JPWO2007029668A1 - ソフトイオン化法のための誘導体化試薬 - Google Patents

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Abstract

本発明は、フェノール類化合物及びアミン類化合物のソフトイオン化法を用いた質量分析測定における検出感度を高めるための手段を提供することを目的とする。
本発明は、式（Ｉ）
【化１】
Figure 2007029668

（式中、Ｘはハロゲンであり、Ｙ１及びＹ２はニトロ基等であり、ＡはＮ等であり、ＱはＣ１〜Ｃ４アルキレン基であり、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は例えば以下の（ａ）を満たす。（ａ）Ｒ１及びＲ２は独立にＣ１〜Ｃ４アルキル基であり、且つＲ３は水素又はＣ１〜Ｃ４アルキル基である）
で表される化合物又はその四級化物を含有する、フェノール類化合物又はアミン類化合物の誘導体化試薬に関する。

Description

本発明はフェノール類化合物又はアミン類化合物のソフトイオン化法を用いた質量分析測定において検出感度を高めるための誘導体化試薬に関する。
エストロゲン（エストロン，エストラジオールなど）は、ホルモンとして超微量で強い生理作用を有し、生命機能維持に不可欠な生体分子である。従ってその生体内レベルは、臨床診断、病態解析や薬物療法上有用な情報となる。また、環境中にも主に生活廃水由来のエストロゲンが存在し、各種動物の内分泌系への影響が懸念されている。さらにビスフェノールＡに代表されるフェノール構造を有する人工化学物質も強い内分泌撹乱作用を有することから（環境ホルモン）、これらの環境中レベル及び動態に関心が持たれている。このように、生体又は環境中に存在する各種フェノール類化合物を測定することの必要性が存在する。
一方、タンパク質、ペプチド、アミノ酸等のアミノ基を有する各種アミン類化合物も生体内や環境中で重要な役割を果たすことが周知である。またアミン類化合物の一つであるポリアミン類は腫瘍マーカーとなり得ることが知られている。従って、生体又は環境中に存在するアミン類化合物の測定手法の確立もまた急がれている。
現在、生体試料及び環境試料中のフェノール類化合物、アミン類化合物等の生理活性物質の分析には、特異性に優れる高速液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）が汎用されている。中でもエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法等のソフトイオン化法と組合されたそれは、操作性や汎用性が高く、微量成分分析のファーストチョイスの地位を確立したと言っても過言ではない。しかし、フェノール類化合物、アミン類化合物等はソフトイオン化法におけるイオン化効率が低く、十分な応答を示さないという問題がある。
上記問題を克服することを目指して、ソフトイオン化法の特性に着目した分析対象化合物の誘導体化法等の新規手法の開発が盛んに行われている。
フェノール類化合物及びアミン類化合物のための既存の誘導体化試薬としては、５−ジメチルアミノナフタレン−１−スルホニルクロリド（ダンシルクロリド（ＤＮＳ−Ｃｌ））や、Ｎ，Ｎ−ジエチル−２，４−ジニトロ−５−フルオロアニリン（非特許文献１）が知られている。しかしながら、それらの既存の試薬による検出感度の向上の程度は満足できるものではない。
Fermo I., Rubino F. M., Bolzacchini E., Arcelloni C., Paroni R., Bonini P. A., J. Chromatogr. B, 433, 53-62, (1988).
本発明は、フェノール類化合物及びアミン類化合物のソフトイオン化法を用いた質量分析測定における検出感度を高めるための手段を提供することを目的とする。
本発明は以下の発明を包含する。
（１）式（Ｉ）
Figure 2007029668
（式中、
Ｘはハロゲンであり、
Ｙ１及びＹ２は、独立に、水素又はニトロ基であり（但しＹ１とＹ２とが同時に水素であることはない）、
ＡはＮ又はＣＨであり、
ＱはＣ１〜Ｃ４アルキレン基であり、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は以下の（ａ）〜（ｃ）の何れか１つを満たすものである
（ａ）Ｒ１及びＲ２は、独立に、Ｃ１〜Ｃ４アルキル基であり、且つ、Ｒ３は水素又はＣ１〜Ｃ４アルキル基である、
（ｂ）Ｒ１とＲ２とが一体となって、Ｃ２〜Ｃ５アルキレン基を形成しており、且つ、Ｒ３は水素又はＣ１〜Ｃ４アルキル基である、
（ｃ）Ｒ１はＣ１〜Ｃ４アルキル基であり、且つ、Ｒ２とＲ３とが一体となって、Ｃ１〜Ｃ４アルキレン基を形成している）
で表される化合物、又は前記Ｒ１及びＲ２で置換されたＮにＣ１〜Ｃ４アルキル基であるＲ４が付加された、カウンターアニオンを有する前記化合物の四級化物を含有する、フェノール類化合物又はアミン類化合物のソフトイオン化法を用いた質量分析測定のための誘導体化試薬。
上記式（Ｉ）で表される化合物又はその四級化物は、基Ｘが結合した炭素において、検出対象化合物であるフェノール類化合物のフェノール性水酸基又はアミン類化合物のアミノ基による求核反応を受け、基Ｘと、水酸基又はアミノ基の水素の一つとが離脱して、該検出対象化合物と共有結合を形成して、該検出対象化合物を誘導体化する。
（２）式（ＩＩ）
Figure 2007029668
（式中Ｘはハロゲンである）
で表される化合物、又はジメチル置換されたＮに更なるメチル基が付加された、カウンターアニオンを有する前記化合物の四級化物を含有する、（１）記載の誘導体化試薬。
（３）式（ＩＩＩ）
Figure 2007029668
（式中Ｘはハロゲンである）
で表される化合物、又はメチル置換されたＮに更なるメチル基が付加された、カウンターアニオンを有する前記化合物の四級化物を含有する、（１）記載の誘導体化試薬。
（４）前記フェノール類化合物がエストロゲン又はフェノール性内分泌撹乱物質である（１）〜（３）の何れかに記載の誘導体化試薬。
（５）前記ソフトイオン化法がエレクトロスプレーイオン化法である（１）〜（４）の何れかに記載の誘導体化試薬。
（６）式（Ｉ）
Figure 2007029668
（式中、
Ｘはハロゲンであり、
Ｙ１及びＹ２は、独立に、水素又はニトロ基であり（但しＹ１とＹ２とが同時に水素であることはない）、
ＡはＮ又はＣＨであり、
ＱはＣ１〜Ｃ４アルキレン基であり、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は以下の（ａ）〜（ｃ）の何れか１つを満たすものである
（ａ）Ｒ１及びＲ２は、独立に、Ｃ１〜Ｃ４アルキル基であり、且つ、Ｒ３は水素又はＣ１〜Ｃ４アルキル基である、
（ｂ）Ｒ１とＲ２とが一体となって、Ｃ２〜Ｃ５アルキレン基を形成しており、且つ、Ｒ３は水素又はＣ１〜Ｃ４アルキル基である、
（ｃ）Ｒ１はＣ１〜Ｃ４アルキル基であり、且つ、Ｒ２とＲ３とが一体となって、Ｃ１〜Ｃ４アルキレン基を形成している）
で表される化合物、又は前記Ｒ１及びＲ２で置換されたＮにＣ１〜Ｃ４アルキル基であるＲ４が付加された、カウンターアニオンを有する前記化合物の四級化物と、フェノール類化合物又はアミン類化合物とを反応させて誘導体を形成させた後に、ソフトイオン化法を用いた質量分析測定を行なう、フェノール類化合物又はアミン類化合物の測定方法。
（７）前記式（Ｉ）で表される化合物と、フェノール類化合物又はアミン類化合物とを反応させて誘導体を形成させた後に、Ｃ１〜Ｃ４アルキル基を有する四級化剤を用いて前記Ｒ１及びＲ２で置換されたＮを四級化する工程を更に含む、（６）記載の方法。
（８）式（Ｉ）
Figure 2007029668
（式中、
Ｘはハロゲンであり、
Ｙ１及びＹ２は、独立に、水素又はニトロ基であり（但しＹ１とＹ２とが同時に水素であることはない）、
ＡはＮ又はＣＨであり、
ＱはＣ１〜Ｃ４アルキレン基であり、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は以下の（ａ）〜（ｃ）の何れか１つを満たすものである
（ａ）Ｒ１及びＲ２は、独立に、Ｃ１〜Ｃ４アルキル基であり、且つ、Ｒ３は水素又はＣ１〜Ｃ４アルキル基である、
（ｂ）Ｒ１とＲ２とが一体となって、Ｃ２〜Ｃ５アルキレン基を形成しており、且つ、Ｒ３は水素又はＣ１〜Ｃ４アルキル基である、
（ｃ）Ｒ１はＣ１〜Ｃ４アルキル基であり、且つ、Ｒ２とＲ３とが一体となって、Ｃ１〜Ｃ４アルキレン基を形成している）
で表される化合物（但し、Ｎ１−（５−クロロ−２，４−ジニトロフェニル）−Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−１，２−プロパンジアミン、Ｎ−（５−クロロ−２，４−ジニトロフェニル）−１−ピペリジンエタンアミン、Ｎ−（５−クロロ−２，４−ジニトロフェニル）−α−メチル−１−ピロリジンエタンアミン、１−（５−クロロ−２，４−ジニトロフェニル）−４−メチル−ピペラジン、Ｎ’−（５−クロロ−２，４−ジニトロフェニル）−Ｎ，Ｎ−ジエチル−１，２−エタンジアミン、Ｎ’−（５−クロロ−２，４−ジニトロフェニル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１，２−エタンジアミン、及びＮ−（５−クロロ−２，４−ジニトロフェニル）−１−ピロリジンエタンアミンを除く）、又は前記Ｒ１及びＲ２で置換されたＮにＣ１〜Ｃ４アルキル基であるＲ４が付加された、カウンターアニオンを有する前記化合物の四級化物。
（９）式（ＩＶ）
Figure 2007029668
（式中Ｘ’はフッ素、臭素又はヨウ素である）
で表される化合物、又はジメチル置換されたＮに更なるメチル基が付加された、カウンターアニオンを有する前記化合物の四級化物。
（１０）式（Ｖ）
Figure 2007029668
（式中Ｘ’はフッ素、臭素又はヨウ素である）
で表される化合物、又はメチル置換されたＮに更なるメチル基が付加された、カウンターアニオンを有する前記化合物の四級化物。
なお、本明細書において「Ｃｍ〜Ｃｎアルキレン基」とは炭素数ｍ個以上ｎ個以下の直鎖又は分岐鎖のアルキレン基を指す。また「Ｃｍ〜Ｃｎアルキル基とは炭素数ｍ個以上ｎ個以下の直鎖又は分岐鎖のアルキル基を指す。
本発明により、フェノール類化合物及びアミン類化合物のソフトイオン化法を用いた質量分析測定における検出感度を高めるための手段が提供される。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2005-261023号の明細書に記載される内容を包含する。
本発明に係る誘導体化試薬は式（Ｉ）で表される化合物を含有することを特徴とする。
Figure 2007029668
式（Ｉ）中の各基について以下に説明する。
Ａはベンゼン環上で基Ｘに対して３、５、６位の何れの位置に結合していてもよいが、５位に結合していることが最も好ましい。
Ｘはハロゲン、好ましくは塩素又はフッ素、特に好ましくはフッ素である。
Ｙ１及びＹ２は、独立に、水素又はニトロ基であり（但しＹ１とＹ２とが同時に水素であることはない）、好ましくはＹ１及びＹ２は共にニトロ基である。
ＡはＮ又はＣＨ、好ましくはＮである。
ＱはＣ１〜Ｃ４アルキレン基、特に直鎖のＣ１〜Ｃ４アルキレン基が好ましい。具体的にはメチレン、エチレン、ｎ−プロピレン、ｎ−ブチレンが好ましく、メチレン及びエチレンが特に好ましい。
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３については下記（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）Ｒ１及びＲ２が、独立に、Ｃ１〜Ｃ４アルキル基であり、且つ、Ｒ３が水素又はＣ１〜Ｃ４アルキル基である場合；
（ｂ）Ｒ１とＲ２とが一体となって、Ｃ２〜Ｃ５アルキレン基を形成しており、且つ、Ｒ３が水素又はＣ１〜Ｃ４アルキル基である場合；
（ｃ）Ｒ１がＣ１〜Ｃ４アルキル基であり、且つ、Ｒ２とＲ３とが一体となって、Ｃ１〜Ｃ４アルキレン基を形成している場合；
の何れかの場合があり得る。何れの場合も、「アルキル基」及び「アルキレン基」は直鎖であることが好ましい。
上記（ａ）の場合。Ｒ１及びＲ２が、独立に、メチル、エチル、ｎ−プロピル又はｎ−ブチルであることが好ましく、特にメチル又はエチルであることが好ましい。Ｒ１及びＲ２は互いに同一の基であることがより好ましい。Ｒ３は水素であることが好ましい。
上記（ｂ）の場合。Ｒ１とＲ２とが一体となって、エチレン、ｎ−プロピレン、ｎ−ブチレン又はｎ−ペンチレンを形成していることが好ましい。Ｒ３は水素であることが好ましい。
上記（ｃ）の場合。Ｒ１がメチル、エチル、ｎ−プロピル又はｎ−ブチルであることが好ましく、メチル又はエチルであることが特に好ましい。Ｒ２とＲ３とが一体となって、メチレン、エチレン、ｎ−プロピレン又はｎ−ブチレンを形成していることが好ましく、メチレン又はエチレンを形成していることが特に好ましい。また、Ｒ２とＲ３とが一体となって形成するアルキレン基が、前記Ｑと同一のアルキレン基であることがより一層好ましい。
式（Ｉ）における各基の特に好ましい組合せを次表に示す。
Figure 2007029668
表１に示す各組合せにおいてハロゲンＸはフッ素又は塩素が好ましく、フッ素が特に好ましい。
本発明において最も好ましい化合物は、
式（ＩＩ）
Figure 2007029668
（式中Ｘはハロゲンである）
で表される化合物、特にＸがフッ素である化合物（Ｎ’−（５−フルオロ−２，４−ジニトロフェニル）−Ｎ，Ｎ−ジエチル−１，２−エタンジアミン）、又は
式（ＩＩＩ）
Figure 2007029668
（式中Ｘはハロゲンである）
で表される化合物、特にＸがフッ素である化合物（１−（５−フルオロ−２，４−ジニトロフェニル）−４−メチル−ピペラジン）である。
上記式（I）で表される化合物の製造方法は特に限定されない。当業者であれば実施例に示す具体的な合成手順と技術常識とを参照することにより、式（I）で表される全ての化合物を製造することが可能である。例えば、以下の式で示す反応をＭｅＣＮ等の適切な溶媒中であり行うことにより式（I）で表される化合物を合成することができる。
Figure 2007029668
（反応式中、各置換基は式（I）について定義した通りである）
上記式（Ｉ）で表される化合物は酸付加塩として用いられることもできる。
上記式（Ｉ）で表される化合物は、Ｒ１及びＲ２で置換されたＮにＣ１〜Ｃ４アルキル基であるＲ４が付加された、カウンターアニオンを有する四級化物の形態で使用することがより好ましい。四級化することにより検出感度が高まるからである。かかる四級化は、上記式（Ｉ）で表される化合物と検出対象化合物（フェノール類化合物又はアミン類化合物）との反応により誘導体を形成する前に行なってもよいし、後に行なってもよいが、誘導体形成反応後に行なうことが好ましい。Ｒ４は直鎖のＣ１〜Ｃ４アルキル基、すなわちメチル、エチル、ｎ−プロピル又はｎ−ブチルであることが好ましく、特にメチル又はエチルであることが好ましい。更にまた、Ｒ４は、Ｒ１が直鎖Ｃ１〜Ｃ４アルキル基である場合（例えば表１の組合せ５及び６の場合）には、Ｒ１と同一の基であることが好ましく、Ｒ１及びＲ２が同一の直鎖Ｃ１〜Ｃ４アルキル基である場合（例えば表１の組合せ１及び２の場合）には、Ｒ１及びＲ２と同一の基であることが好ましい。
基Ｒ４を有する四級化剤としては、特に限定されないが、典型的にはＲ４のヨウ化物（例えばヨウ化メチル、ヨウ化エチル、ヨウ化ｎ−プロピル、ヨウ化ｎ−ブチル）のほか、トリメチルオキソニウム・三フッ化ホウ素錯体［ＯＭｅ３・ＢＦ３］、ジメチル硫酸［（ＭｅＯ）２ＳＯ２］、ジメチル炭酸［（ＭｅＯ）２ＣＯ］、メチルトリフラート［ＭｅＯＳＯ２ＣＦ３］等の通常用いられる四級化剤を用いることができる。本発明の化合物の四級化物は通常は四級化剤に由来するカウンターアニオンを有する。例えば四級化剤としてヨウ化アルキル、トリメチルオキソニウム・三フッ化ホウ素錯体、ジメチル硫酸、ジメチル炭酸、メチルトリフラートを用いた場合、本発明の化合物の四級化物は、それぞれＩ−、ＢＦ３ −、ＭｅＯＳＯ３ −、ＭｅＯＣＯ２ −、ＣＦ３ＳＯ３ −をカウンターアニオンとして有する。また、本発明の化合物の四級化物では、四級化剤に由来するカウンターアニオンは適宜他のアニオンに置換されてもよい。
本発明より検出感度を高めることができる検出対象化合物は、フェノール類化合物又はアミン類化合物に属する化合物であれば特に限定されない。「フェノール類化合物」とはフェノール性水酸基を有する化合物を意味し、具体的にはエストロゲン類（例えばエストロン、エストラジオール）、カテコールアミン類等の生体内成分、ポリフェノール類等の各種生薬成分、ビスフェノール類、ハロゲン化フェノール類、アルキルフェノール類等のフェノール性内分泌撹乱物質（「環境ホルモン」とも称される）が挙げられるがこれらには限定されない。「アミン類化合物」とはアミノ基を有する化合物を意味し、具体的にはタンパク質、ペプチド、アミノ酸、ポリアミン類等が挙げられるがこれらには限定されない。
検出対象化合物の、本発明の誘導体化試薬による誘導体化の条件は特に限定されない。本発明の誘導体化試薬における基Ｘが結合した炭素に、検出対象化合物であるフェノール類化合物のフェノール性水酸基又はアミン類化合物のアミノ基が求核反応し、基Ｘと、水酸基又はアミノ基の水素の一つとが離脱することにより、検出対象化合物と誘導体化試薬との間に共有結合が形成される条件であればどのような条件でもよい。
本発明は、診療、環境の分析、食品の検査、工業製品の検査等の様々な分野において、サンプル中に微量に存在するフェノール類化合物又はアミン類化合物を測定するために応用することができる。本発明の誘導体化試薬を用いたフェノール類化合物の測定方法は、例えば、妊婦尿中のエストロンを測定するために使用できる。妊婦尿中のエストロンの測定は胎児−胎盤系機能の診断に重要である。従来、その測定にはイムノアッセイが用いられているが、イムノアッセイを用いた方法は交差反応性の問題を有し、得られる定量値の信頼性は低いという問題があった。このためより選択性の高いＬＣ／ＭＳによる分析が試みられている。しかしエストロンはエレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）や大気圧化学イオン化法（ＡＰＣＩ）によるイオン化効率が低いため、エストロンの定量には数１００μＬ以上の尿サンプルが必要であった。本発明の誘導体化試薬を用いると、エストロンの微量検出が可能となる。このため尿中エストロンの分析が１０μＬのサンプル量で可能となり、従来法と比べて大幅にサンプル量を減らすことができる。
本発明において「ソフトイオン化法」としては、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）、大気圧化学イオン化法（ＡＰＣＩ）等の大気圧イオン化法（ＡＰＩ）のほかに、化学イオン化法（ＣＩ）、高速原子衝撃法（ＦＡＢ）、マトリクス支援レーザーイオン化法（ＭＡＬＤＩ）、電界脱離イオン化法（ＦＤ）等が挙げられる。本発明に係る誘導体化試薬は、特にＥＳＩ法及びＭＡＬＤＩ法に適したものである。
誘導体化されたフェノール類化合物又はアミン類化合物は、上記ソフトイオン化法によりイオン化された後、質量分離手段により分離される。質量分離手段としては種々のものが利用可能である。例えば、磁場型の単収束タイプのもの、磁場電場を用いた二重収束タイプのもの、四重極型（イオントラップを含む）のもの、飛行時間型のもの、イオンサイクロトロン型のもの等が挙げられるが、質量分離手段はイオンを選択、分離できるものであれば何れの手段であってもよい。また、これらをいくつか組み合わせてイオンの分離の精度を増大させても構わない。
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明は実施例の具体的な記載により限定されるものではない。
Ｎ’−（５−フルオロ−２，４−ジニトロフェニル）−Ｎ，Ｎ−ジエチル−１，２−エタンジアミンの合成
１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（１００ｍｇ，０．４９ｍｍｏｌ）をＭｅＣＮ（１．０ｍＬ）に溶解した。そこへＮ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン（２６．９μＬ，０．２５ｍｍｏｌ）を滴下し室温で３０分攪拌した。反応終了後、窒素気流下、溶媒を留去した。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー［移動相：ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ（２０：１）から（８：１）へ］に付して黄色固体（３０ｍｇ）を得た。更に２−プロパノールで再結晶を行い、黄色結晶を得た。
ｍｐ１３１−１３２℃．１Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：２．３２（６Ｈ，ｓ），２．６７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ），３．３４（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６Ｈｚ），６．５６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５Ｈｚ），９．０（１Ｈ，ｂｒｓ），９．１５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ）．ＥＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ２７２ ［Ｍ］＋．
１−（５−フルオロ−２，４−ジニトロフェニル）−４−メチル−ピペラジンの合成
１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（１００ｍｇ，０．４９ｍｍｏｌ）をＭｅＣＮ（１．０ｍＬ）に溶解し、そこへ１−メチルピペラジン（２７．２μＬ，０．２５ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で３０分撹拌した。反応終了後、窒素気流下、溶媒を留去した。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー［ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ（２０：１）］に付して黄色オイル（６４ｍｇ）を得た。更にヘキサンで再結晶を行い、黄色針状物を得た。
ｍｐ７８−７９℃．１Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：２．３７（３Ｈ，ｓ），２．５７（４Ｈ，ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ），３．２９（４Ｈ，ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ），６．８０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５Ｈｚ），８．７１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ）．ＥＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ２８４ ［Ｍ］＋．
本発明の化合物により誘導体化されたエストロンの検出感度の確認
Ｎ’−（５−フルオロ−２，４−ジニトロフェニル）−Ｎ，Ｎ−ジエチル−１，２−エタンジアミン及び１−（５−フルオロ−２，４−ジニトロフェニル）−４−メチル−ピペラジン並びにこれらの四級化物により誘導体化されたエストロンのＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳによる分析における検出感度を確認した。
検出感度は測定試料の検出限界（ＬＯＤ）（Ｓ／Ｎ＝５）（単位：ｐｇ）を指標に評価した。比較のために、誘導体化していないエストロン並びにダンシルクロリド（ＤＮＳ−Ｃｌ）及びＮ，Ｎ−ジエチル−２，４−ジニトロ−５−フルオロアニリンで誘導体化したエストロンについても同様の条件で検出限界を確認した。
ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにおける測定試料の検出限界量は、液体クロマトグラフィーでの保持時間（ｔＲ）が短いほど小さくなる（すなわち感度が上がる）。そこで、保持時間の相違による検出限界への影響を取り除くために、各測定試料の液体クロマトグラフィーでの保持時間がほぼ同じになるように移動相溶媒の組成を調整した。
Ｎ’−（５−フルオロ−２，４−ジニトロフェニル）−Ｎ，Ｎ−ジエチル−１，２−エタンジアミン及び１−（５−フルオロ−２，４−ジニトロフェニル）−４−メチル−ピペラジンのエストロン誘導体のヨウ化メチルによる四級化は次の手順で行った。共栓付試験管にエストロン（１０ｐｇ−１００ｎｇ）のＥｔＯＨ溶液（１０μＬ）にアセトン（４０μＬ）を加えた。次に、前記誘導体化試薬のアセトン溶液（１ｍｇ／ｍＬ，１０μＬ）を加え、最後に１Ｍ ＮａＨＣＯ３水溶液（１０μＬ）を加えた。これをボルテックスミキサーで撹拌し、６０℃にて６０分間反応させた。５０％ ＭｅＯＨ（５００μＬ）を加えて反応を停止後、予めＡｃＯＥｔ（２ｍＬ）、ＭｅＯＨ（２ｍＬ）及びＨ２Ｏ（２ｍＬ）で順次コンディショニングしたｓｔｒａｔａ−Ｘカートリッジに通導し、脱塩操作を行った。すなわち，Ｈ２Ｏ（２ｍＬ）で洗浄後、ＡｃＯＥｔ（１ｍＬ）で目的物を溶出させた。窒素気流下溶媒を留去後、ヨウ化メチル（１０μＬ）を加え、６０℃にて３０分間反応させた。窒素気流下、ヨウ化メチルを留去し、ＭｅＯＨ−１０ｍＭギ酸アンモニウム水溶液（１：１）（１００μＬ）に溶解し、これを試料溶液としてＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳで分析した。
ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳの測定条件を表２に、本実験に使用した主な試薬等の入手先を表３に、実験結果を表４にそれぞれ示す。
Figure 2007029668
Figure 2007029668
Figure 2007029668
Ｎ’−（５−フルオロ−２，４−ジニトロフェニル）−Ｎ，Ｎ−ジエチル−１，２−エタンジアミン（表４実験番号４）及び１−（５−フルオロ−２，４−ジニトロフェニル）−４−メチル−ピペラジン（表４実験番号５）は、エストロンの検出感度向上のための誘導体化試薬として、既存の誘導体化試薬であるダンシルクロリド（表４実験番号２）及びＮ，Ｎ−ジエチル−２，４−ジニトロ−５−フルオロアニリン（表４実験番号３）と同等またはより優れたものであることが明らかとなった。また、Ｎ’−（５−フルオロ−２，４−ジニトロフェニル）−Ｎ，Ｎ−ジエチル−１，２−エタンジアミンの四級化物（表４実験番号６）及び１−（５−フルオロ−２，４−ジニトロフェニル）−４−メチル−ピペラジンの四級化物（表４実験番号７）はエストロンの検出感度向上のための誘導体化試薬として特に優れたものであることが明らかとなった。
１−（５−フルオロ−２，４−ジニトロフェニル）−４−メチル−ピペラジンの四級化物により誘導体化されたエストロン及びエストラジオールの検出感度の確認
１−（５−フルオロ−２，４−ジニトロフェニル）−４−メチル−ピペラジンの四級化物により誘導体化されたエストロン及びエストラジオールのＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳによる分析における検出感度を確認した。
検出感度は測定試料の検出限界（ＬＯＤ）（Ｓ／Ｎ＝５）（単位：ｆｍｏｌ又はｐｇ）を指標に評価した。
本実施例におけるエストロン及びエストラジオールの誘導体化反応のスキームは以下の通りである。
Figure 2007029668
１−（５−フルオロ−２，４−ジニトロフェニル）−４−メチル−ピペラジンのエストロン及びエストラジオール誘導体のヨウ化メチルによる四級化は次の手順で行った。共栓付試験管にエストロン又はエストラジオール（１０−１００ｐｇ）のＥｔＯＨ溶液（１０μＬ）にアセトン（４０μＬ）を加えた。次に、前記誘導体化試薬のアセトン溶液（１μｇ／μＬ、１０μＬ）を加え、最後に１Ｍ ＮａＨＣＯ３水溶液（１０μＬ）を加えた。これをボルテックスミキサーで撹拌し、６０℃にて６０分間反応させた。５０％ ＭｅＯＨ（５００μＬ）を加えて反応を停止後、予めＡｃＯＥｔ（２ｍＬ）、ＭｅＯＨ（２ｍＬ）及びＨ２Ｏ（２ｍＬ）で順次コンディショニングしたＳｔｒａｔａ−Ｘカートリッジに通導し、脱塩操作を行った。すなわちＨ２Ｏ（２ｍＬ）で洗浄後、ＡｃＯＥｔ（１ｍＬ）で目的物を溶出させた。窒素気流下溶媒を留去後、ヨウ化メチル（１００μＬ）を加え、６０℃にて３０分間反応させた。窒素気流下、ヨウ化メチルを留去し、ＭｅＯＨ−１０ｍＭギ酸アンモニウム水溶液（１：１、ｖ／ｖ、１００μＬ）に溶解し、これを試料溶液としてＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳで分析した。ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳの測定条件を表５に示す。
Figure 2007029668
エストロン、エストロン誘導体、エストラジオール及びエストラジオール誘導体のそれぞれの検出限界（ＬＯＤ）を表６に示す。表６に示される通り、１−（５−フルオロ−２，４−ジニトロフェニル）−４−メチル−ピペラジンの四級化物による誘導体化によりエストロンの検出感度は２３００倍向上し、エストラジオールの検出感度は４０００倍向上した。
Figure 2007029668
妊婦尿中のエストロン及びエストラジオールの検出
共栓付試験管に妊婦尿（１０μＬ）をとり、内部標準として重水素標識エストロン（２００ｐｇ）を加えた。妊婦尿としては、１６週の妊婦及び３７週の妊婦からの尿を使用した。この混合物にメタノール（１００μＬ）を加え、ボルテックスミキサーにて攪拌を行い遠心分離（１０００ｇ，５分間）した。上清を水（４００μＬ）で希釈し、Ｓｔｒａｔａ−Ｘカートリッジに付した。水（２ｍＬ）、３０％メタノール（２ｍＬ）で順次洗浄後、酢酸エチル（１ｍＬ）で溶出を行った。溶出液を窒素気流下にて溶媒留去し、残渣を以下の誘導体化反応に付した。
上記残渣に１−（５−フルオロ−２，４−ジニトロフェニル）−４−メチル−ピペラジン（１μｇ／μＬになるよう調製したアセトン溶液を４０μＬ）、１Ｍ ＮａＨＣＯ３（１０μＬ）、アセトン（４０μＬ）を順次加え、６０℃で加熱した。１時間後、５０％メタノール（４００μＬ）を加えて反応を終了し、ＮａＨＣＯ３の除去を行うため、これをＳｔｒａｔａ−Ｘカートリッジに付した。水（２ｍＬ）で洗浄後、酢酸エチル（１ｍＬ）で溶出し、窒素気流下にて溶媒留去した。得られた残渣にヨウ化メチル（２００μＬ）を加え、６０℃、３０分加熱後、窒素気流下にてヨウ化メチルの除去を行った。
メタノール−１０ｍＭギ酸アンモニウム（１：１，ｖ／ｖ，３０μＬ）で残渣を溶解し、そのうち１０μＬを用いてＬＣ／ＭＳによる分析を行った。
装置：Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ−１０ＡＴ ／ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＡＰＩ ２０００
カラム：ＹＭＣ Ｐａｃｋ Ｃ８（５μｍ、１５０×２ｍｍ ｉ．ｄ．）
移動相：ＭｅＣＮ−ＭｅＯＨ−１０ｍＭ ＨＣＯＯＮＨ４（７：３：１０、ｖ／ｖ／ｖ）
流速：０．２ ｍＬ／ｍｉｎ
検出法：正イオン検出ＥＳＩ
選択反応モニタリング（ＳＲＭ）（エストロン ｍ／ｚ ５４９．３→５０２．４、内部標準 ｍ／ｚ ５５４．３→５０６．４）
なお、検量線の作成のために次の操作を行った。共栓付試験管に健常男性尿（１０μＬ）をとり、エストロン（５，１０，２０，５０，１００，２００ｐｇ）のＥｔＯＨ溶液（１０μＬ）と内部標準として重水素標識エストロン（２００ｐｇ）を加えた。なお、ここで用いた男性尿はあらかじめエストロンが検出されないことを確認している。この混合物にＭｅＯＨ（１００μＬ）を加え、ボルテックスミキサーにて撹拌を行い遠心分離（１０００ｇ，５分間）した。上清をＨ２Ｏ（４００μＬ）で希釈し、Ｓｔｒａｔａ−Ｘカートリッジに付した。Ｈ２Ｏ（２ｍＬ）、３０％ＭｅＯＨ（２ｍＬ）で順次洗浄後、ＡｃＯＥｔ（１ｍＬ）で溶出を行った。溶出液を窒素気流下溶媒留去し、残渣を以下の誘導体化反応に付した。すなわち，１−（５−フルオロ−２，４−ジニトロフェニル）−４−メチル−ピペラジン（１μｇ／μＬになるように調製したアセトン溶液を４０μＬ）、１Ｍ ＮａＨＣＯ３（１０μＬ）、アセトン（４０μＬ）を順次加え、６０℃で加熱した。１時間後、５０％ＭｅＯＨ（４００μＬ）を加えて反応を終了し、ＮａＨＣＯ３を除去するため、これをＳｔｒａｔａ−Ｘカートリッジに付した。Ｈ２Ｏ（２ｍＬ）で洗浄後、ＡｃＯＥｔ（１ｍＬ）で溶出し、窒素気流下溶媒留去した。残渣にヨウ化メチル（２００μＬ）を加え、６０℃、３０分間反応を行い、その後、窒素気流下にてヨウ化メチルの除去を行った。ＭｅＯＨ−１０ｍＭギ酸アンモニウム（１：１、ｖ／ｖ、３０μＬ）で残渣を溶解し、このうち１０μＬを用いてＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳで分析を行い、検量線を作成した。得られた検量線は、Ｘをエストロン濃度（ｎｇ／ｍＬ）、Ｙをエストロンと内部標準とのピーク面積比（エストロンピーク面積／内部標準ピーク面積）としたとき、Ｙ＝０．０６５９７８Ｘ＋０．０００９３０（Ｒ２＝０．９９９８９４）であった。
１６週と３７週の妊婦の尿サンプルについてそれぞれ５回ずつ、上記手順に沿って分析を行い、エストロンと内部標準とのピーク面積比を測定した。そして当該面積比から上記検量線を用いてエストロン濃度（ｎｇ／ｍＬ）を算出した。こうして算出されたエストロン濃度の平均値、標準偏差、及び変動係数（標準偏差／平均値×１００）を表７及び８にまとめた。表７及び８に示されるとおり本発明によるエストロン濃度の測定法の再現性は非常に高かった。
Figure 2007029668
Figure 2007029668
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (10)

  1. 式（Ｉ）
    Figure 2007029668
     （式中、
    Ｘはハロゲンであり、
    Ｙ１及びＹ２は、独立に、水素又はニトロ基であり（但しＹ１とＹ２とが同時に水素であることはない）、
    ＡはＮ又はＣＨであり、
    ＱはＣ１〜Ｃ４アルキレン基であり、
    Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は以下の（ａ）〜（ｃ）の何れか１つを満たすものである
    （ａ）Ｒ１及びＲ２は、独立に、Ｃ１〜Ｃ４アルキル基であり、且つ、Ｒ３は水素又はＣ１〜Ｃ４アルキル基である、
    （ｂ）Ｒ１とＲ２とが一体となって、Ｃ２〜Ｃ５アルキレン基を形成しており、且つ、Ｒ３は水素又はＣ１〜Ｃ４アルキル基である、
    （ｃ）Ｒ１はＣ１〜Ｃ４アルキル基であり、且つ、Ｒ２とＲ３とが一体となって、Ｃ１〜Ｃ４アルキレン基を形成している）
    で表される化合物、又は前記Ｒ１及びＲ２で置換されたＮにＣ１〜Ｃ４アルキル基であるＲ４が付加された、カウンターアニオンを有する前記化合物の四級化物を含有する、フェノール類化合物又はアミン類化合物のソフトイオン化法を用いた質量分析測定のための誘導体化試薬。
  2. 式（ＩＩ）
    Figure 2007029668
     （式中Ｘはハロゲンである）
    で表される化合物、又はジメチル置換されたＮに更なるメチル基が付加された、カウンターアニオンを有する前記化合物の四級化物を含有する、請求項１記載の誘導体化試薬。
  3. 式（ＩＩＩ）
    Figure 2007029668
     （式中Ｘはハロゲンである）
    で表される化合物、又はメチル置換されたＮに更なるメチル基が付加された、カウンターアニオンを有する前記化合物の四級化物を含有する、請求項１記載の誘導体化試薬。
  4. 前記フェノール類化合物がエストロゲン又はフェノール性内分泌撹乱物質である請求項１〜３の何れか１項記載の誘導体化試薬。
  5. 前記ソフトイオン化法がエレクトロスプレーイオン化法である請求項１〜４の何れか１項記載の誘導体化試薬。
  6. 式（Ｉ）
    Figure 2007029668
     （式中、
    Ｘはハロゲンであり、
    Ｙ１及びＹ２は、独立に、水素又はニトロ基であり（但しＹ１とＹ２とが同時に水素であることはない）、
    ＡはＮ又はＣＨであり、
    ＱはＣ１〜Ｃ４アルキレン基であり、
    Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は以下の（ａ）〜（ｃ）の何れか１つを満たすものである
    （ａ）Ｒ１及びＲ２は、独立に、Ｃ１〜Ｃ４アルキル基であり、且つ、Ｒ３は水素又はＣ１〜Ｃ４アルキル基である、
    （ｂ）Ｒ１とＲ２とが一体となって、Ｃ２〜Ｃ５アルキレン基を形成しており、且つ、Ｒ３は水素又はＣ１〜Ｃ４アルキル基である、
    （ｃ）Ｒ１はＣ１〜Ｃ４アルキル基であり、且つ、Ｒ２とＲ３とが一体となって、Ｃ１〜Ｃ４アルキレン基を形成している）
    で表される化合物、又は前記Ｒ１及びＲ２で置換されたＮにＣ１〜Ｃ４アルキル基であるＲ４が付加された、カウンターアニオンを有する前記化合物の四級化物と、フェノール類化合物又はアミン類化合物とを反応させて誘導体を形成させた後に、ソフトイオン化法を用いた質量分析測定を行なう、フェノール類化合物又はアミン類化合物の測定方法。
  7. 前記式（Ｉ）で表される化合物と、フェノール類化合物又はアミン類化合物とを反応させて誘導体を形成させた後に、Ｃ１〜Ｃ４アルキル基を有する四級化剤を用いて前記Ｒ１及びＲ２で置換されたＮを四級化する工程を更に含む、請求項６記載の方法。
  8. 式（Ｉ）
    Figure 2007029668
     （式中、
    Ｘはハロゲンであり、
    Ｙ１及びＹ２は、独立に、水素又はニトロ基であり（但しＹ１とＹ２とが同時に水素であることはない）、
    ＡはＮ又はＣＨであり、
    ＱはＣ１〜Ｃ４アルキレン基であり、
    Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は以下の（ａ）〜（ｃ）の何れか１つを満たすものである
    （ａ）Ｒ１及びＲ２は、独立に、Ｃ１〜Ｃ４アルキル基であり、且つ、Ｒ３は水素又はＣ１〜Ｃ４アルキル基である、
    （ｂ）Ｒ１とＲ２とが一体となって、Ｃ２〜Ｃ５アルキレン基を形成しており、且つ、Ｒ３は水素又はＣ１〜Ｃ４アルキル基である、
    （ｃ）Ｒ１はＣ１〜Ｃ４アルキル基であり、且つ、Ｒ２とＲ３とが一体となって、Ｃ１〜Ｃ４アルキレン基を形成している）
    で表される化合物（但し、Ｎ１−（５−クロロ−２，４−ジニトロフェニル）−Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−１，２−プロパンジアミン、Ｎ−（５−クロロ−２，４−ジニトロフェニル）−１−ピペリジンエタンアミン、Ｎ−（５−クロロ−２，４−ジニトロフェニル）−α−メチル−１−ピロリジンエタンアミン、１−（５−クロロ−２，４−ジニトロフェニル）−４−メチル−ピペラジン、Ｎ’−（５−クロロ−２，４−ジニトロフェニル）−Ｎ，Ｎ−ジエチル−１，２−エタンジアミン、Ｎ’−（５−クロロ−２，４−ジニトロフェニル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１，２−エタンジアミン、及びＮ−（５−クロロ−２，４−ジニトロフェニル）−１−ピロリジンエタンアミンを除く）、又は前記Ｒ１及びＲ２で置換されたＮにＣ１〜Ｃ４アルキル基であるＲ４が付加された、カウンターアニオンを有する前記化合物の四級化物。
  9. 式（ＩＶ）
    Figure 2007029668
     （式中Ｘ’はフッ素、臭素又はヨウ素である）
    で表される化合物、又はジメチル置換されたＮに更なるメチル基が付加された、カウンターアニオンを有する前記化合物の四級化物。
  10. 式（Ｖ）
    Figure 2007029668
     （式中Ｘ’はフッ素、臭素又はヨウ素である）
    で表される化合物、又はメチル置換されたＮに更なるメチル基が付加された、カウンターアニオンを有する前記化合物の四級化物。
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