CN101274909B - 溴化1-[3-(4-马来酰亚胺基苯氧基)丙基]三甲铵及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了溴化1-[3-(4-马来酰亚胺基苯氧基)丙基]三甲铵及其制备方法与应用。本发明所提供的溴化1-[3-(4-马来酰亚胺基苯氧基)丙基]三甲铵(MPPTAB)，其结构如式I。本发明应用对氨基苯酚作桥联剂，将马来酰亚胺官能团与季胺盐连接，首次合成了一种新的季铵盐类衍生试剂——MPPTAB，该化合物可以用于选择性的对含巯基的化合物如肽，蛋白质等进行标记，并提高其在基质辅助激光解析电离时间飞行质谱检测中的灵敏度，特别的是对不易离子化的强疏水性的肽，效果尤为明显。

Description

溴化1-[3-(4-马来酰亚胺基苯氧基)丙基]三甲铵及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及溴化1-[3-(4-马来酰亚胺基苯氧基)丙基]三甲铵及其制备方法与应用，特别是涉及该化合物在含有巯基的化合物的质谱检测中的应用。
背景技术
标记分析方法(如同位素标记、光学标记等)在生化分析中有广泛的应用，该方法是通过向无或低信号响应的物质提供响应基团，使原先无法或者难于进行的分析变得可能，或者使检测信号加强。而质谱对蛋白质酶解之后产生的肽的混合物进行检测是当前在蛋白质组学中的最基本的方法。然而，由于肽的大小、疏水性、所带的电荷以及其二级结构等的影响，肽的质谱信号的强度有很大的差异(Anal.Chem.2004，76，4522-4530)。为提高基质辅助激光解析电离时间飞行质谱中对肽的检测灵敏度，衍生方法被广泛采用。目前的方法主要是通过向肽分子中引入强碱性基团(比如胍基、季铵盐、磷酸盐等)，以提高其离子化水平，从而提高检测灵敏度。对此，人们已经发展了对肽中精氨酸、蛋氨酸、N-末端氨基酸等残基的衍生方法。通常，衍生化不但提高了检测的灵敏度，同时也增加了检测的选择性，从而有助于蛋白质组学的研究(Anal. Chem.2004，76，4550-4557)。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够对巯基进行选择性反应的季铵盐类衍生试剂：溴化1-[3-(4-马来酰亚胺基苯氧基)丙基]三甲铵(MPPTAB)及其制备方法与应用。
本发明所提供的溴化1-[3-(4-马来酰亚胺基苯氧基)丙基]三甲铵(MPPTAB)，其结构如式I。
Figure S07164816020070405D000011
(式I)
该溴化1-[3-(4-马来酰亚胺基苯氧基)丙基]三甲铵的制备方法，其合成路线如下，
其中，
步骤a)的反应条件为：将马来酰酐溶解于N，N-二甲基甲酰胺中，加入对氨基苯酚，再加入浓硫酸、五氧化二磷，加热反应，得到黄色针状固体(i)
步骤b)的反应条件为：将黄色针状固体(i)溶解在呋喃中，搅拌反应，得中间产物(ii)；
步骤c)的反应条件为：将中间产物(ii)溶解于DMF中，加入1，3-二溴丙烷和无水碳酸钠，搅拌反应，得到中间产物(iii)；
步骤d)的反应条件为：将中间产物(iii)溶于丙酮中，加入三甲胺，于冰水浴中搅拌反应，即得中间产物(iv)；
步骤e)的反应产物为：将中间产物(iv)与苯混合，并于60℃加热3h后，蒸去苯，得脱保护的淡黄色产物溴化1-[3-(4-马来酰亚胺基苯氧基)丙基]三甲铵(v)。
本发明所提供的试剂，是专一的用于含有巯基的肽或者其它小分子(如巯基乙醇)的衍生试剂；该试剂与这些分子衍生后，获得了一个永久性的正电荷，在基质辅助激光解析电离时间飞行质谱检测中，可显著提高他们的离子化效率；同时具有紫外吸收的芳香疏水性官能团的引入也可以改善分析物与基质的融合、以及能量的吸收与传递，从而提高它们的检测灵敏度。因此，本发明溴化1-[3-(4-马来酰亚胺基苯氧基)丙基]三甲铵作为含有巯基的化合物的衍生试剂的应用，以及，该化合物在含有巯基的化合物的质谱检测中的应用，都属于本发明的保护范围。
本发明应用对氨基苯酚作桥联剂，将马来酰亚胺官能团与季胺盐连接，首次合成了一种新的季铵盐类衍生试剂——MPPTAB，该化合物可以用于选择性的对含巯基的化合物如肽，蛋白质等进行标记，并提高其在基质辅助激光解析电离时间飞行质谱检测中的灵敏度，特别的是对不易离子化的强疏水性的肽，效果尤为明显。
附图说明
图1为溴化1-[3-(4-马来酰亚胺基苯氧基)丙基]三甲铵(MPPTAB)的合成路线图；
图2为MPPTAB的核磁谱图；
图3为MPPTAB与巯基化合物的衍生反应的图示；
图4为高效液相色谱监测的衍生条件的优化；
图5为含巯基的不同的肽与其衍生后等量混合后的质谱图。
具体实施方式
实施例1、溴化1-[3-(4-马来酰亚胺基苯氧基)丙基]三甲铵的合成
本发明所提供的溴化1-[3-(4-马来酰亚胺基苯氧基)丙基]三甲铵由三部分构成，其结构式如式I所示：首先是马来酰亚胺基团，它可对肽中半胱氨酸残基的巯基进行选择性标记；中间为疏水性的芳香桥联基团，与肽衍生后可增强衍生产物的疏水性，从而易于和基质融合，有利于能量的吸收和转移，进而增强检测信号；最后是季铵盐基团，它的功用是在质谱中提供一个永久性的阳离子，有利于在阳离子模式下对分析物进行检测。
本发明溴化1-[3-(4-马来酰亚胺基苯氧基)丙基]三甲铵的合成路线如图1所示(a-e为不同反应步骤，i-v为各步骤所得到的产物)，可按如下步骤进行：
a.(i)的合成：将马来酰酐(1.96克)溶解于约10毫升新蒸馏制得的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，再加入约等摩尔量的对氨基苯酚，溶液变为黄色。在20℃左右搅拌反应2小时；之后，通过滴液漏斗，在约45分钟内向反应液中滴加含有约0.25毫升浓硫酸、2克五氧化二磷的DMF溶液(约20毫升)，并加热(约70℃)搅拌反应2小时，溶液颜色变为紫红色。然后，将反应液倒入碎冰中终止反应，再加入大量水(约800毫升)稀释。接着，用乙酸乙酯萃取，并用水洗涤有机相。有机相经硫酸钠干燥后，用旋转蒸发仪除去其中的溶剂，残渣用异丙醇进行重结晶，得黄色针状固体(i)。
b.马来酰亚胺中双键的保护：将(i)溶解在新蒸馏制得的呋喃中，得橙黄色溶液，并在常温下搅拌反应48小时。之后，过滤反应液中析出的白色沉淀，干燥，得产物(ii)。
c.将(ii)溶解在新蒸馏制得的DMF中，加入约5倍摩尔量的1，3-二溴丙烷和约10倍量的无水碳酸钠。于20℃左右搅拌反应约24小时，反应体系呈淡紫色；之后加水溶解稀释，用乙酸乙酯萃取，将有机相水洗后用硫酸钠干燥，旋转蒸发至少量液体，用硅胶柱对此残留液体进行分离。洗脱液为乙酸乙酯：石油醚(1：2至1：3，比例越小分离效果越好，但耗时长)的混合液。用旋转蒸发仪除去其中的溶剂，得(iii)。
d.将(iii)溶于丙酮中，加入5倍摩尔量的三甲胺(33％)的甲醇溶液。于冰水浴中搅拌反应48小时，得淡黄色沉淀。过滤、并用冷丙酮洗涤，干燥后即得(iv)。
e.将(iv)与苯混合并于60℃下加热约3小时。然后，蒸去苯，残渣用甲醇重结晶，得脱保护的淡黄色产物(v)，并对其进行核磁(见图2)和高分辨质谱表征。
1H NMR：δ7.24(d，2H)，7.08(d 2H)，6.96(d2H)，4.17(t，2H)，3.53(m，2H)，3.15(s，9H)，2.29(t，2H)。
高分辨质谱(p-SIMS-Gly，Bruker Daltonics.Inc.APEX II.FT-ICRMS)：C16H21N2O3，计算值289.15466；测定值289.1548。
实施例2、溴化1-[3-(4-马来酰亚胺基苯氧基)丙基]三甲铵对含有巯基的肽的衍生化作用
应用本发明溴化1-[3-(4-马来酰亚胺基苯氧基)丙基]三甲铵(MPPTAB)对含有巯基的化合物进行标记的衍生反应如图3所示，该反应在约37℃，约20mmol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(也可以在HEPES缓冲溶液)缓冲溶液(pH约7.4)中进行；在反应中，巯基与马来酰亚胺的双键反应生成硫醚。
通过反相高效液相色谱优化了反应条件，发现在约37℃下，肽与衍生试剂的摩尔比为1：3的条件下，反应约2小时即可以进行完全(在同样的色谱检测条件下，产物的峰面积不再增加)，见图4。图中横坐标为保留时间，纵坐标为紫外吸收；图中所示色谱图：a，谷胱甘肽；b，衍生试剂(MPPTAB)；c到f分别是当肽对衍生试剂反应的摩尔比为1：1.5，1：3，1：5，1：10时的色谱图。谱图中各色谱峰分别为：谷胱甘肽(1)，衍生产物(2)，未知物(3)，衍生试剂(4)。
实施例3、质谱信号提高实验
所有质谱分析都在Bruker BIFLEX III MALDI-TOF MS上进行，该质谱仪配有氮激光源(337nm)。信号采集在反射式阳离子模式下进行，加速电压为19千伏特，反射电压为20千伏；采用α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)做基质(采用其它极性强的基质，信号会减弱或无所需信号)；其饱和溶液用乙腈/水(含0.1％三氟乙酸)为2：1(v/v)的混合液配制，稀释一倍后对结果没有明显的影响。取3μL的样品和3μL的基质溶液混合均匀后，取0.5μL点靶，室温干燥后分析。
所有的质谱信号强度的对比都是取等摩尔浓度的肽溶液和其衍生产物的溶液等体积混合；对未衍生的肽，为了保证其与衍生的肽有相同的背景，其溶液的配制方法和衍生反应的一样，只是不含有衍生试剂。在进行衍生反应体系中，反应结束后加入100倍于衍生试剂的量的β-巯基乙醇，用以消除过量的衍生试剂在混合时与肽继续反应。
在优化的实验条件下，选择了四种肽进行试验：谷胱甘肽，
GPVEDAITAAIGRVAC，CLLLGGTMV，LCMFVPGYT。将上述四种肽衍生化之后，在加入等量的肽混合，混合后的质谱图见图5，图中a为LCMFVPGYT，b为CLLLGGTMV，c为谷胱甘肽，d为GPVEDAITAAIGRVAC。结果显示，各肽的衍生产物与未进行衍生的肽相比，谷胱甘肽(c)信号增强了4.7倍，GPVEDAITAAIGRVAC(d)提高了3.3倍；而对不含有易质子化基团的肽LCMFVPGYT(a)和CLLLGGTMV(b)，质谱图中可以看到，在同样的条件下，它们的信号提高了大约100多倍。这一结果与它们的检测限的改善结果是一致的，这就排除了离子抑制的干扰，说明此衍生试剂的设计合成是非常成功的。究其机理，可能是衍生反应在含有半胱氨酸残基的肽中引入了一个永久性的正电荷，提高了其在质谱检测中的离子化效率，而导致检测信号的增强；特别的是对不易离子化的强疏水性的肽，效果尤为明显。

Claims (6)

1.式I结构的溴化1-[3-(4-马来酰亚胺基苯氧基)丙基]三甲铵，
Figure FSB00000023081000011
2.权利要求1所述溴化1-[3-(4-马来酰亚胺基苯氧基)丙基]三甲铵的制备方法，其合成路线如下，
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：
步骤a的反应条件为：将马来酸酐溶解于N，N-二甲基甲酰胺中，加入对氨基苯酚，再加入浓硫酸、五氧化二磷，加热反应，得到黄色针状固体(i)
步骤b的反应条件为：将黄色针状固体(i)溶解在呋喃中，搅拌反应，得中间产物(ii)；
步骤c的反应条件为：将中间产物(ii)溶解于DMF中，加入1，3-二溴丙烷和无水碳酸钠，搅拌反应，得到中间产物(iii)；
步骤d的反应条件为：将中间产物(iii)溶于丙酮中，加入三甲胺，于冰水浴中搅拌反应，即得中间产物(iv)；
步骤e的反应条件为：将中间产物(iv)与苯混合，并于60℃加热3h后，蒸去苯，得脱保护的淡黄色产物溴化1-[3-(4-马来酰亚胺基苯氧基)丙基]三甲铵(v)。
4.权利要求1所述溴化1-[3-(4-马来酰亚胺基苯氧基)丙基]三甲铵作为含有巯基的化合物的衍生试剂的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述溴化1-[3-(4-马来酰亚胺基苯氧基)丙基]三甲铵与含有巯基的化合物的摩尔比为3∶1。
6.权利要求1所述溴化1-[3-(4-马来酰亚胺基苯氧基)丙基]三甲铵在含有巯基的化合物的质谱检测中的应用。
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