CN117030917B - 一种维生素d代谢物的衍生方法与检测方法和检测维生素d代谢物的试剂盒 - Google Patents
一种维生素d代谢物的衍生方法与检测方法和检测维生素d代谢物的试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117030917B CN117030917B CN202311013118.3A CN202311013118A CN117030917B CN 117030917 B CN117030917 B CN 117030917B CN 202311013118 A CN202311013118 A CN 202311013118A CN 117030917 B CN117030917 B CN 117030917B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- vitamin
- mobile phase
- voltage
- biological sample
- reagent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 229930003316 Vitamin D Natural products 0.000 title claims abstract description 51
- QYSXJUFSXHHAJI-XFEUOLMDSA-N Vitamin D3 Natural products C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)CCCC(C)C)=C/C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C QYSXJUFSXHHAJI-XFEUOLMDSA-N 0.000 title claims abstract description 51
- 235000019166 vitamin D Nutrition 0.000 title claims abstract description 51
- 239000011710 vitamin D Substances 0.000 title claims abstract description 51
- 150000003710 vitamin D derivatives Chemical class 0.000 title claims abstract description 51
- 229940046008 vitamin d Drugs 0.000 title claims abstract description 51
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 title claims abstract description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 29
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims abstract description 20
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 10
- JWUBBDSIWDLEOM-DTOXIADCSA-N calcidiol Chemical compound C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@@H](CCCC(C)(C)O)C)=C\C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C JWUBBDSIWDLEOM-DTOXIADCSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims abstract description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 5
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims abstract description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical group OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 81
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 35
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- MMIRDFLZTSMUQF-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-1,2,4-triazolidine-3,5-dione Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1N1C(=O)NNC1=O MMIRDFLZTSMUQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 claims description 10
- 239000007789 gas Substances 0.000 claims description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 7
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 claims description 7
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 6
- XEFCWBLINXJUIV-UHFFFAOYSA-N acetic acid;iodobenzene Chemical compound CC(O)=O.CC(O)=O.IC1=CC=CC=C1 XEFCWBLINXJUIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 5
- 238000001294 liquid chromatography-tandem mass spectrometry Methods 0.000 claims description 4
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 2
- 238000000889 atomisation Methods 0.000 claims description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 13
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 4
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 4
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GMRQFYUYWCNGIN-NKMMMXOESA-N calcitriol Chemical compound C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@@H](CCCC(C)(C)O)C)=C\C=C1\C[C@@H](O)C[C@H](O)C1=C GMRQFYUYWCNGIN-NKMMMXOESA-N 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 3
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 3
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 3
- 230000009102 absorption Effects 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- JWUBBDSIWDLEOM-XHQRYOPUSA-N (3e)-3-[(2e)-2-[1-(6-hydroxy-6-methylheptan-2-yl)-7a-methyl-2,3,3a,5,6,7-hexahydro-1h-inden-4-ylidene]ethylidene]-4-methylidenecyclohexan-1-ol Chemical compound C1CCC2(C)C(C(CCCC(C)(C)O)C)CCC2\C1=C\C=C1/CC(O)CCC1=C JWUBBDSIWDLEOM-XHQRYOPUSA-N 0.000 description 1
- GMRQFYUYWCNGIN-ZVUFCXRFSA-N 1,25-dihydroxy vitamin D3 Chemical compound C1([C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@@H](CCCC(C)(C)O)C)=CC=C1C[C@@H](O)C[C@H](O)C1=C GMRQFYUYWCNGIN-ZVUFCXRFSA-N 0.000 description 1
- JWUBBDSIWDLEOM-NQZHSCJISA-N 25-hydroxy-3 epi cholecalciferol Chemical compound C1([C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@@H](CCCC(C)(C)O)C)=CC=C1C[C@H](O)CCC1=C JWUBBDSIWDLEOM-NQZHSCJISA-N 0.000 description 1
- 235000021318 Calcifediol Nutrition 0.000 description 1
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000033558 biomineral tissue development Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000002449 bone cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004097 bone metabolism Effects 0.000 description 1
- 239000011612 calcitriol Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- SVWLIIFHXFGESG-UHFFFAOYSA-N formic acid;methanol Chemical compound OC.OC=O SVWLIIFHXFGESG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFWPJPIVLCBXFJ-UHFFFAOYSA-N glymidine Chemical compound N1=CC(OCCOC)=CN=C1NS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 QFWPJPIVLCBXFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000009103 reabsorption Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 208000007442 rickets Diseases 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 102000009310 vitamin D receptors Human genes 0.000 description 1
- 108050000156 vitamin D receptors Proteins 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明涉及物质检测技术领域，尤其涉及一种维生素D代谢物的衍生方法与检测方法和检测维生素D代谢物的试剂盒。本发明维生素D代谢物的衍生方法，包括如下步骤：(1)沉淀生物样品中的蛋白，得到待处理的生物样品；(2)对所述的待处理的生物样品进行过膜处理，得到滤液；将所述的滤液与衍生试剂1反应2～10min，得到中间液；(3)在所述的中间液中加入衍生试剂2，反应2～10min，氮气吹干后，复溶得到维生素D代谢物；所述维生素D代谢物为25(OH)D2、25(OH)D3和1α,25(OH)2VD3。本发明的方法可以定量检测维生素D代谢物，方法稳定高效，具有良好的临床意义。
Description
技术领域
本发明涉及物质检测技术领域，尤其涉及一种维生素D代谢物的衍生方法与检测方法和检测维生素D代谢物的试剂盒。
背景技术
维生素D是一类人体必须的脂溶性维生素，被认为是决定人体体质情况的重要指标，也是体内钙吸收的重要衡量标准，经过肝脏和肾脏代谢，会产生一系列代谢物。25-羟基维生素D是血中被检测的标志物，是人体内维生素D的主要储存形式，通过检测它可以确定总体维生素D的情况，是衡量人体内维生素D营养状态的最佳指标。25-羟基维生素D3(25(OH)D3)、D2(25(OH)D2)(结构式如图1、2)已有大量临床研究，与诸如儿童佝偻病，冠心病，糖尿病，小儿头疼，癌症等众多疾病有密切关系。1α,25(OH)2D3也是其中的一种活性代谢物。近来研究表明，1α,25(OH)2VD3可促进小肠对钙磷的吸收，维持钙、磷正常代谢及骨骼矿化，调节钙、磷在肾脏的重吸收。被用作为肾相关疾病的生物标志物，而且直接作用于骨代谢的骨骼细胞上。1α,25(OH)2VD3还影响二型糖尿病人血清中维生素D受体的表达。
分别检测25(OH)D2、25(OH)D3和1α,25(OH)2VD3才能正确评估维生素D水平和维生素D补充疗法的疗效。因此，分别测定25(OH)D2、25(OH)D3和1α,25(OH)2VD3可以直接反映生物体内维生素D真实活性的水平，具有重要的临床意义和疗效判定意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种维生素D代谢物的衍生方法与检测方法和检测维生素D代谢物的试剂盒。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种维生素D代谢物的衍生方法，包括如下步骤：
(1)沉淀生物样品中的蛋白，得到待处理的生物样品；
(2)对所述的待处理的生物样品进行过膜处理，得到滤液；将所述的滤液与衍生试剂1反应2～10min，得到中间液；
(3)在所述的中间液中加入衍生试剂2，反应2～10min，氮气吹干后，复溶得到维生素D代谢物的衍生物；
所述维生素D代谢物为25(OH)D2、25(OH)D3和1α,25(OH)2VD3。
作为优选，所述生物样品为血清；
步骤(1)所述沉淀生物样品中的蛋白的方法为：将生物样品与蛋白沉淀试剂混合，反应3～5min；
所述生物样品与蛋白沉淀试剂混合的体积比为1～20:60；
所述蛋白沉淀试剂为甲醇或乙腈。
作为优选，步骤(2)所述过膜处理为过有机滤膜；
所述膜的孔径为0.2～0.25μm。
作为优选，所述衍生试剂1为甲醇或乙腈；
所述甲醇为含有碘苯二乙酸的甲醇；
所述碘苯二乙酸的终浓度为1～10mg/mL；
所述滤液与衍生试剂1的体积比为2～4：1；
步骤(2)所述反应的温度为20～30℃。
作为优选，所述衍生试剂2为4-[4-(二甲基氨基)苯基]-1,2,4-三唑烷-3，5-二酮溶液；
所述4-[4-(二甲基氨基)苯基]-1,2,4-三唑烷-3，5-二酮溶液的溶剂为甲醇或乙腈；
所述4-[4-(二甲基氨基)苯基]-1,2,4-三唑烷-3，5-二酮溶液的终浓度为1～10mg/mL；
步骤(3)所述反应的温度为20～30℃。
作为优选，所述复溶的溶剂为乙腈或甲醇。
本发明还提供了所述的衍生方法得到的维生素D代谢物的衍生物，所述维生素D代谢物的衍生物用于检测维生素D代谢物。
本发明还提供了一种检测维生素D代谢物的方法，包括如下步骤：
利用LC-MS/MS方法检测维生素D代谢物的衍生物；
流动相A相为0.1～0.2vt％的甲酸水溶液；
流动相B相为甲酸甲醇溶液；
所述甲酸甲醇溶液的制备方法为：按甲酸与甲醇体积比为1～2:1000混合，得到；
色谱柱为C18色谱柱；
运行时间0min，流速0.4mL/min，流动相A 70％，流动相B 30％；
运行时间0.5min，流速0.4mL/min，流动相A 70％，流动相B 30％；
运行时间1min，流速0.4mL/min，流动相A 35％，流动相B 65％；
运行时间5min，流速0.4mL/min，流动相A 0％，流动相B 100％；
运行时间5.01min，流速0.4mL/min，流动相A 70％，流动相B 30％；
运行时间6.5min，流速0.4mL/min，流动相A 70％，流动相B 30％。
作为优选，质谱条件如下：
气帘气10psi、碰撞气8psi、离子化电压5500V、离子源温度500℃、雾化气GS118psi、辅助气GS250psi；
检测25(OH)D2时的母离子为631.3、子离子为341.2、停留时间50s，去簇电压200V、入口电压10V、碰撞电压31V、碰撞室电压11V；
检测25(OH)D3时的母离子为619.3、子离子为341.2、停留时间50s，去簇电压200V、入口电压10V、碰撞电压35V、碰撞室电压11V；
检测1α,25(OH)2VD3时的母离子为635.3、子离子为357.2、停留时间50s，去簇电压28V、入口电压13V、碰撞电压31V、碰撞室电压3V。
本发明还提供了一种检测维生素D代谢物的试剂盒，包括衍生试剂1和衍生试剂2；
所述衍生试剂1为甲醇或乙腈；
所述甲醇为含有碘苯二乙酸的甲醇；
所述衍生试剂2为4-[4-(二甲基氨基)苯基]-1,2,4-三唑烷-3，5-二酮溶液；
所述4-[4-(二甲基氨基)苯基]-1,2,4-三唑烷-3，5-二酮溶液的溶剂为甲醇或乙腈；
所述4-[4-(二甲基氨基)苯基]-1,2,4-三唑烷-3，5-二酮溶液的终浓度为1～10mg/mL；
所述检测方法为所述的方法。
本发明提供了一种维生素D代谢物的衍生方法与检测方法和检测维生素D代谢物的试剂盒，本发明的方法具有如下优点：
(1)灵敏度高；在使用尽可能低的血清样品体积的前提下，可准确定量含量最低的维生素D代谢物；
(2)简单快速的样本前处理分析；缩短衍生化时间、样品制备及分析时间；
(3)分析成本低；使用廉价，容易合成的化学衍生化试剂，降低成本；
(4)特异性良好；使用新的衍生化方法及优化的衍生化程序，抗干扰能力强，方法稳定高效。
本发明使用的衍生试剂1和衍生试剂2可以与维生素D代谢物发生反应后，反应活性高，生成的物质在质谱中响应好，抗干扰能力强，具体衍生试剂1和衍生试剂2与维生素D代谢物反应过程如图3所示。
附图说明
图1为25(OH)D2的结构图。
图2为25(OH)D3的结构图。
图3为衍生试剂1和衍生试剂2与维生素D代谢物反应过程图。
图4为25(OH)D2的标准曲线。
图5为25(OH)D3的标准曲线。
图6为1α，25(OH)2D3的标准曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明实施例中的25(OH)D2、25(OH)D3和1α,25(OH)2VD3的校准品购自上海安谱实验科技股份有限公司。
本发明实施例中的血清采集自医检所健康志愿者。
实施例1
维生素D代谢物的衍生
取25(OH)D2、25(OH)D3和1α,25(OH)2VD3校准品用甲醇稀释成浓度分别为40ng/mL、200ng/mL和800pg/mL的校准品溶液。
取校准品溶液，标号为S1溶液；取500μLS1溶液，加入500μL甲醇，标号为S2；取500μLS2溶液，加入500μL甲醇标号为S3；取200μLS3溶液，加入800μL甲醇标号为S4；取500μLS4溶液，加入500μL甲醇标号为S5取500μLS5溶液，加入500μL甲醇标号为S6。具体稀释后的校准品溶液作为线性范围，具体如表1所示。
表1线性范围
| 线性范围 | S1 | S2 | S3 | S4 | S5 | S6 |
| 25(OH)D3(ng/mL) | 200 | 100 | 50 | 10 | 5 | 2.5 |
| 25(OH)D2(ng/mL) | 40 | 20 | 10 | 2 | 1 | 0.5 |
| 1α，25(OH)2D3(pg/mL) | 800 | 400 | 200 | 40 | 20 | 10 |
取200μLS1～S6溶液，分别加入50μL内标液和600μL甲醇，涡旋震荡3min，使蛋白沉淀后，得到待处理的生物样品。
内标液中的有效成分为25-(OH)VD3-D6、25-(OH)VD2-D3、1α,25(OH)2VD3-D3，终浓度均为50ng/mL；配置内标液的溶剂为乙腈。
将待处理的生物样品经过0.22μm的有机滤膜再次除去生物样品溶液中的蛋白，取滤液90μL，加入衍生试剂130μL(含有终浓度为10mg/mL碘苯二乙酸的甲醇)25℃反应2min，得到中间液。在所述的中间液中加入终浓度为10mg/mL的衍生试剂2(4-[4-(二甲基氨基)苯基]-1,2,4-三唑烷-3，5-二酮)，25℃反应2min，氮气吹干，用40μL甲醇复溶，涡旋1min，得到维生素D代谢物的衍生物。
实施例2
LC-MS/MS方法检测维生素D代谢物
流动相A相：0.1％甲酸水溶液；
流动相B相：0.1％甲酸甲醇溶液(按甲酸与甲醇体积比为1～2:1000混合，得到)；
色谱柱为C18色谱柱；柱温为40℃。
流动相梯度及流速如表2所示。
表2流动相梯度及流速
| 运行时间(min) | 流速(mL/min) | 流动相A％ | 流动相B％ |
| 0.00 | 0.4 | 70 | 30 |
| 0.5 | 0.4 | 70 | 30 |
| 1.00 | 0.4 | 35 | 65 |
| 5.00 | 0.4 | 0 | 100 |
| 5.01 | 0.4 | 70 | 30 |
| 6.50 | 0.4 | 70 | 30 |
质谱检测时的参数如表3所示。
表3质谱条件
离子源参数如表4所示。
表4离子源参数
按照上述参数检测S1～S6溶液中维生素D代谢物的衍生物，以线性范围中所示的标示浓度为横坐标(x)，以实际检测峰面积与各自内标峰面积的比值为纵坐标(y)，绘制标准曲线。得到的标准曲线如图4～6所示。
25(OH)D2的标准曲线：y＝0.31827x-0.02712，r＝0.99941；
25(OH)D3的标准曲线：y＝0.10389x-0.04261，r＝0.99891；
1α，25(OH)2D3的标准曲线：y＝3.63590e-5x+6.20745e-4，r＝0.99940。
实施例3
取25(OH)D2、25(OH)D3和1α,25(OH)2VD3校准品溶液，用甲醇将25(OH)D2校准品溶液稀释成1ng/mL、4ng/mL和20ng/mL；将25(OH)D3校准品溶液稀释成5ng/mL、20ng/mL和80ng/mL；将1α,25(OH)2VD3校准品溶液稀释成0.005ng/mL、0.02ng/mL和0.08ng/mL。按照实施例1的维生素D代谢物的衍生方法处理各个校准品稀释液后，按照实施例1的LC-MS/MS方法检测衍生处理的各个校准品稀释液的峰面积，分析测定3个批次，计算加样回收率和精密度。结果如表5所示。
加样回收率的计算公式为：
式中：
R：回收率；
V：高值样本体积；
V0：低浓度样本体积；
C：高值样本加入到低浓度样本后的检测浓度；
C0：低浓度样本的浓度；
Cs：高值样本的浓度。
表5回收率和精密度
表5显示，本发明的方法检测维生素D代谢物后的平均回收率在85％～105％范围内，重现性良好，加样回收率良好，精密度为0.5％～5.5％范围内，检测结果的准确度较高。
实施例4
用实施例1～2的方法检测20个人血清样本，血清中维生素D代谢物的浓度结果如表6所示。
表6人血清中维生素D代谢物D浓度
由以上实施例可知，本发明一种维生素D代谢物的衍生方法与检测方法和检测维生素D代谢物的试剂盒。本发明用于检测维生素D代谢物的方法具有(1)灵敏度高；(2)简单快速的样本前处理分析；(3)分析成本低；(4)特异性良好的优点。具有重要的临床意义和疗效判断意义。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种检测维生素D代谢物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
利用LC-MS/MS方法检测维生素D代谢物的衍生物；
维生素D代谢物的衍生方法，包括如下步骤：
（1）沉淀生物样品中的蛋白，得到待处理的生物样品；
（2）对所述的待处理的生物样品进行过膜处理，得到滤液；将所述的滤液与衍生试剂1反应2~10min，得到中间液；
（3）在所述的中间液中加入衍生试剂2，反应2~10min，氮气吹干后，复溶得到维生素D代谢物的衍生物；
所述维生素D代谢物为25（OH）D2、25（OH）D3和1α,25（OH）2VD3；
所述生物样品为血清；
步骤（1）所述沉淀生物样品中的蛋白的方法为：将生物样品与蛋白沉淀试剂混合，反应3~5min;
所述生物样品与蛋白沉淀试剂混合的体积比为1~20:60；
所述蛋白沉淀试剂为甲醇或乙腈；
步骤（2）所述过膜处理为过有机滤膜；
所述膜的孔径为0.2~0.25μm；
所述衍生试剂1为含有碘苯二乙酸的甲醇；
所述碘苯二乙酸的终浓度为1~10mg/mL；
所述滤液与衍生试剂1的体积比为2~4：1；
步骤（2）所述反应的温度为20~30℃；
所述衍生试剂2为4-[4-(二甲基氨基）苯基]-1,2,4-三唑烷-3，5-二酮溶液；
所述4-[4-(二甲基氨基）苯基]-1,2,4-三唑烷-3，5-二酮溶液的溶剂为甲醇或乙腈；
所述4-[4-(二甲基氨基）苯基]-1,2,4-三唑烷-3，5-二酮溶液的终浓度为1~10mg/mL；
步骤（3）所述反应的温度为20~30℃；
所述复溶的溶剂为乙腈或甲醇；
流动相A相为0.1~0.2vt%的甲酸水溶液；
流动相B相为甲酸甲醇溶液；
所述甲酸甲醇溶液的制备方法为：按甲酸与甲醇体积比为1~2:1000混合，得到；
色谱柱为C18色谱柱；
运行时间0min，流速0.4mL/min，流动相A 70%，流动相B 30%；
运行时间0.5min，流速0.4mL/min，流动相A 70%，流动相B 30%；
运行时间1min，流速0.4mL/min，流动相A 35%，流动相B 65%；
运行时间5min，流速0.4mL/min，流动相A 0%，流动相B 100%；
运行时间5.01min，流速0.4mL/min，流动相A 70%，流动相B 30%；
运行时间6.5min，流速0.4mL/min，流动相A 70%，流动相B 30%；
质谱条件如下：
气帘气10psi 、碰撞气8 Unit、离子化电压5500V、离子源温度500℃、雾化气GS118psi、辅助气GS2 50psi；
检测25（OH）D2时的母离子为631.3、子离子为341.2、停留时间50s，去簇电压200V、入口电压10V、碰撞电压31V、碰撞室电压11V；
检测25（OH）D3时的母离子为619.3、子离子为341.2、停留时间50s，去簇电压200V、入口电压10V、碰撞电压35V、碰撞室电压11V；
检测1α,25（OH）2VD3时的母离子为635.3、子离子为357.2、停留时间50s，去簇电压28V、入口电压13V、碰撞电压31V、碰撞室电压3V。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311013118.3A CN117030917B (zh) | 2023-08-11 | 2023-08-11 | 一种维生素d代谢物的衍生方法与检测方法和检测维生素d代谢物的试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311013118.3A CN117030917B (zh) | 2023-08-11 | 2023-08-11 | 一种维生素d代谢物的衍生方法与检测方法和检测维生素d代谢物的试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117030917A CN117030917A (zh) | 2023-11-10 |
| CN117030917B true CN117030917B (zh) | 2024-05-17 |
Family
ID=88634950
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311013118.3A Active CN117030917B (zh) | 2023-08-11 | 2023-08-11 | 一种维生素d代谢物的衍生方法与检测方法和检测维生素d代谢物的试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117030917B (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101910819A (zh) * | 2007-11-28 | 2010-12-08 | 奎斯特诊断投资公司 | 通过质谱法检测二羟基维生素d代谢物的方法 |
| CN110824025A (zh) * | 2018-08-09 | 2020-02-21 | 上海医药临床研究中心 | 一种维生素d代谢物的检测方法 |
| JP2022101457A (ja) * | 2020-12-24 | 2022-07-06 | 学校法人東京理科大学 | 化合物及び誘導体化試薬、並びに化合物の合成方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9068995B2 (en) * | 2013-03-15 | 2015-06-30 | Novilytic, LLC | Method for determining derivatized analytes in a separated biological fluid |
| JP6905703B2 (ja) * | 2016-09-29 | 2021-07-21 | 学校法人東京理科大学 | ｓ−ｃｉｓ−ジエンを有する化合物の誘導体化法、誘導体化試薬キット、および分析方法 |
| JP6739080B2 (ja) * | 2016-11-17 | 2020-08-12 | 学校法人東京理科大学 | ビタミンｄの定量方法、質量分析装置およびビタミンｄ定量用試薬キット |
-
2023
- 2023-08-11 CN CN202311013118.3A patent/CN117030917B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101910819A (zh) * | 2007-11-28 | 2010-12-08 | 奎斯特诊断投资公司 | 通过质谱法检测二羟基维生素d代谢物的方法 |
| CN110824025A (zh) * | 2018-08-09 | 2020-02-21 | 上海医药临床研究中心 | 一种维生素d代谢物的检测方法 |
| JP2022101457A (ja) * | 2020-12-24 | 2022-07-06 | 学校法人東京理科大学 | 化合物及び誘導体化試薬、並びに化合物の合成方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| A novel Cookson-type reagent for enhancing sensitivity and specificity in assessment of infant vitamin D status using liquid chromatography/tandem mass spectrometry;Shoujiro Ogawa等;RAPID COMMUNICATIONS IN MASS SPECTROMETRY;20131115;第27卷(第21期);第2453～2460页 * |
| Development and validation of the simultaneous measurement of four vitamin D metabolites in serum by LC–MS/MS for clinical laboratory applications;Mamoru Satoh等;ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY;20160815;第408卷(第27期);第7619页左栏第2段至右栏第1段 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117030917A (zh) | 2023-11-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN113933423B (zh) | 一种测定人血清中23种精神类药物及代谢物的检测方法 | |
| CN113125601B (zh) | 一种同时检测血清中4种脂溶性维生素的浓度的方法 | |
| Higashi et al. | Application of Cookson‐type reagents for biomedical HPLC and LC/MS analyses: A brief overview | |
| CN111307993A (zh) | 检测血液中胆汁酸含量的方法 | |
| CN113917015A (zh) | 一种同时检测人血清中多种维生素的检测方法 | |
| CN111830146B (zh) | 一种干血片中25-羟基维d的lc-ms/ms高通量检测方法及试剂盒 | |
| CN115248272B (zh) | 一种检测α-酮戊二酸和手性2-羟基戊二酸的方法 | |
| CN115902048A (zh) | 甲基衍生化-高效液相色谱串联质谱检测血清中水溶性维生素的方法 | |
| Li et al. | Improved and simplified LC–ESI-MS/MS method for homocysteine determination in human plasma: Application to the study of cardiovascular diseases | |
| CN117030917B (zh) | 一种维生素d代谢物的衍生方法与检测方法和检测维生素d代谢物的试剂盒 | |
| CN115420812A (zh) | 一种检测尿液中Calcitroic acid的方法及其应用 | |
| CN114544796B (zh) | 一种液相质谱联用测定血浆中司替戊醇的方法 | |
| CN108593790A (zh) | 同时检测血清24,25（oh）2d和25ohd的方法 | |
| CN114720580A (zh) | 一种生物样品中西格列汀和二甲双胍的检测方法 | |
| CN110261519B (zh) | 一种egcg的液质联用分析方法 | |
| CN110927306A (zh) | 一种液质联用测定血浆中布洛芬浓度的方法 | |
| CN114563504B (zh) | 一种测定血浆中游离醛固酮含量的方法及试剂盒 | |
| CN112362770B (zh) | 一种利用高效液相串联质谱检测5-氨基酮戊酸的方法 | |
| CN110031572A (zh) | 一种液质联用测定血浆中头孢呋辛浓度的方法 | |
| CN112083113B (zh) | 一种螺环化合物的生物样品分析方法 | |
| CN116087371A (zh) | 一种快速分析血浆中多种氨基酸的液相色谱串联质谱的方法 | |
| CN115541778B (zh) | 一种测定人血浆中阿普斯特浓度的检测方法 | |
| CN114674943A (zh) | 一种检测血清中25(oh)d2和25(oh)d3的液相色谱质谱串联检测方法 | |
| CN117214349A (zh) | 一种同时测定人血中多种抗菌药的方法、试剂盒及应用 | |
| CN110927305A (zh) | 一种液质联用测定血浆中格列吡嗪浓度的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |