PT1425586E

PT1425586E - Marcadores de massa

Info

Publication number: PT1425586E
Application number: PT02767650T
Authority: PT
Inventors: Andrew Hugin Thompson; Jurgen Schafer; Karsten Kuhn; Josef Schwarz; Thomas Neumann; Christian Hamon
Original assignee: Electrophoretics Ltd
Priority date: 2001-09-14
Filing date: 2002-09-16
Publication date: 2007-12-31
Also published as: CA2460131C; DE60223696T2; DK1425586T3; JP4290003B2; EP1425586B1; WO2003025576A3; DE60223696D1; JP2005503557A; ES2296996T3; EP1425586A2; US7732378B2; US20050048489A1; WO2003025576A2; CA2460131A1

Description

DESCRIÇÃO "MARCADORES DE MASSA" A presente invenção refere-se a compostos úteis para a marcação de moléculas de interesse, particularmente biomoléculas, tais como péptidos e proteínas. Especificamente, esta invenção refere-se á marcação de analitos para detecção por espectrometria de massa e a métodos associados para análise de analitos de massa com marcação por espectrometria de massa. Vários métodos de marcação de moléculas de interesse são conhecidos na técnica, incluindo átomos radioactivos, corantes fluorescentes, reagentes luminescentes, reagentes de captura de electrões e corantes de absorção de luz. Cada destes sistemas de marcação tem características que os tornam adequados para determinadas aplicações e não outras. Por razões de segurança, o interesse em sistemas de marcação não radioactivos leva à dispersão do desenvolvimento comercial de esquemas de marcação fluorescente, particularmente para análise genética. Os esquemas de marcação fluorescente permitem a marcação simultanêa de um número relativamente pequeno de moléculas, tipicamente podem ser utilizadas 4 marcas simultaneamente e, possivelmente, até oito. Contudo, os custos do dispositivo de detecção e as dificuldades em analisar os sinais resultantes limitam o número de marcas que podem ser utilizadas simultaneamente num esquema de detecção fluorescente. 1

Mais recentemente tem havido desenvolvimento na área da espectrometria de massa como um método de detectar marcas que estão ligadas de forma clivável à sua molécula de interesse associada. Em muitas aplicações da biologia molecular, é necessário ter capacidade para efectuar separações das moléculas de interesse antes da análise. Estas são, geralmente, separações de fase liquida. A espectrometria de massa, nos últimos anos, desenvolveu várias interfaces de separações de fase liquida que fazem a espectrometria de massa particularmente eficaz como um sistema de detecção para estes tipos de aplicações. Até recentemente, foi utilizada Espectrometria de Massa por Cromatografia Liquida para detectar directamente iões analitos ou os seus fragmentos de iões, contudo, para muitas aplicações, tal como a análise de ácidos nucleicos, a estrutura do analito pode ser determinada a partir de marcação indirecta. Isto é vantajoso, particularmente em relação à utilização da espectrometria de massa porque biomoléculas complexas, tal como o ADN, possuem espectros de massa complexos e são detectados com uma sensibilidade relativamente pobre. A detecção indirecta significa que uma molécula de marcador associada pode ser utilizada para identificar o analito original, em que o marcador é concebido para uma detecção sensível e com um espectro de massa único. Um espectro de massa único significa que podem ser utilizadas múltiplos marcadores para analisar múltiplos analitos, simultaneamente. 0 documento PCT/GB98/00127 descreve matrizes de sondas de ácido nucleico covalentemente ligadas a marcadores cliváveis que são detectáveis por espectrometria de massa que identificam a sequência da sonda de ácido nucleico covalentemente ligada. As sondas marcadas deste pedido possuem a estrutura Nu-L-M em que Nu é um ácido nucleico covalentemente ligado a L, um ligante 2 clivável, covalentemente ligado a M, um marcador de massa. Os ligantes cliváveis neste pedido, clivam na fonte de iões do espectrómetro de massa. Os marcadores de massa preferidos são éteres de poli-arilo substituídos. Este pedido revela uma variedade de métodos de ionização e análise através de analisadores de massa quadrupolos, analisadores TOF e instrumentos do sector magnético como métodos específicos de análise de marcadores de massa por espectrometria de massa. 0 documento PCT/GB94/01675 revela ligandos, e especificamente ácidos nucleicos, ligados de forma clivável a moléculas de marca de massa. Os ligantes cliváveis preferidos são foto-cliváveis. Este pedido revela a espectrometria de massa "Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) Time of Flight (TOF)" como um método específico de analisar marcadores de massa por espectrometria de massa. 0 documento PCT/US97/22639 revela moléculas libertáveis não voláteis marcadoras de massa. Em formas de realização preferidas, estas marcas compreendem polímeros, tipicamente biopolímeros que estão ligados de forma clivável a um grupo ou ligando reactivo, i. e., uma sonda. Os ligantes cliváveis preferidos parecem ser quimicamente ou enzimaticamente cliváveis. Este pedido revela espectrometria de massa MALDI TOF como um método específico de análise de marcadores de massa por espectrometria de massa.

Os documentos PCT/US97/01070, PCT/US97/01046, e PCT/US97/01304 revelam ligandos e, especificamente, ácidos nucleicos, ligados de forma clivável a moléculas de marca de massa. Os ligantes cliváveis preferidos parecem ser quimicamente ou foto-cliváveis. Este pedido revela uma variedade de métodos 3 de ionização e análise por analisadores de massa quadrupolos, analisadores TOF e instrumentos do sector magnético como métodos específicos de análise de marcadores de massa por espectrometria de massa.

Nenhum destes pedidos da técnica anterior menciona a utilização da análise de massa em tandem ou em série, para utilização em análise de marcadores de massa.

