CN117030917B - 一种维生素d代谢物的衍生方法与检测方法和检测维生素d代谢物的试剂盒 - Google Patents
一种维生素d代谢物的衍生方法与检测方法和检测维生素d代谢物的试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及物质检测技术领域,尤其涉及一种维生素D代谢物的衍生方法与检测方法和检测维生素D代谢物的试剂盒。本发明维生素D代谢物的衍生方法,包括如下步骤:(1)沉淀生物样品中的蛋白,得到待处理的生物样品;(2)对所述的待处理的生物样品进行过膜处理,得到滤液;将所述的滤液与衍生试剂1反应2~10min,得到中间液;(3)在所述的中间液中加入衍生试剂2,反应2~10min,氮气吹干后,复溶得到维生素D代谢物;所述维生素D代谢物为25(OH)D2、25(OH)D3和1α,25(OH)2VD3。本发明的方法可以定量检测维生素D代谢物,方法稳定高效,具有良好的临床意义。
Description
技术领域
本发明涉及物质检测技术领域,尤其涉及一种维生素D代谢物的衍生方法与检测方法和检测维生素D代谢物的试剂盒。
背景技术
维生素D是一类人体必须的脂溶性维生素,被认为是决定人体体质情况的重要指标,也是体内钙吸收的重要衡量标准,经过肝脏和肾脏代谢,会产生一系列代谢物。25-羟基维生素D是血中被检测的标志物,是人体内维生素D的主要储存形式,通过检测它可以确定总体维生素D的情况,是衡量人体内维生素D营养状态的最佳指标。25-羟基维生素D3(25(OH)D3)、D2(25(OH)D2)(结构式如图1、2)已有大量临床研究,与诸如儿童佝偻病,冠心病,糖尿病,小儿头疼,癌症等众多疾病有密切关系。1α,25(OH)2D3也是其中的一种活性代谢物。近来研究表明,1α,25(OH)2VD3可促进小肠对钙磷的吸收,维持钙、磷正常代谢及骨骼矿化,调节钙、磷在肾脏的重吸收。被用作为肾相关疾病的生物标志物,而且直接作用于骨代谢的骨骼细胞上。1α,25(OH)2VD3还影响二型糖尿病人血清中维生素D受体的表达。
分别检测25(OH)D2、25(OH)D3和1α,25(OH)2VD3才能正确评估维生素D水平和维生素D补充疗法的疗效。因此,分别测定25(OH)D2、25(OH)D3和1α,25(OH)2VD3可以直接反映生物体内维生素D真实活性的水平,具有重要的临床意义和疗效判定意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种维生素D代谢物的衍生方法与检测方法和检测维生素D代谢物的试剂盒。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一种维生素D代谢物的衍生方法,包括如下步骤:
(1)沉淀生物样品中的蛋白,得到待处理的生物样品;
(2)对所述的待处理的生物样品进行过膜处理,得到滤液;将所述的滤液与衍生试剂1反应2~10min,得到中间液;
(3)在所述的中间液中加入衍生试剂2,反应2~10min,氮气吹干后,复溶得到维生素D代谢物的衍生物;
所述维生素D代谢物为25(OH)D2、25(OH)D3和1α,25(OH)2VD3。
作为优选,所述生物样品为血清;
步骤(1)所述沉淀生物样品中的蛋白的方法为:将生物样品与蛋白沉淀试剂混合,反应3~5min;
所述生物样品与蛋白沉淀试剂混合的体积比为1~20:60;
所述蛋白沉淀试剂为甲醇或乙腈。
作为优选,步骤(2)所述过膜处理为过有机滤膜;
所述膜的孔径为0.2~0.25μm。
作为优选,所述衍生试剂1为甲醇或乙腈;
所述甲醇为含有碘苯二乙酸的甲醇;
所述碘苯二乙酸的终浓度为1~10mg/mL;
所述滤液与衍生试剂1的体积比为2~4:1;
步骤(2)所述反应的温度为20~30℃。
作为优选,所述衍生试剂2为4-[4-(二甲基氨基)苯基]-1,2,4-三唑烷-3,5-二酮溶液;
所述4-[4-(二甲基氨基)苯基]-1,2,4-三唑烷-3,5-二酮溶液的溶剂为甲醇或乙腈;
所述4-[4-(二甲基氨基)苯基]-1,2,4-三唑烷-3,5-二酮溶液的终浓度为1~10mg/mL;
步骤(3)所述反应的温度为20~30℃。
作为优选,所述复溶的溶剂为乙腈或甲醇。
本发明还提供了所述的衍生方法得到的维生素D代谢物的衍生物,所述维生素D代谢物的衍生物用于检测维生素D代谢物。
本发明还提供了一种检测维生素D代谢物的方法,包括如下步骤:
利用LC-MS/MS方法检测维生素D代谢物的衍生物;
流动相A相为0.1~0.2vt%的甲酸水溶液;
流动相B相为甲酸甲醇溶液;
所述甲酸甲醇溶液的制备方法为:按甲酸与甲醇体积比为1~2:1000混合,得到;
色谱柱为C18色谱柱;
运行时间0min,流速0.4mL/min,流动相A 70%,流动相B 30%;
运行时间0.5min,流速0.4mL/min,流动相A 70%,流动相B 30%;
运行时间1min,流速0.4mL/min,流动相A 35%,流动相B 65%;
运行时间5min,流速0.4mL/min,流动相A 0%,流动相B 100%;
运行时间5.01min,流速0.4mL/min,流动相A 70%,流动相B 30%;
运行时间6.5min,流速0.4mL/min,流动相A 70%,流动相B 30%。
作为优选,质谱条件如下:
气帘气10psi、碰撞气8psi、离子化电压5500V、离子源温度500℃、雾化气GS118psi、辅助气GS250psi;
检测25(OH)D2时的母离子为631.3、子离子为341.2、停留时间50s,去簇电压200V、入口电压10V、碰撞电压31V、碰撞室电压11V;
检测25(OH)D3时的母离子为619.3、子离子为341.2、停留时间50s,去簇电压200V、入口电压10V、碰撞电压35V、碰撞室电压11V;
检测1α,25(OH)2VD3时的母离子为635.3、子离子为357.2、停留时间50s,去簇电压28V、入口电压13V、碰撞电压31V、碰撞室电压3V。
本发明还提供了一种检测维生素D代谢物的试剂盒,包括衍生试剂1和衍生试剂2;
所述衍生试剂1为甲醇或乙腈;
所述甲醇为含有碘苯二乙酸的甲醇;
所述衍生试剂2为4-[4-(二甲基氨基)苯基]-1,2,4-三唑烷-3,5-二酮溶液;
所述4-[4-(二甲基氨基)苯基]-1,2,4-三唑烷-3,5-二酮溶液的溶剂为甲醇或乙腈;
所述4-[4-(二甲基氨基)苯基]-1,2,4-三唑烷-3,5-二酮溶液的终浓度为1~10mg/mL;
所述检测方法为所述的方法。
本发明提供了一种维生素D代谢物的衍生方法与检测方法和检测维生素D代谢物的试剂盒,本发明的方法具有如下优点:
(1)灵敏度高;在使用尽可能低的血清样品体积的前提下,可准确定量含量最低的维生素D代谢物;
(2)简单快速的样本前处理分析;缩短衍生化时间、样品制备及分析时间;
(3)分析成本低;使用廉价,容易合成的化学衍生化试剂,降低成本;
(4)特异性良好;使用新的衍生化方法及优化的衍生化程序,抗干扰能力强,方法稳定高效。
本发明使用的衍生试剂1和衍生试剂2可以与维生素D代谢物发生反应后,反应活性高,生成的物质在质谱中响应好,抗干扰能力强,具体衍生试剂1和衍生试剂2与维生素D代谢物反应过程如图3所示。
附图说明
图1为25(OH)D2的结构图。
图2为25(OH)D3的结构图。
图3为衍生试剂1和衍生试剂2与维生素D代谢物反应过程图。
图4为25(OH)D2的标准曲线。
图5为25(OH)D3的标准曲线。
图6为1α,25(OH)2D3的标准曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明实施例中的25(OH)D2、25(OH)D3和1α,25(OH)2VD3的校准品购自上海安谱实验科技股份有限公司。
本发明实施例中的血清采集自医检所健康志愿者。
实施例1
维生素D代谢物的衍生
取25(OH)D2、25(OH)D3和1α,25(OH)2VD3校准品用甲醇稀释成浓度分别为40ng/mL、200ng/mL和800pg/mL的校准品溶液。
取校准品溶液,标号为S1溶液;取500μLS1溶液,加入500μL甲醇,标号为S2;取500μLS2溶液,加入500μL甲醇标号为S3;取200μLS3溶液,加入800μL甲醇标号为S4;取500μLS4溶液,加入500μL甲醇标号为S5取500μLS5溶液,加入500μL甲醇标号为S6。具体稀释后的校准品溶液作为线性范围,具体如表1所示。
表1线性范围
线性范围 | S1 | S2 | S3 | S4 | S5 | S6 |
25(OH)D3(ng/mL) | 200 | 100 | 50 | 10 | 5 | 2.5 |
25(OH)D2(ng/mL) | 40 | 20 | 10 | 2 | 1 | 0.5 |
1α,25(OH)2D3(pg/mL) | 800 | 400 | 200 | 40 | 20 | 10 |
取200μLS1~S6溶液,分别加入50μL内标液和600μL甲醇,涡旋震荡3min,使蛋白沉淀后,得到待处理的生物样品。
内标液中的有效成分为25-(OH)VD3-D6、25-(OH)VD2-D3、1α,25(OH)2VD3-D3,终浓度均为50ng/mL;配置内标液的溶剂为乙腈。
将待处理的生物样品经过0.22μm的有机滤膜再次除去生物样品溶液中的蛋白,取滤液90μL,加入衍生试剂130μL(含有终浓度为10mg/mL碘苯二乙酸的甲醇)25℃反应2min,得到中间液。在所述的中间液中加入终浓度为10mg/mL的衍生试剂2(4-[4-(二甲基氨基)苯基]-1,2,4-三唑烷-3,5-二酮),25℃反应2min,氮气吹干,用40μL甲醇复溶,涡旋1min,得到维生素D代谢物的衍生物。
实施例2
LC-MS/MS方法检测维生素D代谢物
流动相A相:0.1%甲酸水溶液;
流动相B相:0.1%甲酸甲醇溶液(按甲酸与甲醇体积比为1~2:1000混合,得到);
色谱柱为C18色谱柱;柱温为40℃。
流动相梯度及流速如表2所示。
表2流动相梯度及流速
运行时间(min) | 流速(mL/min) | 流动相A% | 流动相B% |
0.00 | 0.4 | 70 | 30 |
0.5 | 0.4 | 70 | 30 |
1.00 | 0.4 | 35 | 65 |
5.00 | 0.4 | 0 | 100 |
5.01 | 0.4 | 70 | 30 |
6.50 | 0.4 | 70 | 30 |
质谱检测时的参数如表3所示。
表3质谱条件
离子源参数如表4所示。
表4离子源参数
按照上述参数检测S1~S6溶液中维生素D代谢物的衍生物,以线性范围中所示的标示浓度为横坐标(x),以实际检测峰面积与各自内标峰面积的比值为纵坐标(y),绘制标准曲线。得到的标准曲线如图4~6所示。
25(OH)D2的标准曲线:y=0.31827x-0.02712,r=0.99941;
25(OH)D3的标准曲线:y=0.10389x-0.04261,r=0.99891;
1α,25(OH)2D3的标准曲线:y=3.63590e-5x+6.20745e-4,r=0.99940。
实施例3
取25(OH)D2、25(OH)D3和1α,25(OH)2VD3校准品溶液,用甲醇将25(OH)D2校准品溶液稀释成1ng/mL、4ng/mL和20ng/mL;将25(OH)D3校准品溶液稀释成5ng/mL、20ng/mL和80ng/mL;将1α,25(OH)2VD3校准品溶液稀释成0.005ng/mL、0.02ng/mL和0.08ng/mL。按照实施例1的维生素D代谢物的衍生方法处理各个校准品稀释液后,按照实施例1的LC-MS/MS方法检测衍生处理的各个校准品稀释液的峰面积,分析测定3个批次,计算加样回收率和精密度。结果如表5所示。
加样回收率的计算公式为:
式中:
R:回收率;
V:高值样本体积;
V0:低浓度样本体积;
C:高值样本加入到低浓度样本后的检测浓度;
C0:低浓度样本的浓度;
Cs:高值样本的浓度。
表5回收率和精密度
表5显示,本发明的方法检测维生素D代谢物后的平均回收率在85%~105%范围内,重现性良好,加样回收率良好,精密度为0.5%~5.5%范围内,检测结果的准确度较高。
实施例4
用实施例1~2的方法检测20个人血清样本,血清中维生素D代谢物的浓度结果如表6所示。
表6人血清中维生素D代谢物D浓度
由以上实施例可知,本发明一种维生素D代谢物的衍生方法与检测方法和检测维生素D代谢物的试剂盒。本发明用于检测维生素D代谢物的方法具有(1)灵敏度高;(2)简单快速的样本前处理分析;(3)分析成本低;(4)特异性良好的优点。具有重要的临床意义和疗效判断意义。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种检测维生素D代谢物的方法,其特征在于,包括如下步骤:
利用LC-MS/MS方法检测维生素D代谢物的衍生物;
维生素D代谢物的衍生方法,包括如下步骤:
(1)沉淀生物样品中的蛋白,得到待处理的生物样品;
(2)对所述的待处理的生物样品进行过膜处理,得到滤液;将所述的滤液与衍生试剂1反应2~10min,得到中间液;
(3)在所述的中间液中加入衍生试剂2,反应2~10min,氮气吹干后,复溶得到维生素D代谢物的衍生物;
所述维生素D代谢物为25(OH)D2、25(OH)D3和1α,25(OH)2VD3;
所述生物样品为血清;
步骤(1)所述沉淀生物样品中的蛋白的方法为:将生物样品与蛋白沉淀试剂混合,反应3~5min;
所述生物样品与蛋白沉淀试剂混合的体积比为1~20:60;
所述蛋白沉淀试剂为甲醇或乙腈;
步骤(2)所述过膜处理为过有机滤膜;
所述膜的孔径为0.2~0.25μm;
所述衍生试剂1为含有碘苯二乙酸的甲醇;
所述碘苯二乙酸的终浓度为1~10mg/mL;
所述滤液与衍生试剂1的体积比为2~4:1;
步骤(2)所述反应的温度为20~30℃;
所述衍生试剂2为4-[4-(二甲基氨基)苯基]-1,2,4-三唑烷-3,5-二酮溶液;
所述4-[4-(二甲基氨基)苯基]-1,2,4-三唑烷-3,5-二酮溶液的溶剂为甲醇或乙腈;
所述4-[4-(二甲基氨基)苯基]-1,2,4-三唑烷-3,5-二酮溶液的终浓度为1~10mg/mL;
步骤(3)所述反应的温度为20~30℃;
所述复溶的溶剂为乙腈或甲醇;
流动相A相为0.1~0.2vt%的甲酸水溶液;
流动相B相为甲酸甲醇溶液;
所述甲酸甲醇溶液的制备方法为:按甲酸与甲醇体积比为1~2:1000混合,得到;
色谱柱为C18色谱柱;
运行时间0min,流速0.4mL/min,流动相A 70%,流动相B 30%;
运行时间0.5min,流速0.4mL/min,流动相A 70%,流动相B 30%;
运行时间1min,流速0.4mL/min,流动相A 35%,流动相B 65%;
运行时间5min,流速0.4mL/min,流动相A 0%,流动相B 100%;
运行时间5.01min,流速0.4mL/min,流动相A 70%,流动相B 30%;
运行时间6.5min,流速0.4mL/min,流动相A 70%,流动相B 30%;
质谱条件如下:
气帘气10psi 、碰撞气8 Unit、离子化电压5500V、离子源温度500℃、雾化气GS118psi、辅助气GS2 50psi;
检测25(OH)D2时的母离子为631.3、子离子为341.2、停留时间50s,去簇电压200V、入口电压10V、碰撞电压31V、碰撞室电压11V;
检测25(OH)D3时的母离子为619.3、子离子为341.2、停留时间50s,去簇电压200V、入口电压10V、碰撞电压35V、碰撞室电压11V;
检测1α,25(OH)2VD3时的母离子为635.3、子离子为357.2、停留时间50s,去簇电压28V、入口电压13V、碰撞电压31V、碰撞室电压3V。
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