DE10029210A1

DE10029210A1 - Testsystem sowie dessen Verwendung

Info

Publication number: DE10029210A1
Application number: DE10029210A
Authority: DE
Inventors: Peter Drueckes; Thomas Jarchau; Ulrich Walter
Original assignee: Vasopharm Biotech GmbH
Current assignee: Verinos Operations GmbH
Priority date: 2000-06-14
Filing date: 2000-06-14
Publication date: 2002-01-31
Also published as: AU2001263956A1; US20030166005A1; WO2001096594A3; WO2001096594A2; EP1294926A2

Abstract

Beschrieben wird ein Testsystem zum Nachweis der Aktivität von cyclo-Nucleotid-abhängigen Proteinkinasen (cNPK), enthaltend DOLLAR A (a) mindestens eine Testverbindung, DOLLAR A (b) mindestens ein geeignetes CnPK-Substrat, DOLLAR A (c) mindestens eine zu inkubierende Zusammensetzung, enthaltend cNPK und ATP, DOLLAR A (g) ggf. Phosphorylierungsreaktionsstopper und DOLLAR A (e) ein geeignetes Detektionssystem zur Quantifizierung der Phosphorylierung des cNPK-Substrats. DOLLAR A Ferner wird ein Testsystem zum Nachweis der Aktivität von VASP-Phosphatasen beschrieben, enthaltend DOLLAR A (f) mindestens eine Testverbindung, DOLLAR A (g) mindestens ein geeignetes VASP-Phosphatase-Substrat, DOLLAR A (h) mindestens eine zu inkubierende Zusammensetzung, enthaltend VASP-Phosphatase und DOLLAR A (i) ein geeignetes Detektionssystem zur Qualifizierung der Dephosphorylierung des VAPS-Phosphatase-Substrats. DOLLAR A Die beschriebenen Testsysteme lassen sich zum High-Throughput-Screening von Verbindungen aus chemischen oder natürlichen Substanzbibliotheken einsetzen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Testsystem zum Nachweis der Aktivität von cyclo- Nucleotid-abhängigen Proteinkinasen oder von VAPS-Phosphatasen, Verfahren zu dessen Herstellung sowie dessen Verwendung in Screening Verfahren.

Cyclo-Nucleotid-abhängige Proteinkinasen ("cNPK"), deren Substrate ("cNPKS"), sowie die entsprechenden Proteinphosphatasen, sind Teil wichtiger physiologisch, pathophysiologisch und pharmakologisch relevanter zellulärer Signalwege (vergl. Zitate 1, 2 und 3). Zu den cNPK zählen cAMP-abhängige Proteinkinasen (cAK) und cGMP-abhängige Proteinkinasen (cGK). Neben anderen cGMP-Effektorsystemen, wie z. B. cGMP-regulierten Phosphodiesterasen und Ionenkanälen, ist insbesondere die cGK ein wichtiger Mediator der cGMP-vermittelten Signal übertragung.

Bei den Signalen, die zu einer Erhöhung des intrazellulären cGMP-Spiegels führen, unter scheidet man solche, die dies durch membranständige Guanylylzyklasen (GC-A, GC-B, GC-C) bewirken, wie z. B. durch natriuretische Peptide (kurz: ANP, BNP, CNP) und Enteroto xin/Guanylin, und jene, die die lösliche Guanylylcyclase (GC-S) aktivieren. Zu den wichtigsten Agonisten der löslichen Guanylylcyclase zählt das von den NO-Synthasen (NOS I-III) gebil dete Stickstoffmonoxid (NO). Zu den etablierten Effekten, die durch eine cGMP-Erhöhung bewirkt werden, gehören u. a. die Relaxation glatter Muskelzellen (SMCs) sowie Hemmung der Blutplättchenaktivierung. Diese cGMP-Effekte werden durch die cGK (Typ I) vermittelt (vergl. Zitate 1-3). Dies konnte in entsprechenden Mausmodelle mit cGK-I-Defizienz bestätigt werden (vergl. Zitate 4 und 5).

cGMP-abhängige Proteinkinasen (cGK) sind als Homodimere bekannt, von denen eine lösliche (Monomer 76 kDa; cGK I) und eine membranständige Form (Monomer 86 kDa; cGK II) unterschieden werden können. Die Membranverankerung der cGK II wird über die N-terminale Myristoylierung vermittelt (vergl. Zitate 1-3). Von der cGK I existieren 2 Isoformen cGK Iα und cGK Iß. Interessanterweise ist die cGK I, die allgemein als lösliche Form bezeichnet wird, in Blutplättchen überwiegend und in glatten Muskelzellen teilweise partikulär vorhanden. Eine besonders hohe Expression der cGK I findet man in humanen Blutplättchen und in den glatten Muskellzellen. Eine Aktivierung der cGK-I in diesen Zellen führt zu den bereits weiter oben beschriebenen Effekten, wie Senkung des intrazellulären Ca(2+)-Spiegels, Hemmung der Blutplättchen sowie der Kontraktion glatter Muskelzellen.

Zu den bekannten Substraten von cGK zählen neben anderen z. B. der Inositol 1,4,5- triphosphat Rezeptor (IP3R) und das Vasodilator-Stimulated Phosphoprotein (kurz: VASP), sowie p25, Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator (CFTR) und 6-Pyruvoyltetrahydro pterinsynthase (PTPS).

Störungen des ANF/NO/cGMP-Signalweges sind für die verschiedenen Formen der Athe rosklerose und Hypertonie bekannt, und die sogenannte "Endotheliale Dysfunktion" eine ge störte Endothel-vermittelte Vasodilatation, ist ein frühes Merkmal von Gefäßkrankheiten asso ziiert mit Atherosklerose, Hypertonie und Diabetes (vergl. Zitate 6 und 7). Aktuelle Hinweise belegen, daß in diesen Gefäßkrankheiten insbesondere die Aktivierung und/oder Expression der löslichen Guanylylcyclase pathologisch vermindert ist (vergl. Zitate 8-10). Daraus folgt zwingend, daß Verbindungen/Substanzen, die den NO/cGMP-Signalweg ersetzen können, von größter therapeutischer Bedeutung sind. Dies wird belegt durch den Erfolg der NO-Donoren wie Nitroprussid, Nitroglycerin, Molsidomine und seit neuestem durch NO-unabhängige sGC- Aktivatoren wie YC-1 und Derivate. Trotz dieser erprobten Mittel besteht ein großer Bedarf an zusätzlichen, neuen Substanzen, da es ungelöste Probleme gibt (Toleranzentwicklung, toxi sche Nebeneffekte etc). Wünschenswert wäre daher die direkte Aktivierung der cGK, und zwar vorzugsweise cGK-I, da diese nach wie vor in pathologisch veränderten Gefäßabschnit ten exprimiert wird (vergl. Zitat 10-11). Die Tatsache, daß nicht alle durch NO, bzw. cGMP bewirkten Effekte durch cGK vermittelt werden, birgt das Potential, daß sich spezifisch nur einige der ansonsten breiten Effekte dieses Signalweges beeinflussen lassen und damit einige unerwünschte Nebeneffekte wohl ausbleiben. Bisher sind nur zell-membranpermeable cGMP- Analoga (z. B. 8-Br-cGMP, 8-pCPT-cGMP) als Aktivatoren der cGK beschrieben worden, während gewisse cGMP-Analoga (Rp-8Br-PET-cGMPS, Rp-8-pCPT-cGMPS und Isoquino linesulfonamidderivate (KT 5823, H8 and H89) die cGK hemmen (vergl. Zitat 12).

Ein High-Throughput-Screening Ansatz zur systematischen Suche nach unmittelbaren cGK- Aktivatoren und/oder Inhibitoren bzw. nach unmittelbaren Aktivatoren und/oder Inhibitoren der VASP-Phosphatase ist bisher noch nicht durchgeführt worden. Peptiderge cNMP-Kinase- Substrate und Inhibitoren werden aufwendig über kombinatorische Peptidbibliotheken gesucht (vergl. Zitat 13).

Im Stand der Technik werden in Kinaseassays üblicherweise die Übertragung von radioaktiv markiertem Phosphat unter Verwendung von 32P- oder 33P-Isotopen gemessen. Nachteilig können dabei die Be- und Entsorgung von radioaktiven Isotopen in den hierfür notwendigen Mengen, welche eine kostenintensive und sicherheitstechnische Bedeutung darstellt, sein und zum anderen benötigt die Messung radioaktiver Proben mit der erforderlichen Genauigkeit relativ viel Zeit.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, ein Testsystem (synonym: Assay) zu fin den, mit dem auf einfache und effektive Art und Weise eine große Anzahl von (Test)- Verbindungen aus chemischen oder natürlichen Substanzbibliotheken auf ihre Wirkung der Aktivität einer cNPK-abhängigen bzw. regulierten Kinase untersucht werden können [sog. High Throughput Screening (kurz: HTS)].

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein Testsystem zu finden, mit dem auf einfache und effektive Art und Weise eine große Anzahl von (Test)-Verbindungen aus chemischen oder natürlichen Substanzbibliotheken auf ihre Wirkung der Aktivität einer Pro teinphosphatase untersucht werden können [sog. High Throughput Screening (kurz: HTS)].

Es wurde nun gefunden, daß ein Testsystem, vorzugsweise ein nicht radioaktives Testsystem, zum Nachweis der Aktivität einer cNPK-Kinase bzw. zum Nachweis der Aktivität einer Pro teinphosphatase geeignet ist, die oben beschriebenen Nachteile im Stand der Technik zu über winden und somit für das HTS beispielsweise in einer automatisierten Anlage geeignet ist.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Testsystem zum Nachweis der Akti vität einer cNPK (nachstehend erfindungsgemäßes Testsystem) enthaltend

a) mindestens eine Testverbindung
b) mindestens ein geeignetes cNPK-Substrat (cNPKS)
c) mindestens eine zu inkubierende Zusammensetzung enthaltend cNPK und ATP,
d) ggf Phosphorylierungsreaktionsstopper, und
e) ein geeignetes Detektionssystem zur Quantifizierung der Phosphorylierung des cNPK- Substrats, insbesondere einen geeigneten Antikörper für das phosphorylierte Produkt aus (b) mittels (c), welcher sich für die immunologische Detektion einsetzen läßt.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Testsystem zum Nachweis der Aktivität der VASP-Phosphatase enthaltend

a) mindestens eine Testverbindung,
b) mindestens ein geeignetes VASP-Phosphatase-Substrat,
c) mindestens eine zu inkubierende Zusammensetzung enthaltend VASP-Phosphatase, und
d) ein geeignetes Detektionssystem zur Quantifizierung der Dephosphorylierung des VAPS- Phosphatase-Substrats.

Die erfindungsgemäßen Testsysteme ermöglichen eine hohe Zahl an Einzelbestimmungen und erfüllt besondere Anforderungen hinsichtlich Geschwindigkeit, Probengröße und Materialver brauch. Zudem werden Reproduzierbarkeit, Robustheit, Lösungsmitteltoleranz und Automati sierung gewährleistet.

Die erfindungsgemäßen Testsystemen gestatten die Suche nach einer oder mehreren, gleichen oder verschiedenen Testverbindungen.

Die eingesetzte cNPK ist vorzugsweise eine cGK oder cAK oder eine funktionelle Variante mit der Aktivität einer cNPK. Solche Kinasen können als gereinigte Form oder im Rohextrakt eingesetzt werden, insbesondere als Bestandteil in Homogenaten-Proteinmischungen biologi schen Ursprungs, vorzugsweise humanen Ursprungs.

Die eingesetzte VASP-Phosphatase kann auch eine funktionelle Variante mit der Aktivität einer VASP-Phosphatase sein. VASP-Phosphatasen können als gereinigte Form oder im Ro hextrakt eingesetzt werden, insbesondere als Bestandteil in Homogenaten-Proteinmischungen biologischen Ursprungs, vorzugsweise humanen Ursprungs.

Ganz besonders bevorzugt als geeignetes cNPK-Substrat gemäß Merkmal (b) ist VASP - ge mäß SEQ ID No. 1 - enthaltend hochaktive Phosphorylierungsstellen und zwar für: Serin-157, Serin-239 und Threonin-278. Grundsätzlich können cNMP-Kinasen alle 3 Reste phosphorylie ren, jedoch bevorzugt cAMP-Kinase Serin 157 als Hauptphosphorylierungstelle, während cGMP-Kinase Serin-239 bevorzugt. Threonin-278 wird von beiden Kinasen mit vergleichbarer Spezifität phosphoryliert.

Ganz besonders bevorzugt als geeignetes VASP-Phosphatase-Substrat gemäß Merkmal (g) ist phosphoryliertes VASP - gemäß SEQ ID No. 1 - phosphoryliert an den hochaktiven Phospho rylierungsstellen und zwar an: Serin-157, Serin-239 und Threonin-278.

Die Sequenz von VASP ist bekannt und von C. Haffner et al. in EMBO J., 14(1), 19-27 (1995) beschrieben.

Daher betrifft die Erfindung ebenfalls den Einsatz solcher Peptid-Varianten oder Peptoide ei nes cNPK-Substrates oder eines VASP-Phosphatase-Substrats, die vorzugsweise Aminosäure sequenzen enthalten, die in der Umgebung der genannten Phosphorylierungsstellen oder De phosphorylierungsstellen vorhanden sind und zwar nicht abschließend besonders bevorzugt die Pentamere mit den Aminosäuren 155-159 und/der 237-241 und/oder 276-280 gemäß SEQ ID No. 1 oder bevorzugt die Decamere mit den Aminosäuren 152-162 und/oder 234 -244 und/oder 273-283 gemäß SEQ ID No. 1.

Solche erfindungsgemäß phosphorylierten Peptide können besonders vorteilhaft mit geeigne ten Antikörpern im Sinne der Merkmale (e) oder (i), vorzugsweise monoklonalen Antikörpern, markiert werden.

Ganz besonders bevorzugt wird erfindungsgemäß der monoklonale Antikörper 16C2, welcher als DSM ACC2330 öffentlich zugänglich und erhältlich ist, eingesetzt. Dieser Antikörper oder eine funktionelle Variante davon weist spezifisch ein Phosphorylierungsereignis nach, ganz besonders bevorzugt erkennt das Epitop das phosphorylierte Serin-239 der VASP-Sequenz. Eine funktionelle Variante betrifft insbesondere solche Antikörper mit einer Übereinstimmung von vorzugsweise 90-99% oder 70-90% in der Aminosäuresequenz von 16C2 mit der homologen Funktion ein Reaktionsprodukt im Sinne des Merkmals (e) zu repräsentieren.

Das erfindungsgemäße Testsystem kann sowohl heterogen als auch homogen gefahren wer den. Entsprechend der Durchführungsweise kann die immunologische Detektion im Sinne der Merkmale (e) oder (i) nach den dem Fachmann bekannten Methoden erfolgen, wie z. B. ge koppelter Enzymreaktion (alkalische Phosphatase oder Luziferase) oder allgemeinen Sand wichtechnologien (beispielsweise ELISA), sowie fluorimetrischen Methoden (Fluoreszenz, zeitaufgelöste Fluoreszenz, Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET)).

Besonders bevorzugt sind leicht detektierbare radioaktiv-gelabelte oder nicht-radioaktiv- gelabelte, insbesondere fluoresenzmarkierte, Antikörper. Besonders geeignet sind Lanthanid- Chelate. Besonders vorteilhaft kann zudem auf die zeitaufgelöste Fluoresenz-Resonanz- Energie-Transfer-Technik zugegriffen werden. Solche TR-FRET Systeme sind in WO 97/29373 und WO 98/15830 beschrieben und kommerziell über Wallac Oy (Turku, FI) erhält lich. Vgl ebenfalls "Miniaturization of a Lance^TM-assay" und "Use of Generic Reagent in Lance^TM" veröffentlicht bei Wallac Oy, Turku, FI.

Bevorzugt kann jedoch das erfindungsgemäße Testsystem als homogenes HTS automatisiert werden und ist daher für 1536-well Platten und mehr geeignet.

Als hierzu beste Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Testsystem in Fig. 1 abgebildet, die einzelnen Komponenten sind bereits oben näher beschrieben.

Zur Durchführung der Untersuchungen ist es bevorzugt, weitere Hilfsmittel, wie z. B. Puffer lösungen, Stabilisatoren und/oder Energieäquivalente, insbesondere ATP, einzusetzen.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Herstellung eines Testsy stems, bei dem mindestens eine zu untersuchende Verbindung und mindestens eine Zusammen setzung enthaltend cNPK und ATP, ggf cNP, ggf ein Phosphorylierungsreaktionsstopper, minde stens ein geeignetes Detektionssystem, wie ein Antikörper samt immunologischem Detektionsmittel und ggf weitere Hilfsmittel zusammengestellt werden.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Herstellung eines Testsy stems, bei dem mindestens eine zu untersuchende Verbindung, mindestens eine Zusammenset zung enthaltend VASP-Phosphatase und mindestens ein geeignetes Detektionssystem zur Quanti fizierung der Dephosphorylierung eines VAPS-Phosphatase-Substrats zusammengestellt werden.

Bevorzugte Ausführungsformen der einzelnen Komponenten sind bereits oben näher beschrie ben worden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Auffinden einer oder mehrerer wirksamer Verbindungen aus einer Zusammensetzung enthaltend eine Vielzahl von Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, daß

a) die Zusammensetzung in Gegenwart mindestens einer Zusammensetzung enthaltend cNPK und ATP samt geeignetem cNPKS inkubiert wird, und ggf. nach Abbruch der Phosphorylierungsreaktion, mit mindestens einem geeigneten Detektionssystem zur Quantifizierung der Phosphorylierung des cNPK-Substrats versetzt wird; und
b) die Aktivität der cNPK bestimmt wird.

a) die Zusammensetzung in Gegenwart mindestens einer Zusammensetzung enthaltend VASP-Phosphatase samt geeignetem VASP-Phosphatase-Substrat inkubiert wird, und mit mindestens einem geeigneten Detektionssystem zur Quantifizierung der Dephosphory lierung des VASP-Phosphatase-Substrats versetzt wird; und
b) die Aktivität der VASP-Phosphatase bestimmt wird.

Bevorzugte einzelne Komponenten des erfindungsgemäßen Verfahrens sind oben bereits näher beschrieben.

Die wirksame (Test-)Verbindung kann hierbei eine pharmazeutisch wirksame Verbindung und zwar in der Funktion eines Modulators - wie (Hyper)Aktivator/oder (Total)Inhibitor - für die Aktivität einer cNPK sein oder ein Naturstoff im weitesten Sinne sein, insbesondere ein Roh- Extrakt, oder eine darin enthaltene Komponente. Die zu untersuchende Substanz ist im allge meinen eine natürlich vorkommende, eine natürlich vorkommende und chemisch modifizierte und/oder eine synthetische Substanz. Insbesondere können mit den erfindungsgemäßen Ver fahren besonders einfach und schnell sogenannte kombinatorische Substanzbibliotheken durch sucht werden.

Ganz besonders bevorzugt ist eine solche Verbindung geeignet, die unter Umgehung des NO/cGMP Signalweges eine cNPK direkt moduliert - aktiviert oder inhibiert; ggf. selektiv moduliert - aktiviert oder inhibiert.

Daher betrifft die Erfindung ebenfalls ein Verfahren, wobei die pharmazeutisch wirksame Ver bindung einen cNPK-Signalweg moduliert.

In der Beschreibungseinleitung wurde bereits darauf hingewiesen, daß verschiedene Erkran kungen auf eine Störung der cNPK-regulierten (abhängigen) Kinasen zurückzuführen sind. Daher eignet sich die vorliegende Erfindung ebenfalls zur Diagnose einer Erkrankung.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Diagnose durch Bestimmung der cNPK-Aktivität aus Proben, umfassend die Schritte:

a) Inkubieren einer Probe in Gegenwart mindestens einer Zusammensetzung enthaltend geeignetes cNPKS und ggf. ATP,
b) ggf Abbruch der Phosphorylierungsreaktion,
c) Versetzen der Zusammensetzung mit mindestens einem geeigneten Detektionssystem zur Quantifizierung der Phosphorylierung des cNPKS; und
d) Bestimmung der Aktivität der cNPK, insbesondere in Blut-/Zell- oder Gewerbsextrakten oder in Form von permeabilisierten und/oder intakten Zellen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Diagnose durch Bestimmung der VASP-Phosphatase-Aktivität aus Proben, umfassend die Schritte:

a) Inkubieren einer Probe in Gegenwart mindestens einer Zusammensetzung enthaltend ge eignetes VASP-Phosphatase-Substrat
b) Versetzen der Zusammensetzung mit mindestens einem geeigneten Detektionssystem zur Quantifizierung der Dephosphorylierung des VASP-Phosphatase-Substrats; und
c) Bestimmung der Aktivität der VASP-Phosphatase, insbesondere in Blut-/Zell- oder Ge werbsextrakten oder in Form von permeabilisierten und/oder intakten Zellen.

Die zu diagnostizierenden Erkrankungen sind hierbei vorzugsweise Herz-Kreislaufer krankungen und Krankheiten mit assoziierten Gefäßschäden, z. B. Hypertonie, Thrombose und das Syndrom der "endothelialen Dysfunktion" z. B. bei Arteriosklerose, Diabetes oder Vasku litiden.

Die folgenden Figuren und Beispiele sollen die Erfindung näher beschreiben, ohne sie zu be schränken.

Beschreibung der Figur

Fig. 1 zeigt die beste Ausführungsform des erfindungsgemäßen Testsystems.

Beispiele Beispiel 1 FRET-Detektionssystem

A) Soweit nicht anders angegeben, wurden alle Bestimmungen in 96-well Platten durchge führt. Die Kinasereaktion wurde in einem Volumen von 50 µl pro Well ausgeführt. Alle Kon zentrationen, die sich auf die Kinasereaktion beziehen, beziehen sich auf dieses Volumen. Die Kinasereaktion wurde nach Inkubation mit 10 µl einer 50 mM EDTA-Lösung gestoppt. An schließend wurde die Menge an Phosphopeptid durch Zugabe von 200 µl Detektionsmixes bestimmt. Alle Mengen- und Konzentrationsangaben für das Detektionsmix beziehen sich auf diese 200 µl, nicht auf das Gesamtvolumen. Das Detektionsmix enthielt den phospho spezifischen Antikörper und die Fluoreszenzreagenzien.
B) Alternativ wurden die Reagenzien des Detektionsmiexes auch gleich zu Beginn dem Reak tionsansatz zugegeben. In diesem Fall konnte auf eine Termination der Reaktion durch Zugabe von EDTA verzichtet werden. Die Konzentrationen der Detektionsreagenzien blieben die glei chen, wurden hierbei jedoch auf das Volumen der Reaktion (50 µl) bezogen.

Beispiel 2 Titrationen des Meßbereiches mit Phospho-Peptid

Um zunächst die Detektion zu optimieren, wurde anstatt einer Kinasereaktion ein Phospho- Peptid (phosphorylierte Version des Substrat-Peptids) als "Reaktionsprodukt" eingesetzt und mit Detektionsmix quantifiziert. Um den linearen Meßbereich des Assay zu ermitteln, wurden unterschiedliche Mischungen aus nicht-phosphoryliertem Peptid und Phospho-Peptid herge stellt. Dabei wurde die Gesamtkonzentration an Peptid konstant bei 500 nM gehalten. Dies zeigte, daß der Assay bis ca. 100 nM Phospho-Peptid linear ist.

Beispiel 3 Optimierung der Detektionsreagenzien

Mit 100 nM Phospho-Peptid als "Substratkonzentration" wurden alle an der Detektion betei ligten Reagenzien auf das beste Signal-Rausch-Verhältnis (SIN) optimiert. Als S/N diente der Quotient aus dem FRET-Signal mit Phospho-Peptid vs. ohne Phospho-Peptid. Dabei ergaben sich folgende Werte als Optimum für das Detektionsmix und wurden fortan als Standardkon zentrationen des Detektionsmixes verwendet:

- anti-pSer239-VASP (mAb 16C2): 1-2 nM
- anti-Maus-Eu(W 1024): 1 nM

(Änderung der Konzentration des Eu-markierten Antikörpers hatten keinen Einfluß auf das S/N, da bei höheren Konzentrationen nicht nur das Signal, sondern auch der Hintergrund entsprechend anstiegen. Zu Gunsten eines robusten Signals wurde für eine Konzentration von 1 nM entschieden.)

- Streptavidin-APC: 1-2 µg/ml

Beispiel 4 cGK-Kinase Reaktion

In 50 µl des angegebenen Kinasepuffers wurden als Substrate 50 µM ATP und 1,5 bis 2,5 µM biotinyliertes Substratpeptid eingesetzt. Die Kinase wurde in einer Konzentration von 5 µg/ml eingesetzt und der Reaktionsansatz zwischen 5 Minuten und 4 Stunden bei 30°C inkubiert.

Assay Protokoll Kinasereaktion in 50 µl

20 mM Tris/HCl, pH 7.4
10 mM MgCl2
5 mM β-Mercaptoethanol
0.01% BSA
5 µM cGMP
50 µM ATP
2 µM biotinyliertes Peptid
5 µg/ml cGK I

Inkubation für wenige Minuten bis zu 4 Stunden bei 30°C

Stoppen

+10 µl 50 mM EDTA, pH 7.0

Detektion

+200 µl Detektionsmix mit
1 nM α-pSer239-VASP mAb (16C2)
1 nM α-Maus-Eu(W1024)
2 µg/ml Streptavidin-APC
0.1% BSA in PBS

Im Text und Figuren verwendete Abkürzungen

cNPK = Cyclo-Nucleotid-abhängige Proteinkinasen
cNP = Substrat für Cyclo-Nuceotid-abhängige Proteinkinasen
cAK = cAMP-abhängige Proteinkinasen
cGK = cGMP-abhängige Proteinkinasen
cGMP = cyclo-Guanylylmonophosphat
BSA = Bovine-Serum-Albumin
HTS = High-throughput-screening
LANCE = Lanthanide Chelate Excitation Technology
TR-FRET = Time-Resolved-Fluorescence-Resonance-Energy-Transfer
VASP = Vasodilator-stimulated Phosphoprotein

Im Text zitierte Literatur

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Testsystem zum Nachweis der Aktivität der cyclo-Nucleotid-abhängigen Proteinkinase (cNPK) enthaltend

a) mindestens eine Testverbindung,
b) mindestens ein geeignetes cNPK-Substrat (cNPKS),
c) mindestens eine zu inkubierende Zusammensetzung enthaltend cNPK und ATP,
d) ggf Phosphorylierungsreaktionsstopper, und
e) ein geeignetes Detektionssystem zur Quantifizierung der Phosphorylierung des cNPK- Substrats.

2. Testsystem zum Nachweis der Aktivität der VASP-Phosphatase enthaltend

a) mindestens eine Testverbindung,
b) mindestens ein geeignetes VASP-Phosphatase-Substrat,
c) mindestens eine zu inkubierende Zusammensetzung enthaltend VASP-Phosphatase, und
d) ein geeignetes Detektionssystem zur Quantifizierung der Dephosphorylierung des VAPS-Phosphatase-Substrats.

3. Testsystem nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das cNPK- Substrat gemäß Merkmal (b) oder das VASP-Phosphatase-Substrat gemäß Merkmal (g) ausgewählt ist aus einem cNPK-Substrat oder einem VASP-Phosphatase-Substrat, das durch den monoklonalen Antikörper 16C2 erkannt wird.

4. Testsystem nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das cNPK- Substrat gemäß Merkmal (b) oder das VASP-Phosphatase-Substrat gemäß Merkmal (g) ausgewählt ist aus einem Peptid oder Peptoid enthaltend die Pentamere mit den Aminosäu ren 155-159 und/oder 237-241 und/oder 276-280 gemäß SEQ ID No. 1 oder die Decamere mit den Aminosäuren 152-162 und/oder 234-244 und/oder 273-283 gemäß SEQ ID No. 1.

5. Testsystem nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das cNPK-Substrat gemäß Merkmal (b) oder das VASP-Phosphatase-Substrat gemäß Merkmal (g) ausge wählt ist aus SEQ ID No. 1.

6. Testsystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die cNPK, vorzugsweise eine cAMP- und/oder cGMP-Kinase, oder ein funktionelle Variante davon ist.

7. Testsystem nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die cNMP-Kinasen in gerei nigter Form, in Form von Blut-/Zell- oder Gewebsextrakten oder in Form von permeabili sierten und/oder intakten Zellen vorliegen.

8. Testsystem nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Detektionssystem zur Quantifizierung der Phosphorylierung des cNPK-Substrats oder der Dephosphorylierung des VASP-Phosphatase-Substrats ein geeigneter Antikörper für das phosphorylierte Produkt oder für das dephosphorylierte Produkt ist.

9. Testsystem nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper zur Quantifi zierung der Phosphorylierung des cNPK-Substrats ausgewählt ist aus DSM ACC2330 oder einer funktionellen Variante davon.

10. Testsystem nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein gelabelter Antikörpers ist.

11. Testsystem nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper einen Fluoro phor enthält und dem zeitaufgelösten Fluoresenz-Resonanz-Energie Transfer zugänglich ist.

12. Testsystem nach einem der Ansprüche 1-11, dadurch gekennzeichnet, daß als weitere Hilfsmittel Pufferlösungen, Stabilisatoren und/oder Energieäquivalente eingesetzt wer den.

13. Verfahren zur Herstellung eines Testsystems gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine zu untersuchende Verbindung und mindestens eine Zusammenset zung enthaltend cNPK und ATP, und mindestens ein geeignetes Detektionssystem zusam mengestellt werden.

14. Verfahren zur Herstellung eines Testsystems gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine zu untersuchende Verbindung, mindestens eine Zusammensetzung enthaltend VASP-Phosphatase und mindestens ein geeignetes Detektionssystem zur Quan tifizierung der Dephosphorylierung eines VAPS-Phosphatase-Substrats zusammengestellt werden.

15. Verfahren zum Auffinden einer wirksamen Verbindung aus einer Zusammensetzung ent haltend eine Vielzahl von Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, daß

16. Verfahren zum Auffinden einer wirksamen Verbindung aus einer Zusammensetzung enthaltend eine Vielzahl von Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, daß

a) die Zusammensetzung in Gegenwart mindestens einer Zusammensetzung enthaltend VASP-Phosphatase samt geeignetem VASP-Phosphatase-Substrat inkubiert wird, und mit mindestens einem geeigneten Detektionssystem zur Quantifizierung der Dephos phorylierung des VASP-Phosphatase-Substrats versetzt wird; und
b) die Aktivität der VASP-Phosphatase bestimmt wird.

17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß die wirksame Verbindung eine pharmazeutisch wirksame Verbindung, ein Naturstoff ist.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die pharmazeutisch wirksame Verbindung einen cNPK-Signalweg moduliert.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 15-18, dadurch gekennzeichnet, daß die zu untersuchende Verbindung ausgewählt ist aus einer natürlich vorkommenden, natürlich vorkommenden und chemisch modifizierten und/oder synthetischen Verbindung.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die zu untersuchende Verbindung in Form einer kombinatorischen Substanzbibliothek eingesetzt wird.

21. Verfahren zur Diagnose durch Bestimmung der cNPK-Aktivität aus Proben, umfassend die Schritte:

a) Inkubieren einer Probe in Gegenwart mindestens einer Zusammensetzung enthaltend geeignetes cNPKS und ggf. ATP,
b) ggf. Abbruch der Phosphorylierungsreaktion,
c) Versetzen der Zusammensetzung mit mindestens einem geeigneten Detektionssystem zur Quantifizierung der Phosphorylierung des cNPKS; und
d) Bestimmung der Aktivität der cNPK, insbesondere in Blut-/Zell- oder Gewerbsex trakten oder in Form von permeabilisierten und/oder intakten Zellen.

22. Verfahren zur Diagnose durch Bestimmung der VASP-Phosphatase-Aktivität aus Proben, umfassend die Schritte:

a) Inkubieren einer Probe in Gegenwart mindestens einer Zusammensetzung enthaltend geeignetes VASP-Phosphatase-Substrat
b) Versetzen der Zusammensetzung mit mindestens einem geeigneten Detektionssystem zur Quantifizierung der Dephosphorylierung des VASP-Phosphatase-Substrats; und
c) Bestimmung der Aktivität der VASP-Phosphatase, insbesondere in Blut-/Zell- oder Gewerbsextrakten oder in Form von permeabilisierten und/oder intakten Zellen.

23. Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um die Diagnose einer Erkrankung handelt, die eine Herz-Kreislauferkrankung, vorzugsweise eine Gefäßkrankheit, insbesondere eine "Endotheliale Dysfunktion" ist.

24. Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um die Diagnose einer Erkrankung handelt, die ausgewählt ist aus dem Spektrum der Herz- Kreislauferkrankungen und Krankheiten mit assozierten Gefäßschäden, inbesondere Hypertonie, Thrombose, und dem Syndrom der "endiothelialen Dysfunktion" bei Arteriosklerose, Diabetes und Vaskulitiden.