Gygi et al. (Nature Biotechnology 17: 994-999, "Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags" 1999) revela a utilização de "marcas de afinidade codificadas por isótopos" para a captura de péptidos a partir de proteínas, para permitir a análise da expressão de proteínas. Neste artigo, os autores descrevem a utilização de um ligante de biotina que é reactivo com tióis, para a captura de péptidos contendo cisteína. Uma amostra de proteínas de uma fonte é feita reagir com o ligante de biotina e clivada com uma endopeptidase. Os péptidos biotinilados contendo cisteína podem então ser isolados em esferas avidinadas para análise subsequente por espectrometria de massa. Podem ser comparadas duas amostras quantitativamente por marcação de uma amostra com o ligante biotina e por marcação da segunda amostra com uma forma deuterada do ligante de biotina. Cada péptido nas amostras é então representado como um par de picos no espectro de massa. A integração dos picos no espectro de massa corresponde a cada marca indica os níveis de expressão relativos do péptido ligado às marcas.

Este método "codificador de isótopo" tem várias limitações. A primeira é a confiança na presença de tióis numa proteína - muitas proteínas não possuem tióis enquanto outras 4 possuem vários. Numa variação deste método, os ligantes podem ser concebidos para reagir com outras cadeias laterais, tal como aminas. Contudo, uma vez que muitas proteínas contêm mais do que um resíduo de lisina, múltiplos péptidos por proteína serão geralmente isolados nesta abordagem. É provável que isto não reduza a complexidade da amostra suficientemente para análise por espectrometria de massa. É provável que uma amostra que contém demasiadas espécies sofra de "supressão de ião", em que determinadas espécies ionizam, de modo preferido, sobre outras espécies que podem normalmente aparecer no espectro de massa numa amostra menos complexa. Em geral, é provável que a captura de proteínas pelas suas cadeias laterais para dar origem a demasiados péptidos por proteína ou algumas proteínas serão, no seu total, ignoradas. A segunda limitação desta abordagem é o método utilizado para comparar os níveis de expressão de proteínas de diferentes amostras. A marcação de cada amostra com uma diferente variação isotópica da marca de afinidade, resulta num pico adicional no espectro de massa para cada péptido em cada amostra. Isto significa que se duas amostras são analisadas em conjunto existirão o dobro do número de picos no espectro. Do mesmo modo, se forem analisadas três amostras em conjunto, o espectro será três vezes mais complexo do que para uma amostra isolada. É óbvio que esta abordagem será limitada, uma vez que o número sempre crescente de picos aumentará a probabilidade de dois péptidos diferentes possuírem picos sobrepostos no espectro de massa.

Uma outra limitação que é reportada pelos autores do artigo acima, é a alteração de mobilidade caEUAda pelos marcadores. Os autores reportam que péptidos marcados com um marcador de 5 biotina deuterada eluem suavemente após os mesmos péptidos marcados com um marcador não deuterado.

Os espectros de massa produzidos para material analito são muito sensíveis aos contaminantes. Essencialmente, qualquer material introduzido no espectrómetro de massa que pode ionizar, aparecerá no espectro de massa. Isto significa que para muitas análises é necessário purificar, cuidadosamente, o analito antes de introduzi-lo no espectrómetro de massa. Para os objectivos de sistemas de elevado processamento para análise indirecta de analitos através de marcadores de massa, seria desejável evitar quaisquer passos desnecessários de preparação de amostra. 0 mesmo é dizer que seria desejável ser capaz de detectar marcadores num fundo de material contaminante e estar determinado de que o pico que é detectado corresponde, na verdade, ao marcador. A técnica anterior não revela métodos ou composições que podem melhorar a proporção entre o sinal e o ruído alcançável em sistemas de detecção baseados em espectrometria de massa ou que podem proporcionar confirmação de que um pico de massa num espectro foi provocado pela presença de um marcador de massa.

Para os objectivos da detecção de analitos após cromatografia líquida ou separações electroforéticas é desejável que os marcadores utilizados interfiram minimamente com o processo de separação. Se é utilizada uma sequência desses marcadores, é desejável que o efeito de cada membro da sequência no seu analito associado seja a mesma que em qualquer outro marcador. Isto entra em conflito, até determinado ponto, com a intenção da marcação de massa que é de criar sequências de marcadores que são possíveis de resolver no espectrómetro de massa com base na sua massa. É revelado na técnica anterior que 6 os marcadores de massa devem, de um modo preferido, ser resolvidos por 4 Daltons para evitar a interferência de picos isotópico de um marcador com os de outro marcador. Isto significa que para criar 250 marcadores de massa distintos seria necessário que os marcadores se estendam ao longo de um intervalo de cerca de 1000 Daltons e provavelmente mais, uma vez que não é trivial criar grandes sequências de marcadores separados por exactamente 4 Daltons. Este intervalo de massa irá, quase determinadamente resultar em marcadores de massa que irão temr um efeito distinto em qualquer processo de separação que anteceda a detecção por espectrometria de massa. Também tem implicações na concepção do instrumento, na medida em que à medida que o intervalo de massa ao longo do qual o espectrómetro de massa pode detectar iões aumenta, o custo do instrumento aumenta. É por isso um objectivo desta invenção resolver os problemas associados à técnica anterior acima referida e proporcionar marcadores de massa que podem ser detectados num fundo de contaminação e cuja identidade como marcadores de massa possa ser confirmada. Além disso, é um objectivo desta invenção proporcionar sequências de marcadores que podem ser resolvidos num intervalo de massa comprimido, de modo a que os marcadores não interfiram tanto com os processos de separação e que possam ser detectados facilmente num espectrómetro de massa que detecta iões ao longo de um intervalo limitado de proporções de massa em relação à carga. É também um objectivo desta invenção proporcionar métodos para analisar biomoléculas que exploram os marcadores da invenção para maximizar o rendimento, proporções de sinal para 7 ruído e a sensibilidade desses ensaios, particularmente para a análise de péptidos.

Num primeiro aspecto, a invenção proporciona um conjunto de dois ou mais marcadores de massa, cada marcador no conjunto compreendendo, uma unidade de marcador de massa ligada através de, pelo menos, uma ligação amida a uma unidade de normalização de massa, em que a massa agregada de cada marcador no conjunto pode ser a mesma ou diferente e a massa da unidade do marcador de massa de cada marcador no conjunto pode ser a mesma ou diferente e em que o conjunto compreende um grupo de marcadores tendo uma unidade de marcador de massa de uma massa comum, ou o conjunto compreende um grupo de marcadores tendo uma massa agregada comum, e em que qualquer grupo de marcadores no conjunto tendo uma unidade de marcador de massa de uma massa comum, cada marcador tem uma massa agregada diferente de todos os outros marcadores nesse grupo, e em que qualquer grupo de marcadores no conjunto tendo uma massa diferente de todas as outras unidades de marcador de massa nesse grupo, de modo a que todos os marcadores de massa no conjunto sejam distinguíveis uns dos outros através de espectrometria de massa e em que a unidade de marcador de massa compreende um aminoácido e a unidade de normalização de massa compreende um aminoácido. 0 termo unidade de marcador de massa, utilizado no presente contexto, pretende referir-se a uma unidade que deve ser detectada por espectrometria de massa, enquanto o termo unidade de normalização de massa utilizado no presente contexto pretende referir-se a uma unidade que não é necessariamente detectada por espectrometria de massa, mas está presente para assegurar que um marcador de massa tem uma massa agregada desejada. 0 número de marcadores no conjunto não está especialmente limitado, desde que o conjunto compreenda uma pluralidade de marcadores. Todavia, é preferido que o conjunto compreenda dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, ou cinco ou mais marcadores. A presente invenção também proporciona uma sequência de marcadores de massa, compreendendo dois ou mais conjuntos de marcadores de massa como definido acima, em que a massa agregada de cada marcador de massa em qualquer conjunto é diferente da massa agregada de cada marcador de massa em cada outro conjunto na sequência. A unidade de marcador de massa e a unidade de normalização de massa compreendem ambas, pelo menos, um aminoácido. Todavia, as unidades podem compreender outros grupos, se desejado, tais como mais grupos de aminoácidos e/ou grupos de éter de arilo. Assim, as unidades podem ser aminoácidos modificados ou podem ser péptidos. As massas dos conjuntos diferentes na sequência podem ser distinguíveis adicionando outros grupos de aminoácidos a qualquer uma ou a ambas as unidades, como desejado. É ainda proporcionado pela invenção um método de análise, cujo método compreende detectar um analito através da identificação por espectrometria de massa, um marcador de massa ou uma combinação de marcadores de massa únicos para o analito, em que o marcador de massa é um marcador de massa de um conjunto ou uma sequência de marcadores de massa como definido acima.

Em determinadas formas de realização desta invenção, as etiquetas de massa podem compreender funcionalidades reactivas que facilitam a ligação das etiquetas de massa às moléculas de analito. As etiquetas nesta forma de realização são, de um modo preferido, da seguinte forma: 9 aminoácido 1 -ligação amida - aminoácido 2 - funcionalidade reactiva em que a unidade de marcador de massa e a unidade de normalização de massa podem, cada, ser o aminoácido 1 ou o aminoácido 2.

Em formas de realização preferidas da invenção, a sequência das etiquetas são, de um modo preferido, todas quimicamente idênticas e as massas das unidades de normalização de massa e marcador de massa (e. g., aminoácido 1 e aminoácido 2, acima) são alteradas por substituições com isótopos.

Noutras formas de realização preferidas, as etiquetas podem compreender um grupo de aumento da intensidade. As etiquetas estão, de um modo preferido, na forma: grupo de aumento de sensibilidade - aminoácido 1 - ligação amida - aminoácido 2 - funcionalidade reactiva

Neste exemplo, o grupo de aumento da sensibilidade está normalmente ligado à unidade de marcador de massa, uma vez que se pretende aumentar a sensibilidade da detecção desta unidade no espectrómetro de massa. A funcionalidade reactiva é apresentada como estando presente e ligada a uma unidade diferente do grupo de aumento de sensibilidade. Todavia, as etiquetas não têm que estar limitadas deste modo e, em alguns casos, compreendem o grupo de aumento de sensibilidade sem a funcionalidade reactiva. Noutras formas de realização, o grupo de aumento de sensibilidade pode estar ligado à mesma unidade que a funcionalidade reactiva. 10

Em determinadas formas de realização da invenção, as etiquetas de massa compreendem um reagente de captura de afinidade. De um modo preferido, o ligando de captura de afinidade é a biotina. 0 ligando de captura de afinidade permite que os analitos marcados sejam separados dos analitos não marcados, capturando-os, e. g., numa fase sólida avidinada.

Noutro aspecto, a invenção proporciona um método de analisar uma biomolécula ou uma mistura de biomoléculas. Este método, de um modo preferido, compreende os passos de: 1. Reagir a biomolécula ou mistura de biomoléculas com um marcador de massa de acordo com esta invenção; 2. Opcionalmente, separar a biomolécula marcada, electroforeticamente ou cromatograficamente; 3. Ionizar a biomolécula marcada; 4. Seleccionar iões de uma proporção de massa para carga predeterminada, correspondendo à proporção de massa para carga dos iões preferidos da biomolécula marcada num analisador de massa; 5. Induzir a dissociação destes iões seleccionados por colisão; 6. Detectar os produtos de colisão para identificar os iões do produto de colisão que são indicadores dos marcadores de massa. 11

Nesta forma de realização, em que as etiquetas de massa compreendem uma etiqueta de afinidade, as biomoléculas etiquetadas por afinidade podem ser capturadas por um contra-ligando, para permitir que as biomoléculas marcadas sejam separadas das biomoléculas não marcadas. Este passo ocorre, de um modo preferido, antes do segundo passo opcional acima.

Em determinadas formas de realização, o passo de seleccionar os iões de uma proporção de massa para carga predeterminada é realizado no primeiro analisador de massa de um instrumento em série. Os iões seleccionados são então canalizados para uma célula de colisão separada, onde são colididos com uma superfície gasosa ou sólida, de acordo com o quarto passo do primeiro aspecto da invenção. Os produtos de colisão são depois canalizados para outro analisador de massa de um instrumento em série para detectar produtos de colisão de acordo com o quinto passo do primeiro aspecto desta invenção. Instrumentos em série típicos, incluem espectrómetros de massa de quadrupolo triplo, instrumentos de sector em tandem e espectrómetros de massa de quadrupolo tempo de voo.

Noutras formas de realização, o passo de seleccionar os iões de uma proporção de massa para carga predeterminada, o passo de colidir os iões seleccionados com um gás e o passo de detectar os produtos de colisão são realizados na mesma zona do espectrómetro de massa. Isto pode ser realizado em analisadores de massa de captura iónica e espectrómetros de massa de Ressonância de Ciclotrão Iónico de Transformada de Fourier, por exemplo. 12

Noutro aspecto, Esta invenção proporciona conjuntos ou sequências de moléculas marcadas com massa da forma: analito - ligando - marcador em que o marcador é um marcador de massa de um conjunto ou sequência, de acordo com esta invenção, o ligante é um ligante como descrito abaixo e o analito pode ser qualquer analito de interesse, tal como uma biomolécula. Um aspecto preferido desta forma de realização é quando os analitos (um, mais do que um, ou mesmo todos os analitos) no conjunto ou sequência são analitos padrão, com uma massa conhecida ou com propriedades cromatográficas predeterminadas. Esses padrões podem ser empregues nos métodos da presente invenção para comparação com analitos desconhecidos, por exemplo, quando se analisam os resultados de um passo de separação cromatográfico.

Esta invenção descreve marcadores de massa que podem ser rapidamente produzidos num sintetizador de péptidos. Na verdade, os compostos utilizados nesta invenção compreendem péptidos e péptidos modificados. A síntese de péptidos proporciona diversidade química, permitindo que seja produzida uma vasta gama de marcadores com propriedades seleccionadas, de um modo automatizado. 0 termo "MS/MS", no contexto de espectrómetros de massa, refere-se a espectrómetros de massa capazes de seleccionar iões, submetendo os iões seleccionados a Dissociação Induzida por Colisão (CID) e submetendo os iões do fragmento a análise adicional. 13 0 termo "instrumento em série" refere-se a espectrómetros de massa capazes de MS/MS nos quais os analisadores de massa são organizados em série e cada passo do processo de MS/MS é realizado um após o outro em analisadores de massa ligados. Instrumentos em série típicos incluem espectrómetros de massa de triplo quadrupolo, instrumentos de sector em tandem e espectrómetros de massa de tempo de voo quadrupolo. A invenção será agora descrita em maior detalhe, apenas a título de exemplo, com referência aos desenhos que a acompanham, em que: A Figura 1 apresenta um conjunto de 3 etiquetas de massa derivadas de lisina; A Figura 2 apresenta um conjunto de 5 etiquetas de massa derivadas de alanina; A Figura 3 apresenta um conjunto de 5 etiquetas de massa derivadas de alanina e tirosina; A Figura 4 apresenta um conjunto de 4 etiquetas de massa de formas fluoradas de fenilglicina; A Figura 5 apresenta um conjunto de 4 etiquetas de massa derivadas de formas fluoradas de fenilglicina e fenilalanina; A Figura 6a apresenta um conjunto de 2 etiquetas de massa de ligando de afinidade derivadas de metionina com uma funcionalidade hidrazida para marcar carbo-hidratos; 14 A Figura 6b apresenta um conjunto de 2 etiquetas de massa de ligando de afinidade derivadas de metionina com uma funcionalidade de ácido borónico para marcar carbo-hidratos; A Figura 7 apresenta um conjunto de 2 etiquetas de massa de ligando de afinidade derivadas de metionina com uma funcionalidade tiol para marcar resíduos de desidroalanina e metildesidroalanina; A Figura 8 apresenta um conjunto de 2 etiquetas de massa de ligando de afinidade derivadas de metionina com uma funcionalidade maleimida para marcar tióis livres; A Figura 9a apresenta uma via sintética para a preparação de um resíduo de metionina deuterado, protegido com FMOC e a Figura 9b apresenta uma via sintética para a preparação de um ligante reactivo que pode actuar como uma intensificador de sensibilidade; A Figura 10 apresenta um par de péptidos de exemplo derivados de formas isotópicas diferentes de metionina sintetizadas para demonstrar as características desta invenção; A Figura 11 apresenta um espectro de massa por electroaspersão de uma mistura dos dois péptidos apresentados na Figura 10; A Figura 12 apresenta um espectro de massa por electroaspersão da fragmentação de cada dos dois péptidos apresentados na Figura 10; 15 A Figura 13 apresenta um mecanismo de fragmentação hipotético que é provável que seja responsável pelos espectros apresentados nas Figuras 12 e 14; A Figura 14 apresenta um espectro de electroaspersão da fragmentação de uma mistura 70:30 dos dois péptidos apresentados na Figura 10; A Figura 15 apresenta um gráfico apresentando as proporções esperadas dos péptidos A e B (Figura 10) contra proporções observadas dos péptidos A e B encontrados numa série de análises ESI-MS/MS de misturas de A e B;

As Figuras 16a-16c apresentam mecanismos de fragmentação propostos;

As Figuras 17a-17d ilustram etiquetas que exploram o aumento da clivagem na ligação amida clivável;

As Figuras 18a e 18b apresentam as estruturas de duas versões dos marcadores TMT;

As Figuras 19a e 19b apresentam espectros CID típicos para um péptido marcado com TMT de primeira geração nas energias de colisão de 40 V (Figura 19a) e 70V (Figura 19b);

As Figuras 20a, 20b e 20c apresentam espectros de MS e MS/MS para iões de carga tripla do péptido 2 (ver Tabela 7) marcados com os TMT de primeira e segunda geração; A Figura 21 apresenta um espectro CID típico para um péptido (péptido 2 na Tabela 7) marcado com um TMT de segunda geração; 16 A Figura 22 demonstra que o estado da carga do péptido marcado com TMT não afecta o aspecto dos fragmentos de etiqueta nos espectros CID dos péptidos marcados; A Figura 23 apresenta a co-eluição de cada par de péptidos, os péptidos A e B para cada péptido da Tabela 7; A Figura 25 apresenta um estudo de intervalo dinâmico dos pares de péptido TMT 3A/3B que estão presentes numa proporção de 40:60 e foram analisados nas diluições no intervalo desde 100 fmole até 100 pmole;

As Figuras 26a, 26b e 26c apresentam os resultados de uma experiência de repicagem na qual os pares de péptidos 3A e 3B (500 fmol no total, numa proporção de 40:60, respectivamente) comportando um TMT de segunda geração foi misturado com uma digestão triptica de Albumina de Soro Bovino (2 pmol).

As Figuras 1 a 5 ilustram as caracteristicas importantes das etiquetas desta invenção. As etiquetas em todas as figuras 1 a 5 são apresentadas ligadas a uma "funcionalidade reactiva" que poderia ser um ligante para um éster de N-hidroxissuccinimida, por exemplo, ou qualquer uma de várias outras possibilidades, algumas das quais são discutidas abaixo. As Figuras 1, 2 e 4 demonstram que podem ser criadas várias etiquetas combinando diferentes formas modificadas de massa do mesmo aminoácido numa série de dipéptidos. As Figuras 3 e 5 apresentam conjuntos de etiquetas que são criadas combinando diferentes aminoácidos em heterodimeros. As Figuras 1 a 3 ilustram etiquetas que possuem todas a mesma massa total e que são quimicamente idênticas. Estas etiquetas diferem na distribuição de isótopos nas moléculas, enquanto que as Figuras 4 e 5 que possuem todas a 17 mesma massa total, mas que não são quimicamente idênticas, estas etiquetas diferem na distribuição de substituintes de flúor nas etiquetas. A Figura 1 será agora discutida em maior detalhe. A Figura 1 apresenta 3 homodimeros de lisina. A lisina foi bloqueada nos grupos amino épsilon com cloreto de metilsulfonilo. A ligação sulfonamida é mais resistente à fragmentação do que uma ligação amida convencional, de modo a que o grupo de protecção não se perca quando a etiqueta é fragmentada num espectrómetro de massa utilizando dissociação induzida por colisão a energias suficientes para clivar a ligação amida de estrutura convencional entre o par de residuos de lisina modificada. 0 grupo de protecção é utilizado para inibir a protonação na posição épsilon durante a ionização das etiquetas num espectrómetro de massa. A lisina protegida pode ser preparada antes da sintese das etiquetas de massa. 0 grupo amino épsilon pode ser modificado selectivamente acoplando o aminoácido com cloreto de metilsulfonilo na presença de iões de cobre, por exemplo. As funcionalidades de amina e ácido na posição alfa podem formar quelatos com vários catiões divalentes tornando o grupo amino alfa não reactivo. 0 grupo amino alfa do dipéptido foi convertido num grupo guanidino para promover a protonação nesta posição na etiqueta durante a ionização num espectrómetro de massa e para diferenciar a massa do produto de fragmentação do segundo residuo de alanina e residuos de alanina natural na proteína. A guanidinação da posição alfa pode ser realizada como o último passo de uma síntese de péptidos convencional antes da desprotecção do péptido e clivagem da resina (Z. Tian e R. W. Roeske, Int. J. Peptide Protein Res. 37: 425-429, "Guanidination of a peptide side chain amino group on a solid support", 1991). Formas diferentes de lisina deuterada seriam úteis para preparar 18 as três etiquetas diferentes. A massa total de cada das três etiquetas é a mesma, mas a lisina N-terminal em cada etiqueta difere das outras duas em, pelo menos, quatro Daltons. Esta diferença de massa é, normalmente, suficiente para evitar picos de isótopos naturais de porções fragmentadas de cada etiqueta de sobreposição no espectro de massa com os picos de isótopo das porções fragmentadas de outras etiquetas. A Figura 2 será agora discutida em maior detalhe. A Figura 2 apresenta 5 homodímeros de alanina. Formas diferentes de alanina isotopicamente substituídas seriam úteis para preparar as cinco etiquetas diferentes. A massa total de cada das cinco etiquetas é a mesma, mas a alanina N-terminal em cada etiqueta difere uma da outra em, pelo menos, um Dalton. 0 grupo amino alfa da etiqueta de dipéptido foi metilado para diferenciar o produto de fragmentação deste aminoácido do produto de fragmentação do segundo resíduo de alanina e os resíduos de alanina naturais na proteína e para promover a protonação nesta posição na etiqueta durante a ionização num espectrómetro de massa. A Figura 3 será agora discutida em maior detalhe. Formas diferentes de alanina isotopicamente substituídas seriam úteis para preparar as cinco etiquetas diferentes. A massa total de cada das cinco etiquetas é a mesma, mas a alanina N-terminal em cada etiqueta difere uma da outra em, pelo menos, um Dalton. 0 grupo amino alfa da etiqueta de dipéptido foi metilado para diferenciar o produto de fragmentação deste aminoácido dos produtos de fragmentação dos resíduos de alanina naturais na proteína e para promover a protonação nesta posição na etiqueta durante a ionização num espectrómetro de massa. 19 A Figura 4 será agora discutida em maior detalhe. A Figura 4 apresenta 4 dimeros de fenilglicina. Formas de fenilglicina diferentes substituídas com flúor seriam úteis para preparar as 4 etiquetas diferentes. A massa total de cada das 4 etiquetas é a mesma, mas a fenilglicina N-terminal em cada etiqueta difere das outras 3 etiquetas pela massa de, pelo menos, um átomo de flúor. 0 grupo amino alfa da etiqueta de dipéptido foi metilado para diferenciar o produto de fragmentação deste aminoácido a partir do produto de fragmentação do segundo resíduo de fenilglicina e para promover a protonaçâo nesta posição na etiqueta durante a ionização num espectrómetro de massa. A Figura 5 será agora discutida em maior detalhe. A Figura 5 apresenta 4 dimeros compreendendo fenilglicina e fenilalanina. Serão utilizadas formas diferentes de fenilglicina e fenilalanina substituídas de flúor para preparar as 4 etiquetas diferentes. A massa total de cada das 4 etiquetas é a mesma, mas a alanina N-terminal em cada etiqueta difere das outras 3 etiquetas pela massa de, pelo menos, um átomo de flúor. 0 grupo amino alfa da etiqueta de dipéptido foi metilada, embora isto sirva apenas para proteger o grupo amino das reacções laterais e para aumentar a protonaçâo, na medida em que não é necessário diferenciar o primeiro aminoácido, uma vez que o produto de fragmentação sem metilação seria diferente do segundo resíduo de aminoácido do péptido etiqueta. 0 grupo amino alfa pode ser modificado para promover a protonaçâo nesta posição na etiqueta durante a ionização num espectrómetro de massa através de metilação ou guanidinação se isto for desejável. A presente invenção será agora descrita em maior detalhe. Numa forma de realização preferida, a presente invenção proporciona um conjunto de marcadores de massa como definido 20 acima, em que cada marcador no conjunto tem uma unidade marcador de massa tendo uma massa comum e cada marcador no conjunto tem uma massa agregada única.

Numa forma de realização alternativa, mais preferida, cada marcador no conjunto tem uma massa agregada comum e cada marcador no conjunto tem uma unidade de marcador de massa de uma massa única. 0 conjunto de marcadores não necessita de estar limitado às duas formas de realização preferidas descritas acima e pode, por exemplo, compreender marcadores de ambos os tipos, desde que todos os marcadores sejam distinguíveis por espectrometria de massa, como referido acima.

De um modo preferido, num conjunto de marcadores do segundo tipo, cada unidade de marcador de massa no conjunto tem uma estrutura básica comum e cada unidade de normalização de massa no conjunto tem uma estrutura básica comum, e cada marcador de massa no conjunto compreende uma ou mais unidades de ajustador de massa, estando as unidades de ajustador de massa ligadas ou situadas na estrutura básica da unidade de marcador de massa e/ou na estrutura básica da unidade de normalização de massa. Nesta forma de realização, cada unidade de marcador de massa no conjunto compreende um número diferente de unidades de ajustador de massa e cada marcador de massa no conjunto tem o mesmo número de unidades de ajustador de massa.

Ao longo desta descrição, por estrutura básica comum, entende-se que duas ou mais unidades partilham uma estrutura que tem substancialmente o mesmo esqueleto estrutural, coluna dorsal ou núcleo. Este esqueleto ou coluna dorsal pode, por exemplo, 21 compreender um ou mais aminoácidos. De um modo preferido, o esqueleto compreende vários aminoácidos ligados por ligações amida. Todavia, outras unidades, tais como unidades de éter de arilo também podem estar presentes. 0 esqueleto ou coluna dorsal pode compreender substituintes pendentes deste ou substituições atómicas ou isotópicas neste, sem alterar a estrutura básica comum.

Tipicamente, um conjunto de marcadores de massa do segundo tipo referido acima compreende marcadores de massa com a fórmula: Μ (A) y-L-X (A) z em que M é a unidade de normalização de massa, X é a unidade de marcador de massa, A é uma unidade de ajustador de massa, L é o ligante clivável compreendendo a ligação amida, y e z são inteiros de 0 ou superior e y+z é um inteiro de 1 ou superior. De um modo preferido, M é um grupo resistente de fragmentação, L é um ligante que é susceptivel a fragmentação em colisão com outra molécula ou átomo e X é, de um modo preferido, um grupo resistente à fragmentação, pré-ionisado. A soma das massas de M e X é a mesma para todos os membros do conjunto. De um modo preferido, M e X possuem a mesma estrutura básica ou estrutura do núcleo, sendo esta estrutura modificada pelas unidades de ajustador de massa. A unidade de ajustador de massa assegura que a soma das massas de M e X é a mesma para todos os marcadores de massa num conjunto, mas assegura que cada X tem uma massa distinta (única) . A presente invenção também compreende sequências de uma pluralidade de conjuntos de marcadores de massa. As sequências de marcadores de massa da presente invenção não estão 22 particularmente limitadas, desde que contenham uma pluralidade de conjuntos de marcadores de massa, de acordo com a presente invenção. É preferido que as sequências compreendam dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, ou cinco ou mais conjuntos de marcadores de massa. De um modo preferido, cada marcador de massa na sequência tem qualquer das seguintes estruturas: (S)x-M(A)y-L-X(A)z Μ (A) y- (S) x-L-X (A) z em que S é um grupo de modificação de série de massa, M é a unidade de normalização de massa, X é a unidade de marcador de massa, A é a unidade de ajustador de massa, L é o ligando clivável compreendendo a ligação amida, x é um inteiro de 0 ou superior, y e z são inteiros de 0 ou superior e y+z é um inteiro de 1 ou superior. 0 grupo de modificação de série de massa separa as massas dos conjuntos umas das outras. Este grupo pode ser qualquer tipo de grupo, mas é, de um modo preferido, um aminoácido, ou grupo éter de arilo. Os conjuntos podem ser separados em massa, compreendendo um número diferente de aminoácidos nas suas unidades em ralação a outras etiquetas de conjuntos diferentes.

Grupos Ligantes

Na discussão acima e abaixo, é feita referência a grupos ligantes que podem ser utilizados para ligar moléculas de interesse aos compostos de marcador de massa desta invenção. É conhecida na técnica uma variedade de ligandos que podem ser introduzidos entre os marcadores de massa desta invenção e o seu 23 analito covalentemente ligado. Alguns destes ligantes podem ser cliváveis. Podem ser utilizados oligo- ou poli-etilenoglicóis ou seus derivados como ligandos, tais como aqueles revelados em Maskos, U. & Southern, E.M. Nucleic Acids Research 20: 1679-1684, 1992. São também largamente utilizados ligantes baseados em ácido succinico, embora estes sejam menos preferidos para aplicações envolvendo a marcação de oligonucleótidos na medida em que são normalmente lábeis de base e são desse modo incompatíveis com os passos de desprotecção mediados por base utilizados em vários sintetizadores de oligonucleótidos. O álcool propargílico é um ligante bifuncional que proporciona uma ligação que é estável nas condições de síntese de oligonucleótidos e é um ligante preferido para utilização com esta invenção em relação com aplicações de oligonucleótido. Do mesmo modo, o 6-amino-hexanol é um reagente bifuncional útil para ligar moléculas, apropriadamente, funcionalizadas e é também um ligante preferido.

Pode ser utilizada uma variedade de grupos de ligante clivável conhecido, em conjunção com os compostos desta invenção, tais como ligantes fotocliváveis. Os grupos orto-nitrobenzilo são conhecidos como ligantes fotocliváveis, particularmente ésteres de 2-nitrobenzilo e 2-nirobenzilaminas que clivam na ligação benzilamina. Para uma revisão sobre ligantes cliváveis ver Lloyd-Williams et al., Tetrahedron 49, 11065-11133, 1993 que cobre uma variedade de ligantes fotocliváveis e quimicamente cliváveis. 0 documento WO 00/02895 revela os compostos de sulfona de vinilo como ligantes cliváveis que são também aplicáveis para 24 utilização com esta invenção, particularmente, em aplicações envolvendo a marcação de polipéptidos, péptidos e aminoácidos. 0 documento WO 00/02895 revela a utilização de compostos de silício como ligantes que são cliváveis pela base na fase gasosa. Estes ligantes são também aplicáveis para utilização com esta invenção, particularmente em aplicações envolvendo a marcação de oligonucleótidos.

Foi mencionado acima que os marcadores de massa da presente invenção podem compreender funcionalidades reactivas, Re, para auxiliar a sua ligação aos analitos. Em formas de realização preferidas da presente invenção, Re é uma funcionalidade reactiva ou grupo que permite que o marcador de massa seja feito reagir covalentemente com um grupo funcional apropriado numa molécula de analito, tal como, mas não limitado a, um oligonucleótido de nucleótidos, polinucleótido, aminoácido, péptido ou polipéptido. Re pode ser ligado aos marcadores de massa através de um ligante que pode ser ou não clivável. Podem ser introduzidas uma variedade de funcionalidades reactivas nos marcadores de massa desta invenção. A Tabela 1 abaixo lista algumas funcionalidades reactivas que podem ser feitas reagir com funcionalidades nucleofílicas que são encontradas em biomoléculas para criar uma ligação covalente entre as duas entidades. Para aplicações envolvendo oligonucleótidos sintéticos são, frequentemente, introduzidas aminas primárias ou tióis nos terminais das moléculas para permitir a marcação. Qualquer das funcionalidades listadas abaixo pode ser introduzida nos compostos desta invenção para permitir que os marcadores de massa sejam ligados a uma molécula de interesse. Pode ser utilizada uma funcionalidade reactiva 25 para introduzir outros grupos ligantes com uma outra funcionalidade reactiva se isso é desejado. A Tabela 1 não pretende ser exaustiva e a presente invenção não está limitada à utilização apenas das funcionalidades listadas.

Tabela 1

Funci onalidade Nucleofílica Funcionalidade Reactiva Grupo de Ligação Resultante -SH -so2-ch=cr2 -s-cr2-ch2-so2- -nh2 -so2-ch=cr2 -N(CR2-CH2-S02)2 ou -nh-cr2-ch2-so2- -nh2 0 8 K —C—0—N Y 0 -CO-NH- -nh2 0 II A —C—0—N SN δ -CO-NH- -nh2 -NCO -NH-CO-NH -nh2 -NCS -NH-CS-NH- -nh2 -CHO -ch2-nh -nh2 -S02C1 -so2-nh- -nh2 -CH=CH- -nh-ch2-ch2- -OH -OP(NCH(CH3)2)2 -0P(=0) (0)0-

Deve ser salientado que nas aplicações que envolvem a marcação de oligonucleótidos com os marcadores de massa desta 26 invenção, algumas das funcionalidades reactivas acima ou dos seus grupos de ligação resultantes podem ter que ser protegidas antes da introdução num sintetizador de oligonucleótidos. De um modo preferido, devem ser evitadas ligações éster não protegidas, tioéter e tioésteres, amina e amida, na medida em que estas não são normalmente estáveis num sintetizador de oligonucleótidos. É conhecida na técnica uma vasta variedade de grupos protectores que podem ser utilizados para proteger ligações de reacções colaterais indesejadas.

Na discussão abaixo é feita referência a "funcionalidades comportando carga" e grupos de solubilização. Estes grupos podem ser introduzidos nos marcadores de massa, tais como nos marcadores de massa da invenção para promover a ionização e solubilidade. A escolha dos marcadores está dependente de ser utilizada detecção de iões positivos ou negativos. A Tabela 2 abaixo lista algumas funcionalidades que podem ser introduzidas nos marcadores de massa para promover ionização positiva ou negativa. A tabela não pretende ser uma lista exaustiva, e a presente invenção não está limitada a uma utilização apenas das funcionalidades listadas. 27

Tabela 2

Modo de Ião Positivo Modo de Ião Negativo -nh2 -so3" -nr2 0 CM 1 -nr3+ -P03" K —N-C H nh2 1 o o -sr2+ 0 documento WO 00/02893 revela a utilização de unidades de ligação metal-ião, tais como éteres de coroa ou porfirinas para o objectivo de melhorar a ionização de marcadores de massa. Estas unidades também são aplicáveis para utilização com os marcadores de massa desta invenção.

Os componentes dos marcadores de massa desta invenção são, de um modo preferido, resistentes à fragmentação, de modo a que o sitio de fragmentação desses marcadores pode ser controlado pela introdução de uma ligação que é facilmente partida por Dissociação Induzida por Colisão (CID). Éteres de arilo são um exemplo de uma classe de compostos resistentes à fragmentação que também podem ser utilizados nesta invenção. Estes compostos também são quimicamente inertes e termicamente estáveis. O documento WO 99/32501 discute a utilização de poli-éteres em espectrometria de massa em maior detalhe. 28

No passado, o método geral para a síntese de éteres de arilo foi baseado no acoplamento de Ullmann de arilbrometos com fenóis na presença de pó de cobre a cerca de 200 °C (referência representativa: H. Stetter, G. Duve, Chemische Berichte 87 (1954) 1699). Foram desenvolvidos métodos mais moderados para a síntese de éteres de arilo, utilizando um catalisador metálico diferente, mas a temperatura de reacção está ainda entre 100 e 120 °C. (M. Iyoda, M. Sakaitani, H. Otsuka, M. Oda, Tetrahedron Letters 26 (1985) 477). Esta é uma via preferida para a produção de marcadores de massa de poli-éter. Ver síntese de FT77 descrita nos exemplos abaixo. Um método publicado recentemente proporciona uma via mais preferida para a criação de marcadores de massa de poli-éter, como é realizado em condições muito mais moderadas do que os métodos anteriores (D. E. Evans, J. L. Katz, T. R. West, Tetrahedron Lett. 39 (1998) 2937). A presente invenção também proporciona um conjunto de duas ou mais sondas, sendo cada sonda no conjunto diferente e estando ligada a um marcador de massa único ou uma combinação única de marcadores de massa, de um conjunto ou uma sequência de marcadores de massa, como definido acima. É ainda proporcionada uma sequência de sondas compreendendo dois ou mais conjuntos de sondas, em que cada sonda em qualquer conjunto está ligada a um único marcador de massa, ou uma combinação única de marcadores de massa, a partir de um conjunto de marcadores de massa, como definido acima, e em que as sondas em qualquer um dos conjuntos estão ligadas a marcadores de massa do mesmo conjunto de marcadores de massa e cada conjunto de sondas está ligado a marcadores de massa de conjuntos únicos de marcadores de massa de uma sequência de marcadores de massa, como definido acima. 29

Numa forma de realização, cada sonda está, de um modo preferido, ligada a uma combinação única de marcadores de massa, sendo cada combinação distinguida pela presença ou ausência de cada marcador de massa no conjunto de marcadores de massa e/ou a quantidade de cada marcador de massa ligado à sonda. Isto é denominado "modo de mistura" da presente invenção, uma vez que as sondas podem ser ligadas a uma mistura de marcadores de massa.

Nos aspectos acima, a natureza da sonda não está particularmente limitada. Todavia, de um modo preferido, cada sonda compreende uma biomolécula. Qualquer biomolécula pode ser empregue, mas a biomolécula é, de um modo preferido, seleccionada a partir de um ADN, um ARN, um oligonucleótido, uma base de ácido nucleico, um péptido, um polipéptido, uma proteína e um aminoácido.

Numa forma de realização preferida, esta invenção proporciona conjuntos e sequências de analitos marcados em massa, tais como nucleótidos, oligonucleótidos e polinucleótidos, da forma: analito- ligante -marcador em que o ligante é um ligante como definido acima, e o marcador é um marcador de massa de qualquer dos conjuntos e sequências definidas acima.

No aspecto acima, a natureza do analito não está particularmente limitada. Todavia, de um modo preferido cada analito compreende uma biomolécula. Qualquer biomolécula pode 30 ser empregue, mas a biomolécula é, de um modo preferido, seleccionada a partir de um ADN, um ARN, um oligonucleótido, uma base de ácido nucleico, um péptido, um polipéptido, uma proteína e um aminoácido.

Numa forma de realização, cada analito é, de um modo preferido, ligado a uma combinação única de marcadores de massa, sendo cada combinação distinguida pela presença ou ausência de cada marcador de massa no conjunto de marcadores de massa e/ou a quantidade de cada marcador de massa ligado à sonda. Como mencionado acima, isto é denominado o "modo de mistura" da presente invenção, uma vez que as sondas podem ser ligadas a uma mistura de marcadores de massa.

Como mencionado acima, a presente invenção proporciona um método de análise, cujo método compreende detectar um analito através de identificação por espectrometria de massa um marcador de massa ou uma combinação de marcadores de massa única para o analito, em que o marcador de massa é um marcador de massa de um conjunto ou uma sequência de marcadores de massa, como definido acima. 0 tipo de método não está particularmente limitado, desde que o método beneficie da utilização dos marcadores de massa da presente invenção para identificar um analito. 0 método pode ser, por exemplo, um método de sequenciação de ácido nucleico ou um método de determinar o perfil da expressão de um ou mais genes detectando quantidades de proteína numa amostra. 0 método é especialmente vantajoso, uma vez que pode ser utilizado para analisar rapidamente, em simultanêo uma variedade de analitos. Todavia, o método também tem vantagens para analisar analitos únicos individualmente, uma vez que utilizando os presentes marcadores de massa, são produzidos espectros de massa que são 31 mais limpos do que os aspectos convencionais, tornando o método preciso e sensivel.

Noutra forma de realização preferida, a presente invenção proporciona um método, o qual compreende: (a) colocar em contacto um ou mais analitos com um conjunto de sondas, ou uma sequência de sondas, sendo cada sonda no conjunto ou sequência especifica para, pelo menos, um analito, em que as sondas são como definido acima, (b) identificar um analito, detectando a sonda específica para esse analito.

Nesta forma de realização é preferido que o marcador de massa seja clivado da sonda antes de detectar o marcador de massa por espectrometria de massa. A natureza dos métodos desta forma de realização particular não está especialmente limitada. Todavia, é preferido que o método compreenda colocar em contacto um ou mais ácidos nucleicos com um conjunto de sondas de hibridação. 0 conjunto de sondas de hibridação compreende tipicamente um conjunto até 256 4-meros, tendo cada sonda no conjunto uma combinação diferente de bases de ácido nucleico. Este método pode ser adequado para identificar a presença de ácidos nucleicos alvo, ou alternativamente podem ser utilizados num método passo a passo de sequenciação por extensão do iniciador de um ou mais moldes de ácido nucleico.

Os marcadores de massa da presente invenção são particularmente adequados para utilização nos métodos de análise 32 bidimensional, principalmente devido ao grande número de marcadores de massa que podem ser simultaneamente distinguidos. Os marcadores podem assim ser utilizados num método de electroforese em gel bidimensional, ou num método de espectrometria de massa bidimensional. Síntese de Péptidos A síntese de muitos exemplos das etiquetas de massa do péptido desta invenção será possível utilizando métodos de síntese de péptidos convencionais e reagentes comercialmente disponíveis. Os aminoácidos modificados que não estