CN101910819A - 通过质谱法检测二羟基维生素d代谢物的方法 - Google Patents

通过质谱法检测二羟基维生素d代谢物的方法 Download PDF

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Abstract

提供的是采用质谱法检测样品中二羟基维生素D代谢物的存在或量的方法。所述方法一般包括电离样品中的二羟基维生素D代谢物并且检测离子的量以确定样品中维生素D代谢物的存在或量。在某些优选的实施方式中，所述方法包括在质谱法之前免疫纯化二羟基维生素D代谢物。还提供了在单一测试中检测两种或多种二羟基维生素D代谢物的存在或量的方法。

Description

通过质谱法检测二羟基维生素D代谢物的方法
技术领域
本发明涉及二羟基维生素D代谢物的检测。在具体的方面，本发明涉及通过质谱法检测维生素D代谢物的方法。
背景技术
维生素D是在钙(Ca2+)动态平衡的正调节中具有重要生理学作用的基本营养物。维生素D可在皮肤中通过暴露于阳光从头合成或者它可从饮食中得以吸收。有两种形式的维生素D：维生素D2(麦角钙化醇)和维生素D3(胆钙化醇)。维生素D3是由动物从头合成的形式。它还是在美国被添加到生产的牛奶产品和某些食品中的常用添加剂。饮食和内在合成的维生素D3都必须经过代谢活化以产生生物活性代谢物。在人中，维生素D3活化的初始步骤主要发生在肝脏中并且包括羟基化作用以形成中间代谢物25-羟基维生素D3(25-羟基胆钙化醇；钙化醇；25OHD3)。钙化醇是循环中维生素D3的主要形式。循环25OHD3然后由肾转化成1，25-二羟基维生素D3(钙化醇；1，25(OH)2D3)，其一般被认为是具有最高生物学活性的维生素D3的代谢物。
维生素D2源自真菌和植物来源。一些非处方(over-the-counter)饮食添加剂包含麦角钙化醇(维生素D2)，而不是胆钙化醇(维生素D3)。Drisdol-美国可购得的唯一高效的处方形式的维生素D——是用麦角钙化醇配制的。在人中维生素D2经历与维生素D3类似的代谢活化途径，形成代谢物25-羟基维生素D2(25OHD2)和1，25-二羟基维生素D3(1，25(OH)2D2)。在人中维生素D2和维生素D3长期被认为是生物学等价的，然而最近的报道表明这两种形式的维生素D在生物活性和生物利用率上可能具有差异(Armas等人，(2004)J.Clin.Endocrinol.Metab.89：5387-5391)。
维生素D——无活性的维生素D前体——的测量在临床环境下是很少的并且具有很小的诊断价值。相反，25-羟基维生素D3和25-羟基维生素D2(统称为25-羟基维生素D；“25OHD”)的血清水平是维生素D营养状况和某种维生素D类似物效力的有用指标。因此，25OHD的测量通常用于诊断和处理钙代谢疾病。在这方面，25OHD的低水平指示与疾病相关的维生素D缺乏，所述疾病诸如低血钙、低血磷酸盐、二级甲状旁腺功能亢进、碱性磷酸酶升高、成人骨软化和儿童软骨病。在维生素D中毒疑似患者中，25OHD水平升高使该疾病区别于引起高血钙的其它疾病。
1，25(OH)2D的测量也被用于临床环境。例如，某些疾病状态诸如肾衰竭可通过循环1，25(OH)2D水平的降低进行诊断，并且1，25(OH)2D水平的升高可指示副甲状腺激素过多或者可能指示某些疾病诸如肉样瘤病或某些类型的淋巴瘤。
维生素D代谢物的检测可用对25-羟基维生素D3和25-羟基维生素D2共特异性抗体通过放射性免疫测定完成。因为目前基于免疫学的测定无法独立地分辨25-羟基维生素D3和25-羟基维生素D2，所以维生素D营养缺乏的原因在没有诉诸于其它测试的情况下不能确定。最近已经有报道公开了采用质谱法检测特定维生素D代谢物的方法。例如，Yeung B等人，J Chromatogr.1993，645(1)：115-23；Higashi T等人，Steroids.2000，65(5)：281-94；Higashi T等人，Biol Pharm Bull.2001，24(7)：738-43和Higashi T等人，J Pharm Biomed Anal.2002，29(5)：947-55公开了采用液相层析和质谱法检测各种维生素D代谢物的方法。这些方法需要代谢物在通过质谱法检测前进行衍生。通过液相层析/质谱法检测未衍生的1，25(OH)2D3的方法被公开在Kissmeyer和Sonne，J Chromatogr A.2001，935(1-2)：93-103中。
发明内容
本发明提供通过包括在串联质谱法内的质谱法检测样品中二羟基维生素D代谢物的存在或量的方法。
一方面，提供了通过串联质谱法测定一种或多种二羟基维生素D代谢物的存在或量的方法，其包括：(a)从样品中免疫纯化一种或多种二羟基维生素D代谢物；(b)通过HPLC进一步纯化免疫纯化的二羟基维生素D代谢物(或多种)；(c)通过下列步骤通过串联质谱法测定从步骤(b)获得的维生素D代谢物的量：(i)产生二羟基维生素D代谢物(或多种)的前体离子；(ii)产生前体离子的一种或多种碎片离子；和(iii)检测步骤(c)或(d)或两者中产生的一种或多种离子的存在或量并且将检测的离子关联到样品中的二羟基维生素D代谢物(或多种)的存在或量。在某些优选的实施方式中，二羟基维生素D代谢物采用与固体载体连接的抗二羟基维生素D抗体从样品中免疫纯化；优选地二羟基维生素D代谢物采用免疫颗粒进行免疫纯化；优选地免疫颗粒在其表面上具有抗二羟基维生素D抗体。在某些实施方式中，二羟基维生素D代谢物(或多种)包括1α，25(OH)2D2；在某些实施方式中，二羟基维生素D代谢物(或多种)包括1α，25(OH)2D3；在某些特别优选的实施方式中，提供了在单一检测中测定1α，25(OH)2D2和1α，25(OH)2D3的方法。
在上述方面的某些优选的实施方式中，二羟基维生素D代谢物(或多种)在质谱法之前进行衍生；在某些特别优选的实施方式中，二羟基维生素D代谢物(或多种)用Cookson型试剂(例如4-取代的1，2，4-三唑啉-3，5-二酮；TAD)进行衍生；在某些特别优选的实施方式中，二羟基维生素D代谢物(或多种)用4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD)进行衍生；以及在另外其它特别优选的实施方式中，二羟基维生素D代谢物(或多种)用4’-羧苯基-TAD进行衍生。在某些优选的实施方式中，二羟基维生素D代谢物(或多种)包括1α，25(OH)2D2；1α，25(OH)2D2在质谱法之前用4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD)进行衍生；以及更优选地1α，25(OH)2D2的前体离子具有586.37±0.5的质/荷比。在某些优选的实施方式中，二羟基维生素D代谢物(或多种)包括1α，25(OH)2D3；1α，25(OH)2D3在质谱法之前用4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD)进行衍生；以及更优选地1α，25(OH)2D3的前体离子具有574.37±0.5的质/荷比。在某些优选的实施方式中，二羟基维生素D代谢物(或多种)在质谱法之前用4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD)进行衍生，并且碎片离子包括至少一个质/荷比为314.12±0.5的离子
在某些优选的实施方式中，二羟基维生素D代谢物(或多种)在质谱法之前没有进行衍生。在某些特别优选的实施方式中，二羟基维生素D代谢物(或多种)包括1α，25(OH)2D2，1α，25(OH)2D2在质谱法之前没有进行衍生，并且更优选地未衍生的1，25(OH)2D2的前体离子具有411.35±0.5的质/荷比。在某些特别优选的实施方式中，二羟基维生素D代谢物(或多种)包括1α，25(OH)2D3，1α，25(OH)2D3在质谱法之前没有进行衍生，并且更优选地未衍生的1α，25(OH)2D3的前体离子具有399.35±0.5的质/荷比。在某些特别优选的实施方式中，二羟基维生素D代谢物(或多种)没有进行衍生，并且碎片离子包括一种或多种的离子，其选自质/荷比151.12±0.5和135.12±0.5的离子。
在特别优选的实施方式中，提供了在单一检测中通过串联质谱法测定人体样品中1α，25(OH)2D2和1α，25(OH)2D3的量的方法，其包括：(a)从样品中免疫纯化1α，25(OH)2D2和1α，25(OH)2D3；(b)用4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD)衍生1α，25(OH)2D2和1α，25(OH)2D3；(c)通过HPLC纯化从步骤(b)衍生的1α，25(OH)2D2和1α，25(OH)2D3；(d)通过下列步骤通过串联质谱法测定从步骤(c)获得的1α，25(OH)2D2和1α，25(OH)2D3的量：(i)产生质/荷比为586.37±0.5的衍生化1α，25(OH)2D2的前体离子以及质/荷比为574.37±0.5的衍生化1α，25(OH)2D3的前体离子；(ii)产生来自步骤(i)的前体离子的一种或多种碎片离子，其中至少一种碎片离子具有314.12±0.5的质/荷比；和(iii)检测步骤(i)或(ii)或两者中产生的一种或多种离子的存在或量并且将检测的离子关联到样品中的1α，25(OH)2D2和1α，25(OH)2D3的存在或量。
如本文所用，术语“二羟基维生素D代谢物”是指可在动物循环中发现的任何二羟基化的维生素D种类，其通过维生素D或合成维生素D类似物的生物合成或代谢途径形成。优选地，二羟基维生素D代谢物在1和25位置被羟基化。在特别优选的实施方式中，维生素D代谢物是1α，25-二羟基维生素D3(1α，25(OH)2D3)或1α，25-二羟基维生素D2(1α，25(OH)2D2)。在某些优选的实施方式中，二羟基维生素D代谢物自然存在于动物体液中，更优选地存在于人的体液中。在某些特别优选的实施方式中，如本文所述的方法检测1α，25-二羟基维生素D3(1α，25(OH)2D3)和/或1α，25-二羟基维生素D2(1α，25(OH)2D2)并且不检测一种或多种选自24，25-二羟基维生素D、25，26-二羟基维生素D和1，3-二羟基维生素D的二羟基维生素D代谢物。
如本文所用，术语“纯化(purification)”或“纯化(purify)”是指相对于样品的一种或多种其它组分富集感兴趣分析物的量的方法。如本文所用，纯化不需要将分析物从所有其它组分中分离。在优选的实施方式中，纯化步骤或方法可用于去除一种或多种干扰物质，例如一种或多种干扰方法中使用仪器的操作的物质或者可干扰通过质谱法对分析物检测的物质。
如本文所用，术语“免疫纯化(immunopurification)”或“免疫纯化(immunopurify)”是指利用抗体——包括多克隆或单克隆抗体在内——富集一种或多种感兴趣分析物的纯化方法。免疫纯化可采用本领域中熟知的任何免疫纯化方法进行。免疫纯化程序通常利用与固体载体例如柱、孔、管、凝胶、胶囊、颗粒或类似物结合、偶联或另外方式连接的抗体。如本文所用，免疫纯化非限制性地包括本领域中通常称为免疫沉淀的方法以及本领域中通常称为亲和层析的方法。
如本文所用，术语“免疫颗粒”是指这样的胶囊、珠、凝胶颗粒或类似物，其具有结合、偶联或另外方式连接到其表面(在颗粒之上和/或之内)的抗体。在某些优选的实施方式中，免疫颗粒为琼脂糖凝胶或琼脂糖珠。在可选的优选实施方式中，免疫颗粒是玻璃、塑料或硅珠或硅胶。
如本文所用，术语“抗二羟基维生素D抗体”是指对一种或多种二羟基维生素D代谢物具有亲和力的任何多克隆或单克隆抗体。在某些优选的实施方式中，抗二羟基维生素D抗体结合1α，25(OH)2D3和1α，25(OH)2D2。在某些优选的实施方式中，抗二羟基维生素D抗体以相等或相似的亲和力结合1α，25(OH)2D3和1α，25(OH)2D2。在其它优选的实施方式中，抗二羟基维生素D抗体以显著高于1α，25(OH)2D2的亲和力结合1α，25(OH)2D3；在可选的优选实施方式中，抗二羟基维生素D抗体以显著高于1α，25(OH)2D3的亲和力结合1α，25(OH)2D2。在各种实施方式中，抗二羟基维生素D抗体对除了二羟基维生素D代谢物之外的化学物种类的特异性可以不同；例如在某些优选的实施方式中，抗二羟基维生素D抗体对二羟基维生素D代谢物具有特异性，并且因此对除了二羟基维生素D代谢物之外的化学物种类(例如其它维生素D代谢物诸如维生素D或25-羟基维生素D)具有很小的亲和力或无亲和力；相反，在其它优选的实施方式中，抗二羟基维生素D抗体是非特异性的，并且因此结合除了二羟基维生素D代谢物之外的某些化学物种类(例如，非特异性的抗二羟基维生素D抗体可结合其它维生素D代谢物诸如维生素D或25-羟基维生素D)。
在本文所公开的方法的某些优选实施方式中，二羟基维生素D代谢物(或多种)在质谱法之前没有进行衍生。在其它优选的实施方式中，维生素D代谢物在质谱法之前进行衍生。
如本文所用，“生物学样品”是指来自生物学来源的任何样品。如本文所用，“体液”是指可从个体的身体上分离的任何液体。例如，“体液”可包括血液、血浆、血清、胆汁、唾液、尿液、泪液、汗液等。
如本文所用，“衍生”是指使两个分子反应以形成一个新分子。衍生化试剂可包括Cookson型试剂(例如，4-取代的1，2，4-三唑啉-3，5-二酮；TAD)；异硫氰酸盐基团、二硝基-氟代苯基基团、硝基苯氧基羰基基团和/或苯二醛基团。在某些优选的实施方式中，衍生采用诸如在例如Vreeken等人，Bio1.Mass Spec.22：621-632；Yeung B等人，J Chromatogr.1993，645(1)：115-23；Higashi T等人，Biol Pharm Bull.2001，24(7)：738-43；或Higashi T等人，J Pharm Biomed Anal.2002，29(5)：947-55中所公开的那些方法进行。在优选的实施方式中，衍生化试剂是Cookson型试剂。特别优选的衍生化试剂包括4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD)；4’-羧基苯基-TAD；4-[4-(6-甲氧基-2-苯并噁唑基)苯基]-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(MBOTAD)；4-[2-(6，7-二甲氧基-4-甲基-3-氧-3，4-二氢喹喔啉基)乙基]-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(DMEQTAD)；4-硝基苯基-TAD；4-五氟苯基-TAD；4-二茂铁乙基-TAD；4-四胺-TAD等。在某些优选的实施方式中，衍生在层析之前进行；然而在其它优选的实施方式中，衍生例如采用类似于Vreeken等人，Biol.Mass Spec.22：621-632中所述的那些方法在层析之后进行。
如本文所用，“层析”是指这样的方法，其中由液体或气体携带的化学混合物当它们在固定液相或固相周围或之上流动时由于化学实体的微分分布而被分成组分。
如本文所用，“液相层析”(LC)是指当流体均一地通过细微分开的物质的柱或者通过毛细管道过滤时流体溶液的一种或多种组分选择性延迟的方法。延迟是由于当该流体相对于固定相(或多个)移动时混合物的组分在一个或多个固定相和本体流体(bulk fluid)(即流动相)之间的分布。“液相层析”包括反相液相层析(RPLC)、高效液相层析(HPLC)和高湍流液相层析(HTLC)。
如本文所用，术语“HPLC”或“高效液相层析”是指这样的液相层析，其中分离程度是通过使流动相在压力下穿过固定相通常为紧密填充柱而增加的。
如本文所用，术语“气相层析”是指这样的层析，其中样品混合物被蒸汽化并且被注射到穿过包含由液体或颗粒固体组成的固定相的柱而移动的载体气体流(如氮气或氦气)中，并且根据化合物对固定相的亲和力被分离成其组分化合物。
如本文所用，“质谱法”(MS)是指通过它们的质量鉴定化合物的分析技术。MS技术一般包括(1)使化合物电离以形成带电化合物；和(2)检测带电化合物的分子量并计算质荷比(m/z)。化合物可通过任何合适的方式电离并检测。“质谱仪”一般包括电离器和离子检测器。参见例如美国专利号6,204,500，发明名称为“Mass Spectrometry From Surfaces；”6,107,623，发明名称为“Methods and Apparatus for Transerm Mass Spectrometry；”6,268,144，发明名称为“DNA Diagnostics Based On Mass Spectrometry；”6,124,137，发明名称为“Surface-Enhanced Photolabile Attachment And Release For Desorption And Detection Of Analytes；”Wright等人，Prostate Cancer and Prostatic Diseases 2：264-76(1999)；以及Merchant和Weinberger，Electrophoresis 21：1164-67(2000)。
术语“电子电离”如本文所用是指这样的方法，其中气态或蒸汽相中的感兴趣分析物与电子流相互作用。电子与分析物的相互作用产生分析物离子，其然后可用于质谱法技术。
术语“化学电离”如本文所用是指这样的方法，其中试剂气体(例如氨)用于电子碰撞，并且分析物离子通过试剂气体离子与分析物分子相互作用而形成。
术语“快速原子轰击”如本文所用是指这样的方法，其中高能原子束(通常为Xe或Ar)碰撞非挥发性样品，使样品中包含的分子解吸并电离。测试样品被溶解在粘性液体基质诸如甘油、硫代甘油、间硝基苄醇、18-冠-6冠醚、2-硝基苯辛醚、环丁砜、二乙醇胺和三乙醇胺。
术语“场致解吸”如本文所用是指这样的方法，其中非挥发性测试样品被置于电离表面上，并且强电场被用于产生分析物离子。
术语“电离”如本文所用是指产生具有等于一个或多个电子单位的净电荷的分析物离子的过程。负离子是具有一个或多个电子单位的净负电荷的离子，而正离子是具有一个或多个电子单位的净正电荷的离子。
术语“负离子模式运行”是指检测到负离子的质谱法。类似地，“正离子模式运行”是指检测到正离子的质谱法。
术语“解吸”如本文所用是指将分析物从表面和/或分析物进入气相的入口去除。
在第二方面，提供了通过串联质谱法测定样品中1α，25(OH)2D2的存在或量的方法，其包括(a)在样品中用4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD)衍生1，25(OH)2D2；(b)通过HPLC纯化衍生的1，25(OH)2D2；(c)产生质/荷比为586.37±0.5的衍生的1α，25(OH)2D2的前体离子；(d)产生前体离子的一种或多种碎片离子，其中至少一种碎片离子包括质/荷比为314.12±0.5的离子；和(e)检测步骤(c)或(d) 或两者中产生的一种或多种离子的存在或量并且将检测的离子关联到样品中的1α，25(OH)2D2的存在或量。在某些优选的实施方式中，样品中的1，25(OH)2D2在步骤(a)之前通过免疫纯化进行纯化；优选地免疫纯化包括用免疫颗粒进行的免疫纯化；优选地免疫颗粒具有结合到表面的抗二羟维生素D代谢物抗体。在该方面的某些优选的实施方式中，所述方法进一步包括测定样品中1α，25(OH)2D3的存在或量；优选地1α，25(OH)2D3在质谱法之前用4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD)进行衍生；更优选地1α，25(OH)2D3的前体离子质/荷比为574.37±0.5。
在第三方面，提供了通过串联质谱法测定样品中1α，25(OH)2D3的存在或量的方法，其包括：(a)在样品中用4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD)衍生1α，25(OH)2D3；(b)通过HPLC纯化衍生的1α，25(OH)2D3；(c)产生质/荷比为574.37±0.5的衍生的1α，25(OH)2D3的前体离子；(d)产生前体离子的一种或多种碎片离子，其中至少一种碎片离子包括质/荷比为314.12±0.5的离子；和(e)检测步骤(c)或(d)或两者中产生的一种或多种离子的存在或量，并且将检测的离子关联到样品中的1α，25(OH)2D3的存在或量。在某些优选的实施方式中，样品中的1α，25(OH)2D2在步骤(a)之前通过免疫纯化进行纯化；优选地免疫纯化包括用免疫颗粒进行的免疫纯化；优选地免疫颗粒具有结合到表面的抗二羟维生素D代谢物抗体。在该方面的某些优选的实施方式中，所述方法进一步包括测定样品中1α，25(OH)2D2的存在或量；优选地1α，25(OH)2D2在质谱法之前用4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD)进行衍生；更优选地1α，25(OH)2D2的前体离子质/荷比为586.37±0.5。
在第四方面，提供了通过串联质谱法测定样品中1α，25(OH)2D2的存在或量的方法，其包括：(a)通过HPLC纯化1α，25(OH)2D2；(b)产生质/荷比为411.35±0.5的1α，25(OH)2D2的前体离子；(c)产生前体离子的一种或多种碎片离子，其中碎片离子包括选自质/荷比为151.12±0.5和135.12±0.5的离子的一种或多种离子；和(d)检测步骤(b)或(c)或两者中产生的一种或多种离子的存在或量，并且将检测的离子关联到样品中的1α，25(OH)2D2的存在或量。在该方面的优选实施方式中，1α，25(OH)2D2在质谱法之前没有进行衍生。在某些优选的实施方式中，样品中的1α，25(OH)2D2在步骤(a)之前通过免疫纯化进行纯化；优选地免疫纯化包括用免疫颗粒进行的免疫纯化；优选地免疫颗粒具有结合到表面的抗二羟维生素D代谢物抗体。在该方面的某些优选的实施方式中，所述方法进一步包括测定样品中1α，25(OH)2D3的存在或量；优选地1α，25(OH)2D3在质谱法之前没有进行衍生；更优选地1α，25(OH)2D3的前体离子质/荷比为399.35±0.5。
在第五方面，提供了通过串联质谱法测定样品中1α，25(OH)2D3的存在或量的方法，其包括：(a)通过HPLC纯化1α，25(OH)2D3；(b)产生质/荷比为399.35±0.5的1α，25(OH)2D3的前体离子；(c)产生前体离子的一种或多种碎片离子，其中碎片离子包括选自质/荷比为151.12±0.5和135.12±0.5的离子的一种或多种离子；和(d)检测步骤(b)或(c)或两者中产生的一种或多种离子的存在或量，并且将检测的离子关联到样品中的1α，25(OH)2D3的存在或量。在该方面的优选实施方式中，1α，25(OH)2D3在质谱法之前没有进行衍生。在某些优选的实施方式中，样品中的1α，25(OH)2D3在步骤(a)之前通过免疫纯化进行纯化；优选地免疫纯化包括用免疫颗粒进行的免疫纯化；优选地免疫颗粒具有结合到表面的抗二羟维生素D代谢物抗体。在该方面的某些优选的实施方式中，所述方法进一步包括测定样品中1α，25(OH)2D2的存在或量；优选地1α，25(OH)2D2在质谱法之前没有进行衍生；更优选地1α，25(OH)2D2的前体离子质/荷比为411.35±0.5。
术语“大约”如本文所用在提及定量测量时是指所示值加上或减去10％。
具体实施方式
检测和量化测试样品中二羟基维生素D代谢物的方法被描述。本文公开的一些优选方法采用液相层析(LC)——最优选为HPLC——来纯化所选的分析物，并且将该纯化与质谱法(MS)的独特方法组合，由此提供高通量测试系统用于检测并量化测试样品中的二羟基维生素D代谢物。在某些特别优选的实施方式中，二羟基维生素D代谢物在质谱法之前进行免疫纯化。优选的实施方式特别适于大的临床实验室应用。检测和量化二羟基维生素D代谢物的方法被提供，其具有提高的特异性并且以比其它二羟基维生素D代谢物测试所需的更少的时间和更少的样品制备物实现。
合适的测试样品包括任何可包含感兴趣分析物的测试样品。例如，在分析物制备期间获得的样品可以进行分析以测定制备方法的组成和产率。在某些优选的实施方式中，样品是生物学样品；即，从任何生物来源诸如动物、细胞培养物、器官培养物等获得的样品。在某些优选的实施方式中，样品从哺乳动物诸如狗、猫、马等获得。特别优选的哺乳动物是灵长类，最优选地是人。特别优选的样品包括血液、血浆、血清、头发、肌肉、尿液、唾液、泪液、脑脊髓液或其它组织样品。这样的样品可从例如患者——即将自己置于临床环境中以诊断、预测或治疗疾病或病症的有生命的个人——中得到。测试样品优选地从患者例如血清中得到。
质谱法的样品制备
在质谱法之前可采用方法以相对于样品中的其它组分富集二羟基维生素D代谢物或者增加样品中二羟基维生素D代谢物的浓度。这样的方法包括例如过滤、离心、薄层层析(TLC)、包括毛细管电泳在内的电泳、包括免疫亲和分离在内的亲和分离、包括乙酸乙酯提取和甲醇提取在内的提取法以及离液剂的应用或上述或类似方法的任何组合。
样品可进行加工或纯化以获得适于通过质谱法分析的制备物。这样的纯化应通常包括层析，诸如液相层析，并且还可通常包括在层析之前进行的另外的纯化方法。根据样品的类型或层析的类型，各种方法可被用于该目的。实例包括过滤、提取、沉淀、离心、脱脂、稀释及其组合等。对于层析来说，蛋白质沉淀是制备液体生物学样品诸如血清或血浆的一种优选方法。这样的蛋白质纯化方法在本领域中是熟知的，例如，Polson等人，Journal of Chromatography B785：263-275(2003)描述了适合用于本发明方法的蛋白质沉淀方法。蛋白质沉淀可被用于从样品中去除大部分蛋白质，留下在上清液中可溶的二羟基维生素D代谢物。样品可被离心以将液态上清液与沉淀的蛋白质分开。所得上清液然后可应用于液相层析和后来的质谱法分析。在本发明的一个实施方式中，蛋白质沉淀涉及将一份体积的液体样品(例如血浆)加入到大约四份体积的甲醇中。在某些实施方式中，蛋白质沉淀的应用消除了在HPLC和质谱法之前对高湍流液相层析(“HTLC”)或在线提取的需要。因此，在这样的实施方式中，所述方法涉及：(1)进行感兴趣样品的蛋白质沉淀；和(2)在没有使用在线提取或高湍流液相层析(“HTLC”)的情况下将上清液直接加样到HPLC-质谱仪上。
免疫纯化
在特别优选的实施方式中，所述方法包括在质谱法分析之前免疫纯化二羟基维生素D代谢物。免疫纯化步骤可采用本领域熟知的任何免疫纯化方法进行。通常免疫纯化方法采用与固体载体诸如柱、孔、管、胶囊、颗粒或类似物结合、偶联、固定或另外方式连接的抗体。一般地，免疫纯化方法包括(1)将包含感兴趣分析物的样品与抗体温育，以至于分析物结合于抗体，(2)进行一个或多个洗涤步骤，和(3)从抗体中洗脱分析物。
在某些实施方式中，免疫纯化的温育步骤与溶液中游离的抗体一起进行，并且抗体随后在洗涤步骤之前结合或者连接到固体表面。在某些实施方式中，这可采用第一抗体和第二抗体完成，其中第一抗体为抗二羟基维生素D抗体，第二抗体连接到对第一抗二羟基维生素D抗体具有亲和力的固体表面。在可选实施方式中，第一抗体在温育步骤前结合到固体表面。
合适的固体载体非限制性地包括管、载玻片、柱、珠、胶囊、颗粒、凝胶和类似物。在某些优选的实施方式中，固体载体是多孔板，诸如，例如96孔板、384孔板或类似物。在某些优选的实施方式中，固体载体是琼脂糖凝胶或琼脂糖珠或凝胶。本领域中有许多熟知的可将抗体(例如抗二羟基维生素D抗体或第二抗体)结合、连接、固定或偶联到固体载体的方法，例如共价或非共价键吸附、亲和结合、离子键等。在某些优选的实施方式中，抗体用CNBr偶联，例如抗体可被偶联到CNBr活化的琼脂糖凝胶。在其它实施方式中，抗体通过抗体结合蛋白诸如蛋白A、蛋白G、蛋白A/G或蛋白L连接到固体载体。
免疫纯化方法的洗涤步骤一般包括洗涤固体载体，以致于二羟基维生素D代谢物保持结合到固体载体上的抗二羟基维生素D抗体。免疫纯化的洗脱步骤一般包括加入干扰二羟基维生素D代谢物结合到抗二羟基维生素D抗体的溶液。示例性的洗脱溶液包括有机溶液(优选地乙醇)、盐溶液和高或低pH溶液。
在某些优选的实施方式中，免疫纯化采用具有抗二羟基维生素D抗体的免疫颗粒进行。在某些优选的实施方式中，可能包含二羟基维生素D代谢物的测试样品和免疫颗粒在试管中混合进行温育并且二羟基维生素D代谢物结合到连接免疫颗粒的抗二羟基维生素D抗体上；试管进行离心，在沉淀中留下免疫颗粒；去除上清液；通过向沉淀加入溶液将免疫颗粒洗涤一次或多次并且再离心；以及通过将洗脱溶液加入免疫颗粒对二羟基维生素D代谢物进行洗脱，试管进行离心，在沉淀中留下免疫颗粒；并且收集包含二羟基维生素D代谢物的上清液。在相关的优选实施方式中，免疫纯化采用包含具有抗二羟基维生素D抗体的免疫颗粒的柱或筒(cartridge)进行。优选地，这样的柱或筒以这样的方式被配置和安排以使溶液流过而使免疫颗粒包含在其中。在某些优选的实施方式中，溶液由于重力、离心或压力迫使通过柱或筒。柱的应用可使进行温育、洗涤和洗脱步骤变得容易。在某些优选的实施方式中，免疫纯化通过亲和层析；优选地通过自动亲和层析；优选地通过亲和-HPLC；或优选地采用自动化系统诸如由GE Healthcare(前称Amersham biosciences)商业销售的AKTA FPLC层析系统进行的亲和层析来进行。
在某些实施方式中，样品制备和免疫纯化可采用商业可购得试剂盒的方法和试剂进行。例如，IDS Inc(Fountain Hills，AZ)提供1，25-二羟基维生素D125I放射性免疫测定试剂盒(目录号AA-54F1)，其包括放射性免疫测定(RIA)之前用于提取和免疫提取二羟基维生素D的说明书和试剂。参见IDS，Inc.目录号AA-54F1的试剂盒的“Product Support”文件，其以其全部内容通过引用并入本文。具体地，IDS二羟基维生素D RIA试剂盒包括硫酸葡萄糖/氯化镁脱脂步骤和采用包含连接有对1，25二羟基维生素D特异性的单克隆抗体的颗粒悬浮液的免疫胶囊装置进行的免疫提取步骤。因此，在本文所述方法的某些实施方式中，样品经历采用IDS试剂盒或者类似于IDS试剂盒中提供的那些的方法、试剂和二羟基维生素D免疫纯化设备进行维生素D免疫纯化。抗体和二羟基纯化免疫纯化设备也与由ALPODiagnostics(Salem，NH)商业提供的1，25-(OH)2-维生素D ImmunoTube ELISA试剂盒(目录号30-2113)一起提供。该试剂盒包括抗1，25-(OH)2维生素-D检测抗体(目录号K2113A1)、用于1α，25-二羟基维生素D的免疫纯化的ImmunoTube柱(目录号K2113.SI)以及可用于免疫纯化1，25-二羟基维生素D的缓冲液和其它试剂。在本文所述方法的某些实施方式中，ALPO诊断试剂盒的一种或多种组分被用于免疫纯化1，25-二羟基维生素D。
液相层析
一般地，层析在质谱法之前进行，优选地层析是液相层析，更优选地是高效液相层析(HPLC)。在某些优选的实施方式中，层析不是气相层析。优选地，本发明的方法在没有使样品或感兴趣二羟基维生素D代谢物在质谱分析之前经历气相层析的情况下进行。
包括高效液相层析(HPLC)在内的液相层析(LC)依赖于相对慢的层流技术。传统的HPLC分析依赖于柱填充，其中样品穿过柱的层流是将感兴趣分析物从样品中分离的基础。本领域普通技术人员会理解这种柱中的分离是扩散过程。HPLC已经成功地用于生物学样品中化合物的分离。但是，在分离之前需要大量的样品制备并且随后用质谱仪(MS)进行分析，使得该技术需密集劳动。此外，大部分HPLC系统没有尽其最大可能地利用质谱仪，使得仅仅一个HPLC系统连接到单一的MS仪器，导致进行大量测定需要过长的时间。
已经描述了各种方法，其包括将HPLC用于质谱法分析之前的样品清理(clean-up)。参见例如Taylor等人，Therapeutic Drug Monitoring 22：608-12(2000)(血液样品的人工沉淀，接着人工C18固相提取，注射到HPLC用于在C18分析柱上的层析和MS/MS分析)；和Salm等人，Clin.Therapeutics 22Supl.B：B71-B85(2000)(血液样品的人工沉淀，接着人工C18固相提取，注射到HPLC用于在C18分析柱上的层析和MS/MS分析)。
本领域普通技术人员可选择适合用于本发明的HPLC仪器和柱。层析柱通常包括便于分离化学物部分(即分馏)的介质(即填充物质)。介质可包括微小颗粒。颗粒包括结合表面，其与各种化学物部分(chemical moieties)相互作用以促进化学物部分的分离。一个合适的结合表面是疏水性结合表面诸如烷基结合表面。烷基结合表面可包括C-4、C-8或C-18结合烷基基团，优选地C-18结合基团。层析柱包括接收样品的入口和排出包括分馏的样品的流出物的出口。在一实施方式中，样品(或预先纯化的样品)在入口处被施加到柱，用溶剂或溶剂混合物进行洗脱，并且在出口处排出。可选择不同的溶剂模式用于洗脱感兴趣分析物。例如，液相层析可采用梯度模式、等度模式或多型(即混合)模式。在层析期间，物质的分离受到变量诸如洗脱液(也称为“流动相”)的选择、梯度洗脱和梯度条件的选择、温度等的影响。
在某些实施方式中，分析物可在感兴趣分析物被柱填充物质可逆地保留而一种或多种其它物质没有被保留的条件下通过将样品施加到柱中进行纯化。在这些实施方式中，可应用第一流动相条件，其中感兴趣分析物被柱保留，并且一旦未保留的物质被洗涤穿过，随后可应用第二流动相条件以从柱中去除保留的物质。可选地，分析物可在相比一种或多种其它物质感兴趣分析物以不同的速度洗脱的流动相条件下通过将样品施加到柱中进行纯化。这种方法可相对于样品的一种或多种其它组分富集一种或多种感兴趣分析物的量。
最近，高湍流液相层析(“HTLC”)，也被称为高通量液相层析，已经被用于在通过质谱法分析之前的样品制备。参见例如Zimmer等人，J. Chromatogr.A854：23-35(1999)；也可参见美国专利号5,968,367、5,919,368、5,795,469和5,772,874。传统HPLC分析依赖于柱填充，其中样品穿过柱的层流是将感兴趣分析物从样品中分离的基础。本领域普通技术人员会理解这种柱中的分离是扩散过程。相反，应当认为，湍流诸如HTLC柱和方法所提供的湍流可提高传质速度，改进所提供的分离特性。在一些实施方式中，高湍流液相层析(HTLC)，单独地或与一种或多种纯化方法一起，可被用于在质谱法之前纯化感兴趣的二羟基维生素D代谢物。在这样的实施方式中，样品可采用捕获分析物的HTLC提取筒进行提取，然后在离子化之前在第二HTLC柱或分析用HPLC柱上洗脱并层析。因为包含在这些层析方法中的步骤可以自动方式连接，所以对分析物纯化期间操作者参与的需求可最小化。在该方法的某些实施方式中，样品在加载到HTLC柱之前经历上述的蛋白质沉淀；在可选实施方式中，样品可直接加载到HTLC上，而不经历蛋白质沉淀。
最近，研究已经表明维生素D3代谢物的A环的羟基的差向异构是维生素D3代谢和生物活化的重要方面，并且取决于所参与的细胞类型，维生素D3代谢物的3-C差向异构体(例如3-表-25(OH)D3、3-表-24，25(OH)2D3和3-表-1，25(OH)2D3)通常是主要的代谢产物。参见Kamao等人，J. Biol.Chem.，279：15897-15907(2004)。Kamao等人进一步提供采用手性HPLC分离包括3-C差向异构体在内的各种维生素D代谢物的方法。因此，本发明还提供通过下列步骤检测样品中一种或多种维生素D代谢物优选地维生素D3代谢物的具体差向异构体的存在、不存在和/或量的方法：(1)通过手性层析优选地手性HPLC分离一种或多种特定维生素D代谢物；和(2)采用如本文所述的质谱法检测一种或多种维生素D代谢物的存在和/或量。Kamao等人中描述的手性层析方法适用于本发明的方法，然而本领域普通技术人员理解存在许多其它也将适合的手性层析方法。在优选的实施方式中，所述方法包括采用手性层析将25(OH)D3与3-表-25(OH)D3分开，如果样品中存在的话；和采用质谱法检测样品中25(OH)D3和3-表-25(OH)D3的存在和/或量。在相关的实施方式中，所述方法包括采用手性层析将1α，25(OH)D3与3-表-25(OH)D3分开，如果样品中存在的话；和采用质谱法检测样品中1α，25(OH)D3和3-表-25(OH)D3的存在和/或量。在本发明的某些实施方式中，手性层析与上述的HTLC方法联合使用。
通过质谱法的检测和定量
公开的是检测样品中一种或多种二羟基维生素D代谢物的存在或量的方法。在某些方面，所述方法包括电离二羟基维生素D代谢物(或多种)，通过质谱法检测离子(或多种)，和将离子(或多种)的存在或量与样品中二羟基维生素D代谢物(或多种)的存在或量关联。所述方法可包括(a)纯化二羟基维生素D代谢物，如果样品中存在的话，(b)电离纯化的二羟基维生素D代谢物，和(c)检测离子的存在或量，其中将离子的存在或量与样品中二羟基维生素D代谢物的存在或量关联。在优选的实施方式中，电离步骤(b)可包括(i)电离二羟基维生素D代谢物，如果样品中存在的话，以产生离子；(ii)通过质谱法分离二羟基维生素D代谢物粒子以提供前体离子；和(iii)在分离的前体和惰性碰撞气体之间实施碰撞以产生至少一个在质谱仪中可检测的碎片离子。在某些优选的实施方式中，前体离子是二羟基维生素D代谢物的质子化和脱水离子。
进一步提供了通过串联质谱法测定测试样品中二羟基维生素D代谢物的存在或量的方法。所述方法可包括：(a)产生二羟基维生素D代谢物的质子化和脱水前体离子；(b)产生前体离子的一种或多种碎片离子；和(c)检测步骤(a)或(b)或两者中产生的一种或多种离子的存在或量并且将检测的离子关联到样品中的二羟基维生素D代谢物的存在或量。
在本发明的某些优选的实施方式中，至少一种碎片被检测到，其中将前体和/或至少一个片段的存在或量关联到样品中的二羟基维生素D代谢物的存在或量。优选地，至少一种碎片离子对感兴趣二羟基维生素D代谢物具有特异性。在一些实施方式中，本发明的方法可用于检测或定量单一测试中的两种或多种二羟基维生素D代谢物。
采用包括离子源的质谱仪进行质谱法，所述离子源用于电离分馏的样品并产生带电分子用于进一步分析。例如样品的电离可通过电喷雾电离(ESI)、大气压化学电离(APCI)、光致电离、电子电离、快原子轰击(FAB)/液体二次电离(LSIMS)、基质辅助激光解吸电离(MALDI)、场致电离、场致解吸、热喷雾/等离子喷雾电离和粒子束电离进行。技术人员应理解电离方法的选择可根据要测量的分析物、样品类型、检测器类型、正-负模式的选择等进行确定。
样品已经电离后，由此产生的带正电或带负电的离子可进行分析以测定质荷比(即m/z)。用于测定质荷比的合适分析器包括四极分析器、离子阱分析器和飞行时间分析器。离子可采用几种检测模式进行检测。例如，所选离子可以进行检测(即采用选择离子检测模式(SIM))，或者可选地，离子可采用扫描模式例如多反应检测(MRM)或选择反应检测(SRM)进行检测。优选地，质/荷比采用四极分析器进行测定。例如，在“四极”或“四极离子阱”仪器中，振荡射频场中的离子经历与电极之间施加的DC电压、RF信号的振幅和m/z成比例的力。可以选择电压和振幅，以致于只有特定m/z的离子传播四极的长度，而所有其它离子是偏离的。因此，四极仪器可对注入到仪器的离子起到“质量过滤器”和“质量检测器”的作用。
技术人员可通过利用“串联质谱法”或“MS/MS”提高MS技术的分辨率。在该技术中，从感兴趣分子中产生的前体离子(也称为母体离子)可在MS仪器中进行过滤，并且前体离子随后成碎片以产生一种或多种碎片离子(也称为子离子或产物离子)，其然后在第二MS程序中进行分析。通过仔细选择前体离子，仅仅由某些分析物产生的离子通过至碎裂室，在其中与惰性气体原子碰撞以产生子离子(daughter ions)。因为前体和碎片离子都是在给定系列的电离/破碎条件下以可再生方式产生的，所以MS/MS技术可提供极其强大的分析工具。例如，过滤/破裂组合可被用于消除干扰物质，并且可特别用于复杂样品诸如生物学样品。
此外，技术上的最新进展诸如与飞行时间分析器连接的基质辅助激光吸附电离(“MALDI-TOF”)允许分析物在非常短的离子脉冲下在飞摩尔(femtomole)水平上的分析。将飞行时间分析器与串联MS组合的质谱仪对本领域普通技术人员也是熟知的。此外，多个质谱法步骤可在被称为“MS/MSn”的方法中进行组合。可采用各种其它组合，诸如MS/MS/TOF、MALDI/MS/MS/TOF或SELDI/MS/MS/TOF质谱法。
质谱仪一般给用户提供离子扫描；即，在给定范围(例如100至1000amu)内具有特定m/z的各个离子的相对丰度。分析物测试的结果，即质谱，可通过本领域已知的许多方法关联到原始样品中分析物的量。例如，假定取样和分析参数进行仔细控制，可将给定离子的相对丰度与将相对丰度转化成原始分子的绝对量的表进行比较。可选地，分子标准可用样品运行，并且基于从那些标准中产生的离子构建标准曲线。利用这种标准曲线，给定离子的相对丰度可被转化成原始分子的绝对量。在某些优选的实施方式中，内标被用于产生计算二羟基维生素D代谢物的数量的标准曲线。产生和利用这种标准曲线的方法在本领域中是熟知的，并且本领域普通技术人员能选择合适的内标。例如，二羟基维生素D代谢物的同位素可被用作内标，在优选的实施方式中，二羟基维生素D代谢物是含重氢的二羟基维生素D代谢物，例如1α，25(OH)2D2-[26，26，26，27，27，27]-2H或1α，25(OH)2D3-[6，19，19’]-2H或两者。将离子的存在或量与原始分子的存在或量关联的许多其它方法对本领域普通技术人员应是熟知的。
本发明方法的一种或多种步骤可采用自动仪器进行。在某些实施方式中，一种或多种纯化步骤在线进行，并且更优选地所有纯化和质谱法步骤可以在线的方式进行。
在某些实施方式中，诸如MS/MS，其中前体离子被分离以进一步破裂，碰撞活化分裂通常被用于产生碎片离子以进一步检测。在CAD中，前体离子通过与惰性气体碰撞获得能量，并且随后通过被称为“单分子分解”的过程产生碎片。足够的能量必须储蓄在前体离子中以致于离子内的某些键可由于增加的振动能而断开。
在特别优选的实施方式中，二羟基维生素D代谢物如下采用LC-MS/MS进行检测和/或定量。样品经历液相层析，优选地HPLC，来自层析柱的液体溶剂流进入LC-MS/MS分析仪的加热喷雾器界面，并且溶剂/分析物混合物在界面的加热管中被转化为蒸汽。包含在雾状溶剂中的分析物(即二羟基维生素D代谢物)被界面的冠状放电针电离，其将大的电压施加到雾状溶剂/分析物混合物。离子即前体离子穿过仪器的孔并且进入第一个四极。四极1和3(QI和Q3)是质量过滤器，允许根据它们的质荷比(m/z)选择离子(即“前体”和“碎片”离子)。四极2(Q2)为碰撞单元，其中离子被破裂。质谱仪的第一个四极(Q1)选择具有要分析的特定二羟基维生素D代谢物的质荷比的分子。具有特定二羟基维生素D代谢物的前体离子的正确m/z比的前体离子被允许穿到碰撞室(Q2)中，而具有任何其它m/z的多余离子与四极的侧面碰撞并且被除去。进入Q2的前体离子与中性氩气分子和碎片碰撞。该过程被称为碰撞活化分裂(CAD)。所产生的碎片离子穿到四极3(Q3)，其中想得到的二羟基维生素D代谢物的碎片离子被选择而其它离子被除去。
本发明的方法可包括在正或负离子模式下进行的MS/MS。采用本领域熟知的标准方法，本领域普通技术人员能鉴别可用于在四极3(Q3)中选择的二羟基维生素D代谢物的特定前体离子的一种或多种碎片离子。
如果感兴趣二羟基维生素D代谢物的前体离子包括醇或胺基团，通常形成分别代表前体离子的脱水或去氨基的碎片离子。在包括醇基团的前体离子的情况下，通过脱水形成的这些碎片离子通过从前体离子中失去一个或多个水分子而形成(即，其中前体离子与碎片离子之间的m/z差对于失去一个水分子来说是大约18，或者对于失去两个水分子来说大约36等)。在包括胺基团的前体离子的情况下，通过去氨基形成的这些碎片离子通过失去一个或多个氨分子而形成(即，其中前体离子与碎片离子之间的m/z差对于失去一个氨分子来说是大约17，或者对于失去两个氨分子来说大约34等)。同样，包括一个或多个醇和氨基的前体离子常常形成代表失去一个或多个水分子和/或一个或多个氨分子的碎片离子(例如，其中前体离子与碎片离子之间的m/z差对于失去一个水分和失去一个氨分子来说是大约35)。一般地，代表脱水或去氨基的碎片离子不是对特定分析物的特定碎片离子。
随着离子与检测器碰撞，它们产生转化成数字信号的电子脉冲。所获得的数据被传递到计算机，其将所收集的离子数对时间作图。所产生的质量层析图类似于在传统HPLC方法中产生的层析图。测量对应于特定离子的峰下面的面积或这些峰的振幅，并且面积或振幅被关联到感兴趣分析物(维生素D代谢物)的量。在某些实施方式中，对碎片离子(或多种)和/或前体离子来说的曲线下面积或峰的振幅进行测量以测定二羟基维生素D代谢物的量。如上所述，给定离子的相对丰度可基于内部分子标准诸如6D-25OHD3的一种或多种离子的峰采用校准标准曲线转化成原始分析物即二羟基维生素D代谢物的绝对量。
在本发明的某些方面，各种离子的数量通过测量曲线下面积或峰的振幅进行测定，并且计算并检测离子的数量比(即“子离子比检测”)。在该方法的某些实施方式中，可以计算二羟基维生素D代谢物的前体离子的数量和一种或多种碎片离子的数量之比并且与类似测量的二羟基维生素D代谢物的分子标准的比(或多种)进行比较。在检测到二羟基维生素D代谢物的一种以上碎片离子的实施方式中，而不是碎片离子(或多种)相比前体离子的比，或者除了碎片离子(或多种)相比前体离子的比之外，可以测定不同碎片离子的比(或多种)。在检测这种比值的实施方式中，如果样品中的离子比相比分子标准存在大的差别，很可能样品中的分子对结果产生干扰。相反，如果样品和分子标准中的离子比类似，那么可信度增加，没有干扰。因此，检测样品中的这些比值已经将这些比值与可信分子标准的那些比值比较可用于增加方法的精确性。
在本发明特别优选的实施方式中，样品中两个或多种二羟基维生素D代谢物的存在或不存在或量采用上述MS/MS方法在单一测试中进行检测。
下列实施例起到阐明本发明的作用。这些实施例绝对没有意图限制本发明的范围。
实施例
实施例1：通过LC-MS/MS测定1α.25-二羟基维生素D 3 和1α，25-二羟基维生素D 2 将50μl内标混合物(掺有50pg/50微升的1α，25(OH)2D3-[6，19，19]-2H和200pg/50微升的1α，25(OH)2D2-[26，26，26，27，27，27]-2H的处理的血清)加入到试管中，然后添加500μl的校准溶液、质量控制试液或血清标准，接着添加内标混合物。溶液通过加入50μl MgCl2/硫酸葡萄糖溶液并且完全混合进行脱脂。然后离心试管20分钟，并且将500μl上清液转移到来自ALPCO Diagnostics的包含抗二羟基维生素D免疫胶囊的ImmunoTube筒(目录号K2113.SI)。筒在室温下在振荡器上温育两个小时。然后用750μl去离子水将珠子洗涤三次。珠子在通过将筒离心而进行的洗涤之间被排水。与珠子结合的二羟基维生素D用250μl乙醇直接洗脱进入玻璃HPLC插件中，然后在氮气下完全干燥。然后样品通过加入50μl的4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD)溶液(0.8mg/mL，在乙腈中)进行衍生。衍生反应通过加入50ul去离子水而停止。
然后，HPLC插件被转移到HPLC自动取样器以加载到LC-MS/MS分析器。LC-MS/MS采用具有大气压化学电离(APCI)源的Thermo Finnigan LC-MS/MS分析仪(Thermo Finnigan Quantum TSQ(S/N：TQU00655))作为检测器进行。自动取样器被用于将90μL提取的样品上清液注射到HPLC柱。液相层析采用以0.8mL/分钟运行的SynergiTM Max-RP C-12Phenomenex柱进行。两种流动相溶液被用于HPLC：流动相A是HPLC等级水中的0.1％甲酸并且流动相B为100％乙腈。总的运行时间为5.00min，其中收集窗在1：31-2：31之间(60秒)。初始条件(20秒)为50％流动相A和50％流动相B；梯度(160秒)从50％流动相A和50％流动相B至2％流动相A和98％流动相B；洗涤步骤为(60秒)为2％流动相A和98％流动相B；以及再调整步骤为50％流动相A和50％流动相B。
流出HPLC柱的液体溶剂流进入Thermo Finnigan LC-MS/MS分析仪的加热喷雾器表面，并且二羟基维生素D代谢物采用正模式的APCI进行测量。溶剂/分析物混合物首先在界面的加热管中被转化为蒸汽。包含在雾状溶剂中的分析物被界面的冠状放电针电离(正电荷被加入)，其将大的电压施加到雾状溶剂/分析物混合物。离子穿过仪器的孔并且进入第一个四极。四极1和3(Q1和Q3)是质量过滤器，允许根据它们的质荷比(m/z)选择离子(即“前体”和“碎片”离子)。四极2(Q2)为碰撞单元，在其中离子被破裂。
质谱仪的第一个四极(Q1)选择具有1α，25(OH)2D2、1α，25(OH)2D3、6D-1α，25(OH)2D2(内标)和-1α，25(OH)2D3(内标)的质/荷比的分子。具有这些m/z比(参见下表)的离子被允许通过至碰撞室(Q2)，而具有任何其它m/z的多余离子与四极的侧面碰撞并且被除去。进入Q2的离子与中性氩气分子和碎片碰撞。所产生的碎片离子穿到四极3(Q3)，其中1α，25(OH)2D2、1α，25(OH)2D3、6D-1α，25(OH)2D2(内标)和-1α，25(OH)2D3(内标)的碎片离子被选择(参见下表)而其它离子被除去。下列质量转变被用于在确认期间的检测和定量：
表1.所选二羟基维生素D代谢物的质量转变
  分析物 前体离子 产物离子
1α，25(OH)2D3 574.37 314.12
1α，25(OH)2D3-[6，19，19’]-2H(内标) 577.37 317.12
1α，25(OH)2D2 586.37 314.12
1α，25(OH)2D2-[26，26，26，27，27，27]-2H(内标) 592.37 314.12
随着离子与检测器碰撞，它们产生转化成数字信号的电子脉冲。所获得的数据被传递到计算机，其将所收集的离子数对时间作图。所得的质量层析谱类似于在传统HPLC方法中产生的层析谱。
分析物和内标(1α，25(OH)2D3-[6，19，19’]-2H和1α，25(OH)2D2-[26，26，26，27，27，27]-2H)峰的面积比被用于构建标准曲线，其然后被用于计算分析物浓度。采用标准曲线，患者样品中1α，25(OH)2D2和1α，25(OH)2D3的浓度在患者样品中被定量。
实施例2：实验内和实验间的精度
1α，25(OH)2D2和1α，25(OH)2D3的储备液被加入到合并的血清(pooled serum)中以产生低区(Low Pool)(10-15ng/mL各代谢物)、中低区(25-35ng/mL各代谢物)、中高区(55-65ng/mL各代谢物)和高区(115-130ng/mL)。来自各个低、中低、中高和高区的四等分采用实施例1中描述的LC-MS/MS方法在单一实验中进行分析。测得下列精度值：
表2.实验内变化：1α，25-二羟基维生素D2(1α，25(OH)2D2)
表3.实验内变化：1α，25-二羟基维生素D3(1α，25(OH)2D3)
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本文提到或引用的文章、专利和专利申请以及所有其它文件或电子可得到的信息的内容以其全部内容通过引用并入本文至这样的程度，如同每一单独的出版物被具体且单独地显示通过引用并入。申请人保留将任何和所有的来自任何这些文章、专利、专利申请或其它物理和电子文件的物质和信息物理上并入本申请的权利。
本文例证性描述的本发明可在本文没有具体公开的任何元素或多个元素、限制或多个限制不存在的情况下合适地实施。因此，例如术语“包括(comprising)”、“包括(including)”、“包含(containing)”等应当广义且非限制性地理解。此外，本文所用的术语和表达已经作为描述性术语而不是限制性术语使用，并且没有意图使用这种将所示和所述特征的等价形式或其部分排除的术语和表达，但是应当认识到在所请求保护的发明范围内各种改变是可能的。因此，应当理解，尽管本发明通过优选的实施方式和可选特征具体地公开，但是本领域普通技术人员可诉诸于本文公开的其中实施的本发明的改变和变化，并且这种改变和变化被认为在本发明的范围内。
本发明在本文中已经作了广泛且一般性的描述。落入上位公开内容中的每一个较窄类别和亚组也构成本发明的部分。这包括本发明的一般描述，条件是或者否定性的限制是从种类中去除了任何主题内容，无论排除的物质是否在本文中具体描述。
其它实施方式在下列权利要求之内。此外，在本发明的特征或方面按照马库什组进行描述的情况下，本领域普通技术人员应认识到本发明也因此按照马库什组的任何单个成员或成员的亚组进行描述。

Claims (45)

1.通过串联质谱法测定样品中一种或多种二羟基维生素D代谢物的量的方法，其包括：
(a)从所述样品中免疫纯化所述二羟基维生素D代谢物；
(b)通过HPLC进一步纯化来自步骤(a)的免疫纯化的二羟基维生素D代谢物；
(c)通过串联质谱法测定从步骤(b)获得的维生素D代谢物的量，其包括：
(i)产生所述一种或多种二羟基维生素D代谢物的前体离子；
(ii)产生所述前体离子的一个或多个碎片离子；和
(iii)检测步骤(i)或(ii)或两者中产生的一种或多种所述离子的量并且将检测的离子关联到所述样品中的所述一种或多种二羟基维生素D代谢物的量。
2.权利要求1的方法，其中所述免疫纯化步骤利用免疫颗粒。
3.权利要求2的方法，其中所述免疫颗粒包括抗二羟基维生素D抗体。
4.权利要求1-3的任一项的方法，其中所述一种或多种二羟基维生素D代谢物没有经历衍生。
5.权利要求1-3的任一项的方法，其中所述一种或多种二羟基维生素D代谢物在质谱法之前进行衍生。
6.权利要求5的方法，其中所述一种或多种二羟基维生素D代谢物在质谱法之前用4-取代的1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(TAD)进行衍生。
7.权利要求5的方法，其中所述一种或多种二羟基维生素D代谢物在质谱法之前用4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD)进行衍生。
8.权利要求5的方法，其中所述一种或多种二羟基维生素D代谢物在质谱法之前用4’-羧苯基-TAD进行衍生。
9.权利要求1-8的任一项的方法，其中所述一种或多种二羟基维生素D代谢物包括1α，25(OH)2D2。
10.权利要求1-8的任一项的方法，其中所述一种或多种二羟基维生素D代谢物包括1α，25(OH)2D3。
11.权利要求1-10的任一项的方法，其中所述一种或多种二羟基维生素D代谢物包括1α，25(OH)2D2和1α，25(OH)2D3并且其中所述代谢物的所述量在单一测试中进行测定。
12.权利要求1-3、5、6和9-11的任一项的方法，其中所述一种或多种二羟基维生素D代谢物包括1α，25(OH)2D2；其中所述1α，25(OH)2D2在质谱法之前用4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD)进行衍生；并且其中所述1α，25(OH)2D2的所述前体离子的质/荷比为586.37±0.5。
13.权利要求12的方法，其中所述一种或多种碎片离子包括质/荷比314.12±0.5的离子。
14.权利要求1-3、5、6和9-13的任一项的方法，其中所述一种或多种二羟基维生素D代谢物包括1α，25(OH)2D3；其中所述1α，25(OH)2D3在质谱法之前用4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD)进行衍生；并且其中所述1α，25(OH)2D3的所述前体离子的质/荷比为574.37±0.5。
15.权利要求14的方法，其中所述一种或多种碎片离子包括质/荷比314.12±0.5的离子。
16.权利要求1-4和9-11的任一项的方法，其中所述一种或多种二羟基维生素D代谢物包括1α，25(OH)2D2；其中所述1α，25(OH)2D2在质谱法之前进行衍生；并且其中所述1α，25(OH)2D2的所述前体离子的质/荷比为411.35±0.5。
17.权利要求16的方法，其中所述一种或多种碎片离子包括选自质/荷比为151.12±0.5和135.12±0.5的离子的一种或多种离子。
18.权利要求1-4、9-11、16和17的任一项的方法，其中所述一种或多种二羟基维生素D代谢物包括1α，25(OH)2D3；其中所述1α，25(OH)2D3没有进行衍生；并且其中所述1α，25(OH)2D3的所述前体离子的质/荷比为399.35±0.5。
19.权利要求18的方法，其中所述一种或多种碎片离子包括选自质/荷比为151.12±0.5和135.12±0.5的离子的一种或多种离子。
20.通过串联质谱法测定样品中1α，25(OH)2D2的量的方法，其包括：
(a)在所述样品中用4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD)衍生所述1α，25(OH)2D2；
(b)通过HPLC纯化来自步骤(a)的衍生的1α，25(OH)2D2；
(c)产生质/荷比为586.37±0.5的从步骤(b)中得到的衍生的1α，25(OH)2D2的前体离子；
(d)产生所述前体离子的一种或多种碎片离子，其中所述一种或多种碎片离子中的至少一种包括质/荷比为314.12±0.5的离子；和
(e)检测步骤(c)或(d)或两者中产生的一种或多种所述离子的量并且将检测的离子关联到所述样品中的所述1α，25(OH)2D2的量。
21.权利要求20的方法，其中所述样品中的所述1α，25(OH)2D2在步骤(a)之前通过免疫纯化进行纯化。
22.权利要求21的方法，其中所述免疫纯化利用免疫颗粒。
23.权利要求20-22的任一项的方法，其中所述方法进一步包括测定所述样品中的所述1α，25(OH)2D3的量。
24.权利要求23的方法，其中所述1α，25(OH)2D3在质谱法之前用4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD)进行衍生；并且其中所述1α，25(OH)2D3的所述前体离子的质/荷比为574.37±0.5。
25.通过串联质谱法测定样品中1α，25(OH)2D3的量的方法，其包括：
(a)在所述样品中用4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD)衍生所述1α，25(OH)2D3；
(b)通过HPLC纯化步骤(a)的衍生1α，25(OH)2D3；
(c)产生质/荷比为574.37±0.5的衍生的1α，25(OH)2D3的前体离子；
(d)产生所述前体离子的一种或多种碎片离子，其中所述一种或多种碎片离子中的至少一种包括质/荷比为314.12±0.5的离子；和
(e)检测步骤(c)或(d)或两者中产生的一种或多种所述离子的量并且将检测的离子关联到所述样品中的所述1α，25(OH)2D3的量。
26.权利要求25的方法，其中所述样品中的所述1α，25(OH)2D3在步骤(a)之前通过免疫纯化进行纯化。
27.权利要求26的方法，其中所述免疫纯化利用免疫颗粒。
28.权利要求25-27的任一项的方法，其中所述方法进一步包括测定所述样品中1α，25(OH)2D2的量。
29.权利要求28的方法，其中所述1α，25(OH)2D2在质谱法之前用4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD)进行衍生；并且其中所述1α，25(OH)2D2的所述前体离子的质/荷比为586.37±0.5。
30.通过串联质谱法测定样品中1α，25(OH)2D2的量的方法，其包括：
(a)通过HPLC纯化所述1α，25(OH)2D2；
(b)产生质/荷比为411.35±0.5的从步骤(a)中得到的所述1α，25(OH)2D2的前体离子；
(c)产生所述前体离子的一种或多种碎片离子，其中所述一种或多种碎片离子包括选自质/荷比为151.12±0.5和135.12±0.5的离子的一种或多种离子；和
(d)检测步骤(b)或(c)或两者中产生的一种或多种所述离子的量并且将检测的离子关联到所述样品中的所述1α，25(OH)2D2的量；
其中所述1α，25(OH)2D2没有进行衍生。
31.权利要求30的方法，其中所述样品中的所述1α，25(OH)2D2在步骤(a)之前通过免疫纯化进行纯化。
32.权利要求31的方法，其中所述免疫纯化利用免疫颗粒。
33.权利要求30-32的任一项的方法，其中所述方法进一步包括测定所述样品中的所述1α，25(OH)2D3的量。
34.权利要求33的方法，其中所述1α，25(OH)2D3在质谱法之前没有进行衍生；并且其中所述1α，25(OH)2D3的所述前体离子的质/荷比为399.35±0.5。
35.通过串联质谱法测定样品中1α，25(OH)2D3的存在或量的方法，其包括：
(a)通过HPLC纯化衍生1α，25(OH)2D3；
(b)产生质/荷比为399.35±0.5的从步骤(a)中得到的所述1α，25(OH)2D3的前体离子；
(c)产生所述前体离子的一种或多种碎片离子，其中所述一种或多种碎片离子包括选自质/荷比为151.12±0.5和135.12±0.5的离子的一种或多种离子；和
(d)检测步骤(b)或(c)或两者中产生的一种或多种所述离子的量并且将检测的离子关联到所述样品中的所述1α，25(OH)2D3的量；
其中所述1α，25(OH)2D3在质谱法之前没有进行衍生。
36.权利要求35的方法，其中所述样品中的所述1α，25(OH)2D3在步骤(a)之前通过免疫纯化进行纯化。
37.权利要求36的方法，其中所述免疫纯化利用免疫颗粒。
38.权利要求35-37的任一项的方法，其中所述方法进一步包括测定所述样品中的所述1α，25(OH)2D2的量。
39.权利要求38的方法，其中所述1α，25(OH)2D2在质谱法之前没有进行衍生；并且其中所述1α，25(OH)2D2的所述前体离子的质/荷比为411.35±0.5。
40.通过串联质谱法测定样品中一种或多种二羟基维生素D代谢物的量的方法，其包括：
(a)从所述样品中免疫纯化所述二羟基维生素D代谢物；
(b)通过串联质谱法测定从步骤(a)获得的维生素D代谢物的量，其包括：
(i)产生所述一种或多种二羟基维生素D代谢物的前体离子；
(ii)产生所述前体离子的一种或多种碎片离子；和
(iii)检测步骤(i)或(ii)或两者中产生的一种或多种所述离子的量并且将检测的离子关联到所述样品中的所述一种或多种二羟基维生素D代谢物的量。
41.权利要求40的方法，其中来自步骤(a)的所述免疫纯化的二羟基维生素D代谢物在质谱法之前进一步通过液相层析进行纯化。
42.权利要求40-41的任一项的方法，其中所述一种或多种二羟基维生素D代谢物在质谱法之前用4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD)进行衍生。
43.权利要求40-42的任一项的方法，其中所述样品在所述免疫纯化之前经历蛋白质沉淀。
44.权利要求40-43的任一项的方法，其中6D-25OHD3被用作内标。
45.权利要求40-44的任一项的方法，其进一步包括C18固相提取。
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