JP4634913B2 - ステロイドの測定方法 - Google Patents
ステロイドの測定方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4634913B2 JP4634913B2 JP2005324856A JP2005324856A JP4634913B2 JP 4634913 B2 JP4634913 B2 JP 4634913B2 JP 2005324856 A JP2005324856 A JP 2005324856A JP 2005324856 A JP2005324856 A JP 2005324856A JP 4634913 B2 JP4634913 B2 JP 4634913B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- measurement
- steroid
- picolinoyl
- ester
- derivative
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Landscapes
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Description
非特許文献6には、ステロイドのフェノール性水酸基をダンシル化(5−ジメチルアミノナフタレン−1−イルスルフォン化)し、これをLC−MS/MSで測定することにより、例えばエストラジオールの測定限界として6.3pgを達成できたことが記載されている。しかし、この方法においては、特異性及びダンシル化した後の化合物の安定性に欠けるという欠点がある。
特許文献3には、ステロイドをフェニルヒドラゾン化又はフェニルアミノフェニルボロネート化した後、LC−負イオンAPCI/MSで測定することにより、ステロイドを数pgのレベルで測定できることが記載されている。また、このときの測定感度は、ペンタフルオロベンジル化のときと比べ最大7倍上昇していることも示されている。しかしながら、この方法は、オキソ基又はビシナルジオール基を有するステロイドに対してのみ使用可能である。
また、本発明の別の目的は、LC−MSを用いるステロイド測定用の試薬を提供することである。
1)試料中のステロイドの水酸基に下記式
で示される化合物を反応させてエステル誘導体とする工程、
2)前記エステル誘導体を、LC−MSを用いて測定する工程、
を含むことを特徴とする測定方法に関するものである。
また、本発明は、上記式(I)で示される化合物を含むことを特徴とする、LC−MSを用いるステロイド測定用試薬に関するものである。
本明細書において、「LC−MS」とは、例えば、一般的にはLC−MS/MSであり、その中、イオン化法を用いたものとしてはLC−ESI/MS及びLC−APCI/MSを挙げることができ、中でも、LC−ESI/MSが好ましい。
Rは、好ましくは脱離基であり、より好ましくはハロゲン基、最も好ましくはクロロである。
なお、上記低級アルキル基は、炭素数が1〜6の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基であり、例えば、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、イソブチル、t−ブチル、n−ペンチル、n−ヘキシル等を挙げることができる。
また、本発明において上記式(I)の化合物における−CORの置換位置は、特に制限されることはないが、より好ましくは2位である。
なお、前記式(I)の化合物はその殆どが既知であり、たとえ新規であったとしても、既知化合物から既知の方法により容易に合成することができる。
試料の調製
試料は、有機溶媒による抽出の後、簡易カラムクロマトグラフィー、例えば、ウォーターズ社製OASIS HLB(登録商標)カートリッジ、バリアン社製Bond Elut Si(登録商標)カートリッジ等による分離精製等の一般的調製方法を適宜選択して調製してから、次のエステル誘導体化反応に供することができる。
上記で調製した試料に対し、前記式(I)の化合物を反応させて、ステロイドをエステル誘導体に変換する。
この反応は、一般に、不活性有機溶媒、例えば、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン等のエーテル類;ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類;ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等のアミド類;アセトニトリル;ジメチルスルホキシド等の不活性有機溶媒に溶解又は懸濁した状態にて、適当な塩基、例えば、水素化ナトリウム、炭酸カリウム、トリエチルアミン、ピリジン等の存在下にて行うことができる。反応温度は、通常、−5℃乃至80℃の範囲内の温度とすることができ、好ましくは10℃乃至30℃の範囲内の温度が適している。また、反応時間は、通常5〜240分の範囲内の時間とすることができ、好ましくは30〜90分の範囲内が適している。
また、上記エステル誘導体化反応において使用する塩基の量は、特に制限されるものではないが、一般に、試料1mLあたり塩基を少なくとも0.1ミリモル、好ましくは0.1〜0.5ミリモルの範囲内とすることができる。
LC−MS測定
上記エステル化誘導体反応において調製したエステル誘導体のLC−MSによる測定は、一般的なLC、例えば、ヒューレット・パッカード社製HP1100、ウォーターズ社製2795等のLC、及び一般的なMS、例えば、マイクロマス社製QUATTROII(登録商標)、QUATTRO MICRO(登録商標)、アプライド・バイオシステムズ社製API4000等のMSを用いて行うことができる。
本発明において使用されるステロイドのエステル誘導体と、先に述べた先行技術文献に記載されている各種誘導体化試薬を用いて誘導体化されたステロイド誘導体についてのLC−MS/MSでの検出感度を比較した。なお、誘導体化されるステロイド化合物には、テストステロン(T)及びエストラジオール(E2)を用いた。
Tについては、本発明において使用されるT−17−O−ピコリノイルエステル誘導体の他に、T−17−O−N−メチルピリジニウム−2−エーテル誘導体及びT−17−O−N−メチルピリジニウム−2−エーテル−3−エトオキシム誘導体について測定を行い、E2については、本発明において使用されるE2−3,17−O−ジピコリノイルエステル誘導体の他に、E2−3−ペンタフルオロベンジル−17−O−N−メチルピリジニウム−2−エーテル誘導体について測定を行った。
1)本発明において使用されるT−17−O−ピコリノイルエステル誘導体
PY :17−O−N−メチルピリジニウム−2−エーテル誘導体
EAPY :17−O−N−メチルピリジニウム−2−エーテル-3−エトオキシム誘導体
PFBZPY:3−ペンタフルオロベンジル−17−O−N−メチルピリジニウム−2−エーテル誘導体
PI(1) :ピコリノイルエステル誘導体
PI(2) :ジピコリノイルエステル誘導体
エストロン(E1)及びエストラジオール(E2)について、本発明の方法により測定を行う際の検量線を作成した。
まず、E1−3−O−ピコノイルエステル誘導体のMS測定を行ったところ、m/z376.1に前駆イオンが検出され、この前駆イオンについて更にMS測定を行うと、m/z156.9にピークを示すスペクトルが得られた(図1及び図2)。したがって、E1−3−O−ピコリノイルエステル誘導体については検出イオンをm/z156.9と決定した。
次に、E2−3,17−O−ジピコリノイルエステル誘導体についてMS測定を行うと、m/z483.5に前駆イオンが検出され、この前駆イオンついて更にMS測定を行うと、m/z360.1、264.1にピークを示すスペクトルが得られた(図3及び図4)。したがって、E2−3,17−O−ジピコリノイルエステル誘導体については、検出イオンをm/z264.1と決定した。
E1及びE2それぞれについて 0.2、1、5、20、100、500pg/mLの水溶液(0.1mg/mLのアセトニトリル溶液より水で希釈したもの)を調製し、それぞれ1mLを量り、内部標準物質(E1については13C4 −E1、E2については16,16,17−d3−E2)各100pgを加え、さらにジエチルエーテル4mLを加えて振り混ぜ、ジエチルエーテル層を分離後、窒素気流下でジエチルエーテルを留去した。この残留物にピコリノイルクロリド塩酸塩のアセトニトリル溶液(1→20)0.1mL及びピリジン30μLを加えて振り混ぜた後、室温で1時間放置した。反応後、1%塩酸1mLを加え、ジエチルエーテル4mLを加えて振り混ぜ、ジエチルエーテル層を分離後、窒素気流下で留去した。残留物をアセトニトリル0.25mLに溶解し、水1mLを加えて希釈後、Bond Elut C18に負荷し、アセトニトリル溶液(3→10)3mLで洗浄し、更にアセトニトリル溶液(4→5)2.5mLで溶出した。溶媒を遠心エバポレーターで留去した後、アセトニトリル溶液(2→5)0.1mLに溶解した。この液20μLについてLC−MS/MS測定を行った。
LC−MS/MSの測定条件を、下表Bに示す。
1個所をピコリノイルエステル誘導体化した場合と、複数箇所をピコリノイルエステル誘導体化した場合の、それぞれのLC−MSによる測定感度を比較するため、3位にフェノール性水酸基を有するE1と3位にフェノール性水酸基及び17位にアルコール性水酸基を有するE2を用いて、以下のとおり定量限界を求めた。
E1及びE2をそれぞれ0.2、0.5及び20pg含む溶液について、実験例2における検量線作成におけるのと同様の方法で、LC−MS/MS測定を行った。具体的にはE1及びE2のLC−MSクロマトグラムにおける生成イオンのピーク面積をそれぞれ測定し、それらと内部標準物質とのピーク面積比を算出し、これを検量線の値と比較して、E1及びE2の量を求めた。結果を下表Cに示す。
実験例2で行った方法と同様の方法を用いて、健常女性血清10例についてE1及びE2の量を測定した。
健常女性血清0.5mLを採取し、これに内部標準物質として13C4−E1及び16,16,17−d3−E−2にそれぞれ100pgを加えた後、ジエチルエーテル4mLを加えて振とうし、ジエチルエーテル層を分離し、窒素気流下で留去した。
前項1−1で得た残留物にピコリノイルクロリド塩酸塩のアセトニトリル溶液(1→20)0.1mL及びピリジン30μLを加えて振り混ぜた後、室温で1時間放置した。反応後、1%塩酸1mLを加え、ジエチルエーテル4mLを加えて振とうし、エーテル層を分離後、窒素気流下で留去した。残留物をアセトニトリル0.25mLに溶解し、水1mLを加えて希釈後、Bond Elut C18に負荷し、アセトニトリル溶液(3→10)3mLで洗浄し、更にアセトニトリル溶液(4→5)2.5mLで溶出した。溶出液を遠心エバポレーターで留去した後、アセトニトリル溶液(2→5)100μLに溶解し、LC−MS/MSに供した。
前項1−2で得たアセトニトリル溶液100μLのうち、その20μLをLC−MS/MS測定に用いた。測定は、実験例2と同様に行った。そしてE1及びE2のLC−MSクロマトグラムにおける生成イオンのピーク面積をそれぞれ測定し、それらと内部標準物質とのピーク面積比を算出し、検量線と比較してE1及びE2濃度を求めた。その結果を、下表Dに示す。
2−1 検出イオンの決定
T−17−O−ピコリノイルエステル誘導体についてMS測定を行うと、m/z394.4に前駆イオンが検出された。この前駆イオンについて更にMS測定を行うと、m/z253.4にピークを示すスペクトルが得られた(図7及び図8)。したがってT−17−O−ピコリノイルエステル誘導体についての検出イオンをm/z253.4に決定した。
一方、DHT−17−O−ピコリノイルエステル誘導体についてMS測定を行うと、m/z396.4に前駆イオンが検出された。この前駆イオンについて更にMS測定を行うと、m/z255.4にピークを示すスペクトルが得られた(図9及び図10)。したがって、DHT−17−O−ピコリノイルエステル誘導体についての検出イオンをm/z255.4に決定した。
健常男性血清200μLに内部標準物質(16,16,17−d3−T 及び16,16,17−d3−DHT)、ジエチルエーテル4mLを加えて、室温で10分間振とうした後、エーテル層を分離し、窒素気流中で留去した。
なお、唾液の場合は、1mLを採取し、血清と同様に操作した。
前項2−2で得た残留物にピコリノイルクロリド塩酸塩のアセトニトリル溶液(1→40)200μL及びピリジン50μLを加えて振り混ぜた後、室温で90分間放置した。反応後、水750μL及びジエチルエーテル5mLを加えて10分間振り混ぜた後、エーテル層を分離した。このエーテル層に更に水750μLを加えて振り混ぜた後、エーテル層を分取し、窒素気流下で留去した。残留物をアセトニトリル250μLに溶解し、Bond Elut C18カラムに負荷し、水1mL、次いでアセトニトリル溶液(2→5)4mLで洗浄後、アセトニトリル溶液(7→10)3mLで溶出した。溶媒を遠心エバポレーターにより留去した後、残留物をアセトニトリル/0.1%ギ酸混液(7:3)100μLに溶解した。
前項2−3で得たアセトニトリル/0.1%ギ酸混合溶液100μLのうち、その20μLをLC−MS/MS測定に用いた。下表EにLC−MS/MSの測定条件を示す。
3−1 試料の調製
前立腺組織約50mgを精密に量った後、液体窒素により凍結、粉砕し、水4mLを加えてホモジナイズした。ホモジネートした液500μLをとり、これに内部標準物質として16,16,17−d3−T 及び16,16,17−d3−DHTをそれぞれ500pg並びにエタノール4mLを加え、55℃で3時間振とうした後、冷却遠心分離した。遠心分離後の上清を分取し、遠心エバポレーターにより溶媒を留去し、得られた残留物をメタノール250μLに溶解後、水1mLで希釈した。この液を、あらかじめメタノール6mL及び水6mLで調製したBond Elut C18カラムに負荷し、アセトニトリル溶液(3→10)2mLで洗浄した後、アセトニトリル溶液(7→10)2.5mLで溶出した。そして、窒素気流中にて溶媒を留去した。
実施例2−3及び2−4と同様にして、ピコリノイルエステル誘導体化及びLC−MS/MS測定を行い、前立腺組織中のT及びDHTの濃度を求めた。
その結果を、下表Gに示す。
本発明は、例えば、医学、生化学、公衆衛生、食品検査などの分野で利用できる。
Claims (2)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2005324856A JP4634913B2 (ja) | 2005-11-09 | 2005-11-09 | ステロイドの測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2005324856A JP4634913B2 (ja) | 2005-11-09 | 2005-11-09 | ステロイドの測定方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2007132741A JP2007132741A (ja) | 2007-05-31 |
JP4634913B2 true JP4634913B2 (ja) | 2011-02-16 |
Family
ID=38154536
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2005324856A Active JP4634913B2 (ja) | 2005-11-09 | 2005-11-09 | ステロイドの測定方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP4634913B2 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2020143915A (ja) * | 2019-03-04 | 2020-09-10 | 花王株式会社 | ステロイドホルモンの調製又は定量方法 |
WO2021054386A1 (ja) | 2019-09-20 | 2021-03-25 | 株式会社あすか製薬メディカル | 動物体毛試料に含まれるステロイドホルモンを分析する方法、ストレス評価方法及び脱毛原因分析方法 |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20090134325A1 (en) * | 2007-11-27 | 2009-05-28 | Goldman Mildred M | Methods for detecting estradiol by mass spectrometry |
US7972868B2 (en) * | 2007-11-28 | 2011-07-05 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Methods for detecting dihydroxyvitamin D metabolites by mass spectrometry |
US8409865B2 (en) * | 2008-02-25 | 2013-04-02 | Waters Technologies Corp. | Methods and kits for the determination of the presence and quantity of vitamin D analogs in samples |
JP5515113B2 (ja) * | 2010-02-23 | 2014-06-11 | 株式会社あすか製薬メディカル | エストロン類の高感度測定法 |
JP5863784B2 (ja) * | 2011-05-17 | 2016-02-17 | 株式会社あすか製薬メディカル | 原発性アルドステロン症の腺腫鑑別法及び18−オキソコルチゾール(18−oxoF)、18−ヒドロキシコルチゾール(18−OHF)の測定法 |
WO2014126207A1 (ja) * | 2013-02-15 | 2014-08-21 | 味の素株式会社 | 試料中の有機酸の検出方法 |
CN104020240B (zh) * | 2014-06-10 | 2016-03-30 | 上海海洋大学 | 一种离体鱼类性腺内类固醇类性激素的检测方法 |
JP6937512B2 (ja) * | 2015-06-12 | 2021-09-22 | 学校法人東京薬科大学 | ヒトにおけるcyp3a酵素活性の評価方法(フェノタイプ検査法) |
CN111487328A (zh) * | 2019-01-27 | 2020-08-04 | 上海歌特维生物科技集团有限公司 | 一种用质谱法检测人体中多种痕量激素的方法 |
EP4209782A4 (en) | 2020-09-04 | 2023-11-08 | Aderans Company Limited | ANALYSIS METHOD AND ANALYSIS SYSTEM FOR BILE ACIDS, STEROLS AND HORMONES |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2000088834A (ja) * | 1998-09-16 | 2000-03-31 | Sumika Chemical Analysis Service Ltd | 分析方法 |
JP2003161726A (ja) * | 2001-11-28 | 2003-06-06 | Nippon Kayaku Co Ltd | ステロイド類化合物のlc−msによる高感度検出法 |
JP2004257949A (ja) * | 2003-02-27 | 2004-09-16 | Teikoku Hormone Mfg Co Ltd | ステロイド性生体内微量物質の測定方法 |
JP2006138786A (ja) * | 2004-11-15 | 2006-06-01 | Aska Pharmaceutical Co Ltd | 生体内微量エストラジオールの新規測定法 |
-
2005
- 2005-11-09 JP JP2005324856A patent/JP4634913B2/ja active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2000088834A (ja) * | 1998-09-16 | 2000-03-31 | Sumika Chemical Analysis Service Ltd | 分析方法 |
JP2003161726A (ja) * | 2001-11-28 | 2003-06-06 | Nippon Kayaku Co Ltd | ステロイド類化合物のlc−msによる高感度検出法 |
JP2004257949A (ja) * | 2003-02-27 | 2004-09-16 | Teikoku Hormone Mfg Co Ltd | ステロイド性生体内微量物質の測定方法 |
JP2006138786A (ja) * | 2004-11-15 | 2006-06-01 | Aska Pharmaceutical Co Ltd | 生体内微量エストラジオールの新規測定法 |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2020143915A (ja) * | 2019-03-04 | 2020-09-10 | 花王株式会社 | ステロイドホルモンの調製又は定量方法 |
JP7292058B2 (ja) | 2019-03-04 | 2023-06-16 | 花王株式会社 | ステロイドホルモンの調製又は定量方法 |
WO2021054386A1 (ja) | 2019-09-20 | 2021-03-25 | 株式会社あすか製薬メディカル | 動物体毛試料に含まれるステロイドホルモンを分析する方法、ストレス評価方法及び脱毛原因分析方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2007132741A (ja) | 2007-05-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4634913B2 (ja) | ステロイドの測定方法 | |
Caron et al. | A chromatography/tandem mass spectrometry method for the simultaneous profiling of ten endogenous steroids, including progesterone, adrenal precursors, androgens and estrogens, using low serum volume | |
Ke et al. | A sensitive, simple and robust LC–MS/MS method for the simultaneous quantification of seven androgen-and estrogen-related steroids in postmenopausal serum | |
Guo et al. | Stable isotope labeling–Liquid chromatography/mass spectrometry for quantitative analysis of androgenic and progestagenic steroids | |
Schänzer et al. | Mass spectrometric identification and characterization of a new long‐term metabolite of metandienone in human urine | |
Matysik et al. | Quantification of steroid hormones in human serum by liquid chromatography-high resolution tandem mass spectrometry | |
Licea-Perez et al. | Development of a highly sensitive and selective UPLC/MS/MS method for the simultaneous determination of testosterone and 5α-dihydrotestosterone in human serum to support testosterone replacement therapy for hypogonadism | |
Cawley et al. | Searching for new markers of endogenous steroid administration in athletes:“looking outside the metabolic box” | |
Lee et al. | Quantitative profiling of bile acids in rat bile using ultrahigh-performance liquid chromatography–orbitrap mass spectrometry: Alteration of the bile acid composition with aging | |
Le Bizec et al. | Consequence of boar edible tissue consumption on urinary profiles of nandrolone metabolites. I. Mass spectrometric detection and quantification of 19‐norandrosterone and 19‐noretiocholanolone in human urine | |
Kalogera et al. | Androgen glucuronides analysis by liquid chromatography tandem-mass spectrometry: could it raise new perspectives in the diagnostic field of hormone-dependent malignancies? | |
Schofield et al. | Sensitive simultaneous quantitation of testosterone and estradiol in serum by LC–MS/MS without derivatization and comparison with the CDC HoSt program | |
Gravitte et al. | Liquid chromatography–mass spectrometry applications for quantification of endogenous sex hormones | |
JP5288230B2 (ja) | ステロイドの高感度測定法 | |
Kamemura et al. | Sample-multiplexing by derivatization using multiple analogous reagents for enhancing throughput in LC/ESI-MS/MS assay of steroids: Plasma 17α-hydroxyprogesterone as an example | |
EP2893355A1 (en) | Kit and method for quantitative detection of steroids | |
JP7316218B2 (ja) | 安定同位体標識化合物 | |
Bai et al. | A Method for simultaneous determination of 14 carbonyl-steroid hormones in human serum by ultra high performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry | |
Stopforth et al. | Quantification of testosterone and epitestosterone in human urine samples by stir bar sorptive extraction–thermal desorption–gas chromatography/mass spectrometry: Application to HIV‐positive urine samples | |
JP3774888B2 (ja) | ステロイド類化合物のlc−msによる高感度検出法 | |
Moon et al. | Simultaneous quantification of 18 saturated and unsaturated fatty acids and 7 sterols as their tert-butyldimethylsilyl derivatives in human saliva using gas chromatography-tandem mass spectrometry | |
US9834578B2 (en) | Enhanced sensitivity for analysis of ketosteroid compounds using mass spectrometry | |
JP4667832B2 (ja) | 生体内微量エストラジオールの新規測定法 | |
Grignon et al. | Validation of a probe for assessing deconjugation of glucuronide and sulfate phase II metabolites assayed through LC–MS/MS in biological matrices | |
JP6041125B2 (ja) | エストロゲンの超高感度測定法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20081007 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090909 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20101101 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20101116 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20101119 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4634913 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131126 Year of fee payment: 3 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |