DE112014001433T5

DE112014001433T5 - Verfahren zur Bestimmung derivatisierter Analyte in einem separierten biologischen Fluid

Info

Publication number: DE112014001433T5
Application number: DE112014001433.8T
Authority: DE
Inventors: Fred Regnier; Tim Woenker; Jiri Adamec; Jinhee Kim; Richard Zoltek; Wenchu Yang
Original assignee: NOVILYTIC LLC
Current assignee: NOVILYTIC LLC
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-14
Publication date: 2016-01-14
Also published as: JP2016516198A; CA2906589A1; WO2014152502A1; US20140273260A1; US9068995B2

Abstract

Die vorliegende Erfindung umfasst Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart, Menge oder Konzentration von Analyten von Interesse, einschließlich Vitamin D und anderen Secosteroiden, aus biologischen Proben, und zwar durch die Derivatisierung mit verbesserter Geschwindigkeit und Leichtigkeit der Analyse und verbesserte Empfindlichkeit gegenüber Massenspektrometrie. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart, Menge oder Konzentration von Analyten von Interesse, einschließlich Vitamin D und anderen Secosteroiden, aus humanem Vollblut, durch die Derivatisierung und unter Verwendung einer Plasmasammelgerätschaft, um das Sammeln, Abtrennen und Präparieren der Probe zur Derivatisierung und Analyse zu erleichtern.

Description

Querverweise auf verwandte Anmeldungen:
Diese Anmeldung beansprucht Priorität bzgl. und ist verwandt mit der U.S.-Anmeldung Seriennr. 13/833 402, A Method for Determining Derivatized Analytes in a Separated Biological Fluid, eingereicht am 15. März 2013 von Fred E. Regnier, Jiri Adamec, Jinhee Kim, R. P. Zoltek, T. E. Woenker und Wenchu Yang.
Stellungnahme bezüglich staatlich geförderter Forschung oder Entwicklung:
Die vorliegende Erfindung wurde mit staatlicher Förderung unter der Bewilligungs-Nr. 1R43GM97798-1, zugeteilt durch die Nationalen Gesundheitsbehörden (National Institutes of Health, NIH), gemacht. Die Regierung hält bestimmte Rechte an dieser Erfindung.
Technisches Gebiet
Wir haben in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung von derivatisierten Analyten, genauer gesagt von Secosteroiden und noch genauer gesagt von Vitamin D, in einem separierten biologischen Fluid gefunden, wodurch eine signifikante Ersparnis an Zeit, Unannehmlichkeiten und Kosten bei solchen Bestimmungen eintritt und wodurch weiter die Nachweisbarkeit solcher derivatisierten Analyte durch gängige quantitative analytische Verfahren wie Massenspektrometrie verbessert wird.
Stand der Technik
Vitamin D (VD) ist eine für das menschliche Überleben unerlässliche Substanz, die eine wichtige Rolle bei der Calcium- und Phosphor-Absorption und Knochenmobilisierung spielt. Vitamin D wird entweder in der menschlichen Haut in einer Form produziert, die als Vitamin D₃ (Cholecalciferol, VD₃) bekannt ist, oder es wird über die Ernährung aufgenommen, in einer als Vitamin D₂ (Ergocalciferol, VD₂) bekannten Form. Sowohl VD₃ als auch VD₂ erfahren eine Aktivierung durch ihre Hydroxylierung in der Leber (25OHVD₃ und 25OHVD₂) und werden weiter durch zusätzliche Hydroxylierung in den Nieren zu 1,25(OH)₂VD₃, 24,25(OH)₂VD₃, 1,25(OH)₂VD₂ und 24,25(OH)₂VD₂ metabolisiert.
Typischerweise wird eine Messung von Vitamin D in Menschen durch Messung der VD-Metaboliten statt der inaktiven VD-Vorläuferstoffe vorgenommen. Auf die Metabolite 25OHVD₃, 1,25(OH)₂VD₃, 24,25(OH)₂VD₃,25OHVD, 1,25(OH)₂VD₂ und 24,25(OH)₂VD₂ sowie andere VD-Metabolite wird hierin im Allgemeinen als "Vitamin D oder VD" Bezug genommen.
Da die Vitamin-D-Spiegel in Menschen direkt durch die Funktion der Nieren und der Leber beeinflusst werden und da die Vitamin-D-Spiegel die Regulierung von Calcium und Phosphor direkt beeinflussen, ist die Fähigkeit, Vitamin D im Blut zu messen, wichtig für die Diagnose und Untersuchung einer breiten Auswahl an Krankheiten, einschließlich Krankheiten der Knochen, Nieren und der Leber. Viele andere Analyten in der weitgefassten Kategorie der Secosteroide sind ähnlich wichtig für diagnostische Zwecke.
In der Vergangenheit sind die Blutspiegel von Secosteroiden einschließlich von zum Beispiel Vitamin D aus biologischen Proben durch Verfahren bestimmt worden, die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, Massenspektrometrie, kompetitive Proteinbindungsassays oder andere Quantifizierungstechniken wie Enzymassays, Immunassays, chemische kolorimetrische Assays oder Fluoreszenzmarkierung umfassen. Im Fachbereich bekannte Verfahren umfassen weiterhin Verfahren zur Derivatisierung von Analyten unter Verwendung von Cookson-Typ-Reagenzien wie PTAD, um ein derivatisiertes Secosteroid oder Vitamin-D-Metabolite zu erzeugen, Reinigen oder Extrahieren dieser Analyte unter Verwendung von Flüssigkeitschromatographie und Analyse der gereinigten Proben bezüglich Mengen oder Konzentrationen der Analyte unter Verwendung von Massenspektrometrie. Aktuellen Vitamin-D-Analyseverfahren mangelt es oft an der Empfindlichkeit und Spezifität, die zur Bearbeitung fachlich drängender analytischer Probleme erforderlich sind, insbesondere Ansätze zur Feststellung der Gewebeverteilung der vielen Formen von Vitamin D. Im Fachbereich bekannte kommerziell erhältliche Kit-Assays ermöglichen die Analyse von 25(OH)D bei hohem Durchsatz, doch nicht von Vitamin D, und die laborübergreifende Leistung dieser Kits ist schlecht. Im Fachbereich bekannte Kits bringen im Allgemeinen ein Extraktionsverfahren aus dem Serum zur Anwendung, basierend auf Acetonitril, gefolgt von Säulentrennung zur Abtrennung von 25(OH)D von anderen Metaboliten. Kits, die dieses Verfahren zur Anwendung bringen, waren nicht imstande, 25(OH)D₃ und 25(OH)D₂ genau und getrennt zu messen.
Ebenfalls im Fachbereich bekannt ist die Verwendung von Flüssigkeitschromatographie, insbesondere Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) gekoppelt mit Massenspektrometrie (LC-MS). Dieses Verfahren bietet erhöhte Empfindlichkeit und Selektivität gegenüber Kits, insbesondere wenn chemische Ionisation bei Atmosphärendruck (APCI) in Kombination mit einer Technik zur Mehrfachreaktionsüberwachung (Multiple Reaction Monitoring, MRM) eingesetzt wird. Im Fachbereich bekannten LC-MS-Techniken, die auf APCI beruhen, haften allerdings auch mehrere Mängel an. Insbesondere führt APCI zur vorzeitigen Fragmentierung von Vitamin-D-Molekülen während der Ionisierung, was die Qualität und Empfindlichkeit der Analyse verringert und zu einer höheren Variabilität mit hohen LOQs beiträgt.
Im Fachbereich bekannte Verfahren sind darüber hinaus nicht in der Lage, zufriedenstellende Werte von Ionisierungseffizienz für niedrige (fmol-)Spiegel von einigen Secosteroid-Analyten, die in biologischen Matrizen zu erwarten sind, zu entwickeln. Obwohl es Ansätze gegeben hat, Elektrospray-Ionisation (ESI) in LC-MS zu verwenden, um diesen Problempunkt anzugehen, ist die Wirksamkeit von ESI vom Analyt abhängig, und die Struktur von mit Vitamin D verwandten Molekülen lässt vermuten, dass sie während ESI nicht leicht protonieren würden, was, wenn überhaupt, nur zu einer schlechten Detektion führen würde.
Die derzeit im Fachbereich bekannten Verfahren zur Bestimmung von Secosteroid-Spiegeln in biologischen Proben leiden an einer Anzahl an weiteren Nachteilen, einschließlich der Zeitdauer, die zur Vervollständigung des Assays benötigt wird, des Genauigkeitsmaßes, der Empfindlichkeit und der Kosten. Zum Beispiel ist ein im Fachbereich üblicher Ansatz für die Extraktion von Vitamin D und seinen Isoformen die Deproteinisierung einer Probenlösung, von der man annimmt, dass sie Vitamin D enthält, wobei eine solche Deproteinisierung für die Freisetzung von Vitamin-D-Metaboliten angepasst wäre, die an Proteine innerhalb der Probenlösung gebunden sind. Dieses freigesetzte Vitamin D kann dann unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels extrahiert oder unter Verwendung eines Cookson-Typ-Reagenzes derivatisiert werden. Die Durchführung einer Flüssig:Flüssig-Extraktion und/oder eines Derivatisierungsprozesses dieser Art dauert typischerweise recht lange und sie erfordert ein relativ großes Volumen an verfügbarer Probenlösung, um ein ausreichendes Volumen an extrahiertem Vitamin D zu erzeugen, das unter Verwendung von chromatographischen und/oder MS-Trennungs- und Analyse-Techniken analysiert wird. Solche traditionellen Verfahren zur Durchführung von Assays sind darüber hinaus arbeitsintensiv, da sie Personal zur manuellen Durchführung einer Reihe vorangehender Aufgabenschritte wie Extraktion, Zentrifugation, Abdampfen und Derivatisierung benötigen, bevor die Probe getrennt oder gereinigt und schließlich bezüglich der Spiegel des gewünschten Analyten analysiert werden kann. Weiterhin ist die Derivatisierung mit Cookson-Typ-Reagenzien an sich ein vergleichsweise langwieriges Verfahren, das routinemäßig mehrere Stunden dauert.
Es ist im Fachbereich bekannt, die Trennung von Plasma unter Verwendung eines Plasmatrenngeräts zu rationalisieren. Ein repräsentatives Plasmatrenngerät wird zum Beispiel im US-Patent Nr. 4 839 296 beschrieben. Es ist ebenfalls im Fachbereich bekannt, quantitative Trennungs-, Reinigungs- oder Analysetechniken auf Plasma anzuwenden, das unter Verwendung eines PSD getrennt worden ist, wie LC, MS, LC-MS und HPLC-MS, wie beschrieben durch die US-Patentveröffentlichung Nr. 2012-20318971 . Obwohl sie möglicherweise die Wirksamkeit der Verfahren zur Analyse von derivatisierten Secosteroiden und Vitamin-D-Analyten verbessern, erzielen diese im Fachbereich bekannten Techniken nicht die Ersparnisse bei Zeit, Kosten und Effizienz und erreichen auch nicht die verbesserte Detektionsempfindlichkeit bei MS, wie das hierin beschriebe Verfahren es tut.
Zusammenfassung und Ziel der Erfindung
Entsprechend ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen zur Untersuchung biologischer Proben bezüglich der Spiegel, Mengen oder Konzentrationen von Analyten, einschließlich insbesondere von Secosteroiden und noch genauer gesagt Vitamin D, und zwar mit verbesserter Genauigkeit und Empfindlichkeit und ohne den Bedarf an langwierigen und arbeitsintensiven Zubereitungsschritten vor der Analyse. Es es darüber hinaus ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Untersuchung biologischer Proben für Vitamin D mit einer verringerten Anzahl an Schritten bereitzustellen, was zu Ersparnissen bei Zeit, Kosten und Effizienz bei der Durchführung dieser Analysen führt.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ermittelt die Gegenwart, Konzentration oder Menge von Analyten von Interesse in einer Probe eines biologischen Fluids, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: Sammeln eines biologischen Fluids; Abtrennen von flüssigen Bestandteilen von dem biologischen Fluid; Aliquotieren bzw. Aufteilen der Bestandteile der Flüssigkeit in Aliquote; Derivatisierung der Analyte innerhalb der Probe unter Verwendung eines Derivatisierungsmittels; Übertragen der Probe in ein Präparationsgefäß; Fraktionierung der derivatisierten Probe; und Analysieren der Analyte der Probe.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung umfasst darüber hinaus die Messung der Gegenwart, Menge oder Konzentration von Analyten in einer Blutprobe durch die folgenden Schritte: Sammeln einer Vollblutprobe; Abtrennen einer Plasmaprobe aus der Vollblutprobe; Sammeln der Plasmaprobe auf einer Sammeloberfläche; Trocknenlassen der Plasmaprobe auf der Sammeloberfläche; Übertragen der Sammeloberfläche zu einem Präparationsgefäß; Zugabe eines Derivatisierungsmittels zur Derivatisierung der Analyte, die in der Plasmaprobe vermutet werden; Fraktionierung der derivatisierten Probe; und Analysieren der fraktionierten derivatisierten Probe bezüglich der Gegenwart, Menge oder Konzentration von Analyten.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet vorzugsweise ein Plasmatrenngerät oder PSD, das eine Vorrichtung umfasst, die eine Plasmaprobe von vorbestimmtem Volumen aus einer genügend großen Vollblutprobe, die auf die Oberfläche des PSD aufgebracht wird, trennt und in Aliquote teilt bzw. aliquotiert. Ein PSD umfasst im Allgemeinen ein entfernbares Behälterbauteil, ein Bluteinleitungsbauteil im Behälterbauteil, ein Ausbreitungsschichtbauteil in Verbindung mit dem Bluteinleitungsbauteil, ein semipermeables Abtrennungsbauteil in Verbindung mit dem Ausbreitungsschichtbauteil und ein Sammelreservoir von einem vorgegebenen Volumen in Verbindung mit dem semipermeablen AbAbtrennungsbauteil, wobei, sobald eine Vollblutprobe auf dem Bluteinleitungsbauteil platziert wird, sich das Plasma aus der Probe durch das Ausbreitungsschichtbauteil auf dem AbAbtrennungsbauteil ausbreitet, durch das Abtrennungsbauteil getrennt wird und in einem vorbestimmten Volumen durch das Sammelreservoir aufgefangen wird. Das Sammelreservoir kann darüber hinaus wahlweise ein Bauteil mit absorbierendem Material enthalten oder umfassen, welches im Wesentlichen die gesamte gesammelte Plasmaprobe absorbiert. Das Sammelreservoir kann für eine bequeme Isolierung der gesammelten Plasmaprobe entfernt werden. Die gesammelte Plasmaprobe kann dann für die weitere Verarbeitung in ein Präparationsgefäß übertragen werden oder wahlweise kann ein Bauteil mit absorbierendem Material oder eine "Sammelscheibe", das bzw. die eine gesammelte Plasmaprobe im Wesentlichen absorbiert hat, dergestallt übertragen werden. Ein PSD kann wahlweise für die Sammlung einer anderen flüssigen oder verflüssigten biologischen Probe verwendet werden, einschließlich zum Beispiel Blutbestandteile, Speichel, Samen, Rückenmarksflüssigkeit, Urin, Tränen und homogenisierte oder extrahierte Bioproben (d.h. aus einem ganzen Organismus, Organ, Gewebe, Haar oder Knochen).
Diese und andere Vorteile werden in den unten beschriebenen Verfahren bereitgestellt und noch weitere Vorteile der hierin beanspruchten Verfahren werden einer Fachperson offenkundig sein.
Zu lösendes technisches Problem
Ein Nachteil von Verfahren zum Nachweis ausgewählter derivatisierter Analyte in Blut oder anderen biologischen Proben ist die relativ lange Zeit, die für die Probenvorbereitung benötigt wird. Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Nachweis ausgewählter derivatisierter Analyte in Blut oder anderen biologischen Proben durch Massenspektrometrie mit einem wesentlich verringerten Bedarf an Zeit und arbeitsintensiven Vorbereitungsschritten wie Extraktion, Zentrifugation und Abdampfen bereit. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung stellt weiterhin eine verbesserte Derivatisierungszeit für Analyte bereit, die untersucht werden sollen. Vorzugsweise sind solche Analyte Secosteroide. Noch stärker bevorzugt sind solche Analyte Metabolite von Vitamin D. Am stärksten bevorzugt werden die Schritte des Verfahrens der vorliegenden Erfindung zumindest teilweise über die Verwendung eines Plasmatrenngeräts oder PSD durchgeführt.
Ein weiterer Nachteil von im Fachbereich bekannten Verfahren ist die vergleichsweise schlechte Empfindlichkeit von MS und LC-MS in Bezug auf VD und anderen Secosteroiden. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ermöglicht eine verbesserte Detektionsempfindlichkeit bei MS und LC-MS für VD und andere Secosteroide.
Lösung für das technische Problem und vorteilhafte Effekte der Erfindung
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung überwinden die im Fachbereich bekannten Mängel durch den Einsatz eines PSD, das eine Vorrichtung umfasst, die eine Plasmaprobe von vorbestimmtem Volumen aus einer genügend großen Vollblutprobe, die auf die Oberfläche des PSD aufgebracht wird, trennt und aliquotiert. Ein PSD umfasst im Allgemeinen ein entfernbares Behälterbauteil, ein Bluteinleitungsbauteil im Behälterbauteil, ein Ausbreitungsschichtbauteil in Verbindung mit dem Bluteinleitungsbauteil, ein semipermeables Abtrennungsbauteil in Verbindung mit dem Ausbreitungsschichtbauteil und ein Sammelreservoir von einem vorgegebenen Volumen in Verbindung mit dem semipermeablen Abtrennungsbauteil, wobei, sobald eine Vollblutprobe auf dem Bluteinleitungsbauteil platziert wird, Plasma aus der Probe durch das Ausbreitungsschichtbauteil zu dem Abtrennungsbauteil gelangt, durch das Abtrennungsbauteil getrennt wird und in einem vorbestimmten Volumen durch das Sammelreservoir aufgefangen wird. Das Sammelreservoir kann darüber hinaus wahlweise ein Bauteil mit absorbierendem Material oder eine Sammelscheibe enthalten oder umfassen, welches bzw. welche im Wesentlichen die gesamte gesammelte Plasmaprobe absorbiert. Das Sammelreservoir oder die Sammelscheibe kann für eine bequeme Isolierung der gesammelten Plasmaprobe entfernt werden. Die gesammelte Plasmaprobe kann dann für die weitere Verarbeitung in ein Präparationsgefäß übertragen werden, oder wahlweise kann ein Bauteil mit absorbierendem Material, das eine gesammelte Plasmaprobe im Wesentlichen absorbiert hat, dorthin übertragen werden. Ein PSD kann wahlweise für die Sammlung einer anderen flüssigen oder verflüssigten biologischen Probe verwendet werden, einschließlich zum Beispiel Blutbestandteile, Speichel, Samen, Rückenmarksflüssigkeit, Urin, Tränen und homogenisierte oder extrahierte Bioproben (d.h. aus einem ganzen Organismus, Organ, Gewebe, Haar oder Knochen).
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung überwinden darüber hinaus im Fachbereich bekannte Mängel bei der Detektionsempfindlichkeit durch den Einsatz von solchen Verbindungen als Derivatisierungsmittel, die eine positiv geladene Gruppe enthalten, wie vorzugsweise ein primäres Amin, und weiterhin einen oder mehrere Triazolidin-Ring(e) enthalten. Dort wo im Fachbereich bekannte Cookson-Typ-Derivatisierungsmittel einen Triazolinring enthalten, enthalten die Derivatisierungsmittel gemäß der vorliegenden Erfindung einen oder mehrere Triazolidinring(e). Derivatisierungsmittel gemäß der vorliegenden Erfindung verleihen dem derivatisierten Analyt eine permanente positive Ladung, was eine genauere und empfindlichere Detektion des derivatisierten Analyts durch Massenspektrometrie ermöglicht. Das Derivatisierungsmittel ist ein 4-substituiertes 1,2,4-Triazolidin-3,5-dion oder ein anderes funktionell äquivalentes Mittel. Bevorzugte Derivatisierungsmittel umfassen 4-(1-Methyl-4-pyrindinylmethyl)-1,2,4-triazolidin-3,5-dion, 4-Phenyl-1,2,4-triazolidin-3,5-dion und 4-Ferrocenylmethyl-1,2,4-triazolidin-3,5-dion und ihre Isomere, Isotope und Analoga.
In einigen Ausführungsformen umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung die Bestimmung der Gegenwart, Konzentration oder Menge von Vitamin D in einer Vollblutprobe, umfassend die folgenden Schritte: Sammeln einer Vollblutprobe; Abtrennen einer Plasmaprobe von der Vollblutprobe; Aufteilen der Plasmaprobe in Aliquote; Derivatisierung des Vitamin D innerhalb der Plasmaprobe unter Verwendung eines Derivatisierungsmittels; Übertragen der Probe in ein Präparationsgefäß; Fraktionierung der Probe; und Analysieren des Vitamin D innerhalb der Probe. Am stärksten bevorzugt umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung die Verwendung eines PSD, das, wenn Vollblut der Bluteinführungsfläche zugeführt wird, eine Plasmaprobe von vorbestimmtem Volumen in das Sammelreservoir abtrennt und aliquotiert. Das Sammelreservoir des PSD kann wahlweise als eine Sammeloberfläche für die Plasmaprobe dienen. Die Teile eines PSD, wie das Blutbehälterbauteil, das semipermeable Bauteil, das Sammelreservoir oder das Bauteil mit absorbierendem Material können mit einem Derivatisierungsmittel behandelt werden, was dazu führt, dass die gesammelte Plasmaprobe eine Derivatisierung im Sammelreservoir erfährt, ohne die Plasmaprobe zunächst aus dem Sammelreservoir entfernen zu müssen. Das Sammelreservoir kann in einem Sammelreservoir platziert werden, wie einem Röhrchen oder einem Glasfläschchen, um eine Extraktion oder Derivatisierung durchzuführen. Das Trennen, Aliquotieren und die Einleitung der Derivatisierung können, obwohl sie unterscheidbare Operationen sind, praktisch gleichzeitig erfolgen.
Verfahren im Umfang der vorliegenden Erfindung können darüber hinaus im Fachbereich bekannte Mängel überwinden, durch das Erhöhen der MS- und LC-MS-Detektionsempfindlichkeit durch Zugabe eines internen Standards zu einer oder mehreren Plasmaprobe(n), um eine höhere Präzision beim Nachweis der Gegenwart, Menge oder Konzentration von Analyten von Interesse unter Verwendung von Massenspektrometrie zuzulassen. Interne Standards umfassen isotopenmarkierte kodierte Versionen von Vitamin D und seinen Isoformen oder isotopenmarkierte Derivatisierungsmittel, die zur Bildung isotopenkodierter interner Standards von derivatisierten Analyten verwendet werden. Hierin sollen "markiert" und "kodiert" austauschbar verwendet werden. Plasmaproben, Fluide oder verflüssigte Proben können zu jedem beliebigen Zeitpunkt vor der Analyse mit internen Standards behandelt werden. Falls der interne Standard ein Isotop eines Analyten ist, den in der Plasmaprobe zu finden erwartet wird, wird die Plasmaprobe vor der Derivatisierung vorzugsweise mit dem internen Standard behandelt. Am stärksten bevorzugt wird ein PSD verwendet und eines oder mehrere aus Blutbehälterbauteil, semipermeablen Membran, Sammelreservoir oder Bauteil mit absorbierendem Material des PSD werden im Voraus mit einem internen Standard beladen, so dass die Plasmaprobe mit einem solchen internen Standard behandelt wird, während sie durch das PSD gesammelt, getrennt oder aliquotiert wird. Wenn ein PSD mit einem internen Standard vor-beladen wird, der ein isotopenmarkiertes Derivatisierungsmittel ist, kann die Plasmaprobe eine Derivatisierung im Sammelreservoir erfahren, ohne die Plasmaprobe zunächst aus dem Sammelreservoir entfernen zu müssen. Auch kann der interne Standard direkt auf dem Sammelreservoir aufgebracht werden, vor oder nach der Sammlung des Plasmas. Das Trennen, Aliquotieren, Einbringen eines internen Standards und die Einleitung der Derivatisierung können, obwohl sie unterscheidbare Operationen sind, praktisch gleichzeitig erfolgen.
In Ausführungsformen hiervon, in denen ein PSD mit einem internen Standard vorbeladen wird, der einen isotopenmarkierten Analyten von Interesse umfasst, doch nicht mit einem Derivatisierungsmittel oder einem internen Standard, umfassend ein Derivatisierungsmittel, im Voraus beladen wird, können das Trennen, Aliquotieren und Einbringen des internen Standards, obwohl sie in der Abfolge unterscheidbare Operationen sind, praktisch gleichzeitig erfolgen. Man sollte zur Kenntnis nehmen, dass Teile eines PSD mit einem oder mehreren internen Standards behandelt werden können, mit einem Derivatisierungsmittel oder mit einem oder mehreren internen Standards und einem Derivatisierungsmittel, wobei ein solches Derivatisierungsmittel an sich einen internen Standard umfassen kann oder nicht kann.
In einigen Ausführungsformen umfassen die Verfahren der vorliegenden Erfindung die folgenden Schritte: Sammeln, Trennen und Aliquotieren einer Plasmaprobe aus einer Blutprobe, Behandeln der Plasmaprobe mit einem internen Standard, Reinigen der behandelten Plasmaprobe, Derivatisierung der behandelten Plasmaprobe und Analysieren der Mischung der derivatisierten Probe und des internen Standards, um die Konzentration oder Menge der Analyte in der Probe mit den Konzentrationen oder Mengen an internem Standard zu vergleichen, um die Konzentrationen oder Mengen an Analyten innerhalb der Probe zu bestimmen. Obwohl der hier beschriebene Behandlungsschritt mit internem Standard als nach der Aliquotierung stattfindend beschrieben ist, wird eine Fachperson anerkennen, dass dieser Schritt, falls der interne Standard ein markierter Analyt ist, zu jeglichem Zeitpunkt vor der Derivatisierung auftreten kann, und falls der interne Standard ein markiertes Derivatisierungsmittel ist, während der Derivatisierung auftreten wird. In ähnlicher Weise werden, wie in allen Ausführungsformen der Erfindung, obwohl der Derivatisierungsschritt als nach der Reinigung stattfindend angeführt ist, Fachleute anerkennen, dass dieser Schritt zu jedem beliebigen Zeitpunkt nach der Trennung der Plasmaprobe stattfinden kann.
Vorzugsweise wird einer oder werden mehrere Schritte dieser Ausführungsformen der Erfindung über die Verwendung eines PSD bewältigt. In bevorzugten Ausführungsformen wird ein interner Standard im Voraus in das Blutbehälterbauteil, das semipermeable Bauteil, Sammelreservoir oder Bauteil mit absorbierendem Material des PSD vor der Sammlung der Plasmaprobe geladen, so dass die Plasmaprobe mit dem internen Standard durch die Verwendung des PSD behandelt wird. In diesen Ausführungsformen wird eine oder mehrere von der Probe, die Probe enthaltendes Sammelreservoir oder die Probe enthaltendes Bauteil mit absorbierendem Material aus dem PSD entfernt und in ein Präparationsgefäß gegeben und mit einem internen Standard versetzt.
In einigen Ausführungsformen umfassen die Verfahren der vorliegenden Erfindung die folgenden Schritte: Sammeln, Trennen und Aliquotieren mehrerer bzw. multipler Proben, Behandeln jeder dieser mehreren Proben mit analytisch unterscheidbaren separaten internen Standards, Reinigen der behandelten Proben, Derivatisierung der behandelten Proben und Analysieren der derivatisierten Proben als eine Charge, um die Konzentration oder Menge der Analyte in den Proben mit den Konzentrationen oder Mengen an internen Standards zu vergleichen, um die Konzentrationen oder Mengen an Analyten innerhalb der Probe zu bestimmen. Vorzugsweise wird in diesen Ausführungsformen jede Probe mit einem unterschiedlichen internen Standard behandelt, wobei solche Unterschiede vorzugsweise unterschiedliche Isotopenmarkierung der internen Standards umfassen. Am stärksten bevorzugt umfassen die internen Standards in diesen Ausführungsformen isotopenmarkierte Derivatisierungsmittel. Obwohl der hier beschriebene Behandlungsschritt mit internem Standard als nach der Aliquotierung stattfindend beschrieben ist, wird eine Fachperson anerkennen, dass dieser Schritt, falls der interne Standard ein markierter Analyt ist, zu jeglichem Zeitpunkt vor der Derivatisierung auftreten kann, und falls der interne Standard ein markiertes Derivatisierungsmittel ist, während der Derivatisierung auftreten wird. In ähnlicher Weise werden, wie in allen Ausführungsformen der Erfindung, obwohl der Derivatisierungsschritt als nach der Reinigung stattfindend angeführt ist, Fachleute anerkennen, dass dieser Schritt zu jedem beliebigen Zeitpunkt nach der Trennung der Plasmaprobe stattfinden kann.
Ein interner Derivatisierungsmittel-Standard kann im Voraus in das Blutbehälterbauteil, das semipermeable Bauteil, Sammelreservoir oder Bauteil mit absorbierendem Material des PSD, vor dem Sammeln der Plasmaprobe, geladen werden, so dass die Plasmaprobe mit dem internen Standard behandelt und die Derivatisierung durch die Verwendung des PSD eingeleitet wird. Die markierte Verbindung wird dann unter Verwendung von Massenspektrometrie analysiert. In diesen Ausführungsformen kann das Verfahren wahlweise die Bereitstellung eines internen Standards beinhalten, der eine bekannte Konzentration eines bekannten Vitamin-D-Derivats enthält, wobei der bekannte interne Standard mit Derivatisierungsmitteln behandelt wird, so dass ein derivatisiertes Standardaddukt gebildet wird. Die Mischung von derivatisiertem Analyt und internem Standard kann getrennt werden, um getrennte markierte Analyte und interne Standards zu erzeugen, und die getrennten markierten Analyte und internen Standards können unter Verwendung von Massenspektrometrie analysiert werden, unter Verwendung von LC-MS- oder LC-MSMS-Analyse des derivatisierten Addukts.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die 1A ist ein Ablaufdiagramm einer Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung unter Verwendung eines PSD.
Die 1B ist ein Ablaufdiagramm einer Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung unter Verwendung eines PSD.
Die 2 ist ein Fließbild, das mehrere Strategien für die Analyse innerhalb des Umfangs der Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung darstellt, unter Verwendung von internen Standards zur Untersuchung von Analyten in mehreren Proben.
Die 3 zeigt eine Massenspektrometer-Ausgabe unter Verwendung von Mehrfachreaktionsüberwachung des Analyts von Interesse 25-Hydroxy-Vitamin-D3 in Plasma, behandelt mit D6-25-Hydroxyl-Vitamin-D3 als ein interner Standard, durch die Verwendung eines PSD, wie in Beispiel A der 2 beschrieben.
Die 4 zeigt einen beispielhaften Vergleich der Konzentration von 25-Hydroxy-Vitamin-D3 (Analyt), analysiert durch Versionen der vorliegenden Erfindung unter Verwendung eines PSD und Flüssig-Flüssig-Extraktion. D6-25-Hydroxy-Vitamin-D3 ist als ein interner Standard verwendet worden.
Die 5 zeigt eine lineare Regressionsanalyse für den Vergleich von massenspektrometrischen Bestimmungen des Standards 25-Hydroxy-Vitamin-D2 gegen 25-Hydroxy-Vitamin-D3 mit Derivatisierung und unter Verwendung eines PSD gemäß den Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.
Die 6 zeigt Tabellen, die die Reproduzierbarkeit der Peakfläche der Analyte 25-Hydroxy-Vitamin-D2 (1, 2, 5, 10 und 20 pg) und 25-Hydroxy-Vitamin-D3 (2, 4, 10, 20 und 40 pg), gezeigt in der linearen Regressionsanalyse der 5, im Vergleich mit der Peakfläche des entsprechenden internen Standards d6-25-Hydroxy-Vitamin-D2 (1, 2, 5, 10 und 20 pg) bzw. d6-25-Hydroxy-Vitamin-D3 (2, 4, 10, 20 und 40 pg) darstellt.
Die 7 zeigt den Derivatisierungsmechanismus eines 25-Hydroxy-Vitamin-D3 und 25-Hydroxy-Vitamin-D2 mit 4-(1-Methyl-4-pyrindinylmethyl)-1,2,4-triazolidin-3,5-dion.
Die 8 zeigt die Derivatisierung von 1α,25-Dihydroxy-Vitamin-D2 mit 4-(1-Methyl-4-pyrindinylmethyl)-1,2,4-triazolidin-3,5-dion bzw. Ergosterol mit 4-(1-(Methyl-D3)-4-pyrindinylmethyl)-1,2,4-triazolidin-3,5-dion in Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.
Die 9 zeigt eine Massenspektrometer-Ausgabe unter Verwendung von Mehrfachreaktionsüberwachung der Analyte von Interesse 25-Hydroxy-Vitamin-D2 und 25-Hydroxy-Vitamin-D3 in Plasma, behandelt mit D6-25-Hydroxyl-Vitamin-D2 und D6-25-Hydroxyl-Vitamin-D3 als interne Standards, durch die Verwendung der in Beispiel 2 geschilderten Flüssig-Flüssig-Extraktion.
Beschreibung der Ausführungsformen
Obwohl die Zusammensetzung und Verwendung von verschiedenen Versionen der Verfahren der vorliegenden Erfindung unten im Detail erörtert werden, sollte Anerkennung finden, dass die vorliegende Erfindung eine Vielzahl von bestimmten Ausführungsformen beinhaltet, die in einem breiten Spektrum von spezifischen Zusammenhängen eingesetzt werden können. Die hierin erörterten spezifischen Versionen und Ausführungsformen sind lediglich veranschaulichend für die Arten, auf die die Verfahren der vorliegenden Erfindung zusammengesetzt und verwendet werden können und dienen nicht zur Einschränkung des Umfangs der Erfindung.
Spezifisch, wie eine Fachperson anerkennen wird, werden verschiedene Wiederholungsausführungen und Ausführungsformen der unten beschriebenen Verfahren vorgestellt, allerdings soll die Erfindung nicht auf diese Wiederholungsausführungen oder Ausführungsformen oder auf die hierin vorgestellte spezifische Abfolge von Schritten beschränkt sein. Variationen bei der Anzahl und Abfolge der Schritte, das Hinzufügen von anderen Schritten und Kombinationen von Aspekten der verschiedenen Ausführungsformen hierin fallen alle in den Umfang der beanspruchten Erfindung. Zum Beispiel und als Veranschaulichung können, obwohl die hierin offenbarten Ausführungsformen den Derivatisierungsschritt als spezifisch vor oder nach dem Trennungs- oder Reinigungsschritt auftretend erörtern, diese Schritte, wie von einer Fachperson anerkannt werden wird, in unterschiedlichen Abfolgen und zu verschiedenen Zeitpunkten durchgeführt werden, abhängig von der Qualität und dem Charakter der Probe und den Analyten, die für die Analyse von Interesse sind. Die Verwendung eines PSD, wie an verschiedenen Punkten hierin beschrieben, kann darüber hinaus zur Durchführung von einem oder mehreren Schritten gleichzeitig oder praktisch gleichzeitig führen.
Hierein verwendete Ausdrücke haben die Bedeutung, die üblicherweise von Durchschnitsfachpersonen im entsprechenden Fachbereich angenommen wird, sofern nicht spezifisch hierin definiert. Während die Ausdrücke hierin verwendet werden, um bestimmte Ausführungsformen und Versionen der vorliegenden Erfindung zu beschreiben, sollen sie den Umfang der Erfindung nicht beschränken, außer wie es spezifisch in den Ansprüchen festgestellt ist.
Ein "Analyt" gemäß den Versionen der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf Verbindungen oder Bestandteile, die in einer Probe zu messen erwünscht ist. "Analyte" gemäß Versionen der vorliegenden Erfindung können jegliche Verbindung, jeglicher Bestandteil oder jegliche Verbindungsklasse sein, die in biologischen Fluiden vorliegen oder darin angetroffen werden können, einschließlich spezifisch und vorzugsweise menschliches Vollblut oder tierisches Vollblut, das eine reaktive Dien-Gruppe enthält. Vorzugsweise umfassen Analyte Secosteroide. Am stärksten bevorzugt umfassen Analyte Vitamin D und seine Metabolite, einschließlich Vitamin D₂, Vitamin D₃, 25OHD, 24,25(OH)₂D und 1,25(OH)₂D. "Analyte" bezieht sich weiterhin auf Isotope, Isomere und Analoga aller oben Genannten. "Analyte von Interesse" bezieht sich auf Analyte, für die eine Probe zu analysieren ist, ohne Rücksicht darauf, ob diese Analyte in der Probe tatsächlich vorliegen.
Eine "Probe" gemäß den Versionen der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf jegliche Größenordnung von Substanz, die flüssig ist oder die verflüssigt worden ist, die mutmaßlich eine Menge von einem oder mehreren Analyt(en) von Interesse, detektierbar durch Massenspektrometrie-Analyse, enthält. Proben können zum Beispiel Zellen umfassen oder Zellkulturen, Organe, Organteile oder Organkulturen, Vollblut, Plasma, Serum, Samen, Haar, Muskel, Knochen, Speichel, Tränen, Urin, Fäkalien, Rückenmarksflüssigkeit oder unbekannte Substanzen, von denen vermutet wird, dass sie nachweisbare Größenordnungen von einem oder mehreren Analyt(en) enthalten. Vorzugsweise bezieht sich eine Probe auf eine Menge an Vollblut und am stärksten bevorzugt auf eine Menge an menschlichem Blut oder seinen Bestandteilen wie Plasma.
Ein "PSD" bezieht sich auf ein Plasmatrenngerät für die Verwendung in verschiedenen Versionen der vorliegenden Erfindung. Man wird anerkennen, dass das PSD eine Vollblutprobe trennen, aliquotieren und eine Plasmaprobe von vorbestimmtem Volumen von einer Vollblutprobe sammeln kann, was Zeit, Arbeit und Aufwand spart, vergleicht man das Vorgehen mit anderen Verfahren der Probensammlung und -Vorbereitung. Wahlweise kann ein PSD wie hierin beschrieben mit einem Derivatisierungsmittel vorbeladen werden, was ermöglicht, dass der Derivatisierungsschritt bei der Sammlung der Probe beginnt, ohne weiteren Aktionsbedarf. Wahlweise kann ein PSD wie hierin beschrieben mit einem internen Standard vorbeladen werden, was ermöglicht, dass der Schritt der Behandlung mit einem internen Standard bei der Sammlung der Probe beginnt, ohne weiteren Aktionsbedarf.
Ein PSD kann wahlweise mit einem Derivatisierungsmittel vorbeladen werden, indem vor der Sammlung einer Probe in dem PSD eine erwünschte Menge an Derivatisierungsmittel in das Sammelreservoir oder wahlweise das Bauteil mit absorbierendem Material des PSD geladen wird. Fachleute werden anerkennen, dass das PSD mit einem Derivatisierungsmittel vorbeladen werden kann, vor der Verwendung des PSD, ohne Rücksicht darauf, wann das PSD verwendet werden soll, um eine Probe zu sammeln. Wie Fachleute anerkennen werden, hängt die effektive Haltbarkeitsdauer eines solchen PSD von der Identität, Stabilität und Zerfallsrate des ausgewählten Derivatisierungsmittels ab.
Ein PSD kann wahlweise mit einem internen Standard vorbeladen werden, indem vor der Sammlung der Probe in dem PSD eine erwünschte Menge an internem Standard in das Sammelreservoir, semipermeable Bauteil oder wahlweise das Bauteil mit absorbierendem Material des PSD geladen wird. Fachleute werden anerkennen, dass das PSD mit einem internen Standard zu jedem beliebigen Zeitpunkt vor der Verwendung vorbeladen werden kann, ohne Rücksicht darauf, wann das PSD verwendet werden soll, um eine Probe zu sammeln. Wie Fachleute anerkennen werden, hängt die effektive Haltbarkeitsdauer eines solchen vorbeladenen PSD von der Identität, Stabilität und Zerfallsrate des ausgewählten internen Standards ab. Wahlweise können das Blutbehälterbauteil oder semipermeable Bauteil mit einem internen Standard vorbeladen werden, indem diese Bauteile des PSD mit einer gewünschten Menge an internem Standard in flüssiger oder fester Form behandelt oder imprägniert werden. Vorzugsweise ist der interne Standard ein isotopenmarkierter Analyt von Interesse oder ein isotopenmarkiertes Derivatisierungsmittel.
"Derivatisierung" bezieht sich auf die Reaktion eines Analyts von Interesse mit einem Derivatisierungsmittel zur Schaffung einer neuen Verbindung, die als derivatisierter Analyt bezeichnet wird, geeignet für die Ionisierung und Analyse durch Massenspektrometrie. Ein "Derivatisierungsmittel" für den Zweck der Versionen dieser Erfindung bezieht sich auf geeignete Verbindungen, die eine positiv geladene Gruppe enthalten, wie etwa, in bevorzugten Ausführungsformen hiervon, ein primäres Amin, ausgewählt um Analyte, einschließlich Secosteroide und Vitamin D, zu derivatisieren. Derivatisierungsmittel gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten einen oder mehrere Triazolidinring(e). Derivatisierungsmittel gemäß der vorliegenden Erfindung verleihen dem derivatisierten Analyt eine permanente positive Ladung, was eine genauere und empfindlichere Detektion des derivatisierten Analyts durch Massenspektrometrie ermöglicht. Am stärksten bevorzugt ist das Derivatisierungsmittel ein 4-substituiertes 1,2,4-Triazolidin-3,5-dion oder ein anderes funktionell äquivalentes Mittel. Geeignete Derivatisierungsmittel umfassen zum Beispiel 4-(1-Methyl-4-pyrindinylmethyl)-1,2,4-triazolidin-3,5-dion, 4-Phenyl-1,2,4-triazolidin-3,5-dion und 4-Ferrocenylmethyl-1,2,4-triazolidin-3,5-dion und ihre Isomere, Isotope und Analoga.
Man nimmt an, dass die Verwendung eines PSD, bei dem ein Bauteil mit absorbierendem Material integriert ist, in bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung bei der Derivatisierung und Reinigung über den folgenden Mechanismus unterstützt: Menschliches Blut enthält durchschnittlich ungefähr 100 µg/µL an Protein. Ein Aliquot von 2,5 µL Plasma würde entsprechend durchschnittlich ungefähr 250 µg Plasmaprotein enthalten. Das Bauteil mit absorbierendem Material hat ein Volumenpotenzial von ungefähr 150% des Volumens des Sammelreservoirs, oder ungefähr 3,75 µL. Die spezifische Ladekapazität des Elements mit absorbierendem Material beträgt ungefähr 50 µg Protein pro µL Volumenpotenzial des Elements. Daher würde eine Probe von menschlichem Vollblut, die unter Verwendung eines PSD in ein Bauteil mit absorbierendem Material getrennt wird, durchschnittlich ungefähr 187,5 µg Protein ergeben. Vitamin-D-Analyte in der Probe wären in diesem Protein verteilt. Wenn der flüssige Teil der Plasmaprobe aus dem Bauteil mit absorbierendem Material durch Abdampfen entfernt wird, sollte sich das verbleibende Protein im Wesentlichen in einer Monoschicht ablagern, die dann zum Beispiel durch ein organisches Lösungsmittel extrahiert werden kann. Die mutmaßliche Ablagerung in Monoschichten von Protein sollte die Geschwindigkeit der Extraktion erhöhen.
Das bevorzugte Derivatisierungsmittel ist 4-(1-Methyl-4-pyrindinylmethyl)-1,2,4-triazolidin-3,5-dion oder "DR1". DR1 kann synthetisiert werden wie folgt: 50 mmol Methylhydrazinocarboxylat (Sigma, FW 90.08) werden in 50 ml wasserfreiem THF unter N₂ aufgelöst. Fünfzig mmol 1,1'-Carbonyldiimidazol (Sigma, FW 162.15) werden portionsweise über einen Zeitraum von zwei bis drei Minuten hinzugegeben. Die Mischung wird bei Raumtemperatur für 15 Minuten gerührt. Fünfzig mmol 4-Aminomethylpyridin (Sigma, FW 108.14) werden zugegeben, und die Mischung wird bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das feste Produkt ("Verbindung I") wird mittels Filtration gesammelt und mit THF gewaschen. Zwanzig mmol von Verbindung I werden in 10 ml von 4 M KOH 2 Stunden lang refluxiert, dann auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Die Mischung wird dann in einem Eiswasserbad gerührt und während sie so gekühlt ist mit konzentrierter HCl titriert, bis ein massiger Niederschlag eintritt, der nach dem Verbrauch von ungefähr 4 ml HCl und bei einem pH-Wert von ungefähr 6 eintritt. Das feste Produkt (Verbindung II) wird mittels Filtration gesammelt, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Fünf mmol Verbindung II werden zu 15 Volumina Aceton gegeben. Eine Gesamtmenge von 5-fachem Überschuss an Iodmethan (Sigma, FW 141.94) wird zum Feststoff hinzugegeben. Der Feststoff wird in ein Gefäß gegeben und abgedichtet, dann in einen Ofen gegeben, bei 50°C und 6 Tage lang. Das getrocknete Feststoffprodukt beinhaltet im Wesentlichen DR1. Viele der Beispiele von Versionen der vorliegenden Erfindung nutzen auch ein Oxidationsmittel und ein Stabilisierungsmittel, was eine Fachperson anerkennen wird. Vorzugsweise ist das Oxidationsmittel Iodbenzendiacetat, hierin als "DR2" bezeichnet, und das Stabilisierungsmittel (oder "Stabilisator") ist Ascorbinsäure, hierin als "DR3" bezeichnet.
Ein "interner Standard" bezieht sich auf eine Substanz, die in einer bekannten Menge vor der Analyse einer Probe hinzugegeben wird, wobei ein massenspektrometrisches Signal des bekannten internen Standards mit dem massenspektrometrischen Signal von, falls vorhanden, Analyten von Interesse in der Probe verglichen werden kann, und, über diesen Vergleich, das Vorliegen und die Menge an Analyten von Interesse bestimmt werden kann. Ein idealer interner Standard ist eine Substanz mit einer höchst ähnlichen und, falls möglich, identischen chemischen Struktur zum Analyten von Interesse, die sich nur durch das Vorliegen von "schweren" Atomen an spezifischen Stellen im internen Standard unterscheidet. Zum Beispiel ist ein Deuterium-Isotop von VD, in dem ein Deuteriumatom anstelle eines Wasserstoffatoms substituiert ist, ein geeigneter interner Standard für VD. Obwohl der Analyt und der interne Standard sich bezüglich ihrer Masse unterscheiden und individuell durch Massenspektrometrie erkannt werden, sind ihre Fragmentierungsmuster und relativen Ausbeuten von Fragmentionen im Wesentlichen identisch. Interne Standards umfassen vorzugsweise einen oder mehrere isotopenmarkierterte Analyten von Interesse oder einen oder mehrere isotopenmarkierte Derivatisierungsmittel.
Interne Standards, die isotopenmarkierte Analyte von Interesse umfassen, umfassen vorzugsweise isotopenmarkierte Secosteroid-Verbindungen und am stärksten bevorzugt umfassen sie isotopenmarkierte Metabolite von Vitamin D. Interne Standards, die isotopenmarkierte Derivatisierungsmittel umfassen, umfassen vorzugsweise Isotope von DR1.
"Isotopenmarkierung", "isotopenmarkiert", "Kodierung" oder "kodiert" beziehen sich auf das Ersetzen von einem oder mehreren Atom(en) innerhalb eines Interner-Standard-Moleküls durch ein Atom mit derselben Anzahl an Protonen und Elektronen, doch variierenden Anzahlen an Neutronen. Isotopenmarkierungen erzeugen einen Massenshift beim isotopenmarkierten Molekül, relativ zum unmarkierten Molekül, wenn es durch Massenspektrometrie-Techniken analysiert wird, wobei die Menge des unmarkierten Moleküls durch einen Vergleich seiner Massenspektrometrie-Signatur mit der Massenspektrometrie-Signatur des markierten Interner-Standard-Moleküls ermittelt werden kann. Da das während der Massenspektrometrie erzeugte Gasphasen-Fragmentationsmuster von einer Isotopenmarkierung unabhängig ist, ist die Verwendung von isotopenmarkierten internen Standards angemessen für Verfahren der vorliegenden Erfindung. Geeignete Isotopenmarkierungen schließen zum Beispiel Deuterium (²H), ¹³C und ¹⁵N ein. Zum Beispiel wäre ein 25-Hydroxy-Vitamin-D3-Molekül isotopenmarkiert mit Deuterium 3 Atomare Masseneinheiten (atomic mass units, amu) schwerer als ein unmarkiertes 25-Hydroxy-Vitamin-D3-Molekül, was zu einem detektierbaren Massenshift führt, der das 25-Hydroxy-VD3-Molekül und seinen isotopenmarkierten internen Standard unterscheidet, wenn beide mittels MS analysiert werden. Eine Isotopenmarkierung kann an einer oder mehreren Positionen in einem Molekül eingefügt werden und eine oder mehrere Isotopenmarkierungen können auf dem selben isotopenmarkierten Molekül verwendet werden.
"Reinigen" einer Probe gemäß Versionen der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf zumindest teilweises Trennen der Analyten von Interesse, falls vorhanden, von den verbleibenden Bestandteilen einer Probe ohne die Eigenschaften der Analyte von Interesse wesentlich zu verändern. Die Reinigung oder das Reinigen beziehen sich nicht auf das Entfernen aller Materialien außer den Analyten von Interesse aus der Probe, vielmehr beziehen sie sich auf eine Vorgehensweise, die die Menge an Analyten von Interesse, falls vorhanden, anreichert, relativ zu anderen Bestandteilen in der Probe, die die Massenspektrometrie-Analyse der Analyte von Interesse stören könnten. Die Reinigung ermöglicht die relative Abreicherung innerhalb der Probe einer oder mehrerer Substanz(en), die die Detektion von Analyten von Interesse durch Massenspektrometrie stören könnten. Diese relative Abreicherung macht es nicht erforderlich, dass jegliche in der Probe vorliegende Substanz im Wesentlichen oder komplett entfernt wird.
Die Reinigung kann durch jede geeignete Maßnahme erfolgen, wie Fachleute anerkennen werden. Wie Fachleuten ersichtlich sein wird, kann die Reinigung zum Beispiel durch einschließlich die folgenden Maßnahmen erfolgen: Ausfällung, Titration, Filtration, Kapillarelektrophorese, Gaschromatographie, Fraktionierung, Ionenmobilitätstrennung, Elektrospray-Ionisation (ESI), matrixunterstützte Laser-Desorption-Ionisation (MALDI), direkte Elektrospray-Ionisation (DESI), Lösungsmittelextraktion, Zentrifugation oder Verdünnung. Vorzugsweise bezieht sich Reinigung in Versionen der vorliegenden Erfindung auf Flüssigkeitschromatographie ("LC"), einschließlich Hochleistungsflüssigkeitschromatographie ("HPLC").
Wie hierin verwendet bezieht sich "Chromatographie" im Allgemeinen auf ein Verfahren, in dem eine durch eine Flüssigkeit oder ein Gas transportierte chemische Mischung in ihre Bestandteile auftrennt wird, und zwar als ein Resultat der differenziellen Verteilung der chemischen Stoffe, während sie entlang oder über eine stationäre flüssige oder feste Phase fließen. LC bezieht sich auf ein Verfahren der selektiven Retardation von einem oder mehreren der Bestandteile einer Fluidlösung, während das Fluid gleichmäßig durch eine Säule von einer fein zerteilten Substanz oder durch Kapillardurchgänge sickert. Die Retardation resultiert aus der Verteilung der Bestandteile der Mischung zwischen einer oder mehreren stationären Phase(n) und dem Bulkfluid (oder der mobilen Phase), während sich dieses Bulkfluid relativ zu den stationären Phasen bewegt. Beispiele für LC schließen die folgenden ein: Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie, Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, Flüssigkeitschromatographie mit turbulenter Strömung und Flüssigkeitschromatographie mit hohem Durchsatz.
Wie hierin verwendet beziehen sich "Gaschromatographie" oder GC auf Chromatographie, bei der die Probenmischung verdampft und in einen Strom von Trägergas, wie Stickstoff oder Helium, injiziert wird, wobei dieser Strom sich durch eine Säule bewegt, die eine stationäre Phase enthält, zusammengesetzt aus einer Flüssigkeit oder einem partikelförmigen Feststoff. Die Probenmischung wird gemäß der Affinität der Verbindungen innerhalb der Probenmischung für die stationäre Phase aufgetrennt.
"Analysieren" bezieht sich auf den Einsatz geeigneter Techniken zur Bestimmung der Gegenwart oder Abwesenheit und, wahlweise, der Menge oder Konzentration von einem oder mehreren Analyten von Interesse. Genau gesagt bezieht sich Analysieren auf den Einsatz quantitativer analytischer Techniken zur Messung der Gegenwart, Menge oder Konzentration von einem oder mehreren derivatisierten Analyten von Interesse, zumindest teilweise durch Ausnutzung der positiven Ladung, die dem derivatisierten Analyt durch das Derivatisierungsmittel verliehen wird. Analyse bezieht sich vorzugsweise auf Massenspektrometrie, einschließlich eindimensionaler Massenspektrometrie und Tandem-Massenspektrometrie. Das Verfahren kann weiterhin die Bereitstellung eines internen Standards umfassen, der eine bekannte Konzentration von Vitamin D, Vitamin-D-Derivaten oder Vitamin D mit Deuterium enthält, wobei der bekannte interne Standard mit dem Derivatisierungsmittel behandelt wird, so dass ein derivatisiertes Standardaddukt gebildet wird. Die Mischung von derivatisiertem Analyt und internem Standard kann getrennt werden, um getrennte Peaks mit unterschiedlicher Masse oder/und Retentionszeit in einer Chromatographie zu erzeugen, und die getrennten Analyte und internen Standards können unter Verwendung von Massenspektrometrie analysiert werden, unter Verwendung von LC-MS- oder LC-MSMS-Analyse des derivatisierten Addukts.
"Massenspektrometrie" oder "MS" bezieht sich auf ein Verfahren zur Analyse von Verbindungen nach ihrer Masse. MS schließt Verfahren des Filtrierens, Detektierens und Messens von Ionen basierend auf ihrem Verhältnis von Masse-zu-Ladung ("m/z") ein. Wie Fachleute anerkennen werden, umfasst MS im Allgemeinen: (1) Ionisierung einer zu analysierenden Verbindung zur Bildung geladener Verbindungen; (2) Detektieren des im Fachbereichs der geladenen Verbindungen; und (3) Berechnen eines Masse-zu-Ladung-Verhältnisses für die detektierten geladenen Verbindungen. Die Ionisierung kann durch jegliches geeignete Mittel erfolgen, wie Fachleuten ersichtlich sein wird. Geeignete Mittel zur Ionisierung schließen zur Veranschaulichung die folgenden ein: Chemische Ionisation bei Atmosphärendruck, Photoionisation bei Atmosphärendruck, induktiv gekoppeltes Plasma, Felddesorption, Laserdioden-Thermaldesorption, Elektrospray-Ionisation, schneller Atombeschuss, matrixunterstützte Laser-Desorption-Ionisation ("MALDI") oder oberflächenverstärkte Laserdesorption ("SELDI"). Die Ionendetektion kann ebenfalls durch jegliches geeignete Mittel durchgeführt werden, wie Fachleuten ersichtlich sein wird. Zum Beispiel kann die Detektion im Positive-Ionen-Modus oder alternativ im Negative-Ionen-Modus erfolgen. Die Detektion kann, falls erwünscht, unter Verwendung von selektiver Ionenüberwachung oder Mehrfachreaktionsmodus ("MRM") durchgeführt werden. In einigen Ausführungsformen werden Eltern-Tochter-Ion-Übergangs-Überwachung (parent daughter ion transition monitoring, PDITM), selektive Reaktionsüberwachung (SRM) oder MRM der derivatisierten Analyte durchgeführt, unter Verwendung einer Triple-Quadrupol-MS-Plattform.
Die "untere Quantifizierungsgrenze" bezieht sich auf den Punkt, an dem MS-Messungen quantitativ aussagekräftig werden. Es ist der niedrigste Punkt´, an dem die Analytantwort identifizierbar, diskret und mit einer relativen Standardabweichung von weniger als 20% und einer Genauigkeit von mehr als 80% reproduzierbar ist. Die "Nachweisgrenze" bezieht sich auf den Punkt, an dem der unter Verwendung von Massenspektrometrie gemessene Wert gleich oder geringer als die mit diesem Wert zusammenhängende Unsicherheit ist, und ist definiert als dreimal die relative Standardabweichung des Mittelwerts bei Nullkonzentration.
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen ein Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart oder Menge von Analyten von Interesse in einer Plasmaprobe, umfassend die folgenden Schritte: Sammeln einer Blutprobe; Abtrennen einer Plasmaprobe von der Blutprobe; Aufteilen der Plasmaprobe in Aliquote; Derivatisierung der Analyte von Interesse innerhalb der Plasmaprobe unter Verwendung eines Derivatisierungsmittels; Übertragen der Probe in ein Präparationsgefäß; Reinigung der Probe; und Analysieren der Gegenwart, Abwesenheit, Menge oder Konzentration von Analyten von Interesse. Man sollte anerkennen, dass mehrere Schritte dieses Verfahrens praktisch gleichzeitig durchgeführt werden können, wie wenn ein PSD eingesetzt wird. Weiterhin wird man anerkennen, dass einige Schritte, in Abhängigkeit von den verwendeten Labortechniken, ausgelassen oder in wechselnder Abfolge durchgeführt werden können. Zur Veranschaulichung kann die Derivatisierung nach der Reinigung passieren und der Schritt des Übertragens der Probe in ein Präparationsgefäß kann unter einigen Umständen ausgelassen werden, wie hierin beschrieben.
Vorzugsweise wird die Sammlung der Plasmaprobe unter Verwendung eines PSD durchgeführt. Ein PSD kann die Schritte der Sammlung einer Vollblutprobe, Abtrennen einer Plasmaprobe von der Vollblutprobe und Aliquotieren der Plasmaprobe zu einem bekannten Volumen praktisch gleichzeitig durchführen. Ein PSD kann auch mit einem oder mehreren internen Standards oder einem oder mehreren Derivatisierungsmittel im Blutbehälterbauteil, semipermeablen Bauteil, Sammelbauteil oder Bauteil mit absorbierendem Material vorbeladen werden.
Vor der Analyse kann eine Plasmaprobe mit einem oder mehreren getrennt voneinander detektierbaren internen Standards behandelt werden. Wahlweise kann ein interner Standard vor oder während der Derivatisierung hinzugegeben werden. Das Derivatisierungsmittel kann auch einen internen Standard umfassen.
Wahlweise können zwei oder mehr Plasmaproben vor der Analyse gemischt und in einer Charge analysiert werden. Wenn zwei oder mehr Plasmaproben in einer Charge analysiert werden, wird vorzugsweise mindestens eine der Plasmaproben mit einem internen Standard behandelt, bevor die Plasmaproben gemischt werden. Vorzugsweise wird in diesen Ausführungsformen jede zu vermischende Plasmaprobe vor dem Mischen mit einem internen Standard behandelt, der sich von den internen Standards unterscheidet, die zur Behandlung der anderen als Teil der Charge zu vermischenden Plasmaproben verwendet werden. Solche internen Standards können unterschiedliche Isotope von einem oder mehreren Analyt(en) von Interesse, verschiedene Isotop des Derivatisierungsmittels oder Mittels oder eine Kombination von einem oder mehreren Isotopen des Analyts von Interesse und eines oder mehrere Isotope eines Derivatisierungsmittels umfassen. Die 2, 2A und 2B veranschaulichen zum Beispiel die absolute und relative Quantifizierung eines Assays, der zwei Plasmaproben beinhaltet, die mit unterscheidbaren internen Standards behandelt worden waren. Wie in 2A gezeigt, kann der Analyt von Interesse Vitamin D in zwei Plasmaproben gesammelt, aliquotiert und extrahiert werden, und zwar durch die Verwendung eines separierten PSD für jede Probe. Jede Probe wird mit einem unterschiedlichen internen Standard behandelt, wie einem 1-Deuterium-Isotop von Vitamin D, und die Proben werden vermischt. Die gemischten Proben sind dann derivatisiertes DR1. Anschließend kann die Mischung einer Trennung unterzogen werden, zum Beispiel auf einer Umkehrphasen-Säule. Die markierten Analyte und internen Standards können aus der Säule zu unterschiedlichen Zeitpunkten ausgewaschen werden, aufgrund ihrer unterschiedlichen und unterscheidbaren Retentionszeiten auf der Säule. Die Peaks, die aus der Umkehrphasensäule eluieren, umfassen Peaks, die die derivatisierten Analyte aus unbekannten Proben beinhalten, und Peaks, die die derivatisierten internen Standards oder Analyte mit bekannter Konzentration oder Menge enthalten.
In Ausführungsformen, die ein PSD verwenden, kann die Plasmaprobe derivatisiert werden, nachdem die Probe gesammelt worden ist, durch legen des Sammelreservoirs in eine Lösung, die teils ein Derivatisierungsmittel enthält, ohne die Probe zuerst von der Sammelscheibe zu entfernen. Wahlweise kann das Sammelreservoir aus dem PSD entfernt und in einem Präparationsgefäß platziert werden, zu dem ein Derivatisierungsmittel dann hinzugegeben werden kann. Vorzugsweise ist das Sammelreservoir ein Bauteil mit absorbierendem Material. In diesen bevorzugten Ausführungsformen kann das Bauteil mit absorbierendem Material direkt in einem Präparationsgefäß mit einem Lösungsmittel platziert werden, zu dem auch ein Derivatisierungsmittel gegeben werden kann.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung umfasst das Verfahren die folgenden Schritte: Sammeln einer Vollblutprobe; Abtrennen einer Plasmaprobe von der Vollblutprobe; Aufteilen der Plasmaprobe in Aliquote; Derivatisierung der Analyte innerhalb der Plasmaprobe unter Verwendung eines Derivatisierungsmittels; Übertragen der Probe zu einem Präparationsgefäß; Reinigung der Probe; und Analysieren von Analyten von Interesse, falls vorhanden, in der Probe.
Wenn hierin Bezug genommen wird auf den Schritt des Übertragens einer Probe zu einem Präparationsgefäß oder Übertragen eines absorbierenden Bauteils oder einer Sammelscheibe in ein Präparationsgefäß, kann ein solcher Schritt jegliches Verfahren zum Übertragen der Teile der zu analysierenden Probe zu den Reinigungs- und/oder Analyse-Mitteln einschließen. Ein solcher Schritt kann zum Beispiel das Gießen oder Dekantieren der Probe in ein Gefäß einschließen, oder in Ausführungsformen, die ein PSD verwenden, das Platzieren der Sammelscheibe in einem Gefäß. In noch anderen Ausführungsformen, die ein PSD verwenden, kann der Schritt die Elution oder die Desorption des Plasmas an Ort und Stelle innerhalb des Sammelreservoirs eines PSD ohne die Entfernung der Sammelscheibe umfassen. Eine solche Elution oder Desorption an Ort und Stelle kann zum Beispiel erreicht werden durch die Schaffung eines Lochs im Sammelreservoir unterhalb der Sammelscheibe, vor oder nach der Probensammlung, und anschließendes Platzieren des PSD in einer In-Line-Konfiguration, mit einer Unterstützungsstruktur zum Pumpen, Tropfenlassen oder anderweitigen Transportieren von Elutionslösungsmitteln durch das Sammelreservoir, so dass die Lösungsmittel durch die Sammelscheibe fließen und jegliche eluierten Analyten durch das Loch im Sammelreservoir zur Reinigung und/oder Analyse transportieren.
In einer anderen Ausführungsform umfasst das Verfahren die folgenden Schritte: Sammeln einer Vollblutprobe; Abtrennen einer Plasmaprobe von der Vollblutprobe; Sammeln der Plasmaprobe auf einer Sammeloberfläche; Trocknenlassen der Plasmaprobe auf der Sammeloberfläche; Derivatisierung der Analyte innerhalb der Plasmaprobe durch Zugabe eines Derivatisierungsmittels zur Sammeloberfläche; Übertragen der Sammeloberfläche zu einem Präparationsgefäß; Reinigung der Probe aus der Sammeloberfläche und anderen Bestandteilen; und Analysieren von Analyten von Interesse, falls vorhanden, in der Probe.
In einer anderen Ausführungsform umfasst das Verfahren die folgenden Schritte: Sammeln einer Vollblutprobe; Abtrennen einer Plasmaprobe von der Vollblutprobe; Sammeln der Plasmaprobe in einem Bauteil mit absorbierendem Material; Trocknenlassen der Plasmaprobe im Bauteil mit absorbierendem Material; Schaffung von derivatisierten Analyten innerhalb der Plasmaprobe durch Zugabe eines Derivatisierungsmittels zum Bauteil mit absorbierendem Material; Übertragen des Bauteils mit absorbierendem Material zu einem Präparationsgefäß; Reinigung der Probe aus dem Bauteil mit absorbierendem Material und anderen Bestandteilen; und Analysieren von Analyten von Interesse, falls vorhanden, in der Probe.
In anderen Ausführungsformen umfassen die Verfahren der vorliegenden Erfindung die folgenden Schritte: Sammeln, Trennen und Aliquotieren einer Plasmaprobe, Behandeln der Plasmaprobe mit einem internen Standard, Reinigen der Plasmaprobe, Derivatisierung der Plasmaprobe und Analysieren der Mischung aus Probe und dem interne Standard, um die Konzentration oder Menge an Analyten von Interesse, falls vorhanden, in der Probe mit den Konzentrationen oder Mengen an internem Standard zu vergleichen, um die Gegenwart, Menge oder Konzentration eines Analyten von Interesse zu ermitteln. Obwohl der hier beschriebene Behandlungsschritt mit internem Standard als nach der Aliquotierung stattfindend beschrieben ist, wird eine Fachperson anerkennen, dass dieser Schritt, falls der interne Standard ein markierter Analyt ist, zu jeglichem Zeitpunkt vor der Derivatisierung auftreten kann, und falls der interne Standard ein markiertes Derivatisierungsmittel ist, während der Derivatisierung auftreten wird. Einer oder mehrere Schritte von Verfahren dieser Ausführungsform der Erfindung können über die Verwendung eines PSD bewältigt werden. Wahlweise kann der interne Standard in das Blutbehälterbauteil, semipermeable Bauteil, Sammelreservoir oder Bauteil mit absorbierendem Material des PSD vorbeladen werden, vor der Sammlung der Plasmaprobe.
Andere Ausführungsformen von Verfahren der vorliegenden Erfindung umfassen die folgenden Schritte: Sammeln, Trennen und Aliquotieren einer mehrfachen Plasmaprobe, Behandeln jeder dieser mehreren Plasmaproben mit separaten internen Standards, Reinigen der Proben, Derivatisierung der Proben, Mischung der Proben und Analysieren der derivatisierten gemischten Proben als eine Charge, um die Gegenwart, Konzentrationen oder Mengen von Analyten von Interesse in jeder Probe zu bestimmen. Vorzugsweise wird jede Plasmaprobe mit einem unterschiedlichen internen Standard vor dem Mischen behandelt, wobei solche Unterschiede vorzugsweise unterschiedliche Isotopenmarkierung der internen Standards umfassen. Obwohl der Behandlungsschritt mit internem Standard hier als nach der Aliquotierung stattfindend beschrieben ist, wird eine Fachperson anerkennen, dass dieser Schritt, falls der interne Standard ein markierter Analyt ist, zu jeglichem Zeitpunkt vor der Derivatisierung auftreten kann, und falls der interne Standard ein markiertes Derivatisierungsmittel ist, während der Derivatisierung auftreten wird und zu jedem beliebigen Zeitpunkt vor dem Mischen der als eine Charge zu analysierenden Proben erfolgen kann. Einer oder mehrere Schritte von Verfahren dieser Ausführungsform der Erfindung können über die Verwendung eines separaten PSD für jede Probe bewältigt werden. Wahlweise kann jedes separate PSD mit einem analytisch unterscheidbaren internen Standard in seinem Blutbehälterbauteil, semipermeablen Bauteil, Sammelreservoir oder Bauteil mit absorbierendem Material vorbeladen werden.
Beispiele für bevorzugte Ausführungsformen des Verfahrens
Beispiel 1:
Die Analyte von Interesse Vitamin D2 und D3 werden in einer Probe von menschlichem Vollblut gesucht. Eine menschliche Vollblutprobe mit einem Volumen von ungefähr 25 µL wird in ein PSD eingeführt. Nach 3 Minuten wird das Sammelreservoir, enthaltend eine aliquotierte Plasmaprobe von 2,4 µL, aus dem PSD entfernt und an der Luft für weitere 15 Minuten trocknen gelassen. Das Plasma wird von der Vollblutprobe durch die semipermeable Membran des PSD getrennt. Das Reservoir wird in ein Präparationsgefäß gegeben, das ein 2-mL-Poplypropylen-Röhrchen ausmacht, und wird mit 2 µL des internen Standards d6-25OHVD2 (10 pg/µL) und d6-25OHVD3 (20 pg/µL) in MeOH behandelt. Das Reservoir wird weitere 3 Minuten trocknen gelassen. Das Reservoir wird 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Zwanzig µL DR1 (4 mg/mL in MeOH) werden zum Reservoir gegeben. Das Reservoir wird 10 Sekunden lang gevortext. Vierzig µL DR2 werden dann hinzugegeben (2 mg/mL in MeOH) und das Reservoir wird weitere 60 Sekunden lang gevortext.
Die Derivatisierungsreaktion wird durch die Zugabe von 40 µL DR3 (8 mg/mL in H₂O) gequencht. Die Lösung wird dann 10 Sekunden lang gevortext. Die Probe wird ohne jegliche fest verbleibende Teile des Reservoirs in ein neues Fläschchen übertragen. Die Probe wird dann mittels LC/MS analysiert. Fünfzehn µL der Probe werden in eine Umkehrphasen-Säule injiziert, mittels LC separiert und mittels MS analysiert. Wie in der 3 gezeigt, werden die absoluten Konzentrationen von VD2 und VD3 bestimmt durch das Vergleichen der Peakflächen der Analyte von Interesse mit den bekannten Peakflächen der internen Standards.
Die empfohlenen LC-MS/MS-Bedingungen schließen ein:
Die Temperatur am Autosampler wurde auf 4°C eingestellt, die Temperatur am Ofen wurde auf 40°C eingestellt.

Lösungsmittel A: 100% H₂O/0,05% Methansäure bzw. Ameisensäure und
Lösungsmittel B: 100% ACN/0,05% Methansäure können verwendet werden.

Zeit(min)	% B
4	35
14	50
15	100
18	100
18.1	25
21	Stop

Ein QTRAP4000-Triple-Quadrupol-Linear-Ionenfallen-Massenanalysator (AB Sciex) wurde im ESI-positive-Ionen-Modus verwendet. Es wurde Einheitsauflösung verwendet.

		Retentionszeit (min)*	MRM-Übergänge	CE	CXP(Volt)	DP	EP
25OHVD2	L	(10,26/9,81)	617,4/149,1	85	6	85	10
d6-25OHVD2	H	(10,20/9,76)	623,4/149,1	89	12	85	10
25VD3	L	(9,50/9,25)	605,4/149,1	93	12	85	10
d6-25OHVD3	H	(9,44/9,18)	611,4/149,1	85	6	85	10

Empfohlene Referenz-Quellparameter

Hüllgas: 20
Kollisionsgas: hoch
Ionenspray-Spannung: 5000
Temperatur: 450
Ionen-Quellgas 1: 30
Ionen-Quellengas 2: 50

	Q1	Q3		Q1	Q3
25OHVD3	605,4	149,1	d6-25OHVD3	611,4	149,1
25OHVD2	617,4	149,1	d6-25OHVD2	623,4	149,1
1,25OHVD3	621,4	149,1	d6-1,25OHVD3	627,4	149,1
1,25OHVD2	633,4	149,1	d6-1,25OHVD2	639,4	149,1

Beispiel 2:
Venös entnommenes Blut wird in Plasma unter Anwendung der Zentrifugation getrennt. Fünfzig oder 100 µL des Plasmas werden in ein Röhrchen gegeben, und 50 µL interner Standard werden hinzugegeben. Nach der Zugabe von 50 µL Phosphatpuffer wird die Mischung gevortext und dann in der Dunkelheit für 1–2 Stunden bei Raumtemperatur sich ins Gleichgewicht bringen gelassen. Ein mL MTBE (Methyl-t-butyl-ether) wird hinzugegeben und Flüssig-Flüssig-Extraktion (LLE) wird durchgeführt. Nach 2 Minuten Vortexieren werden die Proben 10 Minuten lang zentrifugiert. Die Proben werden mindestens 30 Minuten lang bei einer Temperatur von –80°C gelagert. Die Flüssigkeitsoberschicht wird in ein Gefäß gegossen und bei 30°C mit Stickstoffgas getrocknet. Das Gefäß wird 10 Sekunden lang gevortext, mit Zugabe von fünfzig µL DR1 (2 mg/mL in MeOH). Fünfzig µL DR2 werden hinzugegeben (2 mg/mL in MeOH) und das Gefäß wird weitere 60 Sekunden lang gevortext. Die Derivatisierungsreaktion wird durch die Zugabe von 50 µL DR3 (8 mg/mL in H₂O) gequencht. Die Lösung wird dann 10 Sekunden lang gevortext. Die Probe wird ohne jegliche fest verbleibende Teile in ein neues Gefäß übertragen. Die Probe wird dann mittels LC/MS analysiert. Fünfzehn µL der Probe werden in eine Umkehrphasen-Säule injiziert, mittels LC separiert und mittels MS analysiert. Wie in der 9 gezeigt, werden die absoluten Konzentrationen von VD2 und VD3 bestimmt durch das Vergleichen der Peakflächen der Analyte von Interesse mit den bekannten Peakflächen der internen Standards.
Somit sind spezifische Zusammensetzungen und Verfahren zur Bestimmung von Analyten von Interesse aus einer Probe offenbart worden. Es sollte Fachleuten allerdings ersichtlich sein, dass viele weitere Modifikationen neben den bereits beschriebenen möglich sind, ohne von den erfindungsgemäßen Konzepten hierin abzuweichen. Der erfindungsgemäße Gegenstand soll daher nicht beschränkt werden, außer im Sinne der Offenbarung. Darüber hinaus sollten bei der Interpretation der Offenbarung alle Ausdrücke in der breitestmöglichen Weise, die mit dem Zusammenhang konsistent ist, interpretiert werden. Insbesondere sollen die Ausdrücke "umfasst" und "umfassend" so interpretiert werden, dass sie Elemente bzw. Bauteile, Bestandteile oder Schritte in einer nicht-exklusiven Weise bezeichnen, was anzeigt, dass die bezeichneten Bauteile, Bestandteile oder Schritte mit anderen Elementen vorliegen oder verwendet oder kombiniert werden können, auf die nicht ausdrücklich Bezug genommen worden ist.

Claims

Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart, Konzentration oder Menge von Analyten von Interesse in einer Probe, umfassend die folgenden Schritte: a. Sammeln eines biologischen Fluids; b. Trennen einer flüssigen Probe von dem biologischen Fluid; c. Aliquotieren der Probe; d. Derivatisieren von Analyten von Interesse innerhalb der Probe; e. Überführen der Probe zu einem Präparationsgefäß; f. Reinigen der Probe; und g. Analysieren von Analyten von Interesse der Probe.
Verfahren von Anspruch 1, in dem das eine biologische Fluid Vollblut ist.
Verfahren von Anspruch 1, in dem die flüssige Probe durch die Verwendung eines PSD getrennt und aliquotiert wird.
Verfahren von Anspruch 3, in dem ein oder mehrere des Blutbehälterbauteils, semipermeablen Bauteils oder Sammelreservoirs des PSD mit einem oder mit mehreren von einem Derivatisierungsmittel und einem oder mehreren internen Standards im Voraus beladen wird bzw. werden.
Verfahren von Anspruch 4, in dem ein oder mehrere vom Blutbehälterbauteil, semipermeablen Bauteil oder Sammelreservoir des PSD mit einem Derivatisierungsmittel im Voraus beladen wird bzw. werden.
Verfahren von Anspruch 5, in dem ein oder mehrere der ein oder mehreren Derivatisierungsmittel und des einen oder der mehreren internen Standards isotopenmarkiert bzw. getagged werden.
Verfahren von Anspruch 1, in dem das Derivatisierungsmittel eins oder mehrere von folgenden umfasst: 4-(1-Methyl-4-pyrindinylmethyl)-1, 2, 4-triazolidin-3,5-dion, 4-Phenyl-1,2,4-triazolidin-3,5-dion und 4-Ferrocenylmethyl-1,2,4-triazolidin-3,5-dion und deren Isomere, Isotope und Analoga.
Verfahren von Anspruch 1, in dem die flüssige Probe mit einem oder mehreren von Flüssigchromatographie, Massenspektrometrie, Kapillarelektrophorese, Gaschromatographie, Lösungsmittelextraktion, Filtration, Präzipitation, Zentrifugation und Verdünnung gereinigt wird.
Verfahren von Anspruch 1, in dem die flüssige Probe mittels Massenspektrometrie analysiert wird.
Verfahren von Anspruch 1, welches ferner den Schritt, vor der Analyse, des Behandelns der Probe mit einem internen Standard umfasst.
Verfahren von Anspruch 10, in dem der interne Standard eines oder mehrere von einem isotopenmarkierten Analyten von Interesse oder einem isotopenmarkierten Derivatisierungsmittel umfasst.
Verfahren von Anspruch 11, in welchem die flüssige Probe durch die Verwendung eines PSD getrennt und aliquotiert wird und der interne Standard in einem oder in mehreren von dem Probenbehälterbauteil, semipermeablen Bauteil oder Sammelreservoir des PSD vor der Einführung der Probe geladen wird.
Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart, Konzentration oder Menge von Secosteroiden von Interesse in einer Blutprobe, welches die folgenden Schritte umfasst: a. Sammeln von Vollblut; b. Abtrennen einer Plasmaprobe von der Vollblutprobe; c. Aliquotieren der Plasmaprobe; d. Derivatisieren von Secosteroiden innerhalb der Plasmaprobe unter Verwendung eines Derivatisierungsmittels; e. Transferieren der Probe zu einem Präparationsgefäß; f. Reinigen der Probe; und g. Analysieren von erwünschten Komponenten der Probe.
Verfahren von Anspruch 13, in dem die Plasmaprobe mittels der Verwendung eines PSD abgetrennt und aliquotiert wird.
Verfahren von Anspruch 14, in dem ein oder mehrere von dem Blutbehälterbauteil, semipermeablen Bauteil oder Sammelreservoir des PSD mit einem oder mehreren eines Derivatisierungsmittels oder einem oder mehreren internen Standards im Voraus beladen wird bzw. werden.
Verfahren von Anspruch 15, in welchem ein oder mehrere von dem einen oder den mehreren Derivatisierungsmitteln und dem einen und mehreren internen Standards isotopenmarkiert ist bzw. sind.
Verfahren von Anspruch 13, in dem das Derivatisierungsmittel eines oder mehrere von folgenden umfasst: 4-(1-Methyl-4-pyrindinylmethyl)-1, 2, 4-triazolidin-3,5-dion, 4-Phenyl- 1,2,4-triazolidin-3,5-dion und 4-Ferrocenylmethyl-1,2,4-triazolidin-3,5-dion und deren Isomere, Isotope und Analoga.
Verfahren von Anspruch 13, in dem die Probe durch eines oder mehrere von Flüssigchromatographie, Massenspektrometrie, Kapillarelektrophorese, Gaschromatographie, Lösungsmittelextraktion, Filtration, Präzipitation, Zentrifugation und Verdünnung gereinigt wird.
Verfahren von Anspruch 13, in dem die Probe mittels Massenspektrometrie analysiert wird.
Verfahren von Anspruch 13, welches ferner den Schritt, vor der Analyse, des Behandelns der Probe mit einem internen Standard umfasst.
Verfahren von Anspruch 20, in dem der interne Standard eines oder mehrere von einem isotopenmarkierten Analyten von Interesse oder einem isotopenmarkierten Derivatisierungsmittel umfasst.
Verfahren von Anspruch 21, bei dem die Probe durch die Verwendung von einem PSD getrennt und aliquotiert wird, und der interne Standard in ein oder in mehrere von dem Probenbehälterbauteil, halbpermeablen Bauteil oder Sammelreservoir des PSD vor der Einführung der Probe geladen wird.
Verfahren von Anspruch 20, in dem: (a) mehrere Plasmaproben separat mit mehreren internen Standards behandelt werden, wobei jeder der internen Standards sich analytisch von jedem anderen der internen Standards unterscheidet; und (b) nachdem jede der Proben mit einem der internen Standards behandelt worden ist, die Proben als ein Ansatz analysiert werden.
Verfahren von Anspruch 23, wobei jede der Proben durch die Verwendung eines separaten PSD getrennt und aliquotiert wird und jedes PSD mit einem analytisch verschiedenen internen Standard in einem oder mehreren von dem Probenbehälterbauteil, semi-permeablen Bauteil oder Sammelreservoir des PSD vor der Einführung der Probe beladen wird.
Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart, Konzentration und Menge an Vitamin D in einer Blutprobe, welches die folgenden Schritte umfasst: a. Sammeln von Vollblut; b. Abtrennen einer Plasmaprobe von der Vollblutprobe; c. Aliquotieren der Plasmaprobe; d. Derivatisieren von Vitamin D innerhalb der Plasmaprobe unter Verwendung eines Derivatisierungsmittels; e. Überführen der Probe zu einem Präparationsgefäß; f. Reinigen der Probe; und g. Analysieren von gewünschten Komponenten der Probe.
Verfahren von Anspruch 25, in dem die Plasmaprobe von der Vollblutprobe abgetrennt und unter Verwendung eines PSD aliquotiert wird.
Verfahren von Anspruch 26, in dem ein oder mehrere von dem Blutbehälterbauteil, semipermeablem Bauteil oder Sammelreservoir des PSD mit einem oder mehreren eines Derivatisierungsmittels oder einem oder mehreren internen Standards im Voraus beladen wird bzw. werden.
Verfahren von Anspruch 27, in dem ein oder mehrere von dem einen oder der mehreren Derivatisierungsmitteln und dem einen oder der mehreren Standards isotopenmarkiert wird bzw. werden.
Verfahren von Anspruch 25, in dem das Derivatisierungsmittel eines oder mehrere von folgenden umfasst: 4-(1-Methyl-4-pyrindinylmethyl)-1, 2, 4-triazolidine-3,5-dion, 4-Phenyl-1,2,4-triazolidin-3,5-dion und 4-Ferrocenylmethyl-1,2,4-triazolidin-3,5-dion und deren Isomere, Isotope und Analoga.
Verfahren von Anspruch 25, in dem die Probe mit einem oder mehreren von Flüssigchromatographie, Massenspektrometrie, Kapillarelektrophorese, Gaschromatographie, Lösungsmittelextraktion, Filtration, Präzipitation, Zentrifugation und Verdünnung gereinigt wird.
Verfahren von Anspruch 25, in dem die Probe mittels Massenspektrometrie analysiert wird.
Verfahren von Anspruch 25, welches ferner den Schritt, vor der Analyse, der Behandlung der Probe mit einem internen Standard umfasst.
Verfahren von Anspruch 32, in dem der interne Standard ein oder mehrere von einem isotopenmarkierten Analyten von Interesse oder von einem isotopenmarkierten Derivatisierungsmittel umfasst.
Verfahren von Anspruch 33, in dem die Probe unter Verwendung eines PSD getrennt und aliquotiert wird, und wobei der interne Standard in einen oder in mehrere von dem Probenbehälterbauteil, semipermeablen Bauteil oder Sammelreservoir des PSD vor der Einführung der Probe geladen wird.
Verfahren von Anspruch 32, in dem: (a) mehrere Plasmaproben separat mit mehreren internen Standards behandelt werden, wobei jeder der internen Standards sich analytisch von jedem anderen der internen Standards unterscheidet; und (b) nachdem jede der Proben mit einem der internen Standards behandelt worden ist, die Probe als ein Ansatz analysiert wird.
Verfahren von Anspruch 35, wobei jede der Proben durch die Verwendung eines separaten PSD getrennt und aliquotiert wird und jedes PSD mit einem analytisch verschiedenen internen Standard in einem oder mehreren von dem Probenbehälterbauteil, semi-permeablen Bauteil oder Sammelreservoir des PSD vor der Einführung der Probe beladen wird.
Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart, Konzentration und Menge von Analyten von Interesse in einer Plasmaprobe, welches die folgenden Schritte umfasst: a. Sammeln, Abtrennen und Aliquotieren einer Plasmaprobe unter Verwendung eines PSD, wobei das Sammelreservoir des PSD ein Bauteil aus absorptivem Material umfasst, und die aliquotierte Plasmaprobe im Wesentlichen durch das Bauteil aus absorptivem Material absorbiert wird; b. Herstellen der Plasmaprobe zur Analyse; c. Reinigen der Plasmaprobe; und d. Analysieren der Plasmaprobe.
Verfahren von Anspruch 37, wobei der Herstellungsschritt ferner die folgenden Unterschritte umfasst: a. Exponieren des Bauteils aus absorptivem Material an die Atmosphäre; b. Hineinbringen des Bauteils aus absorptivem Material in ein Präparationsgefäß; c. Hinzugeben eines Extraktionsmittels zu dem Präparationsgefäß; und d. Hinzugeben eines Derivatisierungsmittels zu dem Präparationsgefäß.
Verfahren von Anspruch 38, wobei der Reinigungsschritt eines oder mehrere von Flüssigchromatographie, Gaschromatographie, Kapillarelektrophorese, Ionenmobilitätstrennung, Elektrospray-Ionisierung (ESI), Matrix-unterstützte Laserdesorptionsionisierung (MALDI), direkte Elektrospray-Ionisierung (DESI) und Lösungsmittelextraktion umfasst.
Verfahren von Anspruch 38, wobei die Analyseschritte die Mitwirkung der Massenspektrometrie umfassen.
Verfahren gemäß Anspruch 38, in dem das Derivatisierungsmittel eines oder mehrere von folgenden umfasst: 4-(1-Methyl-4-pyrindinylmethyl)-1, 2, 4-triazolidin-3,5-dion, 4-Phenyl-1,2,4-Itriazolidin-3,5-dion und 4-Ferrocenylmethyl-1,2,4-triazolidin-3,5-dion und ihre Isomer, Isotope und Analoga.
Verfahren von Anspruch 38, wobei das Derivatisierungsmittel und Extraktionsmittel zusammen in einem einzelnen Schritt hinzu gegeben werden.
Verfahren von Anspruch 38, wobei das Derivatisierungsmittel mit einer funktionellen Gruppe auf den Analyten von Interesse reagiert.
Verfahren von Anspruch 38, wobei der interne Standard zu dem Bauteil aus absorptivem Material [eine oder mehrere von] vor der Einführung der Probe oder nach der Einführung der Probe hinzu gegeben wird.
Verfahren von Anspruch 38, wobei ein isotopenmarkierter interner Standard zu der Vollblutprobe hinzu gegeben wird, bevor die Probe zu dem PSD eingeführt wird.
Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart, Konzentration und Menge an Vitamin D und seinen Analogan in einer Plasmaprobe, welches die folgenden Schritte umfasst: a. Sammeln, Trennen und Aliquotieren einer Plasmaprobe unter Verwendung eines PSD, wobei das Sammelreservoir des PSD ein Bauteil aus absorptivem Material umfasst und die aliquotierte Plasmaprobe im Wesentlichen durch das Bauteil aus absorptivem Material absorbiert wird; b. Herstellen einer Plasmaprobe zur Analyse; c. Reinigen der Plasmaprobe; und d. Analysieren der Plasmaprobe.
Verfahren von Anspruch 46, wobei der Herstellungsschritt ferner die folgenden Unterschritte umfasst: a. Exponieren des Bauteils aus absorptivem Material an die Atmosphäre; b. Hineinbringen des Bauteils aus absorptivem Material in ein Präparationsgefäß; c. Hinzugeben eines Extraktionsmittels zu dem Präparationsgefäß; und d. Hinzugeben eines Derivatisierungsmittels zu dem Präparationsgefäß.
Verfahren von Anspruch 47, wobei der Reinigungsschritt eines oder mehrere von Flüssigchromatographie, Gaschromatographie, Kapillarelektrophorese, Ionenmobilitätstrennung, Elektrospray-Ionisierung (ESI), Matrix-unterstützte Laserdesorptionsionisierung (MALDI), direkte Elektrospray-Ionisierung (DESI) und Lösungsmittelextraktion umfasst.
Verfahren von Anspruch 47, wobei die Analyseschritte die Mitwirkung der Massenspektrometrie umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 47, in dem das Derivatisierungsmittel eines oder mehrere von folgenden umfasst: 4-(1-Methyl-4-pyrindinylmethyl)-1, 2, 4-triazolidin-3,5-dion, 4-Phenyl-1,2,4-Itriazolidin-3,5-dion und 4-Ferrocenylmethyl-1,2,4-triazolidin-3,5-dion und ihre Isomer, Isotope und Analoga.
Verfahren von Anspruch 47, wobei ein isotopenmarkierter interner Standard der Probe hinzugefügt wird.