CN116087371A - 一种快速分析血浆中多种氨基酸的液相色谱串联质谱的方法 - Google Patents

一种快速分析血浆中多种氨基酸的液相色谱串联质谱的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速分析血浆中多种氨基酸的液相色谱串联质谱的方法，所述该方法包括如下步骤：S1、氨基酸标准曲线工作液的制备，包括：将26种氨基酸标准品粉末分别准确称重，加入到纯净水中，充分混匀，制备成10mg/mL的单个氨基酸储备液；本发明涉及同时检测多种氨基酸的液相色谱串联质谱技术领域。该快速分析血浆中多种氨基酸的液相色谱串联质谱的方法，通过对血浆进行蛋白沉淀反应处理后，即可将处理好的样本用于液相色谱串联质谱分析，结合96孔板的前处理模式，96人份的血浆样本的前处理流程仅耗时40分钟。另外通过使用优化的流动相和色谱柱的组合，使得样本的上机分析时间仅为10分钟，本装置处理方案简单，高效，无需进行衍生反应。

Description

一种快速分析血浆中多种氨基酸的液相色谱串联质谱的方法
技术领域
本发明涉及分析血浆中多种氨基酸的液相色谱串联质谱技术领域，具体为一种快速分析血浆中多种氨基酸的液相色谱串联质谱的方法。
背景技术
氨基酸是机体代谢的重要物质之一，具有广泛的生物学功能，是构成生物机体蛋白质分子的基本组成单位和维持内稳态重要的物质基础。其生理功能涉及人体生长发育、肌肉骨骼生长、激素分泌等各个环节，例如亮氨酸可以促进骨骼、皮肤和肌肉组织的修复；谷氨酸可以维持和促进脑细胞功能；异亮氨酸可以稳定和调节血糖等。氨基酸参与体内很多的代谢通路，例如谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸、γ-氨基丁酸可用于评估尿素循环代谢；丝氨酸、谷氨酸、天门冬氨酸、酪氨酸、色氨酸、牛磺酸、γ-氨基丁酸可用于评估神经递质的代谢；牛磺酸可用于评估硫代谢。当人体内氨基酸水平异常时，会影响机体代谢的正常进行，最终导致疾病的发生。由此可知，监测血液中氨基酸的含量十分必要，在疾病的预测、诊断和机制研究等方面具有重要意义。
高效液相色谱法是临床中常用的检测氨基酸的方法，尤其是高效液相色谱与串联质谱联合使用后，可以实现对化合物高灵敏度和高特异性的检测。最近几年，这种检测系统在我国的临床检验实验室得到了迅速的发展。
目前液相色谱串联质谱技术检测血浆中的氨基酸主要是两种技术方案，一种是通过使用异硫氰酸苯酯、丹磺酰氯等衍生试剂先对血浆中的氨基酸进行衍生，然后再对衍生后的血浆进行处理，处理后的血浆在C18反向色谱柱上实现多种氨基酸的分离后，再进入质谱进行检测。衍生的一个主要目的是增强氨基酸与色谱柱固定相的相互作用，由于大部分氨基酸的极性较大，在普通的C18反向色谱柱上难以保留，无法实现多种氨基酸在色谱住上的分离，通过衍生试剂与氨基酸进行反应，可以使之生成极性相对较小的衍生物，从而实现在反向色谱住上的保留和分离。另外一种技术方案是通过在流动相中加入全氟羧酸类的离子配对试剂，离子配对试剂与氨基酸通过离子相互作用配对，从而降低氨基酸的极性，实现在C18反向色谱柱上的保留和分离。上述两种技术方案都有各自的缺点，衍生法前处理流程比较复杂，干扰反应多，部分衍生试剂毒性较强。离子配对试剂的使用会加速对质谱仪离子源的污染，增加质谱仪维护成本，进而提高检测成本。另外上述两种方案检测一个样本的机时一般都长达几十分钟，检测效率较低。除此以外，血浆中存在分子量相同的氨基酸同分异构体，以及分子量很接近的氨基酸，这也要求在色谱上对这类氨基酸实现良好的分离，以防止在质谱检测时由于相同的或接近的质荷比而产生干扰，影响检测结果。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种快速分析血浆中多种氨基酸的液相色谱串联质谱的方法，解决了背景技术中提到的问题。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种快速分析血浆中多种氨基酸的液相色谱串联质谱的方法，所述该方法包括如下步骤：
S1、氨基酸标准曲线工作液的制备，包括：
将26种氨基酸标准品粉末分别准确称重，加入到纯净水中，充分混匀，制备成10mg/mL的单个氨基酸储备液；
按照摩尔浓度计算，用移液器分别将一定体积的单个氨基酸储备液加入到离心管中，共26种氨基酸储备液，然后补足相应体积的纯净水，充分混匀，制备成1000umol/L的标准曲线工作液的最高浓度混合液；
再用纯净水将1000umol/L的标准品溶液分别稀释至700umol/L和400umol/L；
将1000(STD13)，700(STD12),400(STD11)umol/L的标准品混合液用纯净水梯度稀释至100,70,40,10,7,4,1,0.7,0.4umol/L(STD10-STD1)；即可完成标准曲线工作液(STD13-STD1)的制备；
S2、血浆中定量检测26种氨基酸的样品前处理，包括：
将100uL待测血浆或氨基酸标准曲线工作液与100uL的氨基酸内标混合液(氨基酸内标使用的是氨基酸的稳定同位素化合物，每一种氨基酸内标的浓度为50umol/L)以及800uL乙腈，加入到96孔板中，先用移液枪初步混匀，然后放置在涡旋仪上混匀，涡旋后将96孔板放在4度冰箱中静置30分钟，取出后离心10分钟，然后取上清液，转移至样品盘中，待液相色谱串联质谱分析；
S3、液相色谱和串联质谱的实验：使用高效液相色谱串联质谱仪对所述处理后标准曲线工作液以及样本进行检测；
S4、样本中氨基酸浓度的计算，包括：
在用液相色谱串联质谱法进行氨基酸定量的流程中,使用了氨基酸的稳定同位素作为内标,以氨基酸标准品的峰面积和其对应内标的峰面积的比值作为Y轴，以氨基酸标准曲线工作液的浓度作为X轴，建立标准曲线，在建立标准曲线时选取1/X2作为线性拟合的权重，样本中各个氨基酸的浓度通过标准曲线的拟合方程进行计算。
优选的，所述在步骤S2中，血浆：氨基酸内标混合溶液：乙腈体积比为1：1：8。
优选的，所述乙腈沉淀剂时，相比较甲醇作为沉淀剂时，无需增加氮气吹干和溶剂复溶两个样本前处理步骤，可以使得离心后的上清液直接进入液相色谱串联质谱进行分析。
优选的，所述在步骤S3中，液相色谱采用岛津LC-20ADX，色谱柱为可以用来分离高极性化合物的亲水柱，柱温是35度，进样体积是10uL.流动相由A相和B相组成，A相是含有0.2％甲酸和10mM甲酸铵的水溶液，B相为含有0.2％甲酸和10mM甲酸铵的乙腈溶液，流动相以梯度的方式按0.6mL/min的流速通过色谱柱。
优选的，所述在步骤S3中，质谱仪为ABSciex API4000质谱仪，采用电喷雾离子化方式，用多反应监测模式对带正电的氨基酸离子进行扫描。
优选的，所述在步骤S3中，质谱条件为：气帘气：35psi；碰撞气：6psi；辅助加热气：50psi；喷雾气：60psi；离子化电压：5500V；离子源温度：500℃。
有益效果
本发明提供了一种快速分析血浆中多种氨基酸的液相色谱串联质谱的方法。具备以下有益效果：
该快速分析血浆中多种氨基酸的液相色谱串联质谱的方法，尽管在处理样本的时候使用了100uL的血浆，但是由于在进行液相色谱串联质谱检测时仅需要10uL的离心后上清液，所以在保证血浆样本：氨基酸内标混合溶液：乙腈的体积比为1：1：8的情况下，在实施本发明进行样本前处理时，可以根据需要减少血浆体积，采用50uL血浆+50uL氨基酸内标混合溶液+400uL乙腈；10uL血浆+10uL氨基酸内标混合溶液+80uL乙腈等组合，在临床应有时，有很大的灵活性。
另外，常用的两种血浆沉淀剂为乙腈和甲醇，本发明优选了乙腈作为血浆的沉淀剂。这有两个原因，一个是在对血浆的相同稀释比例下，乙腈对血浆中的蛋白有更好的沉淀效应，另外使用甲醇作为沉淀剂时，离心后的上清液无法直接进入液相色谱串联质谱进行分析，需要增加氮气吹干和溶剂复溶两个样本前处理步骤，与使用乙腈作为血浆沉淀剂相比，前处理耗时变长。因此更优选乙腈作为前处理试剂。
本方法对26种氨基酸中的同分异构体，比如亮氨酸和异亮氨酸(分子量均为131.2)，以及分子量很接近的氨基酸，比如谷氨酸(分子量为147.1)和谷氨酰胺(分子量为146.1)以及天冬氨酸(分子量为133.1)和天冬酰胺(分子量为132.1)均有很好的分离度。
通过对血浆进行蛋白沉淀反应处理，即可将处理好的样本用于液相色谱串联质谱分析，结合96孔板的前处理模式，96人份的血浆样本的前处理流程仅耗时40分钟。另外通过使用优化的流动相和色谱柱的组合，使得样本的分析时间仅为10分钟，使得本装置处理方案简单，高效，无需进行衍生反应。
附图说明
图1为本发明涉及的26种氨基酸及其对应的内标名称表；
图2为本发明涉及的26种氨基酸及其对应的内标名称表；
图3为本发明流动相梯度表；
图4为本发明26种氨基酸的线性方程及相关系数表；
图5为本发明26种氨基酸的批内和批间不精密度表；
图6为本发明26种氨基酸的批内和批间不精密度表；
图7为本发明26种氨基酸的加标回收率表；
图8为本发明26种氨基酸的加标回收率表；
图9为本发明26种氨基酸的色谱图；
图10为本发明亮氨酸和异亮氨酸色谱图；
图11为本发明谷氨酸，谷氨酰胺，天冬氨酸和天冬酰胺的色谱图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
请参阅图1-11，本发明提供一种技术方案：
实施例一：
一种快速分析血浆中多种氨基酸的液相色谱串联质谱的方法，该方法包括如下步骤：
S1、氨基酸标准曲线工作液的制备，包括：
将26种氨基酸标准品粉末分别准确称重，加入到纯净水中，充分混匀，制备成10mg/mL的单个氨基酸储备液；
按照摩尔浓度计算，用移液器分别将一定体积的单个氨基酸储备液加入到离心管中，共26种氨基酸储备液，然后补足相应体积的纯净水，充分混匀，制备成1000umol/L的标准曲线工作液的最高浓度混合液；
再用纯净水将1000umol/L的标准品溶液分别稀释至700umol/L和400umol/L；
将1000(STD13)，700(STD12),400(STD11)umol/L的标准品混合液用纯净水梯度稀释至100,70,40,10,7,4,1,0.7,0.4umol/L(STD10-STD1)；即可完成标准曲线工作液(STD13-STD1)的制备；
S2、血浆中定量检测26种氨基酸的样品前处理，包括：
将100uL待测血浆或氨基酸标准曲线工作液与100uL的氨基酸内标混合液(氨基酸内标使用的是氨基酸的稳定同位素化合物，每一种氨基酸内标的浓度为50umol/L)以及800uL乙腈，加入到96孔板中，先用移液枪初步混匀，然后放置在涡旋仪上混匀，涡旋后将96孔板放在4度冰箱中静置30分钟，取出后离心10分钟，然后取上清液，转移至样品盘中，待液相色谱串联质谱分析；
S3、液相色谱和串联质谱的实验：使用高效液相色谱串联质谱仪对所述处理后标准曲线工作液以及样本进行检测；
S4、样本中氨基酸浓度的计算，包括：
在用液相色谱串联质谱法进行氨基酸定量的流程中,使用了氨基酸的稳定同位素作为内标,以氨基酸标准品的峰面积和其对应内标的峰面积的比值作为Y轴，以氨基酸标准曲线工作液的浓度作为X轴，建立标准曲线，在建立标准曲线时选取1/X2作为线性拟合的权重，样本中各个氨基酸的浓度通过标准曲线的拟合方程进行计算。
其中，26种氨基酸的方法学验证的步骤如下：
1)、26种氨基酸的线性，包括：本方法的线性评价是通过将标准曲线工作液(STD1-STD13)按照每个浓度水品的工作液平行处理3个重复样本的方式进行前处理，然后进入液相色谱串联质谱系统进行分析，以标准物质的浓度为X轴，以标准物质与其内标的峰面积比值为Y轴，建立标准曲线，26种氨基酸的标准曲线的线性良好，相关系数R均大于0.99；
2)、26种氨基酸的批间与批内不精密度，包括：本方法的不精密度的评价是通过对低，中，高3个浓度的质控品，分成3个批次进行检测，每个批次每种浓度的样本平行处理5份进行测定，从而验证方法的批内和批间不精密度，结果显示26种氨基酸的批间与批内不精密度的CV％均在15％之内，方法的不精密度良好；
3)、26种氨基酸的批间与批内准确度，包括：本方法的准确度的评价是通过向已知浓度的样本血浆中分别加入低和高浓度的氨基酸标准品混合液，制备出2个浓度的加标样本，每个浓度的样本分成5份，重复测定3个批次。分别计算2个浓度下的加标回收率(加标回收率计算公式：((加标样本浓度检测平均值-本底浓度)/理论加标浓度)*100％)。实验结果表明这26种氨基酸在2浓度范围的批内和批间的加标回收率均在85％-115％之间，方法的准确度良好。
实施例二：本实施与实施例一的区别在于，其中，
在步骤S2中，血浆：氨基酸内标混合溶液：乙腈体积比为1：1：8；
乙腈沉淀剂时，相比较甲醇作为沉淀剂时，无需增加氮气吹干和溶剂复溶两个样本前处理步骤，可以使得离心后的上清液直接进入液相色谱串联质谱进行分析；
在步骤S3中，液相色谱采用岛津LC-20ADX，色谱柱为可以用来分离高极性化合物的亲水柱，柱温是35度，进样体积是10uL.流动相由A相和B相组成，A相是含有0.2％甲酸和10mM甲酸铵的水溶液，B相为含有0.2％甲酸和10mM甲酸铵的乙腈溶液，流动相以梯度的方式按0.6mL/min的流速通过色谱柱；
在步骤S3中，质谱仪为ABSciex API4000质谱仪，采用电喷雾离子化方式，用多反应监测模式对带正电的氨基酸离子进行扫描；
在步骤S3中，质谱条件为：气帘气：35psi；碰撞气：6psi；辅助加热气：50psi；喷雾气：60psi；离子化电压：5500V；离子源温度：500℃。
工作步骤如下：
工作时，第一步:将26种氨基酸标准品粉末分别准确称重，加入到纯净水中，充分混匀，制备成10mg/mL的单个氨基酸储备液。按照摩尔体积计算，用移液器将一定体积的单个氨基酸储备液加入到离心管中，补足相应体积的纯净水，充分混匀，制备成1000umol/L的标准曲线工作液的最高浓度混合液，然后用水将此标准品溶液分别稀释至700umol/L和400umol/L。然后将1000(STD13)，700(STD12),400(STD11)umol/L的标准品混合液用纯净水梯度稀释至100,70,40,10,7,4,1,0.7,0.4umol/L。完成标准曲线工作液(STD13-STD1)的制备。
第二步：将待测血浆或氨基酸标准品的混合溶液与氨基酸同位素的标准品混合液(每一种氨基酸同位素的标准品的浓度为50umol/L)以及乙腈，按照1：1：8的体积比加入到96孔板中，先用移液枪初步混匀，然后放置在涡旋仪上混匀，涡旋后将96孔板放在4度冰箱中静置30分钟，取出后离心10分钟，然后取上清液，转移至样品盘中，待液相色谱串联质谱分析；
液相色谱采用岛津LC-20ADX，色谱柱为可以用来分离高极性化合物的亲水柱，柱温是35度，进样体积是10uL.流动相有A相和B相组成，A相是含有0.2％甲酸和10mM甲酸铵的水溶液，B相为含有0.2％甲酸和10mM甲酸铵的乙腈溶液，流动相以梯度的方式按0.6mL/min的流速通过色谱柱。梯度的变化方式如图3；质谱仪为ABSciex API4000质谱仪，采用电喷雾离子化方式，用多反应监测模式对带正电的氨基酸离子进行扫描；
第三步：在用液质法进行氨基酸定量的流程中，使用了氨基酸的同位素标准品作为内标，以校准和消除由于前处理流程，仪器响应的的波动而对分析结果产生的影响，提高分析结果的准确度。因此以氨基酸标准品的峰面积和其对应内标的峰面积的比值作为Y轴，以氨基酸标准曲线工作液的浓度作为X轴，建立标准曲线，在建立标准曲线时选取1/X2作为线性拟合的权重。样本中各个氨基酸的浓度通过标准曲线的拟合方程进行计算；
总：尽管在处理样本的时候使用了100uL的血浆，但是由于在进行液相色谱串联质谱检测时仅需要10uL的离心后上清液，所以在保证血浆样本：氨基酸内标混合溶液：乙腈的体积比为1：1：8的情况下，在实施本发明进行样本前处理时可以根据需要减少血浆体积，采用50uL血浆+50uL氨基酸内标混合溶液+400uL乙腈；10uL血浆+10uL氨基酸内标混合溶液+80uL乙腈等组合，在临床应有时，有很大的灵活性。
另外常用的两种血浆沉淀剂为乙腈和甲醇，本发明优选了乙腈作为血浆的沉淀剂，这有两个原因一个是在对血浆的相同稀释比例下，乙腈对血浆中的蛋白有更好的沉淀效应，另外使用甲醇作为沉淀剂时，离心后的上清液无法直接进入液相色谱串联质谱进行分析，需要增加氮气吹干和溶剂复溶两个样本前处理步骤，与使用乙腈作为血浆沉淀剂相比，前处理耗时变长。因此更优选乙腈作为前处理试剂。
本方法对26种氨基酸中的同分异构体，比如亮氨酸和异亮氨酸(分子量均为131.2)，以及分子量很接近的氨基酸，比如谷氨酸(分子量为147.1)和谷氨酰胺(分子量为146.1)以及天冬氨酸(分子量为133.1)和天冬酰胺(分子量为132.1)均有很好的分离度；
本装置优点在于前处理方案简单，高效，无需进行衍生反应，仅需对血浆进行蛋白沉淀反应处理，即可将处理好的样本用于液相色谱-串联质谱分析，结合96孔板的前处理模式，96人份的血浆样本的前处理流程仅耗时40分钟。另外通过使用优化的流动相和色谱柱的组合，使得样本的分析时间仅为10分钟。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。

Claims (6)

1.一种快速分析血浆中多种氨基酸的液相色谱串联质谱的方法，其特征在于：所述该方法包括如下步骤：
S1、氨基酸标准曲线工作液的制备，包括：
将26种氨基酸标准品粉末分别准确称重，加入到纯净水中，充分混匀，制备成10mg/mL的单个氨基酸储备液；
按照摩尔浓度计算，用移液器分别将一定体积的单个氨基酸储备液加入到离心管中，共26种氨基酸储备液，然后补足相应体积的纯净水，充分混匀，制备成1000umol/L的标准曲线工作液的最高浓度混合液；
再用纯净水将1000umol/L的标准品溶液分别稀释至700umol/L和400umol/L；
将1000(STD13)，700(STD12),400(STD11)umol/L的标准品混合液用纯净水梯度稀释至100,70,40,10,7,4,1,0.7,0.4umol/L(STD10-STD1)；即可完成标准曲线工作液(STD13-STD1)的制备；
S2、血浆中定量检测26种氨基酸的样品前处理，包括：
将100uL待测血浆或氨基酸标准曲线工作液与100uL的氨基酸内标混合液(氨基酸内标使用的是氨基酸的稳定同位素化合物，每一种氨基酸内标的浓度为50umol/L)以及800uL乙腈，加入到96孔板中，先用移液枪初步混匀，然后放置在涡旋仪上混匀，涡旋后将96孔板放在4度冰箱中静置30分钟，取出后离心10分钟，然后取上清液，转移至样品盘中，待液相色谱串联质谱分析；
S3、液相色谱和串联质谱的实验：使用高效液相色谱串联质谱仪对所述处理后标准曲线工作液以及样本进行检测；
S4、样本中氨基酸浓度的计算，包括：
在用液相色谱串联质谱法进行氨基酸定量的流程中,使用了氨基酸的稳定同位素作为内标,以氨基酸标准品的峰面积和其对应内标的峰面积的比值作为Y轴，以氨基酸标准曲线工作液的浓度作为X轴，建立标准曲线，在建立标准曲线时选取1/X2作为线性拟合的权重，样本中各个氨基酸的浓度通过标准曲线的拟合方程进行计算。
2.根据权利要求1所述的一种快速分析血浆中多种氨基酸的液相色谱串联质谱的方法，其特征在于：所述在步骤S2中，血浆：氨基酸内标混合溶液：乙腈体积比为1：1：8。
3.根据权利要求2所述的一种快速分析血浆中多种氨基酸的液相色谱串联质谱的方法，其特征在于：所述乙腈沉淀剂时，相比较甲醇作为沉淀剂时，无需增加氮气吹干和溶剂复溶两个样本前处理步骤，可以使得离心后的上清液直接进入液相色谱串联质谱进行分析。
4.根据权利要求1所述的一种快速分析血浆中多种氨基酸的液相色谱串联质谱的方法，其特征在于：所述在步骤S3中，液相色谱采用岛津LC-20ADX，色谱柱为可以用来分离高极性化合物的亲水柱，柱温是35度，进样体积是10uL.流动相由A相和B相组成，A相是含有0.2％甲酸和10mM甲酸铵的水溶液，B相为含有0.2％甲酸和10mM甲酸铵的乙腈溶液，流动相以梯度的方式按0.6mL/min的流速通过色谱柱。
5.根据权利要求1所述的一种快速分析血浆中多种氨基酸的液相色谱串联质谱的方法，其特征在于：所述在步骤S3中，质谱仪为ABSciex API4000质谱仪，采用电喷雾离子化方式，用多反应监测模式对带正电的氨基酸离子进行扫描。
6.根据权利要求5所述的一种快速分析血浆中多种氨基酸的液相色谱串联质谱的方法，其特征在于：所述在步骤S3中，质谱条件为：气帘气：35psi；碰撞气：6psi；辅助加热气：50psi；喷雾气：60psi；离子化电压：5500V；离子源温度：500℃。
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