DE69839130T2

DE69839130T2 - Verwendung einer festphase für einen enzymassay

Info

Publication number: DE69839130T2
Application number: DE69839130T
Authority: DE
Inventors: Patricia Windham KASILA; Thomas R. Newton MULLINAX; Michael E. Burlington BEMBENEK; Mark N. Lexington BOBROW
Original assignee: PerkinElmer LAS Inc
Current assignee: PerkinElmer Health Sciences Inc
Priority date: 1997-12-19
Filing date: 1998-12-17
Publication date: 2009-02-05
Anticipated expiration: 2018-12-18
Also published as: EP1042500B1; AU758620B2; EP1042500A4; JP4287049B2; EP1042500A1; US5972595A; JP2001526903A; ATE386137T1; WO1999032655A8; AU2000699A; DE69839130D1; WO1999032655A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung bezieht sich auf eine hydrophobe Schicht, wie etwa auf eine auf einem festen Träger gebildete Lipidschicht, wobei die Lipidschicht infolge von hydrophoben Wechselwirkungen ein amphipathisches Enzymsubstrat mit einbindet, welches auf seinem hydrophilen Bereich mit einem sog. Reporter etikettiert ist, auch bezieht sich diese Erfindung auf den Gebrauch eben dieser hydrophoben Schicht, um verschiedene Enzymtests bzw. -versuche ohne irgendwelche Schritte einer Extraktion durchzuführen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Weil viele intrazellulare sowie interzellulare Verfahren unter Zuhilfenahme von Membranen ermöglicht werden, bezieht sich ein großer Teil der Forschung auf die Rekonstitution von biologischen Membranen als eine Methode zum Studieren dieser Verfahren. Seit der ursprünglichen Entwicklung eines Verfahrens zum Herstellen künstlicher, ebener doppelschichtiger Phospholipidmembranen (Mueller et al., 1962) und seit dem Nachweis der Verschmelzung von Innenkanälen enthaltenden Vesikeln zu ebenen Membranen (Miller und Racker, 1976), sind bei den Studien eine Vielfalt von künstlichen Membransystemen und von unterschiedlichen Verfahren eingesetzt worden zum Untersuchen von funktionalen Molekülen, die in biologische Membranen mit eingegliedert sind oder an dieselben gebunden sind (Hoekstra und Duzgunes, 1993). Einige Forscher haben biotinylierte Lipide (es wird z. B. verwiesen auf Wright und Huang, 1992) oder funktionale Enzyme (verwiesen wird z. B. auf Hianik et al., 1996) in künstliche Membranen mit eingegliedert, jedoch ist die Absicht dabei gewesen, die Eigenschaften der Membranen oder der eingebundenen Moleküle zu studieren, nicht aber die synthetischen Membranen als ein Werkzeug zu benutzen, um die Eigenschaften der exogenen Moleküle zu untersuchen wie dies bei der vorliegenden Erfindung der Fall ist. Für eine Übersicht der laufenden Techniken und Forschungen auf diesem Gebiet wird verwiesen auf Ottova und Tien, 1977.
Das Dokument EP0101046 offenbart ein Verfahren zum Nachweisen der Lipaseaktivität in einer Probe, in welcher ein von einem Glycerol abgeleitetes Enzymsubstrat nach der Spaltung durch die Lipase wasserlöslich wird. Das besagte wasserlösliche Molekül wird dann extrahiert und anschließend durch eine Esterase gespalten, um ein Glycerol herzustellen, welches dann nachgewiesen wird.
Das Dokument US 4668623 offenbart ein Verfahren zum fluorometrischen Messen der Aktivität von Fett abbauenden Enzymen unter Verwendung eines amphipathischen Substrates mit einer fluoreszierenden Markierung, die auf dem hydrophoben Abschnitt des Moleküls vorhanden ist. Das Verfahren basiert auf einem Fluoreszenznachweismodus, der auf relativen Veränderungen der Intensität der Excimerfluoreszenz gegenüber der Monomerfluoreszenz beruht.
Phospholipase C (PLC) ist eine generische Bezeichnung für Enzyme, welche die Hydrolyse von Phosphoglyceriden zu Diacylglycerolen und phosphorylierten Alkoholen wie etwa Serie, Cholin, Inositol, Glycerol oder Ethanolamin katalysieren. Zum Beispiel hydrolysiert eine spezifische Phospholipase C Phosphatidylinositol-4-phosphat (PIP) oder Phosphatidylinositol-4,5-biphosphat (PIP₂), was in jedem Fall hin führt zu der Bildung von zwei zweiten Boten bzw. sog. Messenger: zu einem hydrophoben Diacylglycerol und zu einem hydrophilen Inositolphosphat (IP₂ oder bzw. IP₃). Diese Hydrolyse kann durch eine Vielfalt von Verfahren kontrolliert werden unter Verwendung von endogen oder exogen markierten Substraten.
De Vivo (1994) beschreibt gegenwärtige Verfahren, die zum Messen der Hydrolyse von PIP₂ eingesetzt werden. Bei dem endogenen Substratansatz werden die ein Interesse aufweisenden Zellen in Gegenwart von Myo-[³H]-inositol kultiviert. Die Zellen wandeln Inositol unter Verwendung von Phosphatidylinositolsynthase in Phosphatidylinositol (PI) um und das PI wird seinerseits durch Phosphatidylinositolkinase in PIP-[³H] und PIP₂-[³H] umgewandelt. Wenn der Polyphosphoinositidpool durch einen stabilen Zustand gekennzeichnet ist, dann wird die Aufspaltung von PIP und PIP₂ durch die Zugabe eines geeigneten Stimulationsfaktors (z. B. Rezeptoragonisten für intakte Zellen oder Guanylylnukleotide für permeabiliserte Zellen) zu dem Zellkulturmedium eingeleitet.
Bei dem exogenen Substratansatz werden gereinigte, markierte Phospholipide als das Substrat verwendet. Die Phospholipide werden in Gegenwart oder in Abwesenheit eines Detergens gemischt und zum Zubereiten von Vesikeln kurz auf Eis mit Schallwellen behandelt. Aliquote Teile des Substrats werden mit einer Quelle von PLC (Membrane oder gereinigtes Enzym) und oft auch von G-Proteinuntereinheiten gemischt.
Bei den beiden Substratansätzen, sowohl bei dem endogenen als auch bei dem exogenen Ansatz, wird eine Lösungsmittelextraktion verwendet, um die hydrophilen Reaktionsprodukte von dem hydrophoben Substrat zu trennen. Gegenwärtige Verfahren für Versuche mit Sphingomyelinase erfordern ebenfalls Extraktionsschritte mit einem Lösungsmittel. Es würde daher wünschenswert sein, den Extraktionsschritt aus Umwelt- und Gesundheitsgründen überflüssig zu machen. Außerdem ist es schwierig, die Extraktion von großen Anzahlen an Proben zu automatisieren, wie dies notwendig sein würde zum Beispiel bei einem hohen Durchsatz beim Screenen bzw. Klassieren von Arzneimittelkandidaten.
ZUSAMMENAFSSUNG DER ERFINDUNG
Die hier beschrieben Erfindung erlaubt die quantitative oder die qualitative Bestimmung der enzymatischen Aktivität von verschiedenen Enzymen, ohre dass dabei ein Extraktionsschritt erforderlich wäre. Als Substrat verwendet die Erfindung einen festen, mit einer hydrophoben Schicht beschichteten Träger, etwa eine künstliche Lipidschicht, die durch hydrophobe Wechselwirkungen ein amphipathisches Enzymsubstrat mit einbindet, welches derart markiert ist, dass ein hydropbiles markiertes Fragment erzeugt werden wird, wenn das Substrat durch ein spezifisches Enzym gespalten wird. Das markierte hydrophile Fragment wird in die wässrige Phase hinüberwandern, wodurch dasselbe nicht länger mit dem festen Träger verbunden ist, womit die Basis für einen Testversuch der Enzymaktivität gebildet wird. Die Auswahl eines geeignet markierten bzw. gekennzeichneten Substrats erlaubt die Verwendung der Erfindung im Zusammenhang mit einer Vielfalt von Enzymen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Andere Vorteile der vorliegende Erfindung werden leicht abzuschätzen sein, so wie dieselbe durch die Bezugnahme auf die nachfolgende detaillierte Beschreibung in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen betrachtet, eingehender verständlich sein wird:
1 ist eine grafische Darstellung, welche die kinetische Aktivität von verschiedenen Mengen des gereinigten, rekombinanten PLC γl auf einer mit [³H] PIP₂ beschichteten 96-Loch sog Phospholipid FlashPlate^TM illustriert. Verschiedene Konzentrationen der gereinigten rekombinanten PLC werden zu einzelnen Löchern in 0,1 ml 50 mM NaP_i, pH 6,7, 0,1 M NaCl, 0,1 mM CaCl₂, 0,1 mM EGTA hinzugefügt und alsdann wird die Freisetzung von Radioaktivität als ein Funktion der Zeit auf einem sog. Packard TopCount^TM (Mikroplatten Scanningsystem, hergestellt von Packard Instrument Company aus Meriden, Connecticut) überwacht.
2A ist eine grafische Darstellung, welche die Wirkungen von Zusätzen auf die PLC δl Aktivität gegenüber der mit [³H] PIP₂ beschichteten 96-Loch Phospholipid FlashPlate^TM illustriert, wobei die Wirkungen der verschiedenen Konzentrationen an Deoxicholat auf die Freisetzung von Radioaktivität als ein Funktion der Zeit durch 13 mU PLC in 0,2 ml HEPES-NaOH, pH 7,0, 0,14 M KCL, 0,1 mM CaCl₂, 0,1 mM EGTA, [Deoxicholat]'s auf einer Prozentbasis (Gewicht/Volumen) dargestellt werden.
2B ist eine grafische Darstellung, welche die Wirkung des Zusatzes von 0,2 mM Spermin auf die 100 mU PLC Aktivität in 0,2 ml 50 mM HEPES-NaOH, pH 6,7, 0,15 M KCL, 0,1 mM CaCl₂, 0,1 mM EGTA, 0,04% Deoxicholat (Gewicht/Volumen) illustriert. Die Freisetzung von Radioaktivität wird auf einem Packard TopCount^TM überwacht.
3 ist eine grafische Darstellung, welche die Stimulation der PLC Aktivität durch die Zugabe von GTPγS zu den rohen HL60 Cytosolzubereitungen durch GTPγS illustriert, so wie dieselbe auf mit [³H] PIP₂ beschichteten 96-Loch Phospholipid FlashPlates^TM gemessen wird. Unterschiedliche Mengen des HL60 Cytosolproteins werden in die einzelnen Löchern hinzu gegeben, welche 0,2 ml 50 mM HEPES-NaOH, pH 6,7, 0,15 M KCL, 0,1 mM CaCl₂, 0,1 mM EGTA, 0,04% Deoxycholat (Gew./Vol.) entweder in Gegenwart oder in Abwesenheit von 0,2 mM GTPγS enthalten. Die Freisetzung von Radioaktivität wird auf einem Packard TopCount^TM überwacht.
4 ist eine grafische Darstellung, welche die Freisetzung der intrazellularen PLC Aktivität aus mit Streptolysin S permeabilisierten A431 menschlichen Krebszellen auf mit [³H] PIP₂ beschichteten 96-Loch Phospholipid FlashPlate^TM illustriert. Aliquote Anteile von erneut suspendierten A431 Zellen werden in die Löcher verteilt, die 50 mM HEPES-NaOH, pH 6,7, 0,15 M KCL, 0,1 mM CaCl₂, 0,1 mM EGTA, 0,04% Deoxicholat (Gew./Vol.), 10 Einheiten/ml Streptolysin S enthalten, und das Volumen wird mit einem Reaktionspuffer auf 0,2 ml angepasst. Die Freisetzung von Radioaktivität wird auf einem Packard TopCount^TM überwacht.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Das einzigartige Merkmal dieser Erfindung liegt bei der Verwendung eines Substrats, das die Untersuchung der Enzymaktivität in Proben ermöglicht, ohne dass es dabei notwendig wäre, die Reaktionsprodukte zu extrahieren. Die Erfindung kann entweder bei homogenen oder bei heterogenen Testformaten verwendet werden, auch kann sie entweder radiometrische oder nicht radiometrische Substrate einsetzen. Mit einer geeigneten Auslegung des Substrats kann die vorliegende Erfindung dazu verwendet werden, um eine Vielfalt von Enzymen wie etwa Phospholipase zu untersuchen, für welche die Testverfahren sonst Extraktionsschritte erfordern. Substrate, die für die Verwendung im Rahmen der Erfindung geeignet sind, können umfassen, ohne aber auf dieselben begrenzt zu sein, Phospholipide, Sphingolipide und irgendwelche anderen amphipathischen Moleküle wie etwa Glycolsyldiacylglycerole, Ceramide, Ganglioside und komplexe Phospholipide wie Cardiolipin. Das Enzym kann gereinigt, halb gereinigt oder als ein rohes Extrakt verwendet werden.
Ein amphipathisches Enzymsubstrat, das auf einem polaren Anteil markiert ist, wird durch hydrophobe Wechselwirkungen in irgendeine geeignete hydrophobe Schicht wie etwa in eine Lipidschicht mit eingebunden, welche auf einem festen Träger ausgebildet wird und welche durch hydrophobe Wechselwirkungen und/oder durch eine kovalente Anbindung festgehalten wird. Eine geeignete hydrophobe Schicht ist eine solche, welche eine Komponente mit einbindet, welche das amphipathische Substrat durch eine hydrophobe Wechselwirkung bindet. Das besondere zu verwendende Substrat wird ausgelegt oder ausgewählt aufgrund seiner Empfindlichkeit gegenüber der Wirkung des interessierenden Enzyms und aufgrund einer geeigneten Stelle für die Markierung. Geeignete Reportergruppen, die verwendet werden, um das Substrat zu markieren, können umfassen, ohne aber darauf begrenzt zu sein, radioaktive Isotope, Enzyme, fluorogene, kolorimetrische, magnetische, chemilumineszente oder elektrochemische Materialien oder ein Element eines spezifischen Bindungspaares.
Geeignete Träger mit einer festen Phase umfassen, ohne aber darauf begrenzt zu sein, synthetische Polymerträger wie etwa Polystyrol, Polypropylen, substituiertes Polystyrol, z. B. laminiertes oder carboxiliertes Polystyrol; Polyacrylamide; Polyamide; Polyvinylchlorid usw.; Glaskügelchen, Agarose; Nitrozellulose; Nylon; Polyvinylidendifluorid; oberflächenmodifiziertes Nylon usw. Homogene Testmethoden für Phospholipase, welche eine 96-Loch FlashPlate als den festen Träger einsetzen, haben gezeigt, dass sie gut funktionieren. (Ein FlashPlate ist eine 96 Löcher umfassende Mikroplatte aus Polystyrol, in welcher das Innere eines jeden Loches mit einer dünnen Schicht eines auf Polystyrol basierenden Szintillators beschichtet ist.)
Man wird demnach sehen, dass die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren und auf ein Material zur Ausführung von schnellen, auf einem Enzym beruhenden Tests ausgerichtet ist. Die Tests können quantitativer oder qualitativer Art sein und sie erfordern keine aufwendige Probenherstellung oder Extraktionsschritte. Die Tests beruhen auf der Verwendung eines amphipathischen Substrats, welches gegenüber dem Enzym reaktiv ist. Das amphipathische Substrat enthält einen hydrophilen Abschnitt, der einen Reporteranteil trägt (auch als Markierung bezeichnet), und einen hydrophoben Abschnitt.
Bei einem typischen Testverfahren wird eine Probe aus einem Material, welches das verdächtigte Zielenzym enthält, mit der hydrophoben Schicht in Kontakt gebracht, welche, wie dies bereits oben festgestellt worden ist, vorzugsweise auf einem Träger angeordnet ist. Die Probe wird in ein polares Lösungsmittel hinein gegeben, welches typischerweise Wasser enthält, und mindestens ein Abschnitt des Enzyms, das sich in der Probe befindet, wird mit dem darin enthaltenen Substratmaterial in Wechselwirkung treten. Die Wechselwirkung resultiert in einer Spaltung des Substrats, was zu der Freisetzung eines hydrophilen Fragments einschließlich des darauf befindlichen Reportermaterials führt. Das hydrophile Fragment verfügt über eine niedrige Affinität für die hydrophobe Schicht und dringt in das Äußere, in das polare Lösungsmittel, ein. Am liebsten wird der Nachweis der Reaktion durch ein Messen der residuellen Reporteraktivität der hydrophoben Schicht bewerkstelligt, und diese residuelle Reporteraktivität wird umgekehrt proportional zu der Aktivität des Enzyms in der Probe sein. Alternativ kann die Enzymaktivität durch ein Nachweisen der Reportermarkierungsfragmente in dem wässrigen Material gemessen werden.
Wie hierin bereits oben vermerkt worden ist, kann der Reporteranteil eine radioaktive Art wie etwa Tritium umfassen und in einigen Fällen kann die hydrophobe Schicht über einen Träger aufgetragen werden, welcher in sich ein Szintillatormaterial enthält. In anderen Fällen kann das Reportermaterial ein magnetisch markiertes Material sein, oder ein Material mit einer fluoreszierenden Markierung, ein Element eines Antikörper/Antigenpaares, ein fluoreszierendes Mittel, ein eine Farbe bildendes Hilfsmittel, ein chemilumineszentes Material, ein Enzym, das unterschiedlich ist von dem Zielenzym der Probe, ein elektrochemisch aktives Material oder dergleichen und andere solche Reportermaterialien werden einem Experten auf diesem Gebiet offensichtlich sein.
Die nachfolgenden Beispiele dienen dazu, die Erfindung zu illustrieren.
BEISPIEL I
Sphingomyelinasetest
Herstellung des substrats
Mit Streptavidin beschichtete FlashPlates werden von NEN Life Science Products^TM bezogen. Biotinyliertes Phosphatidylethanolamin (PE) (Avanti) wird auf 10 Mikrogramm/ml in PBS verdünnt (0,1 M NaCl in 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,4) und 0,1 ml werden zu ein jedes Loch hinein gegeben. Nach der Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur, um eine Bindung des Streptavidins zu ermöglichen, wird die restliche, verbleibende Lösung durch Aufsaugen aus den Löchern entfernt. Sphingomyelin (Ei), [Cholinmethyl-³H] (NEN Life Science Products, Inc.) wird auf 1,0 Mikrocurie/ml mit Tris-HCl, pH 7,0 verdünnt, das 0,1% Rinderserumalbumin [BSA] enthält, und 0,1 ml werden in ein jedes Loch hinein gegeben. Während der Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur tritt Sphingomyelin hydrophob mit PE in Wechselwirkung, um eine ³H-markierte Lipidschicht aus einer festen Phase zu bilden. Die Platten werden dann abgesaugt und an der Luft getrocknet.
Enzymtest

Sphingomyelinase (Sigma) wird seriell in PBS verdünnt, das 1 mg/ml CaCl₂ und 1 mg/ml MgCl₂ (BioWhittaker) enthält, und 0,1 ml werden in ein jedes Loch hinein gegeben und über Nacht wird bei Raumtemperatur inkubiert. Das ³H markierte hydrophile Fragment, das durch die Aktivität der Sphingomyelinase von dem Sphingomyelin abgespalten worden ist, bewegt sich von der hydrophoben Lipidschicht einer festen Phase in die wässrige Lösung, wobei die Menge an ³H innerhalb einer ausreichenden Nähe zu dem Szintillator um gezählt zu werden abnimmt. Die Ergebnisse in der Tabelle 1 zeigen, dass die wachsende Menge an Sphingomyelinase eine Abnahme der in dem Loch nachgewiesenen Menge an Radioaktivität erzeugt. Das Loch mit keiner Sphingomyelinase wird als negative Kontrolle verwendet. TABELLE 1

Sphingomyelinase (mU/ml)	Zählungen pro Minute (CPM = Counts per Minute)	Prozent der negativen Kontrolle
2000	1038	8,6
200	2144	17,7
20	4672	38,6
2	8933	73,8
0,2	10691	88,4
0	12099	100,0

BEISPIEL II
Phospholipase c test
Herstellung des substrats
Die FlashPlates werden exakt wie in Beispiel I zubereitet mit der Ausnahme, dass PIP₂ _, [Inositol-2-³H(N)] (NEN Life Science Products) anstelle von Sphingomyelin-[³H] bei der Herstellung einer ³H-markierten Lipidschicht aus einer festen Phase hinzugefügt wird.
Teilweise reinigung von plc
(Camps et al., 1992; Camps et al., 1990; Glorschik et al., 1989). Zur Aufrechterhaltung werden die HL-60 Zellen (ATCC CCL-240) in 1-Liter drehenden Flaschen bei 10% CO₂ in Iscove's Medium kultiviert, ergänzt mit 20% fötalem Rinderserum (FBS), 1% L-Glutamin und 0,1% Gentamicin. Um die Phospholipase C einzuleiten, werden die Zellen in Medien, die mit 1,25% Dimethylsulfoxid (DMSO) ergänzt sind, während einer Zeitdauer von fünf Tagen kultiviert oder so lange, bis eine Dichte von etwa 2–3 × 10⁶ an lebensfähigen Zellen errneicht ist. Nach einem Ernten durch Zentrifugieren und einem zweimaligen Waschen mit einem Waschpuffer (20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 1 mM Dithiothreitol, 3 mM Benzamidin, 1 mM Leupeptin, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und 0,002 mM Sojabohnentrypsininhibitor) wird das endgültige Pellet, das etwa 2 × 10¹⁰ Zellen (30 ml gepacktes Zellvolumen) enthält, erneut suspendiert in 50–100 ml Lysispuffer (250 mM Saccharose, 20 mM Tris-HCl [pH 7,5], 1,5 mM MgCl₂, 1 mM ATP, 3 mM Benzamidin, 0,001 mM Leupeptin, 1 mM PMSF, 0,002 mM Sojabohnentrypsininhibitor). Diese Zellen werden durch vier Behandlungen in der Kalte während einer Zeitdauer von jeweils einer Minute mit einem Polyfron Homogenisierer lysiert, wobei jeweils ein zeitlicher Ruheabstand von einer Minute zwischen den Behandlungen erfolgt, dann folgt eine viermalige Schallbehandlung in einem Eisbad während einer Zeitdauer von jeweils einer Minute, wobei jeweils ein zeitlicher Ruheabstand von einer Minute zwischen den Behandlungen erfolgt. Das Lysat wird mit EGTA auf 1,25 mM ergänzt und der Abfall wird durch Zentrifugieren bei 4°C mit 1445 × g während einer Zeitdauer von zwanzig Minuten entfernt. Der resultierende oben schwimmende Anteil wird zentrifugiert bei 4°C mit 17.593 × g. Der oben schwimmende Anteil aus diesem Schritt wird zentrifugiert bei 4°C mit 112.594 × g während einer Zeitdauer von sechzig Minuten. Der endgültige oben schwimmende Anteil (Cytosol) wird durch einen Filter mit einer Porengröße von 0,45 Mikrometer hindurchgeleitet. Nach der Bestimmung der Proteinkonzentration wird das Cytosol blitzgefroren und bei –80°C so lange gespeichert, bis dasselbe als eine Quelle von Phospholipase C verwendet wird.
Enzymtest
Um die Aktivität von Phospholipase C zu testen, wird das aufgetaute HL-60 Cytosol auf verschiedene Proteinkonzentrationen mit Hilfe von PBS verdünnt, das 0,4 mM CaCl₂ und 0,21 mM GTP-gamma-S enthält. Das verdünnte Cytosol (0,1 ml) wird zu einem jeden FlashPlate^® Loch hinzugefügt, das eine Lipidschicht aus einer festen Phase mit PIP₂ [³H] enthält, und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Das ³H markierte hydrophile Fragment, das von dem PIP₂ durch die Aktivität der Phospholipase C abgespalten ist, bewegt sich von der hydrophoben Lipidschicht einer festen Phase in die wässrige Lösung, wobei die Menge an ³H Markierung innerhalb einer ausreichenden Nähe des Szintillators abnimmt, was gezählt werden soll. Die Ergebnisse in der Tabelle 2 zeigen, dass die wachsende Menge von Phospholipase C eine Abnahme der in dem Loch nachgewiesenen Menge an Radioaktivität erzeugt. Das Loch mit keiner Phospholipase C wird als negative Kontrolle verwendet. TABELLE 2

Phospholipase C (mg/ml HL-60 Cytosolprotein) Zählungen pro Minute (CPM = Counts per Minute) Prozent der negativen Kontrolle

3,5 864 31,1

1,0 1072 38,5

0 2782 100
BEISPIEL III
Chemische Oberflächenmodifikation von flashplates für eine kovalente bindung von phosphatidylethanolamin
Es sind zwei Typen von Chemie involviert: der eine Chemietyp setzt Divinylsulfon (DVS) ein und der andere verwendet 1-3-(3-Dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDAC).
Plattenaktivierung mit divinylsulfon:
Eine 1% DVS Lösung wird unmittelbar vor der Verwendung in 0,1 M Natriumcarbonat, pH 11,5, hergestellt. Aliquote Anteile (0,2 ml) werden auf einzelne Löcher verteilt und der Platte wird es ermöglicht, bei Raumtemperatur während einer Zeitdauer von mindestens dreißig Minuten zu stehen. Die Platte wird dann dreimal mit 0,1 M Natriumcarbonat, pH 10,5, gewaschen und dann vor der Zugabe des Lipids kurz an der Luft getrocknet. Eine 25 μg/ml Lösung von Phosphatidylethanolamin (PE) wird in 25–50 mM Natriumcarbonat, pH 9,8–10,2, hergestellt und 0,2 ml werden auf ein jedes Loch verteilt. Die Platte wird wieder bei Raumtemperatur während einer Zeitdauer von mindestens drei Stunden inkubiert. Schließlich wird die Platte zweimal mit einer mit Phosphat gepufferten Salzlösung (PBS), 0,04% Deoxicholat gewaschen und zweimal nur mit PBS alleine. Die Platte wird dann an der Luft getrocknet und in einer abgedichteten Tasche in der Dunkelheit bei Raumtemperatur gelagert.
Edac plattenaktivierung:
Eine Lösung von 0,5 mg/ml EDAC wird in 10–50 mM MES, pH 6,8–7,2, hergestellt, das 25 μg/ml PE enthält, und 0,2 ml werden auf die einzelnen Löcher verteilt. Der Platte wird es ermöglicht, bei Raumtemperatur über Nacht in der Dunkelheit zu stehen. Schließlich wird die Platte zweimal mit einer mit Phosphat gepufferten Salzlösung (PBS), 0,04% Deoxicholat gewaschen und zweimal nur mit PBS alleine. Die Platte wird dann an der Luft getrocknet und in einer abgedichteten Tasche in der Dunkelheit bei Raumtemperatur gelagert.
Einführung:
Inositol spezifische Phospholipase Cs (PLCs) sind Schlüsselenzyme bei der Signalübertragung von vielen mit Hilfe einer Zelle vermittelten Antworten wie Peptidhormone und von Neurotransmittem (Rhee und Choie, 1992). Diese Enzyme sind spezifische Hydrolasen für das Phosphoinositid. Die Enzymreaktion der PLCs mit Phosphatidylinositol-4,5-biphosphat (PIP₂) führt zu der Herstellung von Inositol-1,4,5-Triphosphat (IP₃) und von Diacylgylcerol. Es ist die Erzeugung dieser Produkte, was die Kaskade an Regulatorsignalen durch die Zelle hindurch herstellt. IP₃ leitet die intrazellulare Freisetzung von Ca²⁺ Reserven aus dem endoplasmatischen Retikulum durch seine spezifischen Wechselwirkungen mit dem IP₃ Rezeptor ein, während Diacylgylcerol ein mächtiger Aktivator der Proteinkinase C ist. Die Aktivierung dieser zellularen Ereignisse führt zu einer Anregung einer Serie von Wegen, welche die zellulare Aktivität modulieren.
Klassisch unterteilt man die PLC Enzyme in drei Familien, die als β, δ und γ bezeichnet werden. Die β und γ werden entweder durch den mit dem G-Protein gekoppelten Pfad bzw. durch den mit Hilfe eines Rezeptors vermittelten Tyrosinkinase-Pfadweg reguliert. Die Aktivität dieser Enzyme ist historisch untersucht worden unter Verwendung lösungsbasierter Tests mit Phospholipidvesikeln, die Spurenmengen von [³H, Inositol] PIP₂ (DeVivo, 1994) enthalten. Die hydrolytische Reaktion wird überwacht durch die Zugabe von angesäuerten, organischen Lösungsmitteln und durch die nachfolgende Phasentrennung. [³H] IP₃ verbleibt in der wässrigen Phase, während die sauer markierten Lipide sich in der organischen Schicht verteilen. Somit liefern Radioassays der wässrigen Schicht einen bequemen Weg, um die PLC Aktivität zu messen. Die Grenzen dieses Tests bestehen jedoch darin, dass er nicht leicht den Verfahren zum Screenen bzw. Klassieren mit einem hohen Durchsatz (HTS = high-throughput screening) zugänglich ist.
Um diese Enzyme in der Art eines solchen hohen Durchsatzes zu untersuchen, ist ein Verfahren zum Überwachen der PLC Aktivität auf FlashPlates^TM entwickelt worden, die gebundenes [³H] Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat enthalten. Die FlashPlate^TM wird modifiziert, um markierte Phospholipide auf der Oberfläche einzufangen und um dadurch ein funktionales Substrat zu liefern, um die PLC Aktivität zu messen.
Verfahren:
Die mit Phospholipid modifizierten FlashPlates^TM werden durch eine Vielfalt verschiedener Verfahren hergestellt, um verschiedene Beschichtungsoberflächen zu testen. 96-Loch Phospholipid FlashPlates^TM werden mit 0,2 ml einer Lösung beschichtet, die [1–³H, Inositol] PIP₂ enthält (–20 Ci/mMol, NEN), mit Konzentrationen zwischen 0,25–1 μCi/ml während einer Zeitdauer von mindestens drei Stunden. Die Löcher werden dann zweimal mit einer mit Phosphat gepufferten Salzlösung (PBS), die 0,04% Natriumdeoxicholat enthält, und schließlich mit PBS alleine gewaschen. Typischerweise liegt der Variationskoeffizient in dem Bereich zwischen 8–12%. Reaktionen werden direkt ausgeführt in den Löchern in einem Puffer, angezeigt in den Legenden und überwacht auf einem Packard TopCount^TM Instrument.
Eine Einheit der PLC Aktivität ist definiert als ein nMol von [³H] IP₃, gebildet pro Minute pro mg eines Enzyms unter Verwendung typischer lösungsbasierter Tests (DeVivo, 1994).
HL60 Zellen werden vor der Ernte bis zur späten Protokollphase (log Phase) aufgezogen und kultiviert und der Cytosolanteil wird so wie vorher beschrieben hergestellt (Camps et al. 1990; Camps et al. 1992) oder die HL60 Cytosolextrakte werden im Handel von ABS, Inc. gekauft. Menschliche Epidermoidkarzinomzellen A431 werden vor dem Ernten in 150 cm² großen Glasflaschenkulturen aufgezogen, die Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium (DMEM) mit 10% fötalem Kalbserum (FCS = fetal calf serum) enthalten. Die A431 Zellen werden so lange kultiviert bis –50% Konfluenz erreicht ist. Die Zellen werden geerntet durch ein Abschaben der gebundenen Zellmasse von dem Boden der Glasflasche und durch ein Pelletieren durch ein Zentrifugieren mit einer niedrigen Geschwindigkeit. Die Zellpellets werden dann zweimal mit PBS gespült. Die Zellen werden erneut suspendiert in einem minimalen Volumen eines Reaktionspuffen, der 10 Einheiten/ml Streptolysin S enthält, und sie werden gezählt, bevor sie in aliquoten Teilen den einzelnen Löchern zugeführt werden.
Alle anderen Chemikalien oder Reagenzien sind von der Qualität eines Reagens oder besser.
Ergebnisse
Unsere anfängliche Arbeit dient dazu zu verifizieren, dass die markierte Oberfläche der Phospholipid FlashPlate^TM wirksam die Inositolkopfgruppe dem Enzym für die Hydrolyse darstellen kann. Im Verlauf der 17,5 Stunden andauernden Reaktion zeigt die gereinigte, rekombinante PLC γl eine Fähigkeit, eine bestimmte Menge in einer von der Konzentration abhängigen Art (siehe 1) freizusetzen. In allen Fällen erreicht die Reaktion von PLC γl innerhalb der ersten fünf Stunden der Reaktion ein Plateau und erzeugt danach nur noch eine sehr geringe Freisetzung von Mengen. Bei der höchsten Konzentration des getesteten Enzyms, 130 μg, werden über 75% der Radioaktivität von der Oberflächenplatte freigesetzt. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Mehrzahl des an die Oberfläche gebundenen [³H] PIP₂ leicht als ein Substrat für das Enzym verfügbar ist. Um zu verifizieren, dass die Freisetzung der an die Oberfläche gebundenen Mengen tatsächlich auf die Hydrolyse der [³H] PIP₂ zurückzuführen ist, werden die einzelnen Löcher abgesaugt und mit zwei Volumen Chloroform-Methanol unter sauren Bedingungen (CHCl₃:CH₃OH:HCl, 2:1:0,01) extrahiert. Die relative Verteilung der Radioaktivität in der organischen bzw. wässrigen Phase stellt markiertes PIP₂ bzw. IP₃ dar. Wie in der Tabelle 3 gezeigt ist, ist die Freisetzung von Radioaktivität von der mit Phospholipid markierten FlashPlate^TM vorwiegend auf die Hydrolyse der gebundenen [³H] PIP₂ sowohl mit den rohen PLC Herstellungen aus den HL60 Cytosolextrakten als auch mit rekombinanter PLC (Kontrolltestlöcher zeigen wenig oder gar keine Freisetzung von Radioaktivität; die Daten davon sind nicht gezeigt) zurückzuführen. In beiden Fällen wird die Radioaktivität überwiegend in die wässrige Phase verteilt (~ 90% und darüber), was auf [³H] IP₃ hinweist. Dieses Ergebnis zeigt, dass das markierte IP₃ spezifisch freigesetzt wird aus der Phospholipid FlashPlate^TM und dass an die Oberfläche gebundenes PIP₂ tatsächlich ein lebensfähiges Substrat sowohl für rohe, enzymatische PLC Herstellungen von HL60 Cytosolextrakten als auch für die gereinigte, rekombinante PLC ist. TABELLE 3: ORGANISCHE EXTRAKTION DER NACHREAKTION VON WASSRIGEN PROBEN AUS EINZELNEN TESTLÖCHERN VON MIT [³H] PIP₂ BESCHICHTETEN PHOSPHOLIPID FLASHPLATES^TM

% Verteilung

Probe Wässrige Phase Organische Phase

(# von Experimenten) ([³H]IP₃) ([³H]PIP₂)

HL60 Cytoyol (n = 10) 89 ± 7,5% 11 ± 1,1%

rekombinante PLC (n = 3) 97 ± 0,3% 3 ± 0,15%
Die Reaktion zeigt auch viele derselben Merkmale, wie sei vorher gezeigt worden sind für die lösungsbasierten Tests unter Verwendung gemischter Mizellen in Gegenwart entweder von Deoxicholat (Crooke und Gennett, 1989) oder Spermin (Haber et al., 1991). Für diese Tests zeigt die rekombinante PLC δl eine erhöhte hydrolytische Aktivität in einer von der Konzentration abhängigen Art bei der Zugabe von Natriumdeoxicholat (siehe 2A) oder in Gegenwart von hinzugefügtem Spermin (siehe 2B). Die Ergebnisse bestätigen die Wirkungen dieser Verbindungen auf die Anregung der PLC Aktivität, wie es bereits vorher veröffentlicht worden ist (Crooke und Gennett, 1989; Haber et al., 1989), und sie validieren die Nützlichkeit des Plattenformats, wenn man es mit den lösungsbasierten Mizellentests vergleicht.
Andere Experimente werden ausgelegt, um zu erforschen, ob die Anregung der PLC Aktivität aus rohen zellularen Extrakten auf der Phospholipid FlashPlate^TM unter Verwendung der vorher beschriebenen Protokolle (Rhee und Choi, 1992; DeVivo 1994) überwacht und beobachtet werden kann. Verschiedene Proteinkonzentrationen von HL60 Cytosolextrakten werden in Gegenwart oder Abwesenheit der nicht hydrolysierbaren analogen GTPγS behandelt und die Radioaktivitätverminderung wird kinetisch überwacht. Wie man in der 3 sieht, zeigt die Freisetzung von gebundenen Mengen in der Abwesenheit des Analogon eine Konzentrationsabhängigkeit von der Menge des hinzugefügten Proteins und die Reaktion beginnt, nach drei Stunden allmählich aufzuhören bei –15%. Eine Zugabe von GTPγS zu den Proben erzeugt eine Anregung in der PLC Aktivität bei jeder getesteten Proteinkonzentration. Die Konzentrationsabhängigkeit von dem hinzugefügten Protein scheint jedoch verloren gegangen zu sein möglicherweise auf Grund der Tatsache, dass nur geringe Substrathöhen auf der Oberfläche verfügbar sind. Aber sogar trotz dieses Sachverhalts ist eine deutliche 2–3-fache Anregung offensichtlich für jede verwendete Proteinkonzentration.
Als einen weiteren Test dieses Formats analysieren wir die PLC Aktivität, wenn sie freigesetzt wird aus permeabilisierten, menschlichen Epidermoidkarzinomzellen A431 (siehe 4). In diesem Fall resultiert die Zugabe verschiedener Mengen zu der mit [³H] PIP₂ beschichteten Phospholipid FlashPlate^TM in der Freisetzung einer von der Zellenanzahl abhängigen Radioaktivität. Zellzahlen von und unter 2 × 10⁵ Zellen/ml zeigen eine anfängliche Verzögerungsphase bei der Reaktion, was auf eine Verzögerung in der Freisetzung von PLC Aktivität aus den Zellen hinweist. Darüber hinaus kann bei Zellzahlen von etwa 2 × 10⁵ Zellen/ml gezeigt werden, dass die Freisetzung von Radioaktivität aus der Oberfläche auf die Freisetzung sowohl von intaktem Lipid als auch von IP₃ zurückzuführen ist (Daten nicht gezeigt). Daher lässt dieses Ergebnis bei erhöhten Zellzahlen vermuten, dass andere Zellkomponenten in der Lage sind, das Lipid von der Oberfläche in einer nicht hydrolytischen Reaktion zu entfernen. Kumuliert zeigen diese Ergebnisse, dass die PLC Aktivität sowohl von permeabilisierten Zellen als auch von Cytosolextrakten in der Art eines hohen Durchsatzes auf mit [³H] PIP₂ beschichteten Phospholipid FlashPlates^TM überwacht und beobachtet werden kann.
SCHLUSSFOLGERUNGEN
Diese Arbeit zeigt deutlich die Nützlichkeit der mit [³H] PIP₂ beschichteten Phospholipid FlashPlates^TM zum Überwachen und Beobachten der PLC Aktivität, um mit rezeptorgekoppelten funktionalen Tests ein Screenen bzw. Klassieren mit einem hohen Durchsatz durchzuführen. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass die PLC Aktivität leicht von einer Vielzahl von Quellen einschließlich gereinigter, rekombinanter Enzymeherstellungen bis hin zu rohen Zelllysaten und permeabilisierten Zellen überwacht werden kann. Darüber hinaus liefert dieses Format eine Oberfläche, die jener vergleichbar ist, die für klassisch markierte Mizellenstudien verwendet wird, und es illustriert die Machbarkeit dieses Tests zum Messen der PLC Aktivität in einer Vielzahl von verschiedenen Screenings- bzw. Klassierungstests von Arzneimitteln.
Die Grundsätze der vorliegenden Erfindung können an eine Vielfalt von Enzym/Substratsystemen angepasst werden, von denen alle einem Experten auf diesem Gebiet offensichtlich sein werden. Angesichts des Vorstehenden wird es verständlich sein und anerkannt werden, dass zahlreiche Modifikationen und Variationen der zuvor beschriebenen Erfindung leicht implementiert werden können. Die Diskussion, Beschreibung und die Beispiele, die hier bekannt gemacht worden sind, dienen lediglich zur illustrativen Darstellung von besonderen Ausführungen der vorliegenden Erfindung, aber sie sollen in keiner Weise irgendwelche Beschränkungen der Praxis derselben bedeuten. Es sind die folgenden Ansprüche einschließlich aller Äquivalente, welche den Umfang der Erfindung definieren.
ZITIERTE LITERATUR

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Claims

Verfahren zum Analysieren einer Probe für das Vorhandensein und/oder für die Aktivität eines Enzyms, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: ein Bereitstellen eines hydrophoben Materials; ein Bereitstellen eines amphipatischen Substrates mit einem hydrophoben Abschnitt und einem hydrophilen Abschnitt, wobei der hydrophile Abschnitt einen Reporteranteil darauf mit einschließt, wobei das Substrat in der Lage ist, durch das Enzym gespalten zu werden, um so ein hydrophiles Fragment zu erzeugen, das den Reporteranteil enthält; ein Hineintun des Substrates in das hydrophobe Material; ein Bewerkstelligen eines Kontaktes des hydrophoben Materials, welches das Substrat in sich eingebettet hat, mit der Probe und mit einem polaren Lösungsmittel, wobei ein jedes Enzym, das in der Probe vorhanden ist, das Substrat spalten und das markierte hydrophile Fragment erzeugen wird, welches Fragment in das polare Lösungsmittel eindringen wird; und ein Nachweisen des Vorhandenseins des Reporters in dem polaren Lösungsmittel oder in dem hydrophoben Material, wobei das Vorhandensein des Reporters in dem polaren Lösungsmittel und/oder die Verringerung der Quantität des Reporters in dem hydrophoben Material indikativ für die Aktivität des Enzyms ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei welchem das hydrophobe Material eine Schicht umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 2, bei welchem der Schritt des Nachweisen des Vorhandenseins des Reporters das Nachweisen der Menge des Reporters in der hydrophoben Schicht umfasst; wobei die Konzentration des Reporters in der hydrophoben Schicht umgekehrt proportional zu der Aktivität des Enzyms ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei welchem der Schritt des Nachweisens des Vorhandenseins des Reporters das Nachweisen der Menge des Reporters in dem polaren Lösungsmittel umfasst; wobei die Konzentration des Reporters in dem polaren Lösungsmittel proportional zu der Aktivität des Enzyms ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei welchem der Schritt des Bereitstellens eines hydrophoben Materials ferner den Schritt des Unterstützens des hydrophoben Materials auf einem Träger umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 5, bei welchem der Träger eine Mikrotestplatte umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 5, bei welchem der Träger eine Vielzahl von Kügelchen umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 5, bei welchem der Reporter aus einem radioaktiven Material besteht und wobei der Träger ein auf Strahlung ansprechendes Material enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 5, bei welchem der Reporter aus einem nicht radioaktiven Material besteht und wobei der Träger ein ansprechendes Material enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 2, bei welchem die hydrophobe Schicht kovalent an einen Träger gebunden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 2, bei welchem die hydrophobe Schicht aus einem Lipid besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 11, bei welchem das Lipid Phosphatidylethanolamin umfasst.
Testausrüstung (assay kit) zum Analysieren einer Probe im Hinblick auf das Vorhandensein eines darin enthaltenen Enzyms, wobei die Testausrüstung umfasst. einen Körper aus einem hydrophoben Material; ein amphipathisches Substrat, das in dem hydrophoben Material angeordnet ist, wobei das amphipathische Substrat einen hydrophoben Abschnitt enthält, welcher in Wechselwirkung mit dem hydrophoben Material tritt, um so das darin enthaltene Substrat zurückzuhalten, und einen hydrophilen Abschnitt mit einem Reporteranteil darauf, wobei das Substrat in der Lage ist, durch das Enzym gespalten zu werden, um so ein hydrophiles Fragment zu erzeugen, das den Reporteranteil enthält.
Testausrüstung gemäß Anspruch 13, bei welchem der Körper des hydrophoben Materials auf einem Träger angeordnet ist.
Testausrüstung gemäß Anspruch 14, bei welchem das hydrophobe Material kovalent an den Träger gebunden ist.
Testausrüstung gemäß Anspruch 13, bei welchem das hydrophobe Material aus einem Lipid besteht.
Testausrüstung gemäß Anspruch 16, bei welchem das Lipid Phosphatidylethanolamin umfasst.
Testausrüstung gemäß Anspruch 13, bei welchem der Reporter ein radioaktives Material oder ein nicht radioaktives Material umfasst.