DE112015005283B4

DE112015005283B4 - Analysenverfahren und Analysenvorrichtung

Info

Publication number: DE112015005283B4
Application number: DE112015005283.6T
Authority: DE
Inventors: Hiroaki Nakagawa
Original assignee: Hitachi High Tech Corp
Current assignee: Hitachi High Tech Corp
Priority date: 2014-12-29
Filing date: 2015-12-04
Publication date: 2023-02-02
Anticipated expiration: 2035-12-05
Also published as: US20170343540A1; US20220291210A1; JPWO2016108267A1; WO2016108267A1; DE112015005283T5; JP6482577B2

Abstract

Es wird ein hochgradig präzises Analysenverfahren unter Verwendung eines enzymgekoppelten Immunoassays bereitgestellt. Die Anwesenheit eines Analyten 3 kann erfasst werden oder die Menge des Analyten 3 kann analysiert werden, indem man einen Antikörper 5, der zur spezitischen Bindung an den Analyten 3, der an einer Festphase 1 immobilisiert ist und ein daran gebundenes Enzym 7 aufweist, befähigt ist; anschließend ein Enzymsubstrat 8, das Zersetzungsprodukte erzeugen kann, die sich leicht massenspektrometrisch erfassen lassen, durch das an den Antikörper 5 gebundene Enzym 7 zersetzt; und anschließend die Zersetzungsprodukte 9 und 10 massenspektrometrisch analysiert.

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Analysenverfahren und eine Analysenvorrichtung und insbesondere eine Analysentechnik unter Verwendung eines enzymgekoppelten Immunoassays.
Stand der Technik
In den letzten Jahren wurden Immunoassays, die sich einer Antikörper-Antigen-Reaktion bedienen, bei der ein Antikörper eines biologischen Abwehrproteins fest an eine Substanz mit einer bestimmten Struktur gebunden wird, in breitem Umfang zum Nachweis oder zur quantitativen Analyse von biologischen Komponenten, wie Proteinen, verwendet. Insbesondere handelt es sich dabei um einen enzymgekoppelten Immunoassay zur Messung der Färbung oder Fluoreszenz eines Produkts, das aus einem Enzymsubstrat unter Anwendung einer Enzymreaktion erzeugt wird, d.h. ein multimolekulares Enzym-Reaktionsprodukt. Demzufolge wird der enzymgekoppelte Immunoassay in breitem Umfang eingesetzt, wobei auf relativ einfache Weise eine hohe Empfindlichkeit erreicht wird.
Beispielsweise wird bei einem enzymgekoppelten Immunoassay ein Analyt an einen anti-Analyt-Antikörper, der an einer festen Phase fixiert ist, gebunden und der anti-Analyt-Antikörper, an den eine Markierung zur spezifischen Erkennung des Analyten gebunden ist, wird an den Analyten gebunden. Ein nicht an den Analyten gebundener Komplex wird entfernt, und der Komplex zwischen einer Markierungsbindungssubstanz, die spezifisch an die Markierung gebunden ist, und einem Enzym wird an die Markierung gebunden. Anschließend wird der nicht an die Markierung gebundene Komplex entfernt, und ein Enzymsubstrat, das mit dem Enzym reagiert, wird zugesetzt, wodurch ein Enzym-Reaktionsprodukt erzeugt wird. Gemäß dem Stand der Technik wird das Enzym-Reaktionsprodukt, dessen spektroskopische Eigenschaften, wie die Absorption oder Fluoreszenz, durch die Reaktion stark verändert werden oder das eine weitere Reaktion mit anderen Substanzen eingeht, ausgewählt. Auf diese Weise werden die Anwesenheit oder Abwesenheit sowie die Konzentration des Analyten analysiert, indem man eine Veränderung der Absorption oder der Fluoreszenz zwischen dem Zustand vor und nach der Enzymreaktion analysiert.
Der vorstehend beschriebene Aufbau eines enzymgekoppelten Analysenverfahrens stellt lediglich ein Beispiel dar. Es wurden verschiedene Methoden im Rahmen des enzymgekoppelten Immunoassays entwickelt. Der enzymgekoppelte Immunoassay umfasst auch ein Verfahren, bei dem die Hydrophobizität oder Ionenadsorption sowie die chemische Bindung herangezogen werden, um den Analyten an einer festen Phase ohne Verwendung eines Antikörpers zu fixieren, sowie ein Verfahren, bei dem das Enzym an den anti-Analyt-Antikörper gebunden wird. Als Typen für Enzyme, die verwendet werden, stehen verschiedene Enzyme, wie β-Galactosidase, Peroxidase, alkalische Phosphatase, Acetylcholinesterase und Luciferase, aus gewerblichen Quellen zur Verfügung (vergleiche NPL 1).
Bei einem Massenspektrometer (MS) handelt es sich um eine Vorrichtung, die eine Substanz ionisiert, um das m/z-Verhältnis (Masse dividiert durch Ladung) und die Festigkeit auf der Grundlage der Beweglichkeit des Ions im Vakuum zu messen. Obgleich ein Makromolekül, zum Beispiel ein Protein, direkt analysiert werden kann, ergibt sich in vielen Fällen eine verminderte Empfindlichkeit. Das Protein im lebenden Körper unterliegt einer postranslationalen Modifikation, zum Beispiel einer Alkylierung, Phosphorylierung und Glycosylierung, wodurch es zu Unterschieden im Molekulargewicht oder in Bezug auf den Ladungszustand kommt. Demgemäß wird das Protein normalerweise mit unterschiedlichen m/z-Werten erfasst. Aus diesen Gründen ist ein Massenspektrometer weniger geeignet, direkt das Protein zu messen. Um daher das Protein durch Massenspektrometrie zu messen, wird das Protein unter Verwendung von Trypsin in Peptide aufgespalten, und ein Peptid, das sich für den MS-Nachweis eignet, wird nach entsprechender Auswahl analysiert. Auf diese Weise lässt sich derzeit das Protein in Konzentrationen von einigen 100 pg (einige fmol) nachweisen (vergleiche NPL 2 und NPL 3).
Literaturverzeichnis
Nichtpatentliteratur

NPL 1: The Immunoassay Handbook Fourth Edition, David Wild Edition, 2013, Elsevier Publisher (UK)
NPL 2: Tujin Shi et al., Proteomics, Bd. 12, Nr. 8, S. 1074 - 1092, 2012
NPL 3: Daniel C Liebler et al., Biochemistry, Bd. 52, S. 3797 - 3806, 2013.

Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Technisches Problem
Beim vorstehend beschriebenen enzymgekoppelten Immunoassay gemäß dem Stand der Technik, bei dem man sich der Kolorimetrie oder der Fluoreszenz bedient, besteht die Wahrscheinlichkeit, dass sich Einflüsse durch Trübung oder Bläschen in einer-Probenlösung ergeben, und ferner bestehen Beschränkungen hinsichtlich des Materials der einsetzbaren Gefäße. Andererseits erreicht man mit der vorstehend beschriebenen Massenspektrometrie im Allgemeinen eine hohe Analysenempfindlichkeit, wobei jedoch das Molekulargewicht oder die Ionisierung je nach den Substanzen variieren. Infolgedessen variieren die Analysenbedingungen oder die Empfindlichkeit stark. Zusätzlich kommt es aufgrund des Vorliegens von anderen Substanzen zu einer Erscheinung, die als Ionensuppression bezeichnet wird, wobei die Ionisierung behindert und die Empfindlichkeit verringert werden. Somit kommt es in zahlreichen Fällen zu einer erheblichen Beeinträchtigung der Empfindlichkeit oder der Datenreproduzierbarkeit. Umgekehrt tritt in einigen Fällen eine als Ionenverstärkung bezeichnete Erscheinung auf, bei der die Ionisierung gefördert wird. Insbesondere hängt bei der Hochleistungs-Flüssigchromatographie/MS (LC/MS) bei einer Probe, die zahlreiche Verunreinigungen enthält, zum Beispiel bei biologischen Proben und Nahrungsmitteln, die Datenzuverlässigkeit stark von der Vorbehandlung oder den LC-Trennbedingungen ab. Um daher eine neue Testart zu entwickeln oder die Genauigkeit auf dem Gebiet der klinischen Tests zu verbessern, benötigt man ein Analysenverfahren mit verbesserter Empfindlichkeit.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Analysenverfahren sowie eine Analysenvorrichtung bereitzustellen, mit denen die Empfindlichkeit eines enzymgekoppelten Immunoassays verbessert werden kann und mit denen Substanzen mit unterschiedlichen Molekulargewichten, wie Proteine, genau analysiert werden können.
Lösung der Aufgabe
Zur Lösung der vorstehenden Aufgabe wird erfindungsgemäß ein Analysenverfahren zur Messung eines Analyten bereitgestellt. Bei dem Analysenverfahren wird ein Antikörper, der spezifisch an einen an einer Festphase immobilisierten Analyten zu binden ist und ein daran gebundenes Enzym aufweist, an den Analyten gebunden. Eine Enzymreaktion zwischen dem an den Antikörper gebundenen Enzym und einem Enzymsubstrat wird hervorgerufen. Eine massenspektrometrische Untersuchung wird am Enzym-Reaktionsprodukt des erhaltenen Enzymsubstrats durchgeführt, um so die Anwesenheit oder Abwesenheit und die Konzentration des Analyten zu bestimmen.
Ferner wird zur Lösung der vorstehend beschriebenen Aufgabe eine Analysenvorrichtung zur Messung eines Analyten bereitgestellt. Die Analysenvorrichtung umfasst eine Enzymreaktionseinrichtung, in der ein Antikörper, der spezifisch an einen an einer Festphase immobilisierten Analyten zu binden ist und ein daran gebundenes Enzym aufweist, an den Analyten gebunden wird, wodurch eine Enzymreaktion zwischen dem an den Antikörper gebundenen Enzym und einem Enzymsubstrat hervorgerufen wird, sowie eine Massenspektrometrie-Einrichtung, die eine massenspektrometrische Untersuchung des aus dem Enzymsubstrat erhaltenen Enzym-Reaktionsprodukts durchführt. Die Analysenvorrichtung misst die Anwesenheit oder Abwesenheit sowie die Konzentration des Analyten.
Vorteilhafte Wirkungen der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt eine Vorrichtung bereit, mit der die Analyse eines Analyten unter Anwendung eines enzymgekoppelten Immunoassays mit hoher Empfindlichkeit vorgenommen werden kann und mit der auf einfache Weise verschiedene Zielsubstanzen, wie Proteine, analysiert werden können.
Figurenliste

[1] 1 zeigt in schematischer Weise das Prinzip des erfindungsgemäßen Analysenverfahrens unter Anwendung eines enzymgekoppelten Immunoassays.
[2] 2 zeigt ein Beispiel des Aufbaus einer Analysenvorrichtung gemäß Ausführungsform 1.
[3] 3 zeigt ein Ablaufdiagramm eines Analysenverfahrens gemäß Ausführungsform 1.
[4] 4 zeigt ein Ablaufdiagramm eines Analysenverfahrens gemäß Ausführungsform 2.

Beschreibung der Ausführungsformen
Nachstehend werden bevorzugte Ausführungsformen eines Analysenverfahrens und einer Analysenvorrichtung beschrieben, wobei man sich des erfindungsgemäßen neuen enzymgekoppelten Immunoassays bedient. Zunächst wird das Prinzip des erfindungsgemäßen Analysenverfahrens unter Bezugnahme auf das in 1 dargestellte Beispiel des enzymgekoppelten Immunoassays beschrieben.
Wie in 1 dargestellt, wird ein Analyt 3 in einer Analysenprobe an einen anti-Analyt-Antikörper 2, der an eine Festphase 1, wie ein kleines Teilchen oder eine Behälteroberfläche, gebunden ist, gebunden. Anschließend wird eine Reinigung durchgeführt, um Verunreinigungen in der Analysenprobe zu entfernen. Sodann wird ein anti-Analyt-Antikörper 5, an den eine Markierung 4 zur spezifischen Erkennung des Analyten 3 gebunden ist, an den immobilisierten Analyten 3 durch eine Antigen-Antikörper-Reaktion gebunden. Sodann wird eine Reinigung durchgeführt, um den Komplex der Markierung 4, der nicht an den Analyten 3 und den anti-Analyt-Antikörper 5 gebunden ist, zu entfernen. Sodann wird ein Komplex aus einer Markierungsbindungssubstanz 6, die spezifisch an die Markierung 4 zu binden ist, und einem Enzym 7 zugesetzt, um die Markierung 4 und die Markierungsbindungssubstanz 6 aneinander zu binden. Anschließend wird eine Reinigung durchgeführt, um einen Komplex aus der Markierungsbindungssubstanz 6, die nicht an die Markierung 4 gebunden ist, und dem Enzym 7 zu entfernen.
Wenn ein Enzymsubstrat 8, das mit dem Enzym 7 reagiert, zugesetzt wird, erzeugt das Enzymsubstrat 8 durch eine enzymatische Reaktion die Enzym-Reaktionsprodukte 9 und 10. Beispielsweise umfassen die Markierung 4 und die Markierungsbindungssubstanz 6 eine Kombination aus Biotin und Avidin oder Streptavidin. Jedoch kann es sich bei der Markierungsbindungssubstanz 6 um einen antimarkierten Antikörper handeln, indem man die Markierung 4 an einer beliebigen Verbindung anbringt. Ohne Verwendung der Markierung 4 kann ein anti-Antianalyt-Antikörper für die Erkennung des anti-Analyt-Antikörpers 5 oder ein Antikörper-Bindungsprotein, wie Protein G oder A, verwendet werden.
Nachstehend wird ein spezielles Beispiel für die Enzymreaktion, die durch das Enzymsubstrat hervorgerufen wird, beschrieben. Bei der Reaktion von β-Galactosidase wird p-Nitrophenyl-β-D-galactosid zersetzt und p-Nitrophenol wird freigesetzt. Dieses p-Nitrophenol weist in schwach alkalischer Lösung eine Färbung auf. Dadurch ist es möglich, p-Nitrophenol beispielsweise bei einer Wellenlänge von 420 nm zu messen.
Bei Verwendung von Peroxidase wird Wasserstoffperoxid zersetzt und 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin wird durch den dabei gebildeten aktiven Sauerstoff oxidiert. Das Reaktionsprodukt ist unter sauren Bedingungen gefärbt und wird aufgrund der Absorption bei 450 nm gemessen. Alkalische Phosphatase zersetzt p-Nitrophenylphosphat, wobei p-Nitrophenol entsteht, das durch Absorption bei 405 nm gemessen wird. Acetylcholinesterase zersetzt Acetylcholin zu Essigsäure und Thiocholin. Thiocholin spaltet die Disulfidbindung von 5,5'-Dithio-bis-(2-nitrobenzoesäure). Dabei entsteht 5-Thio-2-nitrobenzoesäure, die aufgrund der Absorption bei 412 nm gemessen wird.
Zusätzlich sind ferner folgende Substrate für β-Galactosidase bekannt: Phenyl-β-D-galactosid, p-Aminophenyl-β-D-galactosid, p-Methoxyphenyl-(3-D-galactosid, o-Nitrophenyl-β-D-galactosid, p-Methylumbelliferyl-β-galactosid, p-5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid, 5-Brom-6-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid, 5-Brom-3-indolyl-β-D-galactopyranosid, 6-Chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid und o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid.
Nachstehend sind Beispiele für Substrate von Peroxidase aufgeführt: 4-Aminoantipyrin, 2,2'-Azinobis-(3-ethylbenzothiazolin-6-ammoniumsulfonat), 5-Aminosalicylsäure, 3,5-Dichlor-2-hydroxybenzolsulfonsäure, 2,4-Dichlorphenol, N,N-Dimethylanilin, 3-Diethylaminotoluol, 3-Methyl-2-benzothiazolinon-hydrazon, 2,2'-Azinodi-(3-ethylbenzthiazolidin)-6'-sulfonat, 1,2-Phenylendiamin, 3-(3,5-Dimethoxyanilino)-2-hydroxypropansulfonsäure, 2,4,6-Tribrom-3-hydroxybenzoesäure, Tyramin und p-Hydroxyphenylpropionsäure. Ein Beispiel für ein Substrat von alkalischer Phosphatase ist 4-Methylumbelliferylphosphat.
Wie vorstehend ausgeführt, bedient sich ein enzymgekoppelter Immunoassay des Standes der Technik der Kolorimetrie oder der Fluoreszenzmessung. Dabei besteht die Wahrscheinlichkeit, dass Trübungen oder Bläschen in der Probenlösung einen Einfluss auf den enzymgekoppelten Immunoassay ausüben. Ferner ist die Auswahl von verwendbaren Materialien für die Gefäße beschränkt.
Daher wird beim erfindungsgemäßen Analysenverfahren und bei der erfindungsgemäßen Analysenvorrichtung, die sich eines enzymgekoppelten Immunoassays bedienen, als Enzymsubstrat, das mit dem Enzym reagiert, eine Verbindung verwendet, deren Enzym-Reaktionsprodukt massenspektrometrisch unter Verwendung eines Massenspektrometers (MS) nachgewiesen werden kann. Obgleich verschiedene MS-Typen verfügbar sind, ist es bevorzugt, sich der Elektrosprayionisation-Triple-Quadrupol-MS zu bedienen. Bei der Elektrosprayionisation handelt es sich um ein Verfahren, bei dem eine Substanz in einer Lösung in stabiler Weise durch eine Potentialdifferenz und ein Sprühgas ionisiert werden. Drei Elektroden des Quadrupol-MS sind in Serie angeordnet und ein Ion mit einem beliebigen m/z-Wert wird vom ersten Quadrupol ausgewählt. Das Ion wird durch den folgenden Quadrupol zersetzt und beliebige zersetzte Ionen werden vom letzen Quadrupol erfasst. Aufgrund einer Differenz der m/z-Werte werden die meisten anderen Substanzen vom ersten Quadrupol abgetrennt. Das Zersetzungsmuster wird durch eine Verbindung im anschließenden Quadrupol charakterisiert. Selbst wenn die Verbindung zufällig im ersten Quadrupol mit einer Verbindung mit dem gleichen m/z-Wert vermischt wird, unterscheiden sich die Zersetzungsprodukte. Es ist daher möglich, die Menge einer bestimmten Substanz im letzten Quadrupol selektiv zu messen.
Die durch ein Massenspektrometer mit diesem Aufbau zu erfassende Verbindung wird durch die Elektrospray-Vorrichtung ionisiert und vom letzten Quadrupol quantitativ erfasst. Das Enzym-Reaktionsprodukt 9, das als in 1 dargestellter Hauptanalyt dient, verringert den Einfluss der Ionensuppression des Enzym-Reaktionsprodukts 10, das nicht als Enzymsubstrat 8 oder als weiterer Hauptanalyt dient. Demzufolge ist es erstrebenswert, diese Komponenten durch Flüssigchromatographie (LC) abzutrennen. Wenn die Verbindung durch das Elektrospray-Verfahren ionisiert wird, ist es wahrscheinlich, dass die Verbindung mit einer höheren Konzentration im organischen Lösungsmittel verdampft wird und sich ein befriedigender Ionisationswirkungsgrad ergibt. Als Verbindung, deren Konzentration im organischen Lösungsmittel in der Säule des bei der LC weit verbreiteten C18-Systems höher wird, wird vorzugsweise eine Verbindung ausgewählt, deren logP-Wert im Bereich von 1 bis 5 liegt. Ferner besteht die Wahrscheinlichkeit, dass eine organische Verbindung, die als Heteroatom ein Stickstoff- oder Sauerstoffatom enthält, ionisiert wird.
Eine zweite charakteristische Eigenschaft, mit der die Analyse unter Anwendung von MS erleichtert wird, besteht darin, dass sich die Verbindungen nicht gegenseitig stören. In einigen Fällen kommt es bei Anwesenheit eines Isotopenelements oder bei der Massenspektrometrie unter Verwendung eines Adduktions, eines Dehydratationsions oder dergleichen zu Störungen, selbst wenn die Massen der Verbindungen unterschiedlich sind. Um diesen Fall auszuschließen, ist es erstrebenswert, dass die Differenz zwischen den m/z-Werten 40 oder mehr beträgt. Wenn außerdem Verbindungen gleichzeitig ionisiert werden, obgleich sie unterschiedliche Massen aufweisen, besteht die starke Wahrscheinlichkeit, dass Störungen, die als Ionensuppression bezeichnet werden, auftreten. Bei der Enzymreaktion wird die Reaktionsgeschwindigkeit durch Erhöhung der Konzentration des Reaktionssubstrats gesteigert, so dass zu erwarten ist, dass die Konzentration des Reaktionssubstrats größer als die einer erfassten Verbindung wird und somit die Ionisation der erfassten Verbindung gehemmt wird.
Beim Enzym-Reaktionssystem des erfindungsgemäßen Analysenverfahrens unter Verwendung des enzymgekoppelten Immunoassays wird das Enzym an der festen Phase immobilisiert. Dabei sind das Enzymsubstrat und Salze oder organische Lösungsmittel, wie Reaktionsprodukte oder Pufferlösungen, vorhanden. Um die nachgewiesene Verbindung durch Chromatographie leicht vom Enzymsubstrat zu trennen, ist es erstrebenswert, dass sich die chemischen Eigenschaften deutlich unterscheiden. Beispielsweise handelt es sich in einem Fall, bei dem β-Galactosidase (ein glycolytisches Enzym) als Enzym und p-Nitrophenyl-β-galactosid als Enzymsubstrat verwendet werden, bei dem beim Nachweis verwendeten Reaktionsprodukt um p-Nitrophenol und bei dem vom Enzym erkannten Produkt um Galactose. Diese Komponenten lassen sich leicht durch hydrophobe Chromatographie, zum Beispiel an C18, aufgrund von deutlich verschiedenen Polaritäten trennen. Zu Beispielen für Verunreinigungen bei der Massenspektrometrie gehören Wasser oder organische Lösungsmittel, zum Beispiel Wasser oder Acetonitril, die als mobile Phase verwendet werden, sowie eine Puffer-Lösungskomponente, wie Ammoniak oder Ameisensäure oder ein Cluster, der durch Vereinigen von mehreren Molekülen davon gebildet wird; diese Produkte treten zusätzlich zu den von der Probe stammenden Verbindungen auf. Um die Bildung von Verunreinigungen zu vermeiden, ist es erstrebenswert, dass der m/z-Wert 150 oder mehr beträgt. Jedoch kann bei steigender Masse nicht angenommen werden, dass leicht mehrwertige Ionen erzeugt werden, so dass es bevorzugt ist, dass das Molekulargewicht der Verbindung 1000 oder weniger beträgt.
Im Hinblick auf die vorstehend beschriebene Konfiguration ist es beim erfindungsgemäßen Analysenverfahren unter Anwendung des enzymgekoppelten Immunoassays erstrebenswert, dass ein Enzym-Reaktionsprodukt, bei dem es sich um das durch die Enzymreaktion erzeugte MS-Analysenobjekt handelt, einen logP-Wert (Index der Hydrophobizität) von 1 bis 5 aufweist und dass die Verbindung ein Molekulargewicht von 150 bis 1000 besitzt. Ferner wird bei einem Triple-Quadrupol-Massenspektrometer eine Verbindung in einem zweiten Tripel-Quadrupol zersetzt, und die Analysengenauigkeit wird unter Ausnutzung der Tatsache, dass die Zersetzungsmuster für die einzelnen Verbindungen unterschiedlich sind, verbessert. In manchen Fällen besteht eine geringere Wahrscheinlichkeit, dass bei einem kleinen Molekül eine Zersetzung nicht leicht erfolgt, sowie dass bei einem großen Molekül die Zersetzung zu kompliziert ist. Eine stabile Zersetzung erfolgt leicht bei einer Struktur, bei der eine Mehrzahl von aromatischen Verbindungen über einen Linker, wie eine Einfachbindung von C-N oder C-O, verknüpft sind. Im Hinblick darauf ist es beim Analysenverfahren und bei der Analysenvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung erstrebenswert, dass es sich beim Enzym-Reaktionsprodukt, das Gegenstand der MS-Analyse ist, um ein Produkt mit einer Struktur handelt, bei der eine Mehrzahl von aromatischen Verbindungen über einen Linker, wie eine Einfachbindung von C-N oder C-O, verknüpft sind, und dass die Verbindung ein Molekulargewicht von 200 bis 600 aufweist. Beispielsweise wird als Enzym-Reaktionsprodukt Verapamil (C₂₇H₃₈O₄, Molekulargewicht 454,61) verwendet.
Ausführungsform 1
Nachstehend wird eine erste Ausführungsform des Analysenverfahrens und der Analysenvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung unter Bezugnahme auf 2 und 3 beschrieben.
Bei der vorliegenden Ausführungsform handelt es sich um ein Analysenverfahren, bei dem ein Antikörper, der spezifisch an einen an einer Festphase immobilisierten Analyten zu binden ist und ein daran gebundenes Enzym aufweist, an den Analyten gebunden wird, wobei eine Enzymreaktion zwischen dem an den Antikörper gebundenen Enzym und einem Enzymsubstrat hervorgerufen wird und eine massenspektrometrische Messung am Enzym-Reaktionsprodukt des Enzymsubstrats durchgeführt wird, um so die Anwesenheit oder Abwesenheit und die Konzentration des Analyten zu bestimmen. Ferner betrifft die vorliegende Ausführungsform eine Analysenvorrichtung, die eine Enzym-Reaktionseinrichtung umfasst, wobei ein Antikörper, der spezifisch an einen an einer Festphase immobilisierten Analyten zu binden ist und ein daran gebundenes Enzym aufweist, an den Analyten gebunden wird, wobei eine Enzymreaktion zwischen dem an den Antikörper gebundenen Enzym und einem Enzymsubstrat hervorgerufen wird, sowie eine massenspektrometrische Einrichtung, die eine massenspektrometrische Untersuchung an einem Enzym-Reaktionsprodukt des Enzymsubstrats durchführt und die Anwesenheit oder Abwesenheit und die Konzentration des Analyten bestimmt.
Die in 2 dargestellte automatische Analysenvorrichtung gemäß Ausführungsform 1 umfasst eine massenspektrometrische Einrichtung, die aus einem durch gestrichelte Linien angedeuteten LeiMS-Gerät 71 aufgebaut ist und weitere Bauelemente umfasst; jedoch werden in der vorliegenden Beschreibung Bauelemente, die zusätzlich zur massenspektrometrischen Einrichtung vorhanden sind, gemeinsam als Enzym-Reaktionseinrichtung bezeichnet. In der Enzym-Reaktionseinrichtung wird ein Antikörper, der spezifisch an einen an einer Festphase immobilisierten Analyten zu binden ist und ein daran gebundenes Enzym aufweist, an den Analyten gebunden, und der Ablauf einer Enzymreaktion zwischen dem an den Antikörper gebundenen Enzym und dem Enzymsubstrat wird veranlasst.
Wie in 2 dargestellt, wird in der Enzym-Reaktionseinrichtung eine bestimmte Menge einer Probe, wie Blutserum oder eine Standardlösung, von einem Probengefäß 21, das sich in einer Proben-Zufuhreinrichtung 20 befindet, in ein Reaktionsgefäß 31 auf einem Reaktionstisch 30 übertragen, wobei man sich der Proben-Dosiervorrichtung 22 bedient (S1 im Ablaufdiagramm von 3, was auch für die nachfolgenden Ausführungen gilt). Die Proben-Dosiervorrichtung 22, die sich zum Reaktionsgefäß 31 bewegt hat, wird unter Verwendung des Düsen-Reinigungsmechanismus 23 gereinigt. Rund um den Reaktionstisch 30 können eine Mehrzahl von Reaktionsgefäßen vorgehalten werden, und das Reaktionsgefäß 31 kann durch eine Drehbewegung des Reaktionstisches 30 zu einem beliebigen Arbeitsbereich bewegt werden. Ferner können am Reaktionstisch 30 eine Thermostatisiereinrichtung, eine Rühreinrichtung, eine Magnetsammeleinrichtung oder dergleichen vorgesehen sein. Das Reaktionsgefäß 31 auf dem Reaktionstisch 30 wird aus einem Reaktionsgefäß-Vorrat 41 durch eine Reaktionsgefäß-Übertragungseinrichtung 40 versorgt. In jedem Reaktionsgefäß ist ein spezifischer anti-Analyt-Antikörper 2 vorher an einen Analyten 3 gebunden und immobilisiert worden (S0).
Das die Probe enthaltende Reaktionsgefäß 31 auf dem Reaktionstisch 30 wird nach einer vorgegebenen Zeitspanne zum Arbeitsbereich einer Saugdüse 32 transportiert (S2) und nach der Umsetzung wird der Überstand abgesaugt und entfernt (S3). Die Saugdüse 32 wird unter Verwendung des Düsen-Reinigungsmechanismus 33 gereinigt. Sodann wird das Reaktionsgefäß 31 zu einem Arbeitsbereich einer Reinigungslösung-Zufuhrdüse 34 transportiert und eine Reinigungslösung wird zugesetzt (S4). Die Reinigungslösung-Zufuhrdüse 34 wird unter Verwendung eines Düsen-Reinigungsmechanismus 35 gereinigt. Das Reaktionsgefäß 31 wird mehrmals gereinigt, indem man zwischen dem Saugdüsen-Arbeitsbereich und dem Arbeitsbereich der Reinigungslösung-Zufuhrdüse wechselt (S4 und S5).
Das gereinigte Reaktionsgefäß 31 wird zum Arbeitsbereich einer Reagenz-Zufuhrdüse 50 transportiert und aus einem Reagenzbehälter 51 mit einem Komplex aus einer Markierung 4 und dem anti-Analyt-Antikörper 5 gefüllt (S6). Die Reagenz-Zufuhrdüse 50 wird unter Verwendung eines Düsen-Reinigungsmechanismus 52 gereinigt. Ein Reagenztisch 53 weist eine Mehrzahl von darauf aufbewahrten Reagenzbehältern 51 auf und ist mit einer Einrichtung zur Konstanthaltung der Temperatur oder einer Rühreinrichtung versehen. Das Reaktionsgefäß 31 wird nach einer bestimmten Zeitspanne zum Arbeitsbereich einer Saugdüse 32 transportiert (S7), und nach der Umsetzung wird der Überstand abgesaugt und entfernt (S8). Das Reaktionsgefäß 31 wird mehrmals gereinigt, indem man zwischen dem Saugdüsen-Arbeitsbereich und dem Arbeitsbereich der Reinigungslösung-Zufuhrdüse wechselt (S9 und S10).
Anschließend wird das Reaktionsgefäß 31 zum Arbeitsbereich einer Reagenz-Zufuhrdüse 50 transportiert und mit einem Komplex aus einer Markierungsbindungssubstanz 6 und einem Enzym 7 gefüllt (S11). Sodann wird das Reaktionsgefäß 31 nach Ablauf einer bestimmten Zeitspanne zum Arbeitsbereich einer Saugdüse 32 transportiert (S12)fernt (S13). Das Reaktionsgefäß 31 wird mehrmals gereinigt, indem man zwischen dem Saugdüsen-Arbeitsbereich und dem Arbeitsbereich der Reinigungslösung-Zufuhrdüse wechselt (S14 und S15).
Anschließend wird das Reaktionsgefäß 31 zum Arbeitsbereich einer Reagenz-Zufuhrdüse 50 transportiert und mit einem Enzymsubstrat 8 gefüllt (S16). Sodann wird das Reaktionsgefäß 31 nach Ablauf einer bestimmten Zeitspanne zum Arbeitsbereich eines Proben-Einspritzdüsenmechanismus 60 transportiert, eine bestimmte Menge einer Probe durchläuft eine LC/MS-Probeneinspritzeinrichtung 70, und die Analyse wird im LC/MS-Gerät 71, das eine massenspektrometrische Einrichtung umfasst, durchgeführt (S18). Der Proben-Einspritzdüsenmechanismus 60 wird unter Verwendung eines Reinigungsmechanismus 61 gereinigt. Sofern die Analyse nicht sofort nach Ablauf einer bestimmten Zeitspanne nach Füllung mit dem Enzymsubstrat 8 durchgeführt werden kann, wird das Reaktionsgefäß 31 durch die Reagenz-Zufuhrdüse 50 mit einer Lösung zum Stoppen der Enzymreaktion gefüllt, vorübergehend in einem Analysenprobengefäß 63 auf einem Analysenprobentisch 62 mittels des Proben-Einspritzdüsenmechanismus 60 gehalten und anschließend im LC/MS-Gerät 71, die eine massenspektrometrische Einrichtung umfasst, analysiert. Nach dem Einspritzen der Probe wird das Reaktionsgefäß 31 durch die Reaktionsgefäß-Transporteinrichtung 40 in die Aufnahmeeinrichtung 42 zur Aufnahme von gebrauchten Reaktionsgefäßen gebracht.
Mit der automatischen Analysenvorrichtung und dem Analysenverfahren der vorstehend beschriebenen Ausführungsform 1 ist es möglich, in hochempfindlicher Weise ein Analysenziel durch den enzymgekoppelten Immunoassay zu analysieren und in einfacher Weise die Analyse von unterschiedlichen Substanzen, wie Proteinen, unter Anwendung von MS durchzuführen.
Ausführungsform 2
Wie vorstehend ausgeführt, werden verschiedene Verfahren für enzymgekoppelte Immunoassays angewandt. Die Ausführungsform 2 betrifft im Gegensatz zum Analysenverfahren von Ausführungsform 1 eine Ausführungsform, bei der ein anti-Antianalyt-Antikörper zur Erkennung eines anti-Analyt-Antikörpers ohne Verwendung einer Markierung eingesetzt wird. 4 zeigt ein Ablaufdiagramm des Analysenverfahrens von Ausführungsform 2. In dem in 4 dargestellten Ablaufdiagramm bedeuten Bezugszeichen, die auch in 3 auftreten, die gleichen Vorgänge. Der vorliegende Betriebsablauf kann ebenfalls unter Verwendung der automatischen Analysenvorrichtung gemäß Darstellung in 2 ablaufen.
Wie in der gleichen Figur dargestellt, wird das Reaktionsgefäß 31, das mehrfach gereinigt wird (S4 und S5), dem Arbeitsbereich der Reagenz-Zufuhrdüse 50 zugeführt. In der vorliegenden Ausführungsform wird das Reaktionsgefäß 31 mit einem Komplex aus dem anti-Analyt-Antikörper 5 und dem Enzym 7 gefüllt (S19). Anschließend wird ähnlich wie bei der Ausführungsform 1 das Reaktionsgefäß 31 nach einer bestimmten Zeitspanne zum Arbeitsbereich der Ansaugdüse 32 transportiert (S12). Nach der Umsetzung wird der Überstand abgesaugt und entfernt (S13). Sodann wird das Reaktionsgefäß 31 mehrmals gereinigt, indem man zwischen dem Arbeitsbereich der Ansaugdüse und dem Arbeitsbereich der Zufuhrdüse für die Reinigungslösung wechselt (S14 und S15). Sodann wird das Reaktionsgefäß 31 zum Arbeitsbereich der Reagenz-Zufuhrdüse 50 transportiert und mit dem Enzymsubstrat 8 gefüllt. Die Enzymreaktion wird durchgeführt (S16). Das Reaktionsgefäß 31 wird nach einer bestimmten Zeitspanne zum Mechanismus 60 mit der Proben-Einspritzdüse transportiert (S17), eine bestimmte Menge einer Probe durchläuft die LC/MS-Probeneinspritzeinrichtung 70 und die Analyse wird im LC/MS-Gerät 71, d.h. einer massenspektrometrischen Einrichtung, durchgeführt (S18).
Gemäß der vorliegenden Ausführungsform wird keine Markierung verwendet. Somit ist es möglich, die Analysenverfahren zu vereinfachen. Ferner ist es ähnlich wie bei der Ausführungsform 1 möglich, ein Analysenziel durch den enzymgekoppelten Immunoassay mit hoher Empfindlichkeit zu analysieren und in einfacher Weise die Analyse von vielfältigen Substanzen, wie Proteinen, unter Anwendung von MS zu analysieren.
Nachstehend werden Analysenbeispiele beschrieben, wobei die Analysen unter Anwendung verschiedener vorstehend beschriebener Ausführungsformen durchgeführt werden.
Analysenbeispiel 1
Vor Durchführung der Analysenbeispiele 2 bis 5 wurde im Analysenbeispiel 1 Galactosidase als Enzym 7 mit p-Nitrophenyl-β-galactosid, 4-Methylumbelliferyl-β-galactosid und einem Verapamil-Derivat von β-Galactosid als Enzymsubstrat 8 umgesetzt. Die Reaktionsprodukte wurden mit LC/MS, d.h. der Massenspektrometrieeinrichtung und der spektralanalytischen Vorrichtung, analysiert. 4-Nitrophenol (C₆H₅NO₃, Molekulargewicht 139,11), bei dem es sich um eines der Enzym-Reaktionsprodukte handelt, lässt sich mit einer Nachweisempfindlichkeit, die ähnlich dem spektroskopischen Ergebnis von LC/MS ist, erfassen. 4-Methylumbelliferon (C₁₀H₈O₃, Molekulargewicht 176,171) eines der Reaktionsprodukte, lässt sich mit einer höheren Empfindlichkeit als bei spektroskopischer Bestimmung mit LC/MS erfassen. Ferner lässt sich Verapamil (C₂₇H₃₈O₄, Molekulargewicht 454,61), eines der Reaktionsprodukte, mit äußerst hoher Empfindlichkeit durch LC/MS erfassen.
Analysenbeispiel 2
Beim vorliegenden Analysenbeispiel handelt es sich um ein Beispiel mit Bezug zur Ausführungsform 1, die unter Bezugnahme auf 2 beschrieben wurde. Humanserumalbumin wurde als Analyt 3, d.h. die Probe, in Pufferlösung in einem Konzentrationsbereich von 50 pg/ml bis 20 ng/ml gelöst und 50 µl des erhaltenen Produkts wurden in das Reaktionsgefäß 31 gegeben, das mit einem anti-Humanserumalbumin-Antikörper, d.h. dem anti-Analyt-Antikörper 2, beschichtet war. Anschließend wurden 100 µl einer Lösung von mit Biotin markiertem anti-Humanserumalbumin-Antikörper, d.h. einem Komplex des anti-Analyt-Antikörpers 5 und der Markierung 4, in das Reaktionsgefäß 31 gegeben. Sodann wurde das Reaktionsgefäß eine Stunde inkubiert. Der Überstand wurde abgesaugt, und das Reaktionsgefäß 31 wurde dreimal mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung gereinigt. 100 µl einer Lösung eines Streptavidin-Galactosidase-Komplexes, d.h. eines Komplexes aus der Markierungsbindungssubstanz 6 und dem Enzym 7, wurde in das Reaktionsgefäß 31 gegeben. Das Gefäß wurde eine Stunde inkubiert. Sodann wurde der Überstand abgesaugt, und das Gefäß wurde dreimal mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung gereinigt. p-Nitrophenyl-β-galactosid und 4-Methylumbelliferyl-β-galactosid wurden als Enzymsubstrate 8 umgesetzt und die Reaktionsprodukte wurden durch LC/MS und die spektrometrische Analysenvorrichtung analysiert.
Analysenbeispiel 3
Das vorliegende Analysenbeispiel bezieht sich auf die unter Bezugnahme auf 2 beschriebene Ausführungsform 1. Humanserumalbumin wurde als Analyt 3, d.h. eine Probe, in einer Pufferlösung in einer Konzentration im Bereich von 50 pg/ml bis 20 ng/ml gelöst, und 50 µl des erhaltenen Produkts wurden in das Reaktionsgefäß 31 gegeben, das mit anti-Humanserumalbumin-Antikörper, d.h. dem anti-Analyt-Antikörper 2, beschichtet war. 100 µl einer Lösung von mit Biotin markiertem anti-Humanserumalbumin-Antikörper, d.h. einem Komplex der Markierung 4 und des anti-Analyt-Antikörpers 5, wurden zugesetzt. Sodann wurde das Reaktionsgefäß eine Stunde inkubiert. Anschließend wurde der Überstand abgesaugt, und das Reaktionsgefäß wurde dreimal mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung gereinigt. 100 µl/Vertiefung einer Lösung eines Streptavidin-Galactosidase-Komplexes, d.h. einem Komplex aus der Markierungsbindungssubstanz 6 und dem Enzym 7, wurden in das Reaktionsgefäß 31 gegeben, und das Reaktionsgefäß wurde eine Stunde inkubiert. Anschließend wurde der Überstand abgesaugt, und das Reaktionsgefäß wurde dreimal mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung gereinigt. Ein Verapamil-Derivat von β-Galactosid, d.h. das Enzymsubstrat 8, wurde umgesetzt, und die Reaktionsprodukte wurden durch Hochleistungs-Flüssigkeits-LC/MS analysiert.
Analysenbeispiel 4
Das vorliegende Analysenbeispiel bezieht sich auf die unter Bezugnahme auf 2 beschriebene Ausführungsform 1. Humanes C-reaktives Protein, d.h. der Analyt 3, wurde als Probe in einer Pufferlösung in einer Konzentration im Bereich von 50 pg/ml bis 16 ng/ml gelöst. 50 µl des erhaltenen Produkts wurden in das Reaktionsgefäß 31 gegeben, das mit einem anti-humanen, C-reaktiven Protein-Antikörper, d.h. dem anti-Analyt-Antikörper 2, beschichtet war. Das Reaktionsgefäß wurde zwei Stunden inkubiert. Sodann wurde der Überstand abgesaugt und das Reaktionsgefäß wurde fünfinal mit 200 µl in einer Reinigungslösung gereinigt. 50 µl eines biotinylierten anti-humanen, C-reaktiven Protein-Antikörpers, d.h. einem Komplex aus der Markierung 4 und dem anti-Analyt-Antikörper 5 wurden zugesetzt, und das Reaktionsgefäß wurde 30 Minuten inkubiert. Der Überstand wurde abgesaugt und das Reaktionsgefäß wurde fünfmal mit 200 µl einer Reinigungslösung gereinigt. 50 µl einer Lösung eines Streptavidin-Galactosidase-Komplexes, d.h. einem Komplex der Substanz 6 mit daran gebundener Markierung und dem Enzym 7, wurden in das Reaktionsgefäß 31 gegeben. Sodann wurde das Reaktionsgefäß 30 Minuten inkubiert. Anschließend wurde der Überstand abgesaugt, und das Reaktionsgefäß wurde fünfmal mit 200 µl einer Reinigungslösung gereinigt. p-Nitrophenyl-β-galactosid, 4-Methylumbelliferyl-β-galactosid und ein Verapamil-Derivat von β-Galactosid, d.h. die Enzymsubstrate 8, wurden jeweils damit umgesetzt. Die Reaktionsprodukte wurden durch Hochleistungs-Flüssigkeits-LC/MS und die spektrometrische Analysenvorrichtung analysiert.
Analysenbeispiel 5
Das vorliegende Analysenbeispiel bezieht sich auf die unter Bezugnahme auf 3 beschriebene Ausführungsform 2. Kaninchen-IgG wurde als Analyt 3, d.h. eine Probe, in einer Pufferlösung in einem Konzentrationsbereich von 2 pg/ml bis 100 ng/ml gelöst. Magnetische Teilchen, d.h. eine feste Phase 1, die mit anti-Kaninchen-IgG-Antikörper, d.h. dem anti-Analyt-Antikörper 2, beschichtet waren, wurden in 100 µl der Lösung suspendiert. Das erhaltene Produkt wurde eine Stunde inkubiert. Die magnetischen Teilchen wurden mit einem Magneten gesammelt, der Überstand wurde abgesaugt, und anschließend wurden die Teilchen fünfinal mit 200 µl einer Reinigungslösung gereinigt. Sodann wurden 100 µl eines mit Galactosidase konjugierten anti-Kaninchen-IgG-Antikörpers, d.h. einem Komplex aus dem anti-Analyt-Antikörper 5 und dem Enzym 7, zugesetzt. Das erhaltene Produkt wurde eine Stunde inkubiert. Die Teilchen wurden mit einem Magneten gesammelt und anschließend fünfinal mit 200 µl einer Reinigungslösung gereinigt. p-Nitrophenyl-β-galactosid, 4-Methylumbelliferyl-β-galactosid und ein Verapamil-Derivat von β-Galactosid, d.h. Enzymsubstrate 8, wurden darin umgesetzt. Die Reaktionsprodukte wurden durch LC/MS und die spektrometrische Analysenvorrichtung analysiert.
Mit dem Analysenverfahren und der Analysenvorrichtung der vorliegenden Erfindung, die vorstehend beschrieben wurden, lassen sich klinische Testgegenstände stark ausweiten und die Genauigkeit bei der Analyse dieser klinischen Testgegenstände lässt sich verbessern, indem die Empfindlichkeit der Analyse der biologischen Komponenten stark erhöht wird.
Ferner ist die vorliegende Erfindung nicht auf die vorstehend beschriebenen Ausführungsformen beschränkt, sondern umfasst verschiedene Modifikationen. Die vorstehend ausführlich beschriebenen Ausführungsformen dienen lediglich einem leichteren Verständnis der vorliegenden Erfindung. Die Konfiguration einer bestimmten Ausführungsform kann teilweise durch die Konfiguration einer anderen Ausführungsform ersetzt werden. Ferner können Konfigurationen anderer Ausführungsformen zur Konfiguration einer bestimmten Ausführungsform hinzugefügt werden. Schließlich können bei Teilen einer Konfiguration der einzelnen Ausführungsformen bestimmte Merkmale hinzugefügt, weggelassen oder durch andere Merkmale ersetzt werden.
Bezugszeichenliste

1: Festphase
2: anti-Analyt-Antikörper
3: Analyt
4: Markierung
5: anti-Analyt-Antikörper
6: Markierungsbindungssubstanz
7: Enzym
8: Enzymsubstrat
9: Enzym-Reaktionsprodukt, das als Hauptanalysenziel dient
10: Enzym-Reaktionsprodukt, das nicht als Hauptanalysenziel dient
20: Probenzufuhreinrichtung
21: Probengefäß
22: Probendosiervorrichtung
23: Düsenreinigungsmechanismus
30: Reaktionstisch
31: Reaktionsgefäß
32: Ansaugdüse
33: Düsenreinigungsmechanismus
34: Reinigungslösung-Zufuhrdüse
35: Düsenreinigungsmechanismus
40: Reaktionsgefäß-Transporteinrichtung
41: Reaktionsgefäßvorrat
42: Aufnahmeeinrichtung für verbrauchte Reaktionsgefäße
50: Reagenzzufuhrdüse
51: Reagenzgefäß
52: Düsenreinigungsmechanismus
53: Reagenztisch
60: Proben-Einspritzdüsenmechanismus
61: Düsenreinigungsmechanismus
62: Analysenprobentisch
63: Analysenprobengefäß
70: LC/MS-Probeneinspritzeinrichtung
71: LC/MS

Claims

Analysenverfahren zur Messung eines Analyten (3), wobei ein Analyt (3) an einer Festphase (1) immobilisiert wird, wobei ein Antikörper (5), an den eine Markierung, die spezifisch an den an der Festphase (1) immobilisierten Analyten (3) zu binden ist, gebunden ist, an den Analyten (3) gebunden wird, wobei eine Markierungsbindungssubstanz (6) mit daran gebundener Galactosidase an die Markierung gebunden wird, wobei eine Enzymreaktion zwischen der an die Markierungsbindungssubstanz (6) gebundenen Galactosidase und einem Enzymsubstrat (8) hervorgerufen wird und wobei eine massenspektrometrische Messung am Enzym-Reaktionsprodukt (9) des Enzymsubstrats (8) durchgeführt wird, um so die Anwesenheit oder Abwesenheit und die Konzentration des Analyten (3) zu bestimmen.
Analysenverfahren nach Anspruch 1, wobei als Markierung und als Markierungsbindungssubstanz (6) Biotin und Avidin verwendet werden.
Analysenverfahren nach Anspruch 1, umfassend: eine Stufe zur Immobilisierung des Analyten (3) an der Festphase (1); eine Stufe zur Bindung des Antikörpers, der spezifisch an den Analyten (3) zu binden ist und der daran gebundene Galactosidase aufweist, an den Analyten (3); eine Enzym-Reaktionsstufe unter Zugabe des Enzymsubstrats (8) und Herbeiführung der Reaktion des Enzymsubstrats (8) mit der Galactosidase für eine vorbestimmte Zeitspanne; und eine Analysenstufe, bei der ein Massenspektrometer zur Analyse des erhaltenen Enzym-Reaktionsprodukts (9) veranlasst wird.
Analysenverfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 und 3, wobei es sich beim Enzym-Reaktionsprodukt (9), das als Analysenziel dient, um eine Verbindung handelt, bei der der logP-Wert, der als Hydrophobizitätsindex dient, 1 bis 5 beträgt und deren Molekulargewicht 150 bis 1000 beträgt.
Analysenverfahren nach Anspruch 4, wobei das Enzym-Reaktionsprodukt (9) eine Struktur aufweist, bei der eine Mehrzahl von aromatischen Verbindungen über einen Linker, der eine Einfachbindung von C-N oder C-O umfasst, verknüpft sind, und die Verbindung ein Molekulargewicht von 200 bis 600 aufweist.
Analysenvorrichtung zur Messung eines Analyten (3), wobei die Vorrichtung Folgendes umfasst: eine Enzym-Reaktionseinrichtung, die einen Analyten (3) an einer Festphase (1) immobilisiert; die einen Antikörper, der spezifisch an einen an der Festphase (1) immobilisierten Analyten (3) zu binden ist, an den Analyten (3) bindet; die eine Markierungsbindungssubstanz (6) mit daran gebundener Galactosidase an die Markierung bindet; und die eine Enzymreaktion zwischen der an die Markierungsbindungssubstanz (6) gebundenen Galactosidase und einem Enzymsubstrat (8) hervorruft; und eine massenspektrometrische Einrichtung, die eine massenspektrometrische Messung am Enzym-Reaktionsprodukt (9) des Enzymsubstrats (8) durchführt, wobei die Analysenvorrichtung die Anwesenheit oder Abwesenheit und die Konzentration des Analyten (3) misst.
Analysenvorrichtung nach Anspruch 6, wobei als Markierung und als Substanz mit daran gebundener Markierung Biotin und Avidin verwendet werden.
Analysenvorrichtung nach Anspruch 6, wobei die Enzym-Reaktionseinrichtung den Analyten (3) an der Festphase (1) immobilisiert, den Antikörper, der spezifisch an den Analyten (3) zu binden ist und der daran gebundene Galactosidase aufweist, an den Analyten (3) bindet, das Enzymsubstrat (8) zusetzt und eine Reaktion des Enzymsubstrats (8) mit der Galactosidase für eine vorbestimmte Zeitspanne hervorruft, um das Enzym-Reaktionsprodukt (9) zu bilden, und wobei die massenspektrometrische Einrichtung ein Quadrupol-Massenspektrometer zur Analyse des erhaltenen Enzym-Reaktionsprodukts (9) veranlasst.
Analysenvorrichtung nach einem der Ansprüche 6, 7 und 8, wobei es sich beim Enzym-Reaktionsprodukt (9), das als Analysenziel dient, um eine Verbindung handelt, deren logP-Wert, der als Hydrophobizitätsindex dient, 1 bis 5 beträgt und deren Molekulargewicht 150 bis 1000 beträgt.
Analysenvorrichtung nach Anspruch 9, wobei das Enzymreaktionsprodukt eine Struktur aufweist, bei der eine Mehrzahl von aromatischen Verbindungen durch einen Linker, der eine Einfachbindung von C-N oder C-O umfasst, verknüpft sind, und es sich um eine Verbindung mit einem Molekulargewicht von 200 bis 600 handelt.