応を進行させた。ＮＡＰ−５カラムを用いてＭＥＫ１試料をＨＢＳで脱塩することによって反応性色素を除いた。標識したＭＥＫ１調製物を８０℃で凍結して保存した。

この試験は、ＭＥＫが表面でアクセス可能な幾つかのチオール基を含有し、ヨードアセトアミド官能化フルオレセイン誘導体を介してアクセプター蛍光色素分子が結合しうるという事実を利用しているが、アミノ反応性イソチオシアネートまたは好適な蛍光色素分子の活性化エステル誘導体は同様に適切である。さらに、この試験ではフルオレセインを使用したが、同様のスペクトルを有する他の蛍光色素分子（例えば、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、オレゴングリーンまたはアレクサフラウア４８８）も同様に好適であり、代替のフィルタセットを採用することによって赤色に移動した蛍光色素分子を使用してもよい。

実施例１４：キナーゼ基質のＧＦＰ融合体の構築および調製
コードした融合タンパク質が（Ｎ末端からＣ末端へ）Ｈｉｓ−タグ、ＥｍＧＦＰおよびキナーゼの基質で構成されるように、ｐＲＳＥＴ（Ｂ）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｖ３５１−２０）を用いて、キナーゼ基質のＧＦＰ融合体のための大腸菌発現プラスミドを構築したる。そのような２つの基質は、ＥｍＧＦＰ−ＡＴＦ２（１９−９６）およびＥｍＧＦＰ−ｃ−Ｊｕｎ（１−７９）である。ＥｍＧＦＰ−ｃ−Ｊｕｎのアミノ酸配列は、

である。
ＥｍＧＦＰ−ＡＴＦ２のアミノ酸配列は、

である。

ＧＦＰのタグを付けたキナーゼ基質用の発現プラスミドでＢＬ２１ Ｓｔａｒ（商標）（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃ６０２０−０３）を形質転換し、アンピシリンとクロラムフェニコールの入ったＬＢ寒天上に播いた。単一コロニーを選抜し、ＬＢ（ルリアブロス）またはＴｕｒｂｏ Ｐｒｉｍｅ（商標）ブロス（アテナエンザイムシステムズ０１１０）のいずれか５００ｍＬ中で増殖させ、誘導に先立ってＯＤ５９５がおよそ０．３〜１．０に達するまで、３７℃、２２５ｒｐｍにて増殖させた。ＩＰＴＧ（０．０５〜０．５ｍＭ）で培養物を誘導し、さらに４〜１６時間培養した後、遠心分離によって細胞を回収し、−８０℃で保存した。５００ｍＬの培養物から得た細胞ペレットを、破壊緩衝液（５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％のトリトンＸ−１００、２０μＭのリューペプチンおよび０．５ｍＭのＰＭＳＦ）２００ｍＬに浮遊させた。浮遊液をおよそ１０，０００ＰＳＩで冷却高圧ホモゲナイザー（アベスチンＥｍｕｌｓｉｆＦｌｅｘ Ｃ５０）に２回通して細胞を粉砕し、氷上で回収した。次いで、４℃にて２８，０００×ｇで３０分間遠心分離することによって細胞溶解物を透明化した。上清を２ｍＬのＮｉＮＴＡアガロース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に４℃にて１時間、バッチ結合しる。次いで、５００×ｇにて５分間の遠心分離によって樹脂を回収した。上清を捨て、次いで約５ｍＬの溶解緩衝液に樹脂を浮遊させ、使い捨てのカラムに移した。カラムの水を抜き、次いで２５ｍＬの破壊緩衝液でカラムを洗浄し、その後、２５ｍＭのイミダゾール入りの破壊緩衝液１０ｍＬを重力で落とした。次いで、２５０ｍＭのイミダゾール入りの破壊緩衝液５ｍＬでカラムを溶出し、明るい緑色での単一分画を回収した。ＧＦＰについて経験的に決定された減衰係数、４８０ｎｍにて４０，０００Ｍ−１ｃｍ−１を用いて、これらの精製されたＧＦＰタグの付いた基質を定量し、−８０℃で保存した。

製造元推奨条件に従い、ＢＳＡを含まないリン酸緩衝生理食塩水における抗体調製物を用いて、リン酸化認識抗体、ｃ−Ｊｕｎ ［ｐＳ７３］（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ ４４−２９２）およびＡＴＦ２ ［ｐＴ７１］（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ ４４−２９４）をアミン反応性のテルビウムキレート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識することによってテルビウム標識された抗体を作製する。

実施例１５：キナーゼ反応およびアッセイ
３８４穴の低容量プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３６７６）にてキナーゼ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、０．０１％ ＢＲＩＪ−３５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２および１ｍＭ ＥＧＴＡ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でキナーゼ反応を行う。２００〜２２５ｎＭの基質、種々の濃度のキナーゼおよび１００μＭのＡＴＰと共に５〜１５μＬの容量で反応を行う。ＪＮＫ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＰＶ３３１９）、ＪＮＫ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＰＶ３６２０）、ｐ３８α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＰＶ３３０４）およびｐ３８β（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＰＶ３６７９）の基質として、ＥｍＧＦＰ−ＡＴＦ２を使用した。ＪＮＫ１およびＪＮＫ２の基質としてＥｍＧＦＰ−ｃ−Ｊｕｎを使用した。ｃＲａｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＰＶ３８０５）、ＢＲＡＦ触媒ドメイン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＰＶ３８４９）およびＢＲＡＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＰＶ３８４８の基質としてフルオレセイン−ＭＥＫ１を使用した。常温にて１時間、キナーゼ反応物をインキュベートし、その後、ＧＦＰ融合体基質のために最終濃度２．５または５ｎＭで適当なテルビウム標識のリン酸化認識抗体を加えた。フルオレセイン−ＭＥＫ１については、非標識のリン酸化認識抗体、ホスホ−ＭＥＫ１／２（Ｓｅｒ２１７／２２１）（セルシグナリングテクノロジー９１２３Ｓ）の１：１０稀釈を５μＬのキナーゼ反応物に等量加え、次いで２０ｎＭのＴｂ−抗ウサギ二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＰＶ３７７３）１０μＬを加えた。抗体は全て、キナーゼ反応物に添加するのに先立ってＴＲ−ＦＲＥＴ稀釈緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５および０．０１％ＮＰ−４０；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で稀釈した。室温で１時間インキュベートした後、Ｔｅｃａｎ Ｕｌｔｒａプレートリーダで蛍光測定を取り込んだ。３４０ｎｍ（３０ｎｍのバンド幅）の励起にて５２０ｎｍ（２０ｎｍのバンド幅）および４９５ｎｍ（１０ｎｍのバンド幅）で強度を測定した。キナーゼ活性は、５２０ｎｍでの発光強度の増加、通常、４９５ｎｍでの発光強度の低下に相関した。図９、１３、１４、１５、１６、１７、１８および１９を参照されたい。

Ｊｕｎキナーゼ（ＪＮＫ）は、適当な刺激に応答してｃ−Ｊｕｎを含む転写因子の宿主をリン酸化する。リン酸化されたｃ−Ｊｕｎは次いでｃ−Ｆｏｓと相互作用して転写アクチベータＡＰ１を形成する。ＪＮＫ活性の活性は、本発明に従って天然の基質のＧＦＰ融合体を用いて、例えば、リン酸化されたｃ−Ｊｕｎに特異的なテルビウム標識された抗体と組み合わせたｃ−Ｊｕｎを利用して容易に測定される。図２０を参照されたい。

ｃ−Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）は、ＵＶ照射または他のストレス刺激に続いてＳｅｒ−６３およびＳｅｒ−７３でｃ−Ｊｕｎを特異的にリン酸化するＭＡＰキナーゼファミリーの一員である。このリン酸化は、例えば、ｃ−Ｊｕｎ基質の３０〜６０残基およびＪＮＫの活性部位近傍の異なったドメイン内の残基が介在する「ドッキング」現象に依存する。

実施例１６：キナーゼ反応モジュレータ用アッセイ
ＳＢ２０２１９０は、強力で且つ選択性のｐ３８マップキナーゼ阻害剤である。この化合物は、ｐ３８αおよびｐ３８βのアイソフォームを阻害するが、ｐ３８γまたはｐ３８δ、ＥＲＫ２、ＭＡＰキナーゼファミリーのほかのメンバーまたはそれらの上流のアクチベータを阻害しない。この選択性によってＳＢ２０２１９０はシグナル伝達経路におけるｐ３８の役割を分析する有用なツールとなっている。ＳＢ２０２１９０は、ｐ３８αおよびｐ３８βに対して３０ｎＭのＩＣ５０を有すると報告されている。

阻害剤ＳＢ２０２１９０（カリフォルニア州、カマリロのバイオソース）に対してｐ３８ＭＡＰキナーゼ、ｐ３８α、ｐ３８β、ｐ３８γおよびｐ３８δ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を評価した。酵素濃度は、調べた酵素についてのＡＴＰのＥＣ５０に相当する１０μＭのＡＴＰの存在下でのＥＣ８０−値に基づく。酵素濃度は、４．５μｇ／ｍＬ（ｐ３８α）、１．２μｇ／ｍＬ（ｐ３８β）、０．３μｇ／ｍＬ（ｐ３８γ）および１．３μｇ／ｍＬ（ｐ３８δ）である。キナーゼ緩衝液Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州）にて３０μＭのＳＢ２０２１９０で開始して３ｐＭまでの１／２対数稀釈で阻害曲線を作製した。ＭＡＰキナーゼの基質として４００ｎＭのＡＴＦ２−ＧＦＰ融合タンパク質を用いて阻害データを生成した。１０μＬ容量にて２２℃で１時間、反応を進行させた。２０ｍＭのＥＤＴＡおよび５ｎＭのテルビウム標識の抗リン酸化認識ＡＴＦ２抗体の１０μＬの添加によって反応を停止した。６０分後、ＴＲ−ＦＲＥＴモードのＴｅｃａｎ Ｕｌｔｒａ３８４プレートリーダで結果を読み取った。使用する励起波長は３４０ｎｍであり、４９５ｎＭおよび５２０ｎｍで発光をモニターしたる。Ｐｒｉｓｍ（カリフォルニア州、サンディエゴのグラフパッドソフトウェア）を用いて阻害剤濃度に対して５２０：４９５の比をプロットしてＩＣ５０を決定した。図２１を参照されたい。

実施例１７：ＭＣＧＧ−ユビキチンの発現、抽出、標識および精製
発現プラスミド（ｐＥＸＰ１４−Ｕｂ−ＭＣＧＧ）は、ユビキチンのＮ末端へのメチオニン−システイン−グリシン−グリシン（ＭＣＧＧ）付加変異体をコードする。エントリーベクターｐＤｏｎｒ２２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１２５３６−０１７）に適合する組換え部位によってＵｂタンパク質を増幅するＰＣＲによってｐＥＸＰ１４−Ｕｂ−ＭＣＧＧベクターを作製した。ＰＣＲ産物をｐＤｏｎｒ２２１に組み換えた。目的ベクターｐＤＥＳＴ１４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１８０１−０１６）と共にＧａｔｅｗａｙ（登録商標）反応にｐＤｏｎｒ２２１を用いた。当業者に明らかになるであろうように、ユビキチンのＮ末端へのメチオニン−システイン−グリシン−グリシン（ＭＣＧＧ）付加変異体を発現するのに対して本質的に適合可能ないかなるベクターもこの目的に好適である。

業者供給の方法を用いて発現ベクターを化学的に形質転換受容性のＤＨ５α細胞に移し；その後、０．１ｍｇ／ｍＬアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレートに播いた。コロニーを選抜して０．１ｍｇ／ｍＬアンピシリンを含有するＬＢブロス５０ｍＬに植菌し、それを３７℃にて一晩増殖させた。一晩の培養物から５ｍＬを使用して０．１ｍｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢブロス５００ｍＬに植菌し、６００ｎｍでの光学密度＞０．６を達成するまで３７℃で増殖させた。この時点で、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を１ｍＭの濃度で加えて、発現プラスミドでＴ７プロモータを誘導し、ＭＣＧＧ−ユビキチン変異体タンパク質の産生を刺激した。３７℃にて４時間細胞を誘導した。４℃にて４２００ｒｐｍ（ＪＳ−４．２ロータ）で２０分間の遠心分離によってＤＨ５ａ細胞を回収した。上清を捨て、細胞ペーストを−８０℃で保存した。

手持ち式ポリトロンバイオホモゲナイザーにより、１ｍＭ ＥＤＴＡと１０ｍＭ ＤＴＴを含有するＨｅｐｅｓ緩衝生理食塩水にＭＣＧＧ−ユビキチンの細胞ペーストを再サスペンドした。１０，０００〜１５，０００ｐｓｉでアベスチンＥｍｕｌｓｉｆＦｌｅｘ Ｃ５０に通すことにより、再サスペンドした細胞を溶解した。ＪＡ−１４ロータにて４℃にて８，９００ｒｐｍ（約１２，０００×ｇ）で２０分間、ホモジネートした細胞を遠心分離した。上清を回収し、氷上で過塩素酸を３．５％（ｖ／ｖ）に加え、混入しているタンパク質を沈殿させた。ＪＡ−１４ロータにて４℃にて８，９００ｒｐｍ（約１２，０００×ｇ）で２０分間、遠心分離することによって沈殿物を除いた。３５００ ＭＷＣＯ Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ３透析膜にて５０ｍＭの酢酸アンモニア緩衝液（ｐＨ４．５）に対して上清を透析した。５０ｍＭの酢酸アンモニア緩衝液（ｐＨ４．５）で事前に緩衝化されたＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰカラムに透析した試料を負荷した。２８０ｎｍでモニターする０〜０．５Ｍの塩化ナトリウムの塩勾配を持つカラムからＭＣＧＧ−ユビキチンを溶出した（典型的な溶出：０．１４〜０．２２Ｍの塩の間）。所望のタンパク質を含有する分画を一緒にプールし、３５００ ＭＷＣＯ Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ３透析膜にてＨｅｐｅｓ緩衝生理食塩水（ｐＨ７．５）に対して一晩透析した。透析した分画は、標識を必要とするまで−８０℃で保存した。

ＭＣＧＧ−ユビキチンを解凍し、ユビキチンのモル吸光係数１２８０Ｍ−１ｃｍ−１に基づいて２８０ｎｍでの吸収により濃度を計測した（ＭＣＧＧ−ユビキチンの分子量：８９１２Ｄａ）。１０当量トリ（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）をＭＣＧＧ−ユビキチンに加えて全てのジスルフィドを還元し、次いで５当量フルオレセイン−５−マレイミド、ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）チオール反応性テルビウムキレートまたはＮ−（ビオチニル）−Ｎ’−（ヨードアセチル）エチレンジアミンのいずれかを加え、それぞれ、フルオレセイン−ユビキチン、テルビウム−ユビキチンおよびビオチン−ユビキチンを作製した。標識ユビキチンを、３５００ ＭＷＣＯ Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ３透析膜にてＨｅｐｅｓ緩衝生理食塩水（ｐＨ７．５）に対して一晩透析して未反応の色素を除いた。標識したタンパク質をＨｉＬｏａｄ ２６／６０スーパーデックス７５調製用カラムで精製した。標識したタンパク質は通常、０．６〜０．７カラム容量の間で溶出した。所望の標識タンパク質を含有する分画を一緒にプールし、ミリポア３０００ＮＭＷＬ膜を付けたアミコン限外ろ過セルにより、フルオレセイン−ユビキチンについては４９２ｎｍ（４９２ｎｍでのモル吸光係数は８３，０００Ｍ−１ｃｍ−１）、テルビウム−ユビキチンについては３４３ｎｍ（３４３ｎｍでのモル吸光係数は１２，５７０Ｍ−１ｃｍ−１）、およびビオチン−ユビキチンについては２８０ｎｍ（２８０ｎｍでのモル吸光係数は１２８０Ｍ−１ｃｍ−１）での吸収に基づいて、０．５〜１ｍｇ／ｍＬの濃度に濃縮した。フルオレセイン−ユビキチンの分子量：９３４１Ｄａ；テルビウム−ユビキチン：９９１２Ｄａおよびビオチン−ユビキチン：９２３８Ｄａ。タンパク質を−２０℃で保存した。

実施例１８：分子鎖内ＴＲ−ＦＲＥＴユビキチン化反応
分子鎖内ＴＲ−ＦＲＥＴユビキチン化反応のために黒色Ｃｏｒｎｉｎｇ３８４穴低容量プレート（品番３６７６）で以下の溶液を混ぜ合わせた。

ＡＴＰ再生溶液は、Ｔ．Ｙａｏ、Ｒ．Ｅ．Ｃｏｈｅｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２０００年、２７５巻、３６８６２−３６８６８ページから適用した。

ホイルでプレートを密封して蒸発を防ぎ、３７℃で６〜８時間置いた。インキュベートに続いて、ＴＲ−ＦＲＥＴ稀釈緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５および０．０１％ ＮＰ−４０）１０μＬを各ウェルに加え、ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）推奨フィルタセットを用い、Ｔｅｃａｎ ＵｌｔｒａまたはＢＭＧ ＰｈｅｒａＳｔａｒのいずれかでプレートを読み取った。図２２に、分子鎖内ＴＲ−ＦＲＥＴユビキチン化アッセイを図示する。

実施例１９：異種ユビキチン様タンパク質（Ｕｂ１）を用いる脱コンジュゲートアッセイ
Ｕｂ１融合タンパク質
ＳＵＭＯ１／２／３またはＮｅｄｄ８基質用の発現プラスミドでＢＬ２１ Ｓｔａｒ（商標）（ＤＥ３） ｐＬｙｓＳ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｃ６０２０−０３）を形質転換し、アンピシリンとクロラムフェニコール入りのＬＢ寒天に播いた。単一コロニーを選抜し、アンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）およびクロラムフェニコール（３４ｍｇ／Ｌ）の入ったＬＢ（ルリアブロス）培地５０ｍＬにて３７℃、２２５ｒｐｍで一晩増殖させた。各一晩培養物５ｍＬを５００ｍＬ ＬＢ培地に植菌し、ＯＤ６００がおよそ０．６に達するまで３７℃、２２５ｒｐｍで増殖させた。次いで、培養物を２５℃に移し、１時間増殖させた後、１ｍＭ ＩＰＴＧによって誘導した。４時間の追加の増殖の後、遠心分離によって細胞を回収し、−８０℃で保存した。５００ｍＬ培養物からの細胞ペレットを２００ｍＬの溶解緩衝液（２５ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ）にサスペンドした。サスペンジョンを１０〜１５，０００ポンド／平方インチ（ＰＳＩ）での冷却高圧ホモゲナイザー（アベスチンＥｍｕｌｓｉｆＦｌｅｘ Ｃ５０）に２回通すことによって細胞を粉砕し、氷上で回収する。次いで、４℃にて２８，０００×ｇで２０分間遠心分離することによって細胞溶解物を透明にする。上清を２ｍＬのＮｉＮＴＡアガロース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に４℃にて１時間、バッチ結合した。次いで、１５３×ｇにて５分間の遠心分離によって樹脂を回収した。上清を捨て、次いで約５ｍＬの溶解緩衝液に樹脂をサスペンドし、使い捨てカラムに移した。カラムの水を抜き、次いで２０ｍＬの溶解緩衝液でカラムを洗浄し、その後、３０ｍＭのイミダゾール入りの溶解緩衝液１０ｍＬを重力で落とした。次いで、２５ｍＭトリス、５０ｍＭ ＮａＣｌおよび３００ｍＭのイミダゾール（ｐＨ７．５）の４ｍＬでカラムを溶出し、例えば、明るい緑色である単一分画を回収した。溶出したタンパク質にジチオスレイトール（ＤＴＴ）を最終濃度１０ｍＭにして加えた。

次いで、ＮＡＰ−５カラム（ＧＥヘルスケア１７−０８５３−０１）を用いてＨＢＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌおよび１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．５）で約０．５〜１ｍｇのタンパク質を脱塩し、タンパク質の試料当たり、単一の１ｍＬ分画に回収した。次いでチオール反応性テルビウムキレート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＰＶ３５８０）を水に１ｍｇ／ｍＬで溶解し、脱塩したタンパク質に２倍のモル過剰で加えた。室温にて３時間、標識反応を進行させ、ＮＡＰ−５カラムにて生成物を脱塩し、ＨＢＳで一晩透析した。

一次配列情報

ユビキチン様タンパク質（Ｕｂ１）の脱コンジュゲートアッセイ
２ｍＭ ＤＴＴを有するＴＲ−ＦＲＥＴ稀釈緩衝液の反応緩衝液をこれらのアッセイで使用した。各ウェル１０μＬの最終容量で、プレート全体にわたり、ＳＥＮＰ１、ＳＥＮＰ２またはＮＥＤＰ１酵素（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｅ−７００、Ｅ−７１０またはＥ−８００）の滴定を行った。ＳＵＭＯ１、ＳＵＭＯ２、ＳＵＭＯ３またはＮｅｄｄ８脱コンジュゲート基質の２５ｎＭ溶液１０μＬを各酵素に加えた。室温にて１時間のインキュベートの後、ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ Ｐｈｅｒａｓｔａｒプレートリーダで蛍光測定を取り込んだ。３４０ｎｍ（３０ｎｍのバンド幅）の励起にて５２０ｎｍ（２０ｎｍのバンド幅）および４９５ｎｍ（１０ｎｍのバンド幅）で強度を測定した。図３９Ａに、それぞれＳＥＮＰ１およびＮＥＤＰ１によるＳＵＭＯ１脱コンジュゲート基質（Ｔｏｐａｚ−ＳＵＭＯ１−Ｔｂ）およびＮｅｄｄ８脱コンジュゲート基質（Ｔｏｐａｚ−Ｎｅｄｄ８−Ｔｂ）の切断を示す。図３９Ｂに、ＳＥＮＰ２によるＳＵＭＯ２（Ｔｏｐａｚ−ＳＵＭＯ２−Ｔｂ）およびＳＵＭＯ３（Ｔｏｐａｚ−ＳＵＭＯ３−Ｔｂ）脱コンジュゲート基質の切断を示す。

実施例２０：ＪＮＫ１およびＪＮＫ２調節アッセイ
阻害剤ＳＰ６００１２５（ＪＮＫ阻害剤１とも呼ばれる）は、強力で選択的なＡＴＰ競合性のＪＮＫ阻害剤である。

キナーゼアッセイ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、０．０１％ ＢＲＩＪ−３５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２および１ｍＭ ＥＧＴＡ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた１０μＬの反応物中、２μＭ ＡＴＰと１０μＭ〜５６．５ｐｍまでの範囲の３倍連続稀釈のＳＰ６００１２５（カルビオケム）の存在下で、２００ｎＭ ＧＦＰ−ＡＴＦ２に対してＪｎｋ１またはＪｎｋ２（それぞれ３００ｎｇ／ｍＬおよび６５０ｎｇ／ｍＬ）を１時間アッセイした。反応に続いて、ＴＲ−ＦＲＥＴ稀釈緩衝液（２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５および０．０１％ ＮＰ−４０；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、ＥＤＴＡおよびＴｂで標識した抗ＡＴＦ２（ｐＴ７１）を最終容量２０μＬで、最終濃度それぞれ１０ｍＭおよび２ｎＭで加えた。１時間後、前記のようにプレートを読み取った。各反応を３つ組で行い、データを表にした。

これらの条件でのアッセイでは、ＳＰ６００１２５のＥＣ５０は、ＪＮＫ１については１６０ｎＭであり、ＪＮＫ２については１２０ｎＭだった。表１も参照されたい。

実施例２１：アッセイの最小化／容量および耐干渉性
３つ組の１０μＬのアッセイ反応で、１００μＭ ＡＴＰの存在下で４００ｎＭ ＧＦＰ−ｃＪｕｎ（１〜１７９）に対して連続稀釈したＪＮＫ１キナーゼをアッセイした。１時間後、２ｎＭの抗体および１０ｍＭのＥＤＴＡの最終濃度で、各ウェルにテルビウム標識した抗リン酸化ｃＪｕｎ（ｐＳｅｒ７３）およびＥＤＴＡの溶液１０μＬを加えた。１時間インキュベートした後、プレートを読み取り、ＴＲ−ＦＲＥＴの値を算出した。アッセイの安定度（Ｚ’）および干渉化合物実験について、非リン酸化産物と完全にリン酸化された産物との間でＴＲ−ＦＲＥＴの値に８０％の変化を達成するのに必要とされるキナーゼの濃度を決定するため、先ず、連続稀釈したＪＮＫ１をアッセイした。キナーゼのこの濃度をＺ’の実験および干渉化合物実験に用い、キナーゼのこの濃度の５倍を含有する対照ウェルを測定して実験がキナーゼのＥＣ８０付近で行われることを検証した。Ｚ’の実験については、４８の陽性ウェルおよび４８の陰性ウェル（ＡＴＰなし）を測定し、Ｚ’を算出した。さらに少ないアッセイ容量でＺ’値を概算するため、４μＬ等量を対照ウェルから取り出して空のウェルに入れ、機器のＺ軸の焦点高さを再調整したのに続いて読み取った。続いてキナーゼアッセイに加えられる干渉剤の存在下で６つの陽性対照ウェルおよび６つの陰性対照ウェルを測定し、干渉化合物実験を行った。ＮＡＤＰＨ、タルトラジンおよびアルラレッドを最終濃度５μＭで、クマリンおよびフルオレセインを最終濃度１００ｎＭで、非乳性クリームを最終濃度０．５ｍｇ／ｍＬで加えた。

基質としてＧＦＰ−ｃＪｕｎ（１〜１７９）を用い、ＪＮＫ１のＥＣ８０の濃度を用いて、ＪＮＫ１活性のアッセイについてＺ’値を決定した。低容量３８４穴プレートにて４８の陽性対照ウェルおよび４８の陰性対照ウェルを用いて、２０μＬの最終アッセイ容量では、０．９３のＺ’が決定された。（当該アッセイを実施する容量限度に対処する液体の非存在下において）アッセイの条件を模倣するため、各対照ウェルの４μＬを空のウェルに移し、Ｚ’は０．８８であると決定された。これらの結果に基づいて、容量限度に対処する適当な液体を考えると、少なくとも１０μＬの反応最終アッセイ容量より少なくアッセイを容易に最少化することができる。

Ｚ’値に加えて、ＨＴＳスクリーニングに存在する高濃度のライブラリ化合物からの光学的干渉に耐性である蛍光に基づくＨＴＳアッセイを有することが好ましい。干渉の３つの一般的な供給源は、「色消光剤」（励起光または発光光のいずれかを吸収することによる内部フィルタ効果を生じる化合物）、自家蛍光化合物および沈殿した化合物からの散乱光である。テルビウムに基づいたＴＲ−ＦＲＥＴアッセイのこれら一般的な干渉への耐性を実証するため、読み取りに先立って陽性対照ウェルおよび陰性対照ウェルを干渉化合物と混ぜた。色消光剤（ＮＡＤＰＨ、タルトラジンおよびアルラレッド）は５μＭの濃度で存在してキナーゼアッセイで１０μＭの濃度を模倣した。タルトラジンおよびアルラレッドは、食用色素における主な発色団、それぞれ、ＦＤ＆Ｃ黄色＃５およびＦＤ＆Ｃ赤色＃４０である。ＮＡＤＰＨはテルビウムキレートが励起される（λｍａｘ＝３４０ｎｍ）ＵＶドメインで強く吸収し、タルトラジンはテルビウムの励起と発光の間のドメイン（λｍａｘ＝４２５ｎｍ）で強く吸収し、アルラレッドは蛍光の発光ドメイン（λｍａｘ＝５２４ｎｍ）で強く吸収する。蛍光の強い化合物、クマリンおよびフルオレセインは１００ｎＭで存在し、２００ｎＭのアッセイ濃度を表した。フルオレセインのこの濃度は、フルオレセインフィルタセットで読み取る場合、ＬＯＰＡＣ１２８０ライブラリ（Ｓｉｇｍａ）における任意の化合物の１０μＭでの最高蛍光強度の１０倍を表す。最終的に、非乳性のコーヒークリーマーは、光散乱剤として０．５ｍｇ／ｍＬで使用した。この濃度で溶液は視覚的に濁っている。これらの場合全てにおいて、比例関係を保ったアッセイの読み取りで無視できる影響が見られた。ドナーとアクセプターの強度に関する生データで（示さず）、アルラレッドを含有するウェルのみ干渉化合物の顕著な（約３０％の低下）影響を示したが、この影響の大きさは、双方のデータで類似しており、データを「比で示す」ことによって補正された。蛍光化合物または光散乱化合物からの干渉は、どんな干渉も測定が行われるずっと前にバックグランドのレベルまで崩壊したという読み取りの時間分解の性質によって回避された。

実施例２２：細胞溶解物からのキナーゼのアッセイ
血清を除いてＲＡＷ２６４．７細胞（マウスのマクロファージ細胞株）を一晩培養し、溶解物を調製するのに先立って１０μｇ／ｍｌのアニソマイシンで１５分間刺激した（またはしなかった）。例えば、キナーゼ活性アッセイキットプロトコル（カリフォルニア州のバイオソース、Ｒｅｖ． Ａ１ １２／９／０５、カタログ番号ＫＮＺ００３１）に記載されたような標準的なプロトコルに従って溶解物を調製した。プロトコルを以下に概略する。

細胞からのタンパク質抽出手順
Ｏｍｎｉａ（商標）溶解物アッセイを用いて細胞溶解物のＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２活性を測定する場合、試料の調製に以下の手順を用いてもよい。このプロトコルは、ヒトやマウスに由来する幾つかの細胞株に上手く適用されている。１．氷上でＯｍｎｉａ細胞抽出緩衝液（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を解凍する。
２．所望のように細胞を設定し、刺激する。
３．遠心分離（非付着性細胞について）または培養プレートからのこすり取り（付着性細胞について）によって冷却ＰＢＳ中に細胞を回収する。
４．４℃にて１，５００ｒｐｍで５分間、細胞を遠心分離する。
５．ＰＢＳを吸引する。
６．細胞ペレットをＯｍｎｉａ細胞抽出緩衝液に再浮遊し、溶解物を１．５ｍＬの微量遠心管に移す。Ｏｍｎｉａ細胞抽出緩衝液の容量は、細胞数およびＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２の発現レベルに依存する。溶解物の最適なタンパク質濃度は、５〜１０ｍｇ／ｍＬの範囲内である。使用前に、適当量のプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤（通常、１００倍のストック溶液として提供される）を加える。これらの条件下で、０．００５ｍＬ（２５〜５０μｇ）の澄んだ細胞抽出物の使用は、ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２活性の測定に十分である。
７．回転装置上で４℃にて３０分間、細胞を溶解する。次いで所望であれば、全細胞抽出物を手短に超音波処理するか、または針付き注射器に通すことができる。
８．４℃にて１３，０００ｒｐｍで２０〜３０分間遠心分離する。
９．澄んだ細胞抽出物を清浄な微量遠心管に移す。
１０．分析の準備ができるまで、澄んだ細胞抽出物を−８０℃で保存する。凍結−融解サイクルの反復は避けること。アッセイを行うための調製においては、試料を氷上で融解しうる。分析に先立ってよく混合する。

溶解物を緩衝液中で連続稀釈し、１００μＭ ＡＴＰを含有するアッセイ緩衝液中にて４００ｎＭ ＧＦＰ−ｃＪｕｎに対して５μＬ等量をアッセイした。ＥＤＴＡおよび最終濃度２ｎＭリン酸化ｃＪｕｎ認識抗体の添加によりアッセイを停止した。１時間のインキュベートの後、プレートを読み取り、データを回収した。表２を参照されたい。試料は２つ組で作製した。

溶解物のウエスタンブロット分析も刺激の際のＪＮＫのリン酸化を示した（データは示さず）。

実施例２３：細胞性（生細胞）のユビキチン化アッセイ
本発明の態様の１つの実施例として、この実施例は、２つの技術、ドナーの標識を提供するＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ ＴＲ−ＦＲＥＴ試薬（テルビウムで標識したユビキチン特異的モノクローナル抗体）および生細胞で発現されるユビキチン化標的（例えば、ＩκＢα）に融合される組換え緑色蛍光タンパク質（アクセプター標識）を利用する。

ゲートウエイクローニング技術（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によってｐｃＤＮＡ−ＥｍＧＦＰ−ＩｋＢａ発現クローン（ＣＭＶプロモータ、ＴＫポリＡ）を生成した。ｐｃＤＮＡ６．２−Ｎ−ＥｍＧＦＰ−ＤＥＳＴ（図３２Ａ）およびＵｌｔｉｍａｔｅ ＯＲＦクローンＩＯＨ４１３８基質を用いてＬＲ組換え反応を行った。ＥｍＧＦＰ−ＩｋＢａのコーディング配列を図３２Ｂに示す。リポフェクトアミン２０００形質移入試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＧｒｉｐＴｉｔｅ２９３細胞にこのＤＮＡ構築物で形質移入した。ブラストサイジンに安定して耐性（およびＧＦＰの安定した発現）の細胞がいったん樹立されると、ＦＡＣＳによって細胞を仕分けし、さらなるアッセイの開発のためにクローンを保存した。

本実施例は、ＧＦＰ−ＩκＢα融合タンパク質を発現しているＨＥＫ２９３細胞株（ＦＡＣＳによってクローンとして単離された）を記載する。この細胞株は、ＮＦκＢ経路を介したＴＮＦα刺激の炎症性の効果に応答性である。ＩκＢαはＴＮＦα処理に応答してユビキチン化されるようになるので（例えば、ポリユビキチン化）、ＮＦκＢを遊離させて核に転位させ、標的遺伝子の転写を刺激すると考えられている。

ユビキチン鎖またはポリユビキチン鎖に特異的に結合するモノクローナル抗体をＩＴＣ−テルビウムキレートで標識した（大まかに７〜１０の標識／Ａｂ）。製造元のプロトコルを用いて、アミン反応性のＩＴＣ−Ｔｂキレート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をモノクローナル抗体にコンジュゲートさせた。簡単に言えば、５００μｇ抗体（Ｈｅｐｅｓ緩衝生理食塩水、ｐＨ７．５で透析）を５０μｇ ＩＴＣ−Ｔｂキレート（１Ｍの重炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．５に再懸濁）の１：１０容積と反応させた。室温にて一晩、コンジュゲートを進行させ、翌日、Ｈｅｐｅｓ緩衝生理食塩水で透析した。吸収法を用いてＴｂ標識効率を決定した。

第１日目に、９６穴の透明底プレート（Ｃｏｓｔａｒ）のウェル当たり、８×１０^４個のＨＥＫ２９３／ＧＦＰ−ＩκＢα細胞を加えた。１００μＬ／ウェルの容量におけるＤＭＥＭ＋１０％ｄＦＢＳ＋ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ＋２５ｍＭのＨＢＳ＋非必須アミノ酸の中に細胞を入れた。２日目に、２０ｎｇ／ｍＬ ＴＮＦ（最終濃度）で始まる用量反応性のＴＮＦα（バイオソース、カタログ番号ＰＨＣ３０１５）１０μＬで細胞を１時間刺激し、最終データ点としての「ゼロ」ＴＮＦ対照を含む連続稀釈液（１：５）を細胞に加えた。ＴＮＦの連続稀釈は、完全増殖培地で行った。次いで、培地を除いた。ｐｈｏｓｐｈｏ−ｅｌｉｓａ溶解緩衝液（プロテアーゼ阻害剤を加えた２０ｍＭトリス／１％ ＮＰ４０系）５０μＬによって氷上で３０分間、細胞を溶解し、卓上プレートミキサーで手短に撹拌した（ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＬＩＳＡ溶解緩衝液の組成（１×）。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１％ ＮＰ４０、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＮａＰＰ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＶＯ４、１：２００稀釈のプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ、Ｐ８３４０））。２０μＬの細胞溶解物を３８４穴プレートに移し、５０ｎＭの抗体−Ｔｂ溶液５μＬを加えた（抗体の最終濃度は大まかに１０ｎＭである）。ＢｉｏＭｏｌ（Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ、米国ペンシルベニア州）から購入した以下のモノクローナル抗体をこれらの実験で使用した。ＦＫ−１（ポリユビキチン鎖を認識する、カタログ番号ＰＷ８８０５）およびＦＫ−２（ユビキチンを認識する、カタログ番号ＰＷ８８１０）複合体を形成させ、室温にて３０分間平衡化させ、Ｔｅｃａｎ Ｕｌｔｒａ蛍光プレートリーダを用いて（３４０での励起、４９５と５２０での発光、１００μｓの遅延時間、２００μｓの積算時間）、ＴＲ−ＦＲＥＴを測定した。５２０での発光値を３４０でのこれらで割り、抗体濃度におけるウェルからウェルへの変異を正規化した。各試料について「バックグランドを差し引いた」値を得るために、５２０でのＡｂの蛍光値を試料の５２０の値から差し引いた。図３０に、ＧＦＰ−ＩκＢαのユビキチン化のＴＮＦαによる刺激に関する用量依存性曲線の例を示す。図３０Ａに、Ｔｂ−抗ユビキチン抗体（ＦＫ２）を利用した。図３０Ｂに、Ｔｂ−抗ポリユビキチン抗体（ＦＫ１）を利用しているデータを示す。

要約すれば、用量反応性の様式でＴＮＦαによってＧＦＰ−ＩκＢα／ＨＥＫ２９３細胞を処理し、トリス／１％ＮＰ−４０に基づく溶解緩衝液で溶解した。ＴＲ−ＦＲＥＴの読み取り（３４０での励起、４９５と５２０での発光、１００μｓの遅延時間、２００μｓの積算時間）を用いて、ＧＦＰ−ＩκＢα−Ｕｂ複合体に結合するその能力についてＴｂ−抗体を調べた。このアッセイによってユーザーは炎症の経路を（特異的に）アッセイしうるが、このアプローチは他の疾患経路（例えば、ｐ５３、カスパーゼ等のユビキチン化）からの種々の標的に対する有用な基盤になりうる。

実施例２４：ＰｒｏｔｏＡｒｒａｙ（登録商標）タンパク質マイクロアレイにおけるタンパク質のユビキチン化
以下の実施例において、ユビキチン化様タンパク質（例えば、ＳＵＭＯ化、ＮＥＤＤ化およびＩＳＧ化）関連物を含むタンパク質のユビキチン化アッセイはタンパク質アレイを用いて行いうることを示す。

材料および方法
タンパク質アレイ
ｐ５３（ＢｉｏＭｏｌ）およびｃ−Ｊｕｎ（ＢｉｏＭｏｌ）をプリンティング緩衝液で稀釈し、アレイヤー（ＯｍｎｉＧｒｉｄ、ゲノム溶液）を用いて、ニトロセルロースを被覆したスライド（ＰＡＴＨ、Ｇｅｎｔｅｌ）上でアレイ化し、−２０℃で保存した。

ＰｒｏｔｏＡｒｒａｙ（登録商標）タンパク質マイクロアレイ上でのユビキチン化アッセイ
４℃にて１時間、緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、５ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％のＴｗｅｅｎ２０）中でタンパク質アレイをブロックした。ＢｉｏＭｏｌのユビキチンコンジュゲートキットを用いてユビキチン化コンジュゲートミックスを調製した。手短に言えば、１２０μＬの反応用に以下のミックスを調製した。（１０μｌのエネルギー、４０μｌの分画Ａ、３０μｌのビオチン−ユビキチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）または蛍光−ユビキチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のいずれかを伴う４０μｌの分画Ｂ。）Ｈｙｂｒｉｓｌｉｐ（商標）のもとでタンパク質アレイにユビキチンコンジュゲート反応を加え、２５℃で９０分間インキュベートした。続いて、緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、５ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％のＴｗｅｅｎ２０）で３回スライドを洗浄した。蛍光−ユビキチンで処理したスライドについて、スライドを乾燥し、走査した。ビオチン−ユビキチンで処理したスライドについては、ストレプトアビジン−ＡＦ６４７（０．７５μｇ／ｍｌ）と共に４℃にて４５分間、アレイをインキュベートした。次いで、緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、５ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）で３回スライドを洗浄し、乾燥して、走査した。ＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ（モレキュラーデバイス）によってタンパク質からのデータを取得し、マイクロソフトエクセルでデータを処理した。

結果
高含量タンパク質アレイ（ＰｒｏｔｏＡｒｒａｙ（登録商標）タンパク質マイクロアレイ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、米国カリフォルニア州社）は、ユビキチン−タンパク質リガーゼ（Ｅ３）の新規の基質を迅速に同定する機会を提示する。発明者らは、タンパク質アレイ上でタンパク質のユビキチン化を検出する実験を行った。この実験のために、生体内でユビキチン化されることが公知のタンパク質（ｐ５３とｃ−Ｊｕｎ）を含有するタンパク質アレイを、タンパク質ユビキチン化のための機構を含有する酵素混合物（Ｓ．Ｙ．Ｆｕｃｈｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２７２巻、３２１６３−８ページ、１９９７年、およびＡｕｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、３９９巻、７０１−１７ページ、２００５年）で処理した。発明者らは、修飾したガラススライド上に固相化されたｃ−Ｊｕｎおよびｐ５３双方のユビキチン化を認めた。基質のユビキチン化の検出は、ストレプトアビジン−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（ＳＡ６４７）に結合したビオチン−ユビキチンおよび蛍光−ユビキチンの双方で認められた（図３１Ａ）。アレイ上でスポット化されたタンパク質の量の関数として、タンパク質のユビキチン化のデータを定量した。シグナル（マイクロアレイ上のスポットの蛍光強度）の低下は、スポット化されたタンパク質の量の相当する低下と共に認められる（図３１Ｂ）。

本実施例は、タンパク質アレイ上でのタンパク質のユビキチン化を示す。高含量のタンパク質アレイは、例えば、分解を促進する、タンパク質機能における変化を促進するまたは細胞内におけるタンパク質の局在を変えるためにタンパク質をユビキチン化、ＳＵＭＯ化、またはＮＥＤＤ化する細胞機構（Ｔ．Ｒ．Ｐｒａｙら、Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔ Ｕｐｄａｔ、５巻、２４９−５８ページ、２００２年）の基質を同定するのに有用なツールである可能性がある。

実施例２５：ＴＨＰ１細胞溶解物におけるＬＰＳ誘導ＧＦＰ−ＡＴＦ２のリン酸化
種々の量のＬＰＳ（カルビオケム、品番４３７６２８）を細胞に３０分間加えることによってＴＨＰ１細胞（ＡＴＴＣ、品番ＴＩＢ−２０２）を刺激した。細胞を洗浄し、実施例２２のように溶解し、溶解物５μＬを４００ｎＭのＧＦＰ−ＡＴＦ２および２００μＭのＡＴＰの５μＬに加えた。６０分後、Ｔｂ−抗ｐＡＴＦ２抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、品番ＰＶ４４５）およびＥＤＴＡを加えてキナーゼ反応を停止することによってリン酸化産物を検出した。Ｔｅｃａｎ Ｕｌｔｒａ３８４プレートリーダ（スイス、テキャングループ社）を用いてデータを回収した。図３７Ａに、結果を示す。

実施例２６：ＴＨＰ１細胞溶解物で測定されるＳＰ６００１２５によるＪＮＫ活性化の阻害
ＪＮＫ活性の強力な阻害剤であるが、ＪＮＫを活性化するキナーゼの弱い阻害剤であるＳＰ６００１２５の存在下でＬＰＳ（６０ｎｇ／ｍＬ）によってＴＨＰ１細胞を刺激した。アッセイは、実施例２５に記載のように行った。認められたＩＣ５０値が公表された研究に一致するということは、ＳＰ６００１２５は（その上流ではなく）ＪＮＫ活性で作用することを示唆している。図３７Ｂに、結果を示す。

実施例２７：ＨＥＫ２９３ ＧＦＰ−ＩκＢα細胞におけるＴＮＦαが誘導するＧＦＰ−ＩκＢαのリン酸化
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）法を用い、ＩκＢα断片をｐＣＤＮＡ（商標）６．２／Ｎ−ＥｍＧＦＰ ＤｅｓｔにサブクローニングすることによってＨＥＫ２９３−ＧＦＰ−ＩκＢα細胞株の安定発現のための哺乳類の発現ベクターを生成した。配列決定によって得られたベクターｐＣＤＮＡ（商標）６．２−ＧＦＰ−ＩκＢαを検証した。

リポフェクトアミン（商標）ＬＴＸを用いて製造元のプロトコルに従って、発現ベクターでＨＥＣ２９３細胞株に形質移入した。ブラストサイジンＳ ＨＣｌ（５．２μｇ／ｍｌ）によって１４日間、形質移入した細胞を選抜し、ＧＦＰを発現する細胞についてフローサイトメトリーによって選別した。単一細胞の選別により個々のクローンを生成し、その後全ての実験のために最良に機能するクローンを選択した。

種々の量のＴＮＦαでＨＥＫ２９３−ＧＦＰ−ＩκＢα細胞を３０分間刺激し、その後、細胞を洗浄し、溶解した（２０ｍＭトリス、ｐＨ７．４；１％ ＮＰ−４０；５ｍＭ ＥＤＴＡ；５ｍＭピロリン酸ナトリウム；５ｍＭ ＮａＦ；１５０ｍＭ ＮａＣｌ；２ｍＭ ＶＯ４；１：１００ホスファターゼ阻害剤ミックス１（ＳＩＧＭＡ、Ｐ−２８５０）；１：１００プロテアーゼ阻害剤ミックス（ＳＩＧＭＡ、Ｐ８３４０））。ＧＦＰ−ＩκＢαのリン酸化を測定するため、２０μｌの溶解物を３８４穴プレートに移し、次いでＴｂ−抗ｐＳ３２−ＩκＢα抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、品番ＰＶ３６６２）を加えた。室温での２０分間のインキュベートの後、Ｔｅｃａｎ Ｕｌｔｒａ３８４プレートリーダを用いて試料を分析した。図３８Ａに、結果を示す。

実施例２８：ＴＮＦα誘導ＧＦＰ−ＩκＢαのリン酸化阻害
この実験は、１０００ｐｇ／ｍＬ ＰＳを用いてＴＮＦαによる刺激に先行して阻害剤と共に６０分間の追加インキュベートを行い、実施例２７に記載のように実施した。使用した阻害剤は、ＩＫＫ−阻害剤ＩＶ、ＢＭＳ−３４５５４１およびウィタフェリンだった。図３８Ｂに、結果を示す。

実施例２９：異なったユビキチン様タンパク質（Ｕｂ１）を用いたコンジュゲートアッセイ
Ｕｂ１のＣＧＧ付加変異体の発現／標識：
ＳＵＭＯ１／２／３またはＮｅｄｄ８のＮ末端へのシステイン−グリシン−グリシン（ＣＧＧ）挿入をコードするように発現プラスミド（ｐＥＸＰ１７−ＣＧＧ−Ｕｂｌ）を構築した。エントリーベクターｐＤｏｎｒ２２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１２５３６−０１７）に適合する組換え部位によってＵｂタンパク質を増幅するＰＣＲによってｐＥＸＰ１７−ＣＧＧ−ＵＢｌベクターを作製した。ＰＣＲ産物をｐＤｏｎｒ２２１に組み換えた。目的ベクターｐＤＥＳＴ１７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１８０３）と共にゲートウエイ（登録商標）反応にｐＤｏｎｒ２２１を用いた。当業者に明らかになるであろうように、ＳＵＭＯ１／２／３またはＮｅｄｄ８のＮ末端へのシステイン−グリシン−グリシン（ＣＧＧ）挿入を発現するのに対して本質的に適合可能ないかなるベクターもこの目的に好適である。

業者供給の方法を用いて化学的に形質転換受容性のＢＬ２１ Ｓｔａｒ（商標）（Ｄ３）細胞に発現プラスミドで形質移入し、次いで、０．１ｍｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢ寒天プレートに播いた。コロニーを選抜して０．１ｍｇ／ｍＬアンピシリンを含有するＬＢブロス５０ｍＬに植菌し、それを３７℃にて一晩増殖させる。一晩の培養物から５ｍＬを使用して０．１ｍｇ／ｍＬアンピシリンを含有するＬＢブロス５００ｍＬに植菌し、６００ｎｍでの光学密度が＞０．６となるまで３７℃で増殖させた。この時点で、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を１ｍＭの濃度に加えて、発現プラスミドでＴ７プロモータを誘導し、ＣＧＧ Ｕｂ１付加変異体タンパク質の産生を刺激した。２５℃にて４時間細胞を誘導した。４℃にて４２００ｒｐｍ（ＪＳ−４．２ロータ）で２０分間遠心分離して細胞を回収した。上清を捨て、細胞ペーストを−８０℃で保存した。

手持ち式ポリトロンバイオホモゲナイザーを用いて、１ｍＭのＥＤＴＡと１０ｍＭ ＤＴＴを含有するＨｅｐｅｓ緩衝生理食塩水にＣＧＧ−Ｕｂ１の細胞ペーストを再サスペンドした。１０，０００〜１５，０００ｐｓｉでのアベスチンＥｍｕｌｓｉｆｌｅｘ Ｃ５０に通すことによって再サスペンドした細胞を溶解した。ＪＡ−１４ロータにて４℃にて１３，５００ｒｐｍ（約２８，０００×ｇ）で２０分間、ホモジネートした細胞を遠心分離した。回収した上清を２ｍＬのＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に４℃で１時間、バッチ結合した。次いで、１５３×ｇにて５分間遠心分離して樹脂を回収した。上清を捨て、約５ｍＬの溶解緩衝液に樹脂を浮遊させ、使い捨てのカラムに移した。カラムの水を抜き、次いで２０ｍＬの溶解緩衝液でカラムを洗浄し、その後、３０ｍＭのイミダゾール入りの溶解緩衝液１０ｍＬを重力で落とした。次いで３００ｍＭのイミダゾール入りのＨＢＳ４ｍＬ（ｐＨ７．５）でカラムを溶出した。最終濃度１０ｍＭでジチオスレイトール（ＤＴＴ）を溶出したタンパク質に加えた。

次いで、タンパク質をＨｉｇｈＴｒａｐ Ｑ ＨＰ（ＳＵＭＯ１／２／３）（ＧＥヘルスケア１７−１１５３−０１）カラムまたはＨｉｇｈＴｒａｐ ＳＰ ＨＰ（Ｎｅｄｄ８）（ＧＥヘルスケア１７−１１５１−０１）カラムに負荷した。ＡＫＴＡ純化装置により３０カラム容量を超える０〜４００ｍＭ ＮａＣｌの線形グラジエントを実施した。所望のタンパク質は１５０〜３００ｍＭ ＮａＣｌで溶出した。所望のタンパク質（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定される）を含有する分画をプールし、最終濃度１０ｍＭでＤＴＴを加えた。

標識するため、ＮＡＰ−５カラム（ＧＥヘルスケア１７−０８５３−０１）を用いてＨＢＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌおよび１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．５）でタンパク質約２ｍｇを脱塩し、タンパク質の試料当たり、単一の１ｍＬ分画に回収する。タンパク質のテルビウム標識については、チオール反応性のテルビウムキレート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＰＶ３５８０）を水に溶解し、脱塩したタンパク質に２倍のモル過剰で加えた。タンパク質のフルオレセイン標識については、フルオレセイン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｆ−１５０）をＤＭＳＯに５ｍｇ／ｍＬで溶解し、脱塩したタンパク質に５倍過剰で加えた。室温にて４時間、標識反応を進行させ、生成物をＮＡＰ−５カラムで脱塩するか、またはＨＢＳで一晩透析した。

一次配列情報

抗−エピトープＴＲ−ＦＲＥＴ「ＳＵＭＯ化」アッセイ：
抗−エピトープＴＲ−ＦＲＥＴ ＳＵＭＯ化反応のために以下の溶液を黒色Ｃｏｒｎｉｎｇ３８４穴低容量プレート（品番３６７６）で混合した。

以下の試薬は、以下のＳＫＵ ＃：Ｅ１（ＵＷ９３３０）；Ｕｂｃ９（ＵＷ９３２０）；ＧＳＴ−ＲａｎＢＰ２（ＵＷ９４５５）；およびＧＳＴ−ＳＰ１００（ＵＷ９８２５）と共にＢｉｏＭｏｌ社製を用いた。

ホイルでプレートを密封して蒸発を防ぎ、３７℃で１〜３時間置いた。インキュベートに続いて、４０ｎＭのＴｂ−抗−ＧＳＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＰＶ４２１６）を含有するＴＲ−ＦＲＥＴ稀釈緩衝液（２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５および０．０１％ ＮＰ−４０）１０μＬを各ウェルに加え、室温にて３０分間プレートを平衡化した。ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）用の推奨フィルタセットを有するＴｅｃａｎ Ｕｌｔｒａ３８４またはＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ ＰｈｅｒａＳｔａｒのいずれかでアッセイプレートを読み取った。図４０に、フルオレセイン−ＳＵＭＯ１／２／３およびＴｂ−抗−ＧＳＴ抗体によるＧＳＴ−ＳＰ１００の抗エピトープＴＲ−ＦＲＥＴ ＳＵＭＯ化アッセイの代表的なデータを示す。

実施例３０：ＧＦＰ−ユビキチン融合タンパク質を用いる脱ユビキチン化アッセイ
２ｍＭ ＤＴＴの入ったＴＲ−ＦＲＥＴ稀釈緩衝液の反応緩衝液をこれらのアッセイに用いた。各ウェル１０μＬの最終容量でプレートを横切って、酵素、ＳＥＮＰ１、ＳＥＮＰ２またはＮＥＤＰ１（Ｂｏｓｔｏｎ ＢｉｏｃｈｅｍのＥ−７００、Ｅ−７１０またはＥ−８００）の滴定を実施した。各酵素に、ＳＵＭＯ１、ＳＵＭＯ２、ＳＵＭＯ３またはＮｅｄｄ８の脱コンジュゲート基質の２５ｎＭ溶液１０μＬを加えた。室温にて１時間のインキュベートの後、ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ ＰｈｅｒａＳｔａｒプレートリーダで蛍光測定を取り込んだ。３４０ｎｍ（３０ｎｍのバンド幅）の励起にて５２０ｎｍ（２０ｎｍのバンド幅）および４９５ｎｍ（１０ｎｍのバンド幅）で強度を測定した。

ＧＦＰ−Ｕｂ−Ｔｂは、ＵＣＨ−Ｌ３（■）、ＵＳＰ−２（●）、ＵＳＰ−１５（▲）、ＵＣＨ−Ｌ１（▼）、ＵＳＰ−５（◆）およびＵＳＰ−１４（○）に対する基質（１０ｎＭで）として調べられた（ＵＣＨ−Ｌ３（ＢｉｏＭｏｌ；ＵＷ９７４５）；ＵＳＰ−２（ＢｉｏＭｏｌ；ＵＷ９８５０）；ＵＳＰ−１５（ＢｉｏＭｏｌ；ＵＷ９８４５）；ＵＣＨ−Ｌ１（ＢｏｓｔｏｎＢｉｏｃｈｅｍ；Ｅ−３４０）；ＵＳＰ−５（ＢｏｓｔｏｎＢｉｏｃｈｅｍ；Ｅ−３２２）；ＵＳＰ−１４（ＢｏｓｔｏｎＢｉｏｃｈｅｍ；Ｅ−３４２））ＵＳＰ−１４は、２６ｓプロテアソームの成分との会合の非存在下では、活性を示すとは考えられなかった。ＵＳＰ−２およびＵＳＰ−１５は区別が付かなかった（図４１ａ）。

０．１ｎＭ ＵＣＨ−Ｌ３および１０ｎＭ ＧＦＰ−Ｕｂ−Ｔｂに対し、強結合ＤＵＢ阻害剤であるユビキチンアルデヒドを滴定し、０．２ｎＭのＩＣ５０で反応を阻害することが示された（図４１Ｂ）。

低回転率において優れたＺ’値
増加する量のＤＵＢを含有する２４の陰性ウェルおよび２４の陽性ウェルからＺ’値を決定した。生成物に対する基質の２０％回転率に対して＞０．５のＺ’が認められ、生成物に対する基質の３８％回転率に対して＞０．７５のＺ’が認められ、生成物に対する基質の５４％回転率に対して＞０．８のＺ’が認められた。

実施例３１：本発明の例示プロトコルおよび文献
本実施例は、本発明の組成物および方法に関連する例示文献を提供し、本発明の非限定の方法および組成物の実施例を提供することを意味する。Ｌａｎｔｈａｓｃｒｅｅｎ（商標）ユビキチンアッセイ試薬に関するユーザーガイドを例示する。付属物Ａで記載された方法および組成物は、本明細書に記載されるように本発明の例示となる方法および組成物である。

第１．０節と第２．０節は、とりわけ、本発明の方法で使用することが可能である試薬の例、およびこれらの試薬が包装されうる可能性のある量（例えば、重量）の例を提供する。

第３．０節は、とりわけ、ＦＲＥＴ、ＴＲ−ＦＲＥＴおよびＴＲ−ＦＲＥＴを含むＦＲＥＴで使用される一般的なランタニド類を記載する序論である。

第４．０節は、とりわけ、本発明に関する機器設定の非限定例および一般的な原理を記載する。

第５．０節は、ユビキチン化を検出することおよび／または測定することに関するアッセイ形式の種々の非限定例を記載する。第５．０節は、試料のアッセイ条件を包含する。当業者であれば、これらの条件が例示的であり、本発明が、この場合、ユビキチン化反応が生じることができ、本明細書で記載されるようなユビキチン化の検出が可能である他の条件を包含することを認識するであろう。抗エピトープユビキチン化アッセイについての条件は、例示および／または最適条件としての提供である。例えば、同様のユビキチン化アッセイを行うことができ、その際、抗体はタンパク質を結合し（例えば、天然のタンパク質配列を結合し）、タンパク質またはポリペプチドに組み入れられたエピトープタグを必ずしも結合するわけではない。

第６．０節は、ＧＦＰ融合タンパク質を含む本発明のユビキチン化アッセイの例を記載する。本発明は、蛍光タンパク質または蛍光ポリペプチドとしてのＧＦＰの使用に限定されない。本明細書で議論されるように、本発明は、適合可能な蛍光タンパク質または蛍光ポリペプチドの使用を包含する。ＧＦＰは、テルビウムドナーと適合可能である蛍光タンパク質または蛍光ポリペプチドの例として示される。

第７．０節は、とりわけ、比例関係を保った測定を用いる本発明の例示となる方法に関する安定度／データの質を明らかにする。

ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）ユビキチンアッセイ試薬−ユーザーガイド
目次
１．０ 利用可能な試薬
２．０ 序論
３．０ 機器設定
４．０ Ｔｒ−Ｆｒｅｔ試薬によるユビキチン化の高速処理スクリーニング
５．０ Ｇｆｐ融合タンパク質による代替のユビキチン化アッセイ
６．０ 比例関係を保った測定におけるデータの質の評価
７．０ 関連する製品
８．０ 購入者への注意

１．０ 利用可能な試薬

２．０ 序論
化合物のライブラリをスクリーニングするため、時間分解ＦＲＥＴ（ＴＲ−ＦＲＥＴ）は、化合物の自家蛍光または沈殿した化合物からの光散乱からの干渉を克服する認識された方法である。ＴＲ−ＦＲＥＴの根拠は、標準的なＦＲＥＴと同じであり、好適な一対の蛍光色素分子が互いに密接な近傍範囲内にもたらされると、第１の蛍光色素分子（ドナー）の励起は、第２の蛍光色素分子（アクセプター）へのエネルギー移動を生じる。このエネルギー移動を、アクセプターの蛍光発光の上昇およびドナーの蛍光発光の低下によって検出する。ＨＴＳアッセイでは、ＦＲＥＴは、アクセプター蛍光色素分子とドナー蛍光色素分子の強度の比として表されることが多い。そのような値の比例関係を保った性質によって、ウェル間のアッセイ値の差異が補正され、着色化合物による消光効果が補正される。

標準的なＦＲＥＴとは対照的に、ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイは、ドナー種として寿命の長いランタニドキレートを使用する。ランタニドキレートは、その励起された状態の寿命（分子が光子を受け取った後励起された状態で費やす平均時間）をミリ秒以上の桁にすることができるという点で独特である。このことは、通常、ナノ秒範囲である、標準的なＦＲＥＴアッセイで使用される一般的な蛍光色素分子の寿命と鋭く対照的である。自家蛍光化合物または散乱光からの干渉はナノ秒の時間尺度なので、これらの因子は標準的なＦＲＥＴアッセイに否定的な影響を与える。これらの干渉を克服するため、マイクロタイタープレートリーダにおいて、閃光灯による励起光源によって励起された後、好適な遅延、通常、５０〜１００ミリ秒後にＦＲＥＴを測定することによってＴＲ−ＦＲＥＴアッセイを行う。この遅延によって、バックグランドの蛍光または散乱光からの干渉が克服されるだけでなく、閃光灯による励起光源の瞬時ではない性質による直接励起からの干渉も回避される。

ＨＴＳ用のＴＲ−ＦＲＥＴアッセイで最も一般的に使用されるランタニドは、テルビウムおよびユーロピウムである。テルビウムは、ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイでドナー種として使用されるとユーロピウムよりも独特の利点を提供する。アクセプターとしてＡＰＣを用いるユーロピウム系の方式とは対照的に、テルビウム系のＴＲ−ＦＲＥＴアッセイはアクセプターとして、例えば、フルオレセインのような一般的な蛍光色素分子を使用することができる。テルビウム系のＴＲ−ＦＲＥＴアッセイでは、ユーロピウム系アッセイで一般的に行われるストレプトアビジンが介在するＡＰＣの動員を介して間接的に標識されなければならないビオチン化分子ではなく、蛍光標識した試薬を使用してもよい。テルビウム系のＴＲ−ＦＲＥＴアッセイにおける直接標識された分子の使用のよって、コストが軽減され、動態が改善され、大きなＡＰＣコンジュゲートが関与する立体的相互作用による問題が回避され、直接標識方式には最適化を必要とする独立変数がほとんどないのでアッセイの開発が簡略化される。

３．０ 機器設定
図６下方に、テルビウムおよびフルオレセインの励起および発光のスペクトルを示す。他のＴＲ−ＦＲＥＴシステムと同様に、３０ｎｍのバンド幅と共に３４０ｎｍ励起フィルタを用いてテルビウムドナーを励起した。しかしながら、励起フィルタの正確な仕様は重要ではなく、類似の仕様を持つフィルタも上手く機能する。一般に、ユーロピウム系のＴＲ−ＦＲＥＴ方式で上手く機能する励起フィルタは、ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）テルビウムキレートで上手く機能する。

図６に示すように、テルビウムの発光スペクトルは、４つの鋭い発光ピークと各ピーク間のサイレントドメインを特徴とする。テルビウムの最初の発光ピーク（およそ４８５ｎｍと５０５ｎｍの間に中心がある）は、フルオレセインの最大励起ピークと重なる。次いで、テルビウムの最初の２つの発光ピークの間のサイレントドメインでフルオレセインへのエネルギー移動を測定した。テルビウムからの干渉を受けずにフルオレセインへのエネルギー移動を測定することが重要なので、この目的には、２５ｎｍのバンド幅を持ち、５２０ｎｍに中心があるフィルタを用いた。このフィルタの仕様は、励起フィルタより重要である。一般に、標準的な「フルオレセイン」のフィルタは、テルビウムのスペクトルに関連する光も同様に通すので使用してはならない。テルビウムの最初のピークを単離するフィルタを用いて、このピークの発光に対してＦＲＥＴによるフルオレセインの発光を参照する（または「比として表す」）。通常、これは、１０ｎｍのバンド幅を持ち、４９０ｎｍまたは４９５ｎｍに中心があるフィルターによって達成される。一般に、機器の２色性ミラーの選択（例えば、Ｔｅｃａｎ Ｕｌｔｒａ機器におけるもの）が４９５ｎｍのフィルタの仕様を必要としてもよいが、４９０ｎｍのフィルタは、この測定に「流れ出る」フルオレセインの発光量を低減する。いずれかの場合、得られる測定の質に対する影響は最小である。ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）アッセイに好適なフィルタは、フィルタセットＰＶ００１としてＣｈｒｏｍａ（Ｒｏｃｋｉｎｇｈａｍ、米国バーモント州）から、または他の業者から入手可能である。ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ ＰＨＥＲＡｓｔａｒ用のＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）フィルタモジュールは、ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ（Ｄｕｒｈａｍ、米国ノースカロライナ州）から入手可能である。

フィルタの選択とは別に、機器の設定は、ユーロピウム系の技術で使用される設定に対して独特である。一般に、機器の製造元によって提供される指針を最適化の出発点として使用することができる。遅延時間１００μｓ、その後の積算時間２００μｓは、ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）アッセイに独特である。ウェル当たりの閃光または測定の数は機器に高度に依存し、機器製造元推奨のように設定した。一般に、ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）アッセイは、例えば、Ｔｅｃａｎ Ｕｌｔｒａ、 ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ ＰＨＥＲＡＳｔａｒ、モレキュラーデバイスアナリスト、またはパーキンエルマーエンビジョンのような時間分解ＦＲＥＴが可能である任意のフィルター系機器で行うことができる。ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）アッセイはまた、Ｔｅｃａｎ Ｓａｆｉｒｅ^２単色光分光器系機器およびモレキュラーデバイスＭ５機器でも上手く実施されている。機器に固有の設定の指針については、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ技術サービスに連絡されたい。

４．０ ＴＲ−ＦＲＥＴ試薬によるユビキチン化の高速処理スクリーニング
ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）ユビキチン化製品は、タンパク質のモノユビキチン化およびポリユビキチン化の形成率または量の変化をモニターするための高感度ＨＴＳ試薬を提供する。ＴＲ−ＦＲＥＴのドナー（すなわち、テルビウム）およびアクセプター（すなわち、フルオレセイン）を組み入れることによって、ユビキチンをコンジュゲートする酵素のためのスクリーニングアッセイを迅速に展開するのに使用することができる普遍的なアッセイ試薬を創出した。選択的な標識工程のために、ユビキチン内のリジンは全て未修飾であり、標識されたユビキチン試薬は迅速に、ユビキチン−タンパク質のコンジュゲートおよびポリユビキチン鎖に組み入れられる。

ＨＴＳユビキチン化アッセイの形式
典型的なＨＴＳ ＴＲ−ＦＲＥＴユビキチン化アッセイについては、ユビキチンをコンジュゲートする酵素（Ｅ１、Ｅ２およびＥ３）、ユビキチン化される標的タンパク質およびＡＴＰと共に、フルオレセイン、テルビウム−またはビオチン−ユビキチンをインキュベートする。酵素は、標識されたユビキチンを標的タンパク質にコンジュゲートさせて、モノユビキチン化またはポリユビキチン化を生じる。具体的なアッセイによって、検出試薬（すなわち、Ｔｂ−抗エピトープタグ抗体またはＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｔｂ−ストレプトアビジン）をユビキチン化反応に加え、ＴＲ−ＦＲＥＴの対形成を完了してもよい。例として図１０、２２、２６、２７および２９を参照されたい。

標的タンパク質のユビキチン化の程度はＴＲ−ＦＲＥＴのシグナルに直接関係する。一般に、ＴＲ−ＦＲＥＴシグナルの上昇は、標的タンパク質のユビキチン化を意味するが、ＴＲ−ＦＲＥＴシグナルに上昇がないことは標的タンパク質がユビキチン化されないことを示唆する。ＨＴＳの適用では、薬剤を導入して標的タンパク質のユビキチン化を阻害するまたは促進する化合物の有効性を測定する。薬剤がユビキチン化反応を阻害するのであれば、標的タンパク質のユビキチン化の低下のためにＴＲ−ＦＲＥＴシグナルの低下（対照に比べて）が認められるであろう。逆に、薬剤がユビキチン化反応を促進するのであれば、ＴＲ−ＦＲＥＴシグナルの上昇が認められるであろう。

ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）ツールボックスからのＴｂ標識した抗−種抗体の利用性は、標的タンパク質に対する特異的な一次抗体が利用可能である場合、ユビキチン化を検出する追加のアッセイ形式を提供する。ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）ユビキチン化試薬の汎用性によってＴＲ−ＦＲＥＴ ＨＴＳの利点を最少の展開時間と一体化するカスタムアッセイを容易に構築することができる。

アッセイ条件の例
ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ ＴＲ−ＦＲＥＴユビキチン化アッセイのためのアッセイ条件の例を以下に概略する。アッセイのパラメータは、ユビキチンをコンジュゲートする酵素ＵｂｃＨ１（Ｅ２−２５ｋ）に基づいて実験的に決定され、最適化の出発点として提供する。ジチオスレイトール（ＤＴＴ）の添加は適宜であり、一部のユビキチンをコンジュゲートする酵素を活性化するのに必要な場合もある。ユビキチン化反応を停止するには、反応の範囲内でＭｇ^２＋の濃度と等しい濃度のＥＤＴＡを加えることで、ＡＴＰの加水分解を妨げうる。

^＊ＡＴＰ再生溶液（１×）：４ｍＭのＡＴＰ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５ｍＭリン酸クレアチン（Ｓｉｇｍａ、Ｐ７９３６）および０．０３ｍｇ／ｍＬクレアチンホスフォキナーゼ（Ｓｉｇｍａ、Ｃ３７５５）および０．３単位／ｍＬ無機ピロホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ、Ｉ１６４３）。Ｔ．Ｙａｏ、Ｒ．Ｅ．Ｃｏｈｅｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２０００年、２７５巻、３６８６２−３６８６８ページから適用した。「ＡＴＰ再生酵素」は機能的ユビキチン化アッセイには必要としない。ＡＴＰおよびＭｇＣｌ_２のみの溶液もユビキチン化アッセイにとって適当なエネルギー源である。

抗エピトープユビキチン化アッセイ
標的タンパク質がエピトープタグを含有する場合、抗エピトープユビキチン化アッセイを使用しうる。ＴＲ−ＦＲＥＴドナー（Ｔｂ）は導入された抗体上に位置するので、ＴＲ−ＦＲＥＴの対形成を完了するのにユビキチン鎖の形成が必要とされないから、モノユビキチン化またはポリユビキチン化を検出するのにこのアッセイを使用しうる（図２７（フルオレセイン抗エピトープ／テルビウムＵｂ））。

Ｃｏｒｎｉｎｇ低容量３８４穴プレート（＃３６７６）中で溶液を混ぜ合わせ、アルミニウム密封テープで覆って蒸発を防ぎ、３７℃にて８時間置いた。他のユビキチンコンジュゲート酵素による実験は、９０分等の短いインキュベート時間でＴＲ−ＦＲＥＴシグナルの発生を示した。理想的なインキュベート時間は、最適な性能について実験的に決定される。

インキュベートに続いて、Ｔｂ抗ＧＳＴ（最終濃度：１ｎＭ）を含有するＴＲ−ＦＲＥＴ稀釈緩衝液（ＰＶ３５７４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、米国カリフォルニア州）１０μＬを各ウェルに加えた。室温にて２０分間、プレートを平衡化し、ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）用の推奨されたフィルタセットを持つＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ ＰＨＥＲＡｓｔａｒで読み取った。図３４に、ＧＳＴ−ＵｂｃＨ１による抗−エピトープユビキチン化アッセイの代表的なデータを示す。

分子鎖内ユビキチン化アッセイ：
標的タンパク質のポリユビキチン化を検出するのに分子鎖内ユビキチン化アッセイを使用した。ＴＲ−ＦＲＥＴのドナーおよびアクセプター双方ともユビキチン自体に位置するので、展開工程または試薬添加工程を必要としない。（図２２）これによって、鎖内ユビキチン化反応をリアルタイムユビキチン化読み取り（若しくはユビキチン化動態）に使用でき、または終点アッセイとして使用しうる。以下に概略する条件は終点アッセイの読み取り用である。

Ｃｏｒｎｉｎｇ低容量３８４穴プレート（＃３６７６）にて溶液を混ぜ合わせ、アルミニウム密封テープで覆って蒸発を防ぎ、３７℃にて８時間置いた。インキュベートに続いて、１０μＬのＴＲ−ＦＲＥＴ稀釈緩衝液（ＰＶ３５７４）を各ウェルに加え、ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）用の推奨されたフィルタセットを持つＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ ＰＨＥＲＡｓｔａｒでプレートを読み取った。図２３、２５および３５に、ＵｂｃＨ１による終点鎖内ユビキチン化アッセイの代表的なデータを示す。

リアルタイムの鎖内ユビキチンアッセイでは、展開工程や試薬添加工程を実施しない。展開工程の除くことに合わせるために、アッセイ容量を２０μＬに減らし、フルオレセイン−ユビキチンおよびＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｔｂ−ユビキチンの濃度をそれぞれ１５０ｎＭおよび１２．５ｎＭに低下させて、拡散した高いＦＲＥＴの観察を防ぐべきである。タンパク質のプレートへの吸着を防ぐために、少量の界面活性剤（約０．０１％ノニデットＰ−４０）の反応物への添加も推奨する。

ビオチン／ストレプトアビジン ユビキチン化アッセイ：
標的タンパク質のポリユビキチン化を検出するのにビオチン／ストレプトアビジン ユビキチン化アッセイを使用することもできる。このアッセイでは、展開工程の間のＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｔｂ−ストレプトアビジンの添加と共にＴＲ−ＦＲＥＴドナー（Ｔｂ）を導入する（図３３）。

Ｃｏｒｎｉｎｇ低容量３８４穴プレート（＃３６７６）にて溶液を混ぜ合わせ、アルミニウム密封テープで覆って蒸発を防ぎ、３７℃にて８時間置いた。インキュベートに続いて、ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｔｂ−ストレプトアビジン（最終濃度：２ｎＭ）を含有するＴＲ−ＦＲＥＴ稀釈緩衝液（ＰＶ３５７４）１０μＬを各ウェルに加えた。室温にて２０分間プレートを平衡化し、ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）用の推奨されたフィルタセットを持つＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ ＰＨＥＲＡｓｔａｒで読み取った。図３６に、ＵｂｃＨ１によるビオチン／ストレプトアビジンユビキチン化アッセイの代表的なデータを示す。

プレートに添加するための溶液の予備混合
単一溶液添加工程のためのユビキチン化アッセイ溶液の予備混合は、ＴＲ−ＦＲＥＴのシグナルに軽微な変動を生じた。予備混合が行われるのであれば、第２の工程としてＡＴＰ溶液が添加されてユビキチン化反応を開始する際、さらに高いＺ’値を達成した。予備混合の条件を評価して最適なアッセイ条件を同定すべきである。

アッセイの安定性および読み取り窓
所与のアッセイ方式については、シグナルの安定性および読み取り窓が評価されるべきである。一般に、アッセイは、展開工程に続いて１２時間安定なシグナルを示した。ＵｂｃＨ１以外のユビキチンコンジュゲート酵素による実験は、９０分のような短いインキュベート時間でＴＲ−ＦＲＥＴシグナルの発生を示している。具体的なアッセイの構成およびアッセイの要求によって、これらの時間は異なってもよく、所与のアッセイ方式について実験的に決定されるべきである。

プレートの選択
発明者らは、ｂｌａｃｋ Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）３８４穴の低容量、丸底（非結合表面）のアッセイプレート（ニューヨーク州、Ｃｏｒｎｉｎｇ、＃３６７６）を推奨する。他の黒色壁の低結合のアッセイプレートは、試さなかったが好適であってもよい。

５．０ ＧＦＰ融合タンパク質による代替のユビキチン化アッセイ
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）テルビウムドナーの優れたＦＲＥＴアクセプターである。従って、ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｔｂ−ユビキチンまたはＴｂ−ストレプトアビジン／ビオチン−ユビキチンによるユビキチン化アッセイでＧＦＰ融合タンパク質を使用しうる。図２６を参照されたい。これら特定のアッセイ形式では、ＧＦＰはＴＲ−ＦＲＥＴアクセプターとしてフルオレセインを置き換え、標準のＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）のフィルタセットによって読み取りうる。

６．０ 比例関係を保った測定におけるデータの質の評価
ＴＲ−ＦＲＥＴの値は、根底にあるドナーおよびアクセプターシグナルの単位のない比である。根底にあるドナーおよびアクセプターシグナルは、機器設定（例えば、機器の増幅率）に依存するので、ＴＲ−ＦＲＥＴの比、シグナル対ノイズ（Ｓ／Ｎ）、シグナル対バックグランド（Ｓ／Ｂ）およびアッセイ窓の得られる「最高」と「最低」は同様にこれらの設定に依存し、機器ごとに異なるであろう。アッセイの安定度を決定することにおいて重要なものは、最大値と最小値の差異に関するデータにおける誤差の大きさと同じ程度に窓の大きさではない。Ｚｈａｎｇとその共同研究者（Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．、１９９９年、４巻、２号、６７−７３ページ）によって提案された、これらの因子を考慮に入れる「Ｚプライム」（Ｚ’）値が、ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイにおいてデータの質を評価するための正しい方法であるというのがこの理由である。以下に示すのは、同一のユビキチン化アッセイ試料で、しかし、２つの異なった機器で行われた２つの「Ｚプライム」の計算である。各機器は、異なったＴＲ−ＦＲＥＴのシグナルを示すにもかかわらず、アッセイ窓およびＺ’値は類似している。通常、我々のユビキチン化アッセイは０．７より大きいＺ’値を有する。破線は±３標準偏差を表す。

７．０ 関連製品

完全な、最新の製品リストについては、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（Ｃａｒｌｓｂａｄ、米国カリフォルニア州）に連絡されたい。

説明目的のために、本発明の特定の実施例を上述してきたが、添付の特許請求の範囲に記載の本発明から逸脱することなく、詳細には多数の変更が行われてもよいことは、当業者によって十分に理解されるであろう。

本明細書で言及された出版物、特許および特許出願は、あたかも各個々の出版物、特許および特許出願が参照によって本明細書に組み入れられるように具体的に且つ個々に指示されたかのように、同じ程度にその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。

本発明を例示するため、本発明における特定の態様を図面に表す。しかしながら、本発明は、図面に表す態様の正確な配置および装備に限定されない。
ＴＲ−ＲＥＴアッセイの一態様を示す模式図である。 有機アンテナ部分および有機アンテナ部分からランタニド金属イオンへのエネルギー移動を含んでなる、ランタニド金属キレートの構造を示す図である。 有機アンテナ部分を含んでなる２つのルミネッセンス金属キレートの化学構造を示す図である。 有機アンテナ部分（ＣＳ１２４）を含んでなるテルビウムキレートの、正規化した励起／発光スペクトルを示す。 フルオレセインおよびローダミン励起バンドと重複するテルビウム発光バンド、ならびにテルビウム発光が極小となるドメインにおけるフルオレセインおよびローダミン発光の位置を示す、テルビウムキレート発光スペクトルである。 テルビウムキレートおよびフルオレセインスペクトルの重複を示す図である。 テルビウムキレートおよびローダミンスペクトルの重複を示す図である。 キレートおよびキレート−抗体コンジュゲートの吸光特性を示す図である。 キナーゼ活性の測定法に関する本発明の態様を表す図である。 脱ユビキチン化活性の測定法に関する本発明の一実施例を表す図である。 本発明において利用可能なユビキチン基質の非限定的な実施例を表す図である。図１１Ｅおよび図１１Ｆは、テルビウム標識抗体を利用する。当業者であれば、ランタニド金属錯体および蛍光アクセプター（ＧＦＰポリペプチドまたはタンパク質等）に付加／結合する、他の類似の変更および組み合わせを認識するであろうが、本発明はそれらの全てを包含する。ＧＦＰは、標識の実施例およびアクセプター標識の実施例として示す。テルビウム（Ｔｂ）は、標識の実施例およびドナー標識の実施例として示す。本発明は、ＧＦＰにもＴｂにも限定することを意味せず、任意の互換性のあるＲＥＴ用ドナーまたはアクセプターを含んでなる任意の基本的な標識の使用を包含する。加えて、図中に用語ユビキチンを用いる場合は、常にモノユビキチンまたはポリユビキチンのいずれをも指しうる。略語：ＳＡ（ストレプトアビジン）、Ｂ（ビオチン） 脱ユビキチン化活性を測定するアッセイの結果を示す図である。 脱ユビキチン化活性を測定するアッセイの結果を示す図である。 キナーゼ活性を測定するアッセイの結果を示す図である。 キナーゼ活性を測定するアッセイの結果を示す図である。 キナーゼ活性を測定するアッセイの結果を示す図である。 キナーゼ活性を測定するアッセイの結果を示す図である。 キナーゼ活性を測定するアッセイの結果を示す図である。 キナーゼ活性を測定するアッセイの結果を示す図である。 キナーゼ活性を測定するアッセイの結果を示す図である。 ｃ−Ｊｕｎ−ＧＦＰ融合基質を用いるＪＮＫ１およびＪＮＫ２アッセイの結果を示す図である。 基質にＡＴＦ２−ＧＦＰを用いてｐ３８アイソフォームを選択的に阻害するアッセイを示す図である。 分子鎖内ＴＲ−ＦＲＥＴユビキチン化アッセイを提示する図である。 ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）分子鎖内ユビキチン化反応および対応する対照で検証されたＴＲ−ＦＲＥＴシグナルの代表的な棒グラフを示す図である。 分子鎖内ユビキチン化反応のための代表的なＺ’データを示す図である。ネガティブ対照（−）は、ＡＴＰ溶液のない反応混合物である。点線は２つの標準偏差を表す。 メチル化ユビキチンを有する分子鎖内ＴＲ−ＦＲＥＴユビキチン化アッセイの阻害曲線を示す図である。メチル化ユビキチンは、タンパク質内のリジン残基がメチル化されることにより、ポリユビキチン鎖の形成能がないか減少し、これにより分子鎖内ＴＲ−ＦＲＥＴペア形成を妨害または阻害する。 図２６Ａは、ＧＦＰ／Ｐ５３融合タンパク質およびテルビウム−ユビキチン（テルビウム標識ユビキチン）を有するユビキチン化アッセイの実施例を示す図である。標的タンパク質（この場合はｐ５３）のＤＮＡ配列が既知である場合、蛍光タンパク質またはポリペプチド（ＧＦＰ等）を有する融合生成物を形成しうる。例えば、ｐ５３のユビキチン化をモニタするためのテルビウム−ユビキチンを有するユビキチン化アッセイにおいて、ｐ５３−ＧＦＰ融合タンパク質を使用できる。図２６Ｂは、Ｔｂ−ストレプトアビジン／ビオチン−ユビキチンフォーマットを示す図である。標的タンパク質のＧＦＰ融合を利用可能なときには、ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｔｂ−ユビキチンまたはＴｂ−ストレプトアビジン／ビオチン−ユビキチンを用いるユビキチン化アッセイが可能である。ＧＦＰはＴＲ−ＦＲＥＴアクセプターとして作用し、ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）標準フィルタセット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、米国カリフォルニア州）標準フィルタセットにより読み取りうる。 フルオレセイン標識抗体を利用する種々のユビキチン化アッセイフォーマットの実施例を示す図である。抗体をテルビウムで標識し、ユビキチンをフルオレセインで標識する、同様のフォーマットを利用してもよい。抗体をＲＥＴペアのアクセプター部分で標識し、ユビキチンをＲＥＴペアのドナー部分で標識する、同様のフォーマットを利用してもよい。例えば、「タグ」への結合または１次抗体で間接的に結合する替わりに、標識抗体がユビキチン化されるタンパク質に直接に結合する、別の同様のフォーマットを利用してもよい。 蛍光タンパク質系ＴＲ−ＦＲＥＴキナーゼアッセイの一般原理を示す図である。 ユビキチン化基質（ＩκＢα等）およびアクセプター標識（ＧＦＰ等）を含んでなる融合タンパク質のユビキチン化を検出することを表す図である。幾つかの態様において、融合タンパク質は細胞中に発現する。細胞は、適宜、基質のユビキチン化（例えば、その速度）を調整するかどうかを計測するための条件および／または化合物と接触する。細胞は次いで溶解され、ユビキチン（ポリユビキチン等）と結合し、融合タンパク質のアクセプター標識とＦＲＥＴペアを形成するドナー標識で結合パートナーが標識される、結合パートナーと接触する。ユビキチン化は、アクセプターおよび／またはドナーの発光における変化等のＦＲＥＴにより検出される。 下記実施例２３等において本願明細書に記載の、細胞ユビキチン化アッセイ由来のデータを示す図である。表Ａに、抗ユビキチン標識された抗体を用いるデータを示す。表Ｂに、抗ポリユビキチン標識された抗体を用いるデータを示す。 タンパク質アレイ上でのタンパク質のユビキチン化を表す図である。ｐ５３およびｃ−Ｊｕｎタンパク質を含むタンパク質アレイを、フルオレセインユビキチンまたはビオチン−ユビキチン存在下において、タンパク質ユビキチン化のための酵素と共にインキュベートした。ビオチン−ユビキチン処理したアレイに対してユビキチン化を検出するため、アレイはストレプトアビジン−ＡＦ６４７（ＳＡ６４７）でも処理した。ＳＡ６４７のみで処理したアレイにおいても、ネガティブ対照を実施した。 Ａのデータを定量化し、アレイ上にスポットしたタンパク質の相対量（ｘ軸）に対するシグナル強度（ｙ軸）の関数としてプロットした。 ｐｃＤＮＡ６．２−Ｎ−ＥｍＧＦＰ−ＤＥＳＴのマップを表す図である。 ＥｍＧＦＰ−ＩｋＢａのためのコード配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）を示す図である。 ユビキチン化（ポリユビキチン化等）のためのビオチン／ストレプトアビジンフォーマットを表す図である。これは、フォーマットの一実施例の図示である。幾つかの態様において、ストレプトアビジンはＵｂに付加し、標識ビオチン（Ｔｂ標識等）はストレプトアビジン−Ｕｂと結合する。幾つかの態様において、ストレプトアビジン／ビオチン複合体は、Ｕｂ上のＦＲＥＴペアの他のメンバーと共に、標的タンパク質上にありうる。幾つかの態様において、ストレプトアビジン／ビオチン複合体は、標的タンパク質上のＦＲＥＴペアの他のメンバーと共に、Ｕｂ上にありうる。幾つかの態様において、ストレプトアビジン複合体は、ＦＲＥＴペアのドナーメンバーを含んでなる。幾つかの態様において、ストレプトアビジン複合体は、ＦＲＥＴペアのアクセプターメンバーを含んでなる。 ＧＳＴ−ＵｂｃＨ１を有する抗エピトープユビキチン化アッセイ由来の代表的なデータを示す図である。抗エピトープユビキチン化アッセイは、対照（Ａ）と比較して良好なシグナル対バックグラウンドを有し、メチル化ユビキチンはＧＳＴ−ＵｂｃＨ１（Ｂ）への付加においてフルオレセイン−ユビキチンと競合する。 ２３個のポジティブ対照ウェル（標準ユビキチン化反応条件）および２３個のネガティブ対照ウェル（ＡＴＰ無しの標準ユビキチン化反応）の結果から、抗エピトープユビキチン化アッセイにおけるＺ’値は０．８８であった。 ＵｂｃＨ１を有する終端分子鎖内ユビキチン化アッセイ由来の代表的なデータを示す図である。２４個のポジティブ対照ウェル（標準ユビキチン化反応条件）および２４個のネガティブ対照ウェル（ＡＴＰナシの標準ユビキチン化反応）の結果から、分子鎖内ユビキチン化アッセイにおけるＺ’値は０．９２であった。点線は±３の標準偏差を表す。 ＵｂｃＨ１を有するビオチン／ストレプトアビジンユビキチン化アッセイ由来の代表的なデータを示す図である。ビオチン／ストレプトアビジンユビキチン化アッセイは、対照（Ａ）と比較して良好なシグナル対バックグラウンドを有し、メチル化ユビキチンはポリユビキチン鎖（Ｂ）形成においてフルオレセイン−ユビキチンの能力と競合する。２１個のポジティブ対照ウェル（標準ユビキチン化反応条件）および２１個のネガティブ対照ウェル（ＡＴＰ無しの標準ユビキチン化反応）の結果から、ビオチン／ストレプトアビジンユビキチン化アッセイ（Ｃ）におけるＺ’値は０．８であった。点線は±３の標準偏差を表す。 図３７Ａは、ＴＨＰ１細胞溶解物におけるＧＦＰ−ＡＴＦ２のＬＰＳ誘発リン酸化アッセイの結果を示す図である。図３７Ｂは、ＴＨＰ１細胞溶解物において測定した、ＳＰ６００１２５によるＪＮＫ活性阻害の結果を示す図である。 図３８Ａは、ＨＥＫ２９５ ＧＦＰ−ＩκＢ−α細胞中でのＧＦＰ−Ｉκβ−αのＴＮＦ−α誘発リン酸化を示す図である。図３８Ｂは、ＧＦＰ−ＩκＢαのＴＮＦ−α誘発リン酸化の阻害を示す図である。 図３９Ａは、ＳＥＮＰ１およびＮＥＤＰ１により、基質（Ｔｏｐａｚ−ＳＵＭＯ１−Ｔｂ）を脱コンジュゲートするＳＵＭＯ１、および基質（Ｔｏｐａｚ−Ｎｅｄｄ８−Ｔｂ）を脱コンジュゲートするＮｅｄｄ８の切断を示す図である。図３９Ｂは、ＳＥＮＰ２により基質を脱コンジュゲートする、ＳＵＭＯ２（Ｔｏｐａｚ ＳＵＭＯ２−Ｔｂ）およびＳＵＭＯ３（Ｔｏｐａｚ ＳＵＭＯ３−Ｔｂ）を示す図である。 フルオレセイン−ＳＵＭＯ１／２／３およびＴｂ−抗ＧＳＴ抗体を有するＧＳＴ−ＳＰ１００の抗エピトープＴＲ−ＦＲＥＴ ＳＵＭＯ化アッセイの代表的なデータを示す図である。 図４１Ａは、ＧＦＰ−Ｕｂ−Ｔｂを、ＵＣＨ−Ｌ３（■）ＵＳＰ−２（●）ＵＳＰ−１５（▲）ＵＣＨ−Ｌ１（▼）ＵＳＰ−５（◆）およびＵＳＰ−１４（○）に対する基質（１０ｎＭにおいて）として試験した結果を示す図である。ＵＳＰ−１４は、２６Ｓプロテアソーム構成成分との結合なしに活性を示すとは考えられない。ＵＳＰ−２およびＵＳＰ−１５は区別できなかった。図４１Ｂは、強結合ＤＵＢ阻害剤であるユビキチンアルデヒドを０．１ｎＭ ＵＣＨ−Ｌ３および１０ｎＭ ＧＦＰ−Ｕｂ−Ｔｂに対して滴定し、０．２ｎＭのＩＣ５０において反応を阻害する結果を示す図である。図４１Ｃは、実施例１２に記載のように、ＹＦＰ−ユビキチン−Ｔｂ基質の滴定においてシグモイド的な用量反応（可変傾斜）がＥＣ_５０値をとることを示す図である。 図４２Ａは、ホスホジエステラーゼによりｃＡＭＰが分解してＡＭＰを生成することを示す図である。図４２Ｂは、リン酸ジエステル合成のための一般的なストラテジを示す図である。図４２Ｃは、ｃＡＭＰを表し、種々の位置に付加するリンカーと共に利用可能なアナログを示す図である。図４２Ｄは、Ｔｂ−抗ＡＭＰ抗体を用いるフルオレセイン標識ＡＭＰの検出を表す図である。図４２Ｅは、認識配列としてホスホチロシンを用いるＰＤＥ活性検出の方法を例示する図である。図４２Ｆは、基質としてビス−（フルオレセイン−チロシン）リン酸塩を用いるＰＤＥ活性検出の方法を例示する図である。

Claims (16)

1. 以下の段階を含む、化合物が翻訳後修飾のモジュレータであるか否かを判定する方法：
   ａ）化合物と少なくとも１つの融合タンパク質を発現している細胞とを接触させて被験試料を生成させる段階であって、融合タンパク質が第１の標識および翻訳後修飾のための基質を含む段階；
   ｂ）翻訳後修飾のための適切な条件下で被験試料をインキュベートする段階；
   ｃ）（ｂ）の前、間、または後に、翻訳後修飾の有無に基づいて、被験試料を少なくとも１つの融合タンパク質への弁別結合を示す結合パートナーと接触させる段階であって、結合パートナーが第２の標識を含み、第１および第２の標識が共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）ペアである段階；および
   ｄ）被験試料を少なくとも１つの波長の光に曝露する段階；ならびに
   ｅ）被験試料からの蛍光発光を測定する段階。
2. 以下の段階を含む、少なくとも１つの化合物のキナーゼ活性を測定する方法：
   ａ）少なくとも１つの化合物と少なくとも１つの融合タンパク質とを接触させて被験試料を生成させる段階であって、融合タンパク質が蛍光ポリペプチドおよびキナーゼ基質ポリペプチドを含む段階；
   ｂ）キナーゼ活性のための適切な条件下で被験試料をインキュベートする段階；
   ｃ）（ｂ）の前、間、または後に、被験試料を標識を含む結合分子と接触させる段階であって、結合分子が非リン酸化基質またはリン酸化基質のいずれかを含有する少なくとも１つの融合タンパク質に特異的に結合し、かつ蛍光ポリペプチドおよび標識がＲＥＴペアである段階；
   ｄ）被験試料を少なくとも１つの波長の光に曝露する段階；ならびに
   ｅ）被験試料からの蛍光発光を測定する段階。
3. 以下の段階を含む、少なくとも１つの化合物の脱ユビキネーション活性を測定する方法：
   ａ）化合物と少なくとも１つの融合タンパク質とを接触させて被験試料を生成させる段階であって、
   少なくとも１つの融合タンパク質が以下を含み：
   ｉ）蛍光ポリペプチド；
   ｉｉ）脱ユビキネーション酵素ポリペプチド基質；および
   ｉｉｉ）標識、
   蛍光ポリペプチドおよび標識がＲＥＴペアであり、脱ユビキネーション酵素ポリペプチド基質の切断により（ｉ）および（ｉｉｉ）の間の共鳴エネルギー移動が減少する段階；
   ｂ）被験試料を少なくとも１つの波長の光に曝露する段階；ならびに
   ｃ）被験試料からの蛍光発光を測定する段階。
4. 以下の段階を含む、少なくとも１つの化合物がキナーゼ活性を調節するか否かを判定する方法：
   ａ）少なくとも１つの化合物、少なくとも１つのキナーゼ、および少なくとも１つの融合タンパク質を接触させて被験試料を生成させる段階であって、融合タンパク質が蛍光ポリペプチドおよびキナーゼ基質ポリペプチドを含む段階；
   ｂ）キナーゼ活性に適切な条件下で被験試料をインキュベートする段階；
   ｃ）（ｂ）の前、間、または後に、被験試料を標識を含む結合分子と接触させる段階であって、結合分子が非リン酸化基質またはリン酸化基質のいずれかを含有する少なくとも１つの融合タンパク質と特異的に結合し、かつ蛍光ポリペプチドおよび標識がＲＥＴペアである段階；
   ｄ）被験試料を少なくとも１つの波長の光に曝露する段階；ならびに
   ｅ）被験試料からの蛍光発光を測定する段階。
5. 以下の段階を含む、少なくとも１つの化合物が脱ユビキネーション活性を調節するか否かを判定する方法：
   ａ）少なくとも１つの化合物、少なくとも１つの脱ユビキネーション酵素および少なくとも１つの融合タンパク質を接触させて被験試料を生成させる段階であって、
   融合タンパク質が、以下を含み：
   ｉ）蛍光ポリペプチド；
   ｉｉ）脱ユビキネーション酵素ポリペプチド基質；および
   ｉｉｉ）標識、
   蛍光ポリペプチドおよび標識がＲＥＴペアであり、脱ユビキネーション酵素ポリペプチド基質の切断により（ｉ）および（ｉｉｉ）の間の共鳴エネルギー移動が減少する段階；
   ｂ）被験試料を少なくとも１つの波長の光に曝露する段階；ならびに
   ｃ）被験試料からの蛍光発光を測定する段階。
6. ａ）パッケージ材料；
   ｂ）蛍光ポリペプチドおよびキナーゼ基質ポリペプチドを含む少なくとも１つの融合タンパク質；ならびに
   ｃ）標識を含む少なくとも１つの結合分子
   を含む、製品であって、
   蛍光ポリペプチドおよび標識がＲＥＴペアである、製品。
7. ａ）パッケージ材料；ならびに
   ｂ）ｉ）蛍光ポリペプチド；
   ｉｉ）脱ユビキネーション酵素ポリペプチド基質；および
   ｉｉｉ）標識を含む少なくとも１つの融合タンパク質
   を含む、製品であって、
   蛍光ポリペプチドおよび標識がＲＥＴペアであり、脱ユビキネーション酵素ポリペプチド基質の切断により（ｉ）および（ｉｉｉ）の間の共鳴エネルギー移動が減少する、製品。
8. ｉ）蛍光ポリペプチド；
   ｉｉ）脱ユビキネーション酵素ポリペプチド基質；および
   ｉｉｉ）標識
   を含む、融合タンパク質であって、
   蛍光ポリペプチドおよび標識がＲＥＴペアであり、脱ユビキネーション酵素ポリペプチド基質の切断により（ｉ）および（ｉｉｉ）の間の共鳴エネルギー移動が減少する融合タンパク質。
9. 以下の段階を含む、少なくとも１つの化合物のユビキチン化活性を測定する方法：
   ａ）少なくとも１つの化合物を、少なくとも１つのタンパク質および少なくとも２集団のユビキトンを接触させて被験試料を生成させる段階であって、１集団のユビキトンがＲＥＴペアのためのアクセプター部分を含み、もう１つの集団がＲＥＴペアのためのドナー部分で標識されている段階；
   ｂ）被験試料を少なくとも１つの波長の光に曝露する段階；および
   ｃ）被験試料からの蛍光発光を測定する段階。
10. 以下の段階を含む、少なくとも１つの化合物がユビキチン化活性を調節するか否かを判定する方法：
    ａ）少なくとも１つの化合物、少なくとも１つのタンパク質および少なくとも２集団のユビキトンを接触させて被験試料を生成させる段階であって、１集団のユビキトンがＲＥＴペアのためのアクセプター部分を含み、もう１つの集団がＲＥＴペアのためのドナー部分で標識されている段階；
    ｂ）被験試料を少なくとも１つの波長の光に曝露する段階；ならびに
    ｃ）被験試料からの蛍光発光を測定する段階。
11. ａ）パッケージ材料；および
    ｂ）少なくとも２集団のユビキチン
    を含む、製品であって、
    １集団のユビキチンがＲＥＴペアのためのアクセプター部分を含み、もう１つの集団がＲＥＴペアのためのドナー部分で標識されている、製品。
12. 以下の段階を含む、少なくとも１つの化合物のユビキチン化活性を測定する方法：
    ａ）ｉ）少なくとも１つの化合物を、
    ｉｉ）ユビキチン、および
    ｉｉｉ）タンパク質
    と接触させて被験試料を生成させる段階であって、タンパク質がユビキチン化基質とＲＥＴペアの第１の部分とを含む段階；
    ｂ）ユビキチン化のための適切な条件下で被験試料をインキュベートする段階；
    ｃ）（ｂ）の前、間、または後のいずれかに、被験試料をユビキチンと結合する結合分子と接触させる段階であって、結合分子がＦＲＥＴペアの第２の部分で標識されている段階；
    ｄ）被験試料を少なくとも１つの波長の光に曝露する段階；ならびに
    ｅ）被験試料からの蛍光発光を測定する段階。
13. 以下の段階を含む、少なくとも１つの化合物がユビキネーション活性のモジュレータであるか否かを判定する方法：
    ａ）ｉ）少なくとも１つの化合物を、
    ｉｉ）ユビキチン、
    ｉｉｉ）タンパク質、および
    ｉｖ）ユビキチン化酵素
    と接触させて被験試料を生成させる段階であって、タンパク質がユビキチン化基質とＲＥＴペアの第１の部分とを含む段階；
    ｂ）ユビキチン化のための適切な条件下で被験試料をインキュベートする段階；
    ｃ）（ｂ）の前、間、または後のいずれかに、被験試料をユビキチンと結合する結合分子と接触させる段階であって、結合分子がＦＲＥＴペアの第２の部分で標識されている段階；
    ｄ）被験試料を少なくとも１つの波長の光に曝露する段階；
    ｅ）被験試料からの蛍光発光を測定する段階、ならびに
    ｆ）蛍光発光を対照試料と比較する段階。
14. 以下の段階を含む、少なくとも１つのユビキチン化酵素またはユビキチン化様の酵素のための少なくとも１つの基質を検出する方法：
    ａ）ｉ）少なくとも１つのユビキチン化酵素またはユビキチン化様の酵素を、
    ｉｉ）基体上に固定されたポリペプチド、および
    ｉｉｉ）検出可能部分を含む、少なくとも１つのユビキチンまたはユビキチン様のタンパク質
    と接触させる段階；
    ｂ）ユビキチン活性またはユビキチン化様の活性を可能にする条件下で（ａ）をインキュベートする段階；
    ｃ）基体上の任意のポリペプチドに結合する検出可能部分を検出する段階。
15. 以下の段階を含む、試料の脱ユビキチン化活性を同定する方法：
    ａ）ｉ）試料を、ｉｉ）基体上に固定された少なくとも１つまたは複数のポリペプチドと接触させる段階であって、少なくとも１つまたは複数のポリペプチドが検出可能部分に結合したユビキチンまたはユビキチン様のタンパク質を含み、脱ユビキチン化活性が基体からの検出可能部分の解離を生じさせる、段階；
    ｂ）脱ユビキチン化活性に適切な条件下で（ａ）をインキュベートする段階；
    ｃ）基体上の任意のポリペプチドに結合する検出可能部分を検出する段階。
16. 以下の段階を含む、ホスホジエステラーゼ活性を検出する方法：
    ａ）ｉ）試料を、
    ｉｉ）ホスホジエステラーゼの基質
    と接触させて被験試料を生成させる段階であって、基質がＲＥＴペアの第１のメンバーを含む段階；
    ｂ）ホスホジエステラーゼ活性に適切な条件下で（ａ）をインキュベートする段階；
    ｃ）（ｂ）の前、間、または後のいずれかに、被験試料を、ホスホジエステラーゼの切断生成物の特異性を有する結合分子と接触させる段階であって、結合分子がＲＥＴペアの第２のメンバーを含み、切断生成物がＲＥＴペアの第１のメンバーを含む段階；
    ｄ）被験試料を少なくとも１つの波長の光に曝露する段階；ならびに
    ｅ）被験試料からの蛍光発光を測定する段階。

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