JP2004257949A - ステロイド性生体内微量物質の測定方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】ＬＣ／ＭＳにおけるステロイド性生体内微量物質の測定感度を高めるための化合物及び高感度測定方法を提供すること。
【解決手段】血清試料に式（Ｉ）：
【化１４】
〔式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ他から独立してＨ、ＣＦ３又はＮＯ２を表す〕の化合物等を反応させて反応成績体とする工程、及び前記反応成績体を、ＬＣ／負イオンＡＰＣＩ−ＭＳを用いて測定する工程、を含むことを特徴とする、ステロイド性生体内微量物質の測定方法。
【選択図】 なし
【解決手段】血清試料に式（Ｉ）：
【化１４】
〔式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ他から独立してＨ、ＣＦ３又はＮＯ２を表す〕の化合物等を反応させて反応成績体とする工程、及び前記反応成績体を、ＬＣ／負イオンＡＰＣＩ−ＭＳを用いて測定する工程、を含むことを特徴とする、ステロイド性生体内微量物質の測定方法。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料中のステロイド性生体内微量物質に電子親和性原子団を有する化合物を導入し、負イオンＡＰＣＩ−ＭＳ法（負イオン大気圧化学イオン化質量分析法）により生体内微量物質を測定する方法、その測定に供される反応成績体及びその測定のための試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ビタミンＤ３代謝物（９，１０−セコステロイド）を含むステロイドホルモンは、生体内において、極微量にて強力な生理作用を表す。これらのステロイドホルモンの生体内レベルを把握することは、臨床診断及び病態解析上極めて重要であるが、これらの生体内濃度は著しく低い上に、構造類似化合物が共存するため、その分析には極めて高い感度及び特異性が要求される。
【０００３】
従来、これら生体内ステロイドホルモンの測定は、主としてＬＣ（Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：液体クロマトグラフィ）を用いて行われてきたが、実用的に十分な程度の感度が得られない場合が多かった。
【０００４】
近年、ＬＣとＡＰＣＩ−ＭＳ（Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）を組合せた方法、すなわち、ＬＣ／ＡＰＣＩ−ＭＳが特異性や多用性の面で有用であることが提案された（非特許文献１参照）。
しかし、ＬＣ／ＡＰＣＩ−ＭＳを用いた方法においても、ステロイドホルモン化合物自体のイオン化効率が低いために、十分な感度を得ることはできなかった。
【０００５】
さらに、ＬＣとＥＳＩ（Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：エレクトロスプレーイオン化）−ＭＳを組合せる方法も行われているが、本法は極性化合物に有効であるが、多くのステロイドホルモンは極性基を数個しか有していないことから、この方法もあまり実用的ではなかった。
【０００６】
最近になって、正イオン検出ＡＰＣＩ−ＭＳを用いた測定において、ステロイド化合物に電子親和性原子団を導入した誘導体が高感度で検出できることが示された（非特許文献２−４参照）。一方、負イオンモードのＡＰＣＩ−ＭＳは、バックグラウンドノイズが低いことが一般的に知られており、負イオンモードＡＰＣＩ−ＭＳを用いた測定において、ステロイド化合物に電子親和性原子団を導入すれば、更なる高感度化が期待できると考えられる。
しかしながら、これまで、負イオン検出ＡＰＣＩ−ＭＳのための電子親和性原子団の導入については、ペンタフルオロベンジル化の例（非特許文献５参照）が知られているのみで、他の誘導体化についての検討はなされていない。
【０００７】
【非特許文献１】
Ｋ． Ｓｈｉｍａｄａ， ｅｔ ａｌ．：Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． Ａ．， ２００１（９３５）， １４１
【非特許文献２】
Ｔ． Ｈｉｇａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．； Ｂｉｏｍｅｄ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．， ２００１（１５）， １３３．
【非特許文献３】
Ｔ． Ｈｉｇａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．； Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． Ｂ， ２００２（７７２）， ２２９．
【非特許文献４】
Ｋ． Ｓｈｉｍａｄａ ｅｔ ａｌ．； Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． Ｂ， １９９８（７１４）， １５３．
【非特許文献５】
Ｇ． Ｓｉｎｇｈ， ｅｔ ａｌ．； Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．， ２０００（７２）， ３００７
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、負イオンＡＰＣＩ−ＭＳを用いたステロイド性生体内微量物質の測定において、ステロイド性生体内微量物質に電子親和性原子団を有する化合物を導入することにより、ステロイド性生体内微量物質を高感度に測定する方法を提供することである。また、本発明の目的は、負イオンＡＰＣＩ−ＭＳを用いたステロイド性生体内微量物質の測定における測定感度を高めるための化合物を含むイオン化試薬、及び当該化合物をステロイド性生体内微量物質に導入した化合物を提供することである。さらに、本発明の目的は、負イオンＡＰＣＩ−ＭＳを用いたステロイド性生体内微量物質の測定のための試薬を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、負イオン検出ＡＰＣＩ−ＭＳを用いたステロイド性生体内微量物質の測定において、その測定感度を上昇させるべく鋭意検討したところ、驚くべきことに、特定の電子親和性原子団をステロイド性生体内微量物質に導入すると、その測定感度が数倍〜２００倍以上も上昇することを見出した。また、この測定感度はこれまでに知られている電子親和性原子団、すなわち、ペンタフルオロベンジル基を導入した場合に比較しても最大で７倍以上高いものであった。本発明者らは、これらの知見をもとにさらに検討を行い、本発明を完成させた。
【００１０】
しかして、本発明によれば、ステロイド性生体内微量物質のＬＣ／ＭＳ測定において、次の工程、すなわち、
ｉ） 血清試料に下記式（Ｉ）：
【００１１】
【化７】
【００１２】
〔式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３はそれぞれＨ、ＣＦ３又はＮＯ２を表す〕
の化合物又は下記式（ＩＩ）：
【００１３】
【化８】
【００１４】
〔式中、Ａｒは下記式：
【００１５】
【化９】
【００１６】
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は前記の意味を有する、）
の基、３，５−ジニトロ−２−ピリジル基又は７−ニトロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール−４−イル基を表す〕
の化合物を反応させて、下記式（ＩＩＩ）
【００１７】
【化１０】
【００１８】
〔式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は前記の意味を有し、Ｓｔはオキソ基を有するステロイド化合物からオキソ基を除いた部分を表す〕
で示される反応成績体又は下記式（ＩＶ）：
【００１９】
【化１１】
【００２０】
〔式中、Ａｒは前記の意味を有し、
【００２１】
【化１２】
【００２２】
はビシナルジオール部分構造を有するビタミンＤ３代謝物からビシナルジオール部分を除いた部分又はカテコール部分構造を有するステロイド化合物からカテコール部分を除いた部分を表す〕
で示される反応成績体とする工程、及び
ｉｉ） 前記反応成績体をＬＣ／負イオンＡＰＣＩ−ＭＳを用いて測定する工程、
を含むことを特徴とする、ステロイド性生体内微量物質の測定方法が提供される。
【００２３】
また、本発明によれば、前記式（ＩＩＩ）で示される化合物及び前記式（ＩＶ）で示される化合物が提供される。
【００２４】
さらに、本発明によれば、質量分析（ＭＳ）、さらに好ましくはＬＣ／ＭＳ分析のための、式（Ｉ）で表される化合物又は式（ＩＩ）で表される化合物を含む、高感度検出用イオン化試薬が提供される。
【００２５】
加えて、本発明によれば、分析対象が、ステロイド性生体内微量物質である、上記イオン化試薬、並びに、ＬＣ／ＭＳ分析が、負イオンＡＰＣＩ−ＭＳである、上記イオン化試薬が提供される。
【００２６】
なお、本発明のイオン化試薬は、ＡＰＣＩ法のみならず、ＥＳＩ法及びＣＦ−ＦＡＢ（連続フロー高速原子衝撃）法等、他のイオン化方法を用いる質量分析にも用いることができる。
【００２７】
本明細書において用いる語「ステロイド性生体内微量物質」とは、ステロイド化合物及びビタミンＤ３類縁体を意味する。したがって、ステロイド性生体内微量物質としては、例えば、テストステロン、ジヒドロテストステロン、デヒドロエピアンドロステロン、プレグネノロン、エストロン、２−ヒドロキシエストラジオール、４−ヒドロキシエストラジオール、２−ヒドロキシエストロン、４−ヒドロキシエストロン等のステロイド化合物及び２４，２５−（ジヒドロキシ）ビタミンＤ３、１，２４，２５−（トリヒドロキシ）ビタミンＤ３等のビタミンＤ３類縁体を挙げることができる。
【００２８】
本発明において使用される血清試料の調製方法については後記実験例において詳述するが、一般的な調製方法により精製した血清であれば、その血清試料は本発明に用いることができる。
【００２９】
本明細書において、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３はそれぞれＨ、ＣＦ３又はＮＯ２を表す。
【００３０】
本発明に使用することのできる前記式（Ｉ）の化合物としては、例えば、次のものを挙げることができる。
２−ニトロフェニルヒドラジン
２，４−ジニトロフェニルヒドラジン
２，４，６−トリニトロフェニルヒドラジン
２−ニトロ−６−トリフルオロメチルフェニルヒドラジン
２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニルヒドラジン
４−ニトロ−２−トリフルオロメチルフェニルヒドラジン
２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニルヒドラジン
なお、本明細書において、化合物名は原則として一般名を部分的に用いて記載するが、一般名を用いて表すことができない化合物については化学名にて表記する。
【００３１】
前記式（Ｉ）の化合物のうち、好ましい化合物としては次のものを挙げることができる。
２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニルヒドラジン
２，４−ジニトロフェニルヒドラジン
２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニルヒドラジン
【００３２】
また、本発明に使用することのできる前記式（ＩＩ）の化合物としては、例えば、次のものを挙げることができる。
〔３−（４−ニトロフェニル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン
〔３−（２，４−ジニトロフェニル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン
〔３−（２，４，６−トリニトロフェニル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン
４−〔Ｎ−（３−ジヒドロキシボリル）フェニル〕アミノ−７−ニトロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール
〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン
〔３−（４−ニトロ−２−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン
〔３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン
〔３−（２，４−ジニトロピリジル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン
〔３−（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンジル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン
【００３３】
前記式（ＩＩ）の化合物のうち、好ましいのは次に挙げる化合物である。
〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン
〔３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン
〔３−（２，４−ジニトロフェニル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン
【００３４】
さらに、前記式（ＩＩＩ）においてＳｔで表される部分は、テストステロン、ジヒドロテストステロン、デヒドロエピアンドロステロン及びプレグネノロンからそれぞれオキソ基を除いた部分であり、好ましくは、テストステロン及びジヒドロテストステロンからそれぞれオキソ基を除いた部分である。
【００３５】
また、前記式（ＩＶ）において
【００３６】
【化１３】
【００３７】
で表される部分は、２４，２５−（ジヒドロキシ）ビタミンＤ３及び１，２４，２５−（トリヒドロキシ）ビタミンＤ３からそれぞれビシナルジオール部分を除いた部分並びに２−ヒドロキシエストラジオール、４−ヒドロキシエストラジオール、２−ヒドロキシエストロン及び４−ヒドロキシエストロンからカテコール部分を除いた部分であり、好ましくは、２４，２５−（ジヒドロキシ）ビタミンＤ３からビシナルジオール部分を除いた部分並びに２−ヒドロキシエストラジオール及び４−ヒドロキシエストラジオールからカテコール部分を除いた部分である。
【００３８】
本発明により提供される前記式（ＩＩＩ）の化合物としては、例えば、次のものを挙げることができる。
３−（２−ニトロフェニル）ヒドラジニルテストステロン
３−（２，４−ジニトロフェニル）ヒドラジニルテストステロン
３−（２，４，６−トリニトロフェニル）ヒドラジニルテストステロン
３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルテストステロン
３−（２−ニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルテストステロン
３−（４−ニトロ−２−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルテストステロン
３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルテストステロン
３−（２−ニトロフェニル）ヒドラジニルジヒドロテストステロン
３−（２，４−ジニトロフェニル）ヒドラジニルジヒドロテストステロン
３−（２，４，６−トリニトロフェニル）ヒドラジニルジヒドロテストステロン
３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルジヒドロテストステロン
３−（２−ニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルジヒドロテストステロン
３−（４−ニトロ−２−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルジヒドロテストステロン
３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルジヒドロテストステロン
２０−（２−ニトロフェニル）ヒドラジニルプレグネノロン
２０−（２，４−ジニトロフェニル）ヒドラジニルプレグネノロン
２０−（２，４，６−トリニトロフェニル）ヒドラジニルプレグネノロン
２０−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルプレグネノロン
２０−（２−ニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルプレグネノロン
２０−（４−ニトロ−２−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルプレグネノロン
２０−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルプレグネノロン
１７−（２−ニトロフェニル）ヒドラジニルデヒドロエピアンドロステロン
１７−（２，４−ジニトロフェニル）ヒドラジニルデヒドロエピアンドロステロン
１７−（２，４，６−トリニトロフェニル）ヒドラジニルデヒドロエピアンドロステロン
１７−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルデヒドロエピアンドロステロン
１７−（２−ニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルデヒドロエピアンドロステロン
１７−（４−ニトロ−２−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルデヒドロエピアンドロステロン
１７−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルデヒドロエピアンドロステロン
【００３９】
また、前記式（ＩＩＩ）の化合物のうち、好ましい化合物としては次のものを挙げることができる。
３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルテストステロン
３−（２，４−ジニトロフェニル）ヒドラジニルテストステロン
３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルテストステロン
３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルジヒドロテストステロン
３−（２，４−ジニトロフェニル）ヒドラジニルジヒドロテストステロン
３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルジヒドロテストステロン
２０−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルプレグネノロン
２０−（２，４−ジニトロフェニル）ヒドラジニルプレグネノロン
２０−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルプレグネノロン
１７−（２，４−ジニトロフェニル）ヒドラジニルデヒドロエピアンドロステロン
１７−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルデヒドロエピアンドロステロン
１７−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルデヒドロエピアンドロステロン
【００４０】
また、前記式（ＩＩＩ）の化合物のうち、さらに好ましい化合物としては次のものを挙げることができる。
３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルテストステロン
３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルジヒドロテストステロン
２０−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルプレグネノロン
１７−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルデヒドロエピアンドロステロン
【００４１】
本発明により提供される前記式（ＩＶ）の化合物としては、例えば、次のものを挙げることができる。
２４，２５−〔３−（４−ニトロフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ３
２４，２５−〔３−（２，４−ジニトロフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ３
２４，２５−〔３−（２，４，６−トリニトロフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ３
２４，２５−〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ３
２４，２５−〔３−（２−ニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ３
２４，２５−〔３−（４−ニトロ−２−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ３
２４，２５−〔３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ３
２４，２５−〔３−（３，５−ジニトロピリジン−２−イル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ３
２４，２５−〔３−（７−ニトロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール−４−イル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ３
１−ヒドロキシ−２４，２５−〔３−（４−ニトロフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ３
１−ヒドロキシ−２４，２５−〔３−（２，４−ジニトロフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ３
１−ヒドロキシ−２４，２５−〔３−（２，４，６−トリニトロフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ３
１−ヒドロキシ−２４，２５−〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ３
１−ヒドロキシ−２４，２５−〔３−（２−ニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ３
１−ヒドロキシ−２４，２５−〔３−（４−ニトロ−２−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ３
１−ヒドロキシ−２４，２５−〔３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ３
１−ヒドロキシ−２４，２５−〔３−（３，５−ジニトロピリジン−２−イル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ３
１−ヒドロキシ−２４，２５−〔３−（７−ニトロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール−４−イル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ３
２，３−〔３−（４−ニトロフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（２，４−ジニトロフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（２，４，６−トリニトロフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（２−ニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（４−ニトロ−２−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（３，５−ジニトロピリジン−２−イル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（７−ニトロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール−４−イル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（４−ニトロフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（２，４−ジニトロフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（２，４，６−トリニトロフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（２−ニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（４−ニトロ−２−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（３，５−ジニトロピリジン−２−イル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（７−ニトロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール−４−イル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（４−ニトロフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（２，４−ジニトロフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（２，４，６−トリニトロフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（２−ニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（４−ニトロ−２−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（３，５−ジニトロピリジン−２−イル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（７−ニトロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール−４−イル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（４−ニトロフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（２，４−ジニトロフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（２，４，６−トリニトロフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（２−ニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（４−ニトロ−２−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（３，５−ジニトロピリジン−２−イル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（７−ニトロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール−４−イル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
【００４２】
また、前記式（ＩＶ）の化合物のうち、好ましいのは次に挙げる化合物である。
２４，２５−〔３−（２，４−ジニトロフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ３
２４，２５−〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ３
２４，２５−〔３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ３
１−ヒドロキシ−２４，２５−〔３−（２，４−ジニトロフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ３
１−ヒドロキシ−２４，２５−〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ３
１−ヒドロキシ−２４，２５−〔３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ３
２，３−〔３−（２，４−ジニトロフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（２，４−ジニトロフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（２，４−ジニトロフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（２，４−ジニトロフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
【００４３】
また、前記式（ＩＶ）の化合物のうち、さらに好ましいのは次に挙げる化合物である。
２４，２５−〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ３
１−ヒドロキシ−２４，２５−〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ３
２，３−〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
【００４４】
本発明の測定方法における測定には、一般的なＬＣ及びＭＳを用いることができる。
次に、本発明の化合物の製造方法及び本発明の方法を用いたステロイド性生体内微量物質の測定について記載する。
【００４５】
【発明の実施の形態】
オキソ基を有するステロイド化合物の測定
本発明における前記式（Ｉ）の化合物は、商業的に入手可能な原料より、ヒドラジンによる置換反応によって容易に合成することができる。また、本発明における血清試料は、常法により容易に調製することができる。
すなわち、本発明における血清試料は、採血した全血より血清を分取した後、市販のカートリッジ（例えば、ＯＡＳＩＳ ＨＬＢ（登録商標） ｃａｒｔｒｉｄｇｅやＢｏｎｄ ＥＬＵＴ Ｓｉ（登録商標） ｃａｒｔｒｉｄｇｅ等）を用いた精製により調製できる。
【００４６】
本発明における血清試料をエタノール等のアルコール類に懸濁し、これに、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸等の酸性触媒の存在下にて、前記式（Ｉ）のヒドラジン化合物を反応させることにより、前記式（ＩＩＩ）の化合物へと誘導することができる。
【００４７】
前記式（ＩＩＩ）の化合物への合成反応、すなわち、ヒドラジン誘導体化反応における反応温度は、室温乃至８０℃の範囲内の温度で行うことができ、好ましくは５０℃乃至７０℃の範囲内の温度が適している。また、前記式（Ｉ）のヒドラジン化合物は、直接又は不活性有機溶媒、例えば、アセトニトリル、エタノール、酢酸エチル等の溶液の状態にて加えることもできる。
【００４８】
また、上記ヒドラジン誘導体化反応において、血清試料に対するヒドラジン化合物の使用割合は、血清試料２００μｌに対してヒドラジン化合物２μｇ乃至２０μｇとすることができ、好ましくは４μｇ乃至１０μｇが適している。
【００４９】
前記式（ＩＩＩ）のヒドラジン誘導体のＬＣ／負イオンＡＰＣＩ−ＭＳ測定は、一般的なＬＣ、例えば、Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋｅｒｄ社製 ＨＰ１１００又はＷａｔｅｒｓ社製 ２７９５など、並びに一般的なＭＳ、例えば、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ社製 ＱＵＡＴＴＲＯ ＩＩ又はＭｉｃｒｏｍａｓｓ社製 ＱＵＡＴＴＲＯ ＭＩＣＲＯなどを用いて行うことができる。
【００５０】
ビシナルジオール部分構造を有するビタミンＤ ３ 誘導体の測定
本発明における前記式（ＩＩ）の化合物についても、商業的に入手可能な原料より、アミノフェニルジヒドロキシボランによる置換反応によって容易に合成することができる。
【００５１】
本発明における血清試料と前記式（ＩＩ）のジヒドロキシボラン化合物とを不活性有機溶媒、例えば、アセトニトリル、エタノール、ピリジン等の溶媒中にて反応させ、前記式（ＩＶ）の化合物へと誘導することができる。
【００５２】
前記式（ＩＶ）の化合物への合成反応、すなわち、ボロン酸誘導体化反応における反応温度は、室温乃至７０℃の範囲内の温度で行うことができ、好ましくは４０℃乃至６０℃の範囲内の温度が適している。
【００５３】
また、ボロン酸誘導体化反応において、血清試料に対するボロン酸化合物の使用割合は血清試料５０μｌに対してボロン酸化合物２μｇ乃至２０μｇとすることができ、好ましくは４μｇ乃至１０μｇが適している。
【００５４】
前記式（ＩＩＩ）のヒドラジン誘導体のＬＣ／負イオンＡＰＣＩ−ＭＳ測定は、一般的なＬＣ及びＭＳを用いて行うことができる。
以下の実施例は、本発明をより詳細に説明するものであるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００５５】
【実施例】
実施例１ ２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニルヒドラジン（２ＮＦＰＨ）の合成
４−フルオロ−３−ニトロベンゾトリフルオライド１００μｌをアセトニトリル１ｍｌに溶解し、８０％ヒドラジン水和物１１０μｌを加え室温にて１５分間攪拌する。反応混合物を減圧下にて濃縮した後、これに酢酸エチルを加え、水洗し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下にて溶媒を留去し、得られた粗結晶をＭｅＯＨより２回再結晶して、橙色針状晶の２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニルヒドラジンを得た（定量的）。
融点：１１６−１１６．５℃
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ２２０．０〔Ｍ−Ｈ〕−
製造例１と同様にして、以下の実施例２の化合物を合成した。
【００５６】
実施例２ ２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニルヒドラジン（ＤＮＦＰＨ）の合成
黄色針状晶
収率：定量的
融点：１４０．５−１４１．５℃
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ２６５．０〔Ｍ−Ｈ〕−
【００５７】
実施例３ 〔３−（４−ニトロフェニル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン（ＮＰ−ＡＰＢ）の合成
４−フルオロニトロベンゼン０．３ｍｌ及びアミノフェニルジヒドロキシボラン５０ｍｇを、ジメシルスルホキシド：１Ｍ炭酸ナトリウム水溶液＝１：１の混合液２ｍｌに加え、７０℃にて６時間攪拌した。反応混合物を酢酸エチルで抽出した後、水洗し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下にて溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝２０：１）にて精製し、標題化合物の黄色固形物を得た（定量的）。
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ２５７．３〔Ｍ−Ｈ〕−
実施例３と同様にして、以下の実施例４―１１の化合物を合成した。
【００５８】
実施例４ 〔３−（２，４−ジニトロフェニル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン（ＤＮＰ−ＡＰＢ）
橙色固形物
出発原料：２，４−ジニトロフルオロベンゼン
収率：定量的
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ３０２．２〔Ｍ−Ｈ〕−
【００５９】
実施例５ 〔３−（２，４，６−トリニトロフェニル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン（ＴＮＰ−ＡＰＢ）
茶色固形物
出発原料：２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム二水和物
収率：定量的
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ３４７．２〔Ｍ−Ｈ〕−
【００６０】
実施例６ ４−〔Ｎ−（３−ジヒドロキシボリル）フェニル〕アミノ−７−ニトロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール（ＤＮＢ−ＡＰＢ）
茶色固形物
出発原料：４−クロロ−７−ニトロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール
収率：定量的
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ２９９．２〔Ｍ−Ｈ〕−
【００６１】
実施例７ 〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン（２ＮＦＰ−ＡＰＢ）
黄色固形物
出発原料：４−フルオロ−３−ニトロベンゾトリフルオライド
収率：定量的
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ３２５．２〔Ｍ−Ｈ〕−
【００６２】
実施例８ 〔３−（４−ニトロ−２−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン（４ＮＦＰ−ＡＰＢ）
黄色固形物
出発原料：２−フルオロ−５−ニトロベンゾトリフルオライド
収率：定量的
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ３２５．２〔Ｍ−Ｈ〕−
【００６３】
実施例９ 〔３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン（ＤＮＦＰ−ＡＰＢ）
橙色固形物
出発原料：２−クロロ−３，５−ジニトロベンゾトリフルオライド
収率：定量的
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ３７０．２〔Ｍ−Ｈ〕−
【００６４】
実施例１０ 〔３−（２，４−ジニトロピリジル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン（ＤＮＰｙ−ＡＰＢ）
橙色固形物
出発原料：２−クロロ−３，５−ジニトロピリジン
収率：定量的
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ３０３．２〔Ｍ−Ｈ〕−
【００６５】
実施例１１ 〔３−（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンジル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン（ＰＦＢ−ＡＰＢ）
無色固形物
出発原料：２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンジルブロマイド
収率：定量的
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ３１６．２〔Ｍ−Ｈ〕−（３０％），３４８．１〔Ｍ−Ｈ＋Ｏ２〕−（１００％）
【００６６】
実施例１２ ヒト血清試料中の生体内微量物質の測定
１２−１ ヒト血清試料の調製
ヒト全血より得た血清試料２００μｌにアセトニトリル２００μｌを加え、３０秒間混和し、１，５００ｘｇ、４℃にて１０分間遠心分離した。上清を分取し、水２ｍｌで希釈した後、ＯＡＳＩＳ ＨＬＢカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ製。使用前に酢酸エチル２ｍｌ、メタノール２ｍｌ及び水２ｍｌを通して洗浄しておく。）に通した。カートリッジを水２ｍｌ及びメタノール：水＝７：３の混合液２ｍｌにて洗浄した後、酢酸エチル１ｍｌを用いて被検成分を溶出した。
【００６７】
得られた溶出液を減圧下にて留去した後、残渣にヘキサン：酢酸エチル＝３：１の混合液０．２ｍｌを加え、この懸濁液をＢｏｎｄ Ｅｌｕｔ Ｓｉカートリッジ（Ｖａｒｉａｎ製。使用前に酢酸エチル４ｍｌ及びヘキサン４ｍｌを通して洗浄しておく。）に充填した。さらに、同液０．２ｍｌにより同じ操作を繰り返して同カートリッジに充填した。このカートリッジをヘキサン３ｍｌ及びヘキサン：酢酸エチル＝３：１の混合液３ｍｌにて洗浄した後、ヘキサン：酢酸エチル＝１：３の混合液３ｍｌを用いて、カートリッジから被検成分を溶出した。この溶出液を減圧下にて留去し、ヒト血清試料とした。
【００６８】
１２−２−１ オキソステロイド化合物に対するヒドラジン誘導体化
実験例１に示す操作により得たヒト血清試料をエタノール（２０μｌ）に懸濁し、これに、トリクロロ酢酸０．５ｍｇの存在下にて、ヒドラジン化合物５μｇ（製造例１〜２において合成した化合物）のアセトニトリル５０μｌ溶液を加え、６０℃にて１時間攪拌した。反応終了後、溶媒を減圧下にて留去し、得られた残渣をエタノール４０μｌに溶解して、そのうちの１０μｌをＬＣ／ＭＳ測定のために用いた。
【００６９】
１２−２−２ ビシナルジオールを部分構造を有するビタミンＤ３代謝物に対するボロン酸誘導体化
ボロン酸化合物（実施例３〜１１において合成した化合物）５μｇをピリジン５０μｌに溶解し、これに実験例１に示す操作により得たヒト血清試料を加え５０℃にて１時間攪拌した。反応終了後、溶媒を減圧下にて留去し、得られた残渣をアセトニトリル４０μｌに溶解して、そのうちの１０μｌをＬＣ／ＭＳ測定のために用いた。
【００７０】
１２−２−３ カテコール部分構造を有するステロイド化合物に対するボロン酸誘導体化
上記実施例２と同様の操作により、カテコール部分構造を有するステロイド化合物のボロン酸誘導体化反応及び後処理を行い、カテコール部分構造を有するステロイド化合物のボロン酸誘導体が含まれる残渣を得た。これをアセトニトリル４０μｌに溶解して、そのうちの１０μｌをＬＣ／ＭＳ測定のために用いた。
【００７１】
１２−３ 被検物質の測定
ＬＣ／ＭＳ（ＭＳ）は、ｊａｓｃｏ ｐｕ−９８０クロマトグラフに接続したｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ−ｉｏｎ ｔｒａｐ−ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ ＴｈｅｒｍｏＱｕｅｓｔ ＬＣＱを用い、ＡＰＣＩ条件にて測定した。カラムはＪ’ｓｐｈｅｒｅ ＯＤＳ Ｈ−８０（ＹＭＣ製。４μｍ，１５０×４．６ｍｍ ｉ．ｄ．。）を用い、Ｆｌｏｗ Ｒａｔｅは１ｍｌ／ｍｉｎ．、温度は４０℃とした。ＭＳ／ＭＳ分析においては、ヘリウムをＣｏｌｌｉｓｉｏｎ Ｇａｓとして用いた。Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｖｏｌｔａｇｅ及びＴｕｂｅ Ｌｅｎｓ Ｏｆｆｓｅｔ Ｖｏｌｔａｇｅは、ヒドラジン誘導体についてはそれぞれ−１０Ｖ及び−１５Ｖとし、ボロン酸誘導体についてはそれぞれ−３Ｖ及び−１５Ｖとした。また、両誘導体とも負イオン且つＺｏｏｍＳｃａｎモードにて測定した。その他のＭＳ測定条件及び各被検物質の移動相については、表１〜表３に記載した。
【００７２】
各被検物質の測定結果を下記表１〜表３に示す。
【００７３】
【表１】
【００７４】
【表２】
【００７５】
【表３】
【００７６】
また、図１にテストステロン、デヒドロエピアンドロステロン及びプレグネノロンについてのクロマトグラム及びマススペクトルを示し、図２に２４，２５−（ジヒドロキシ）ビタミンＤ３についてのクロマトグラム及びマススペクトルを示す。
【００７７】
本発明により、負イオン検出ＡＰＣＩ−ＭＳを用いたステロイド性生体内微量物質の測定感度が従来の方法に比較して５〜２２５倍上昇し、ステロイド性生体内微量物質の測定が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、テストステロン、デヒドロエピアンドロステロン及びプレグネノロンをそれぞれ２−ニトロ−４−トリフルオロメチルヒドラジニル化し、ＬＣ／負イオン検出ＡＰＣＩ−ＭＳにより測定した時のクロマトグラム及びマススペクトルである。
【図２】図２は、２４，２５−（ジヒドロキシ）ビタミンＤ３を〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボラニル化し、ＬＣ／負イオン検出ＡＰＣＩ−ＭＳにより測定した時のクロマトグラム及びマススペクトルである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料中のステロイド性生体内微量物質に電子親和性原子団を有する化合物を導入し、負イオンＡＰＣＩ−ＭＳ法（負イオン大気圧化学イオン化質量分析法）により生体内微量物質を測定する方法、その測定に供される反応成績体及びその測定のための試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ビタミンＤ３代謝物（９，１０−セコステロイド）を含むステロイドホルモンは、生体内において、極微量にて強力な生理作用を表す。これらのステロイドホルモンの生体内レベルを把握することは、臨床診断及び病態解析上極めて重要であるが、これらの生体内濃度は著しく低い上に、構造類似化合物が共存するため、その分析には極めて高い感度及び特異性が要求される。
【０００３】
従来、これら生体内ステロイドホルモンの測定は、主としてＬＣ（Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：液体クロマトグラフィ）を用いて行われてきたが、実用的に十分な程度の感度が得られない場合が多かった。
【０００４】
近年、ＬＣとＡＰＣＩ−ＭＳ（Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）を組合せた方法、すなわち、ＬＣ／ＡＰＣＩ−ＭＳが特異性や多用性の面で有用であることが提案された（非特許文献１参照）。
しかし、ＬＣ／ＡＰＣＩ−ＭＳを用いた方法においても、ステロイドホルモン化合物自体のイオン化効率が低いために、十分な感度を得ることはできなかった。
【０００５】
さらに、ＬＣとＥＳＩ（Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：エレクトロスプレーイオン化）−ＭＳを組合せる方法も行われているが、本法は極性化合物に有効であるが、多くのステロイドホルモンは極性基を数個しか有していないことから、この方法もあまり実用的ではなかった。
【０００６】
最近になって、正イオン検出ＡＰＣＩ−ＭＳを用いた測定において、ステロイド化合物に電子親和性原子団を導入した誘導体が高感度で検出できることが示された（非特許文献２−４参照）。一方、負イオンモードのＡＰＣＩ−ＭＳは、バックグラウンドノイズが低いことが一般的に知られており、負イオンモードＡＰＣＩ−ＭＳを用いた測定において、ステロイド化合物に電子親和性原子団を導入すれば、更なる高感度化が期待できると考えられる。
しかしながら、これまで、負イオン検出ＡＰＣＩ−ＭＳのための電子親和性原子団の導入については、ペンタフルオロベンジル化の例（非特許文献５参照）が知られているのみで、他の誘導体化についての検討はなされていない。
【０００７】
【非特許文献１】
Ｋ． Ｓｈｉｍａｄａ， ｅｔ ａｌ．：Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． Ａ．， ２００１（９３５）， １４１
【非特許文献２】
Ｔ． Ｈｉｇａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．； Ｂｉｏｍｅｄ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．， ２００１（１５）， １３３．
【非特許文献３】
Ｔ． Ｈｉｇａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．； Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． Ｂ， ２００２（７７２）， ２２９．
【非特許文献４】
Ｋ． Ｓｈｉｍａｄａ ｅｔ ａｌ．； Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． Ｂ， １９９８（７１４）， １５３．
【非特許文献５】
Ｇ． Ｓｉｎｇｈ， ｅｔ ａｌ．； Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．， ２０００（７２）， ３００７
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、負イオンＡＰＣＩ−ＭＳを用いたステロイド性生体内微量物質の測定において、ステロイド性生体内微量物質に電子親和性原子団を有する化合物を導入することにより、ステロイド性生体内微量物質を高感度に測定する方法を提供することである。また、本発明の目的は、負イオンＡＰＣＩ−ＭＳを用いたステロイド性生体内微量物質の測定における測定感度を高めるための化合物を含むイオン化試薬、及び当該化合物をステロイド性生体内微量物質に導入した化合物を提供することである。さらに、本発明の目的は、負イオンＡＰＣＩ−ＭＳを用いたステロイド性生体内微量物質の測定のための試薬を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、負イオン検出ＡＰＣＩ−ＭＳを用いたステロイド性生体内微量物質の測定において、その測定感度を上昇させるべく鋭意検討したところ、驚くべきことに、特定の電子親和性原子団をステロイド性生体内微量物質に導入すると、その測定感度が数倍〜２００倍以上も上昇することを見出した。また、この測定感度はこれまでに知られている電子親和性原子団、すなわち、ペンタフルオロベンジル基を導入した場合に比較しても最大で７倍以上高いものであった。本発明者らは、これらの知見をもとにさらに検討を行い、本発明を完成させた。
【００１０】
しかして、本発明によれば、ステロイド性生体内微量物質のＬＣ／ＭＳ測定において、次の工程、すなわち、
ｉ） 血清試料に下記式（Ｉ）：
【００１１】
【化７】
〔式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３はそれぞれＨ、ＣＦ３又はＮＯ２を表す〕
の化合物又は下記式（ＩＩ）：
【００１３】
【化８】
〔式中、Ａｒは下記式：
【００１５】
【化９】
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は前記の意味を有する、）
の基、３，５−ジニトロ−２−ピリジル基又は７−ニトロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール−４−イル基を表す〕
の化合物を反応させて、下記式（ＩＩＩ）
【００１７】
【化１０】
〔式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は前記の意味を有し、Ｓｔはオキソ基を有するステロイド化合物からオキソ基を除いた部分を表す〕
で示される反応成績体又は下記式（ＩＶ）：
【００１９】
【化１１】
〔式中、Ａｒは前記の意味を有し、
【００２１】
【化１２】
はビシナルジオール部分構造を有するビタミンＤ３代謝物からビシナルジオール部分を除いた部分又はカテコール部分構造を有するステロイド化合物からカテコール部分を除いた部分を表す〕
で示される反応成績体とする工程、及び
ｉｉ） 前記反応成績体をＬＣ／負イオンＡＰＣＩ−ＭＳを用いて測定する工程、
を含むことを特徴とする、ステロイド性生体内微量物質の測定方法が提供される。
【００２３】
また、本発明によれば、前記式（ＩＩＩ）で示される化合物及び前記式（ＩＶ）で示される化合物が提供される。
【００２４】
さらに、本発明によれば、質量分析（ＭＳ）、さらに好ましくはＬＣ／ＭＳ分析のための、式（Ｉ）で表される化合物又は式（ＩＩ）で表される化合物を含む、高感度検出用イオン化試薬が提供される。
【００２５】
加えて、本発明によれば、分析対象が、ステロイド性生体内微量物質である、上記イオン化試薬、並びに、ＬＣ／ＭＳ分析が、負イオンＡＰＣＩ−ＭＳである、上記イオン化試薬が提供される。
【００２６】
なお、本発明のイオン化試薬は、ＡＰＣＩ法のみならず、ＥＳＩ法及びＣＦ−ＦＡＢ（連続フロー高速原子衝撃）法等、他のイオン化方法を用いる質量分析にも用いることができる。
【００２７】
本明細書において用いる語「ステロイド性生体内微量物質」とは、ステロイド化合物及びビタミンＤ３類縁体を意味する。したがって、ステロイド性生体内微量物質としては、例えば、テストステロン、ジヒドロテストステロン、デヒドロエピアンドロステロン、プレグネノロン、エストロン、２−ヒドロキシエストラジオール、４−ヒドロキシエストラジオール、２−ヒドロキシエストロン、４−ヒドロキシエストロン等のステロイド化合物及び２４，２５−（ジヒドロキシ）ビタミンＤ３、１，２４，２５−（トリヒドロキシ）ビタミンＤ３等のビタミンＤ３類縁体を挙げることができる。
【００２８】
本発明において使用される血清試料の調製方法については後記実験例において詳述するが、一般的な調製方法により精製した血清であれば、その血清試料は本発明に用いることができる。
【００２９】
本明細書において、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３はそれぞれＨ、ＣＦ３又はＮＯ２を表す。
【００３０】
本発明に使用することのできる前記式（Ｉ）の化合物としては、例えば、次のものを挙げることができる。
２−ニトロフェニルヒドラジン
２，４−ジニトロフェニルヒドラジン
２，４，６−トリニトロフェニルヒドラジン
２−ニトロ−６−トリフルオロメチルフェニルヒドラジン
２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニルヒドラジン
４−ニトロ−２−トリフルオロメチルフェニルヒドラジン
２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニルヒドラジン
なお、本明細書において、化合物名は原則として一般名を部分的に用いて記載するが、一般名を用いて表すことができない化合物については化学名にて表記する。
【００３１】
前記式（Ｉ）の化合物のうち、好ましい化合物としては次のものを挙げることができる。
２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニルヒドラジン
２，４−ジニトロフェニルヒドラジン
２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニルヒドラジン
【００３２】
また、本発明に使用することのできる前記式（ＩＩ）の化合物としては、例えば、次のものを挙げることができる。
〔３−（４−ニトロフェニル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン
〔３−（２，４−ジニトロフェニル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン
〔３−（２，４，６−トリニトロフェニル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン
４−〔Ｎ−（３−ジヒドロキシボリル）フェニル〕アミノ−７−ニトロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール
〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン
〔３−（４−ニトロ−２−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン
〔３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン
〔３−（２，４−ジニトロピリジル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン
〔３−（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンジル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン
【００３３】
前記式（ＩＩ）の化合物のうち、好ましいのは次に挙げる化合物である。
〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン
〔３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン
〔３−（２，４−ジニトロフェニル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン
【００３４】
さらに、前記式（ＩＩＩ）においてＳｔで表される部分は、テストステロン、ジヒドロテストステロン、デヒドロエピアンドロステロン及びプレグネノロンからそれぞれオキソ基を除いた部分であり、好ましくは、テストステロン及びジヒドロテストステロンからそれぞれオキソ基を除いた部分である。
【００３５】
また、前記式（ＩＶ）において
【００３６】
【化１３】
で表される部分は、２４，２５−（ジヒドロキシ）ビタミンＤ３及び１，２４，２５−（トリヒドロキシ）ビタミンＤ３からそれぞれビシナルジオール部分を除いた部分並びに２−ヒドロキシエストラジオール、４−ヒドロキシエストラジオール、２−ヒドロキシエストロン及び４−ヒドロキシエストロンからカテコール部分を除いた部分であり、好ましくは、２４，２５−（ジヒドロキシ）ビタミンＤ３からビシナルジオール部分を除いた部分並びに２−ヒドロキシエストラジオール及び４−ヒドロキシエストラジオールからカテコール部分を除いた部分である。
【００３８】
本発明により提供される前記式（ＩＩＩ）の化合物としては、例えば、次のものを挙げることができる。
３−（２−ニトロフェニル）ヒドラジニルテストステロン
３−（２，４−ジニトロフェニル）ヒドラジニルテストステロン
３−（２，４，６−トリニトロフェニル）ヒドラジニルテストステロン
３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルテストステロン
３−（２−ニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルテストステロン
３−（４−ニトロ−２−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルテストステロン
３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルテストステロン
３−（２−ニトロフェニル）ヒドラジニルジヒドロテストステロン
３−（２，４−ジニトロフェニル）ヒドラジニルジヒドロテストステロン
３−（２，４，６−トリニトロフェニル）ヒドラジニルジヒドロテストステロン
３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルジヒドロテストステロン
３−（２−ニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルジヒドロテストステロン
３−（４−ニトロ−２−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルジヒドロテストステロン
３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルジヒドロテストステロン
２０−（２−ニトロフェニル）ヒドラジニルプレグネノロン
２０−（２，４−ジニトロフェニル）ヒドラジニルプレグネノロン
２０−（２，４，６−トリニトロフェニル）ヒドラジニルプレグネノロン
２０−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルプレグネノロン
２０−（２−ニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルプレグネノロン
２０−（４−ニトロ−２−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルプレグネノロン
２０−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルプレグネノロン
１７−（２−ニトロフェニル）ヒドラジニルデヒドロエピアンドロステロン
１７−（２，４−ジニトロフェニル）ヒドラジニルデヒドロエピアンドロステロン
１７−（２，４，６−トリニトロフェニル）ヒドラジニルデヒドロエピアンドロステロン
１７−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルデヒドロエピアンドロステロン
１７−（２−ニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルデヒドロエピアンドロステロン
１７−（４−ニトロ−２−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルデヒドロエピアンドロステロン
１７−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルデヒドロエピアンドロステロン
【００３９】
また、前記式（ＩＩＩ）の化合物のうち、好ましい化合物としては次のものを挙げることができる。
３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルテストステロン
３−（２，４−ジニトロフェニル）ヒドラジニルテストステロン
３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルテストステロン
３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルジヒドロテストステロン
３−（２，４−ジニトロフェニル）ヒドラジニルジヒドロテストステロン
３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルジヒドロテストステロン
２０−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルプレグネノロン
２０−（２，４−ジニトロフェニル）ヒドラジニルプレグネノロン
２０−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルプレグネノロン
１７−（２，４−ジニトロフェニル）ヒドラジニルデヒドロエピアンドロステロン
１７−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルデヒドロエピアンドロステロン
１７−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルデヒドロエピアンドロステロン
【００４０】
また、前記式（ＩＩＩ）の化合物のうち、さらに好ましい化合物としては次のものを挙げることができる。
３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルテストステロン
３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルジヒドロテストステロン
２０−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルプレグネノロン
１７−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）ヒドラジニルデヒドロエピアンドロステロン
【００４１】
本発明により提供される前記式（ＩＶ）の化合物としては、例えば、次のものを挙げることができる。
２４，２５−〔３−（４−ニトロフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ３
２４，２５−〔３−（２，４−ジニトロフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ３
２４，２５−〔３−（２，４，６−トリニトロフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ３
２４，２５−〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ３
２４，２５−〔３−（２−ニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ３
２４，２５−〔３−（４−ニトロ−２−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ３
２４，２５−〔３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ３
２４，２５−〔３−（３，５−ジニトロピリジン−２−イル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ３
２４，２５−〔３−（７−ニトロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール−４−イル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ３
１−ヒドロキシ−２４，２５−〔３−（４−ニトロフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ３
１−ヒドロキシ−２４，２５−〔３−（２，４−ジニトロフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ３
１−ヒドロキシ−２４，２５−〔３−（２，４，６−トリニトロフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ３
１−ヒドロキシ−２４，２５−〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ３
１−ヒドロキシ−２４，２５−〔３−（２−ニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ３
１−ヒドロキシ−２４，２５−〔３−（４−ニトロ−２−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ３
１−ヒドロキシ−２４，２５−〔３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ３
１−ヒドロキシ−２４，２５−〔３−（３，５−ジニトロピリジン−２−イル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ３
１−ヒドロキシ−２４，２５−〔３−（７−ニトロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール−４−イル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ３
２，３−〔３−（４−ニトロフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（２，４−ジニトロフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（２，４，６−トリニトロフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（２−ニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（４−ニトロ−２−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（３，５−ジニトロピリジン−２−イル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（７−ニトロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール−４−イル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（４−ニトロフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（２，４−ジニトロフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（２，４，６−トリニトロフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（２−ニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（４−ニトロ−２−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（３，５−ジニトロピリジン−２−イル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（７−ニトロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール−４−イル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（４−ニトロフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（２，４−ジニトロフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（２，４，６−トリニトロフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（２−ニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（４−ニトロ−２−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（３，５−ジニトロピリジン−２−イル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（７−ニトロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール−４−イル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（４−ニトロフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（２，４−ジニトロフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（２，４，６−トリニトロフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（２−ニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（４−ニトロ−２−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（３，５−ジニトロピリジン−２−イル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（７−ニトロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール−４−イル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
【００４２】
また、前記式（ＩＶ）の化合物のうち、好ましいのは次に挙げる化合物である。
２４，２５−〔３−（２，４−ジニトロフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ３
２４，２５−〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ３
２４，２５−〔３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ３
１−ヒドロキシ−２４，２５−〔３−（２，４−ジニトロフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ３
１−ヒドロキシ−２４，２５−〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ３
１−ヒドロキシ−２４，２５−〔３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ３
２，３−〔３−（２，４−ジニトロフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（２，４−ジニトロフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（２，４−ジニトロフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（２，４−ジニトロフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
【００４３】
また、前記式（ＩＶ）の化合物のうち、さらに好ましいのは次に挙げる化合物である。
２４，２５−〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ３
１−ヒドロキシ−２４，２５−〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボラニルジオキシビタミンＤ３
２，３−〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−ヒドロキシ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
２，３−〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
３，４−〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボロニルジオキシ−１７−オキソ−１，３，５（１０）−エストラトリエン
【００４４】
本発明の測定方法における測定には、一般的なＬＣ及びＭＳを用いることができる。
次に、本発明の化合物の製造方法及び本発明の方法を用いたステロイド性生体内微量物質の測定について記載する。
【００４５】
【発明の実施の形態】
オキソ基を有するステロイド化合物の測定
本発明における前記式（Ｉ）の化合物は、商業的に入手可能な原料より、ヒドラジンによる置換反応によって容易に合成することができる。また、本発明における血清試料は、常法により容易に調製することができる。
すなわち、本発明における血清試料は、採血した全血より血清を分取した後、市販のカートリッジ（例えば、ＯＡＳＩＳ ＨＬＢ（登録商標） ｃａｒｔｒｉｄｇｅやＢｏｎｄ ＥＬＵＴ Ｓｉ（登録商標） ｃａｒｔｒｉｄｇｅ等）を用いた精製により調製できる。
【００４６】
本発明における血清試料をエタノール等のアルコール類に懸濁し、これに、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸等の酸性触媒の存在下にて、前記式（Ｉ）のヒドラジン化合物を反応させることにより、前記式（ＩＩＩ）の化合物へと誘導することができる。
【００４７】
前記式（ＩＩＩ）の化合物への合成反応、すなわち、ヒドラジン誘導体化反応における反応温度は、室温乃至８０℃の範囲内の温度で行うことができ、好ましくは５０℃乃至７０℃の範囲内の温度が適している。また、前記式（Ｉ）のヒドラジン化合物は、直接又は不活性有機溶媒、例えば、アセトニトリル、エタノール、酢酸エチル等の溶液の状態にて加えることもできる。
【００４８】
また、上記ヒドラジン誘導体化反応において、血清試料に対するヒドラジン化合物の使用割合は、血清試料２００μｌに対してヒドラジン化合物２μｇ乃至２０μｇとすることができ、好ましくは４μｇ乃至１０μｇが適している。
【００４９】
前記式（ＩＩＩ）のヒドラジン誘導体のＬＣ／負イオンＡＰＣＩ−ＭＳ測定は、一般的なＬＣ、例えば、Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋｅｒｄ社製 ＨＰ１１００又はＷａｔｅｒｓ社製 ２７９５など、並びに一般的なＭＳ、例えば、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ社製 ＱＵＡＴＴＲＯ ＩＩ又はＭｉｃｒｏｍａｓｓ社製 ＱＵＡＴＴＲＯ ＭＩＣＲＯなどを用いて行うことができる。
【００５０】
ビシナルジオール部分構造を有するビタミンＤ ３ 誘導体の測定
本発明における前記式（ＩＩ）の化合物についても、商業的に入手可能な原料より、アミノフェニルジヒドロキシボランによる置換反応によって容易に合成することができる。
【００５１】
本発明における血清試料と前記式（ＩＩ）のジヒドロキシボラン化合物とを不活性有機溶媒、例えば、アセトニトリル、エタノール、ピリジン等の溶媒中にて反応させ、前記式（ＩＶ）の化合物へと誘導することができる。
【００５２】
前記式（ＩＶ）の化合物への合成反応、すなわち、ボロン酸誘導体化反応における反応温度は、室温乃至７０℃の範囲内の温度で行うことができ、好ましくは４０℃乃至６０℃の範囲内の温度が適している。
【００５３】
また、ボロン酸誘導体化反応において、血清試料に対するボロン酸化合物の使用割合は血清試料５０μｌに対してボロン酸化合物２μｇ乃至２０μｇとすることができ、好ましくは４μｇ乃至１０μｇが適している。
【００５４】
前記式（ＩＩＩ）のヒドラジン誘導体のＬＣ／負イオンＡＰＣＩ−ＭＳ測定は、一般的なＬＣ及びＭＳを用いて行うことができる。
以下の実施例は、本発明をより詳細に説明するものであるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００５５】
【実施例】
実施例１ ２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニルヒドラジン（２ＮＦＰＨ）の合成
４−フルオロ−３−ニトロベンゾトリフルオライド１００μｌをアセトニトリル１ｍｌに溶解し、８０％ヒドラジン水和物１１０μｌを加え室温にて１５分間攪拌する。反応混合物を減圧下にて濃縮した後、これに酢酸エチルを加え、水洗し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下にて溶媒を留去し、得られた粗結晶をＭｅＯＨより２回再結晶して、橙色針状晶の２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニルヒドラジンを得た（定量的）。
融点：１１６−１１６．５℃
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ２２０．０〔Ｍ−Ｈ〕−
製造例１と同様にして、以下の実施例２の化合物を合成した。
【００５６】
実施例２ ２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニルヒドラジン（ＤＮＦＰＨ）の合成
黄色針状晶
収率：定量的
融点：１４０．５−１４１．５℃
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ２６５．０〔Ｍ−Ｈ〕−
【００５７】
実施例３ 〔３−（４−ニトロフェニル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン（ＮＰ−ＡＰＢ）の合成
４−フルオロニトロベンゼン０．３ｍｌ及びアミノフェニルジヒドロキシボラン５０ｍｇを、ジメシルスルホキシド：１Ｍ炭酸ナトリウム水溶液＝１：１の混合液２ｍｌに加え、７０℃にて６時間攪拌した。反応混合物を酢酸エチルで抽出した後、水洗し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下にて溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝２０：１）にて精製し、標題化合物の黄色固形物を得た（定量的）。
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ２５７．３〔Ｍ−Ｈ〕−
実施例３と同様にして、以下の実施例４―１１の化合物を合成した。
【００５８】
実施例４ 〔３−（２，４−ジニトロフェニル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン（ＤＮＰ−ＡＰＢ）
橙色固形物
出発原料：２，４−ジニトロフルオロベンゼン
収率：定量的
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ３０２．２〔Ｍ−Ｈ〕−
【００５９】
実施例５ 〔３−（２，４，６−トリニトロフェニル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン（ＴＮＰ−ＡＰＢ）
茶色固形物
出発原料：２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム二水和物
収率：定量的
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ３４７．２〔Ｍ−Ｈ〕−
【００６０】
実施例６ ４−〔Ｎ−（３−ジヒドロキシボリル）フェニル〕アミノ−７−ニトロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール（ＤＮＢ−ＡＰＢ）
茶色固形物
出発原料：４−クロロ−７−ニトロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール
収率：定量的
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ２９９．２〔Ｍ−Ｈ〕−
【００６１】
実施例７ 〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン（２ＮＦＰ−ＡＰＢ）
黄色固形物
出発原料：４−フルオロ−３−ニトロベンゾトリフルオライド
収率：定量的
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ３２５．２〔Ｍ−Ｈ〕−
【００６２】
実施例８ 〔３−（４−ニトロ−２−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン（４ＮＦＰ−ＡＰＢ）
黄色固形物
出発原料：２−フルオロ−５−ニトロベンゾトリフルオライド
収率：定量的
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ３２５．２〔Ｍ−Ｈ〕−
【００６３】
実施例９ 〔３−（２，４−ジニトロ−６−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン（ＤＮＦＰ−ＡＰＢ）
橙色固形物
出発原料：２−クロロ−３，５−ジニトロベンゾトリフルオライド
収率：定量的
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ３７０．２〔Ｍ−Ｈ〕−
【００６４】
実施例１０ 〔３−（２，４−ジニトロピリジル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン（ＤＮＰｙ−ＡＰＢ）
橙色固形物
出発原料：２−クロロ−３，５−ジニトロピリジン
収率：定量的
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ３０３．２〔Ｍ−Ｈ〕−
【００６５】
実施例１１ 〔３−（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンジル）アミノフェニル〕ジヒドロキシボラン（ＰＦＢ−ＡＰＢ）
無色固形物
出発原料：２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンジルブロマイド
収率：定量的
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ３１６．２〔Ｍ−Ｈ〕−（３０％），３４８．１〔Ｍ−Ｈ＋Ｏ２〕−（１００％）
【００６６】
実施例１２ ヒト血清試料中の生体内微量物質の測定
１２−１ ヒト血清試料の調製
ヒト全血より得た血清試料２００μｌにアセトニトリル２００μｌを加え、３０秒間混和し、１，５００ｘｇ、４℃にて１０分間遠心分離した。上清を分取し、水２ｍｌで希釈した後、ＯＡＳＩＳ ＨＬＢカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ製。使用前に酢酸エチル２ｍｌ、メタノール２ｍｌ及び水２ｍｌを通して洗浄しておく。）に通した。カートリッジを水２ｍｌ及びメタノール：水＝７：３の混合液２ｍｌにて洗浄した後、酢酸エチル１ｍｌを用いて被検成分を溶出した。
【００６７】
得られた溶出液を減圧下にて留去した後、残渣にヘキサン：酢酸エチル＝３：１の混合液０．２ｍｌを加え、この懸濁液をＢｏｎｄ Ｅｌｕｔ Ｓｉカートリッジ（Ｖａｒｉａｎ製。使用前に酢酸エチル４ｍｌ及びヘキサン４ｍｌを通して洗浄しておく。）に充填した。さらに、同液０．２ｍｌにより同じ操作を繰り返して同カートリッジに充填した。このカートリッジをヘキサン３ｍｌ及びヘキサン：酢酸エチル＝３：１の混合液３ｍｌにて洗浄した後、ヘキサン：酢酸エチル＝１：３の混合液３ｍｌを用いて、カートリッジから被検成分を溶出した。この溶出液を減圧下にて留去し、ヒト血清試料とした。
【００６８】
１２−２−１ オキソステロイド化合物に対するヒドラジン誘導体化
実験例１に示す操作により得たヒト血清試料をエタノール（２０μｌ）に懸濁し、これに、トリクロロ酢酸０．５ｍｇの存在下にて、ヒドラジン化合物５μｇ（製造例１〜２において合成した化合物）のアセトニトリル５０μｌ溶液を加え、６０℃にて１時間攪拌した。反応終了後、溶媒を減圧下にて留去し、得られた残渣をエタノール４０μｌに溶解して、そのうちの１０μｌをＬＣ／ＭＳ測定のために用いた。
【００６９】
１２−２−２ ビシナルジオールを部分構造を有するビタミンＤ３代謝物に対するボロン酸誘導体化
ボロン酸化合物（実施例３〜１１において合成した化合物）５μｇをピリジン５０μｌに溶解し、これに実験例１に示す操作により得たヒト血清試料を加え５０℃にて１時間攪拌した。反応終了後、溶媒を減圧下にて留去し、得られた残渣をアセトニトリル４０μｌに溶解して、そのうちの１０μｌをＬＣ／ＭＳ測定のために用いた。
【００７０】
１２−２−３ カテコール部分構造を有するステロイド化合物に対するボロン酸誘導体化
上記実施例２と同様の操作により、カテコール部分構造を有するステロイド化合物のボロン酸誘導体化反応及び後処理を行い、カテコール部分構造を有するステロイド化合物のボロン酸誘導体が含まれる残渣を得た。これをアセトニトリル４０μｌに溶解して、そのうちの１０μｌをＬＣ／ＭＳ測定のために用いた。
【００７１】
１２−３ 被検物質の測定
ＬＣ／ＭＳ（ＭＳ）は、ｊａｓｃｏ ｐｕ−９８０クロマトグラフに接続したｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ−ｉｏｎ ｔｒａｐ−ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ ＴｈｅｒｍｏＱｕｅｓｔ ＬＣＱを用い、ＡＰＣＩ条件にて測定した。カラムはＪ’ｓｐｈｅｒｅ ＯＤＳ Ｈ−８０（ＹＭＣ製。４μｍ，１５０×４．６ｍｍ ｉ．ｄ．。）を用い、Ｆｌｏｗ Ｒａｔｅは１ｍｌ／ｍｉｎ．、温度は４０℃とした。ＭＳ／ＭＳ分析においては、ヘリウムをＣｏｌｌｉｓｉｏｎ Ｇａｓとして用いた。Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｖｏｌｔａｇｅ及びＴｕｂｅ Ｌｅｎｓ Ｏｆｆｓｅｔ Ｖｏｌｔａｇｅは、ヒドラジン誘導体についてはそれぞれ−１０Ｖ及び−１５Ｖとし、ボロン酸誘導体についてはそれぞれ−３Ｖ及び−１５Ｖとした。また、両誘導体とも負イオン且つＺｏｏｍＳｃａｎモードにて測定した。その他のＭＳ測定条件及び各被検物質の移動相については、表１〜表３に記載した。
【００７２】
各被検物質の測定結果を下記表１〜表３に示す。
【００７３】
【表１】
【表２】
【表３】
また、図１にテストステロン、デヒドロエピアンドロステロン及びプレグネノロンについてのクロマトグラム及びマススペクトルを示し、図２に２４，２５−（ジヒドロキシ）ビタミンＤ３についてのクロマトグラム及びマススペクトルを示す。
【００７７】
本発明により、負イオン検出ＡＰＣＩ−ＭＳを用いたステロイド性生体内微量物質の測定感度が従来の方法に比較して５〜２２５倍上昇し、ステロイド性生体内微量物質の測定が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、テストステロン、デヒドロエピアンドロステロン及びプレグネノロンをそれぞれ２−ニトロ−４−トリフルオロメチルヒドラジニル化し、ＬＣ／負イオン検出ＡＰＣＩ−ＭＳにより測定した時のクロマトグラム及びマススペクトルである。
【図２】図２は、２４，２５−（ジヒドロキシ）ビタミンＤ３を〔３−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニル）アミノフェニル〕ボラニル化し、ＬＣ／負イオン検出ＡＰＣＩ−ＭＳにより測定した時のクロマトグラム及びマススペクトルである。
Claims (6)
- ステロイド性生体内微量物質のＬＣ／ＭＳ測定において、次の工程、すなわち、
ｉ） 血清試料に下記式
の化合物あるいは下記式
の基、３，５−ジニトロ−２−ピリジル基又は７−ニトロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール−４−イル基を表す〕
の化合物を反応させて、下記式
で示される反応成績体、あるいは下記式
で示される反応成績体とする工程、及び
ｉｉ） 前記反応成績体を、ＬＣ／負イオンＡＰＣＩ−ＭＳを用いて測定する工程、を含むことを特徴とする、ステロイド性生体内微量物質の測定方法。 - 請求項１の式（ＩＩＩ）で示される化合物。
- 請求項１の式（ＩＶ）で示される化合物。
- 質量分析のための、請求項１の式（Ｉ）で表される化合物又は請求項１の式（ＩＩ）で表される化合物を含む、高感度検出用イオン化試薬。
- 分析対象が、ステロイド性生体内微量物質である、請求項４記載のイオン化試薬。
- 質量分析が、負イオンＡＰＣＩ−ＭＳである、請求項４又は５に記載のイオン化試薬。
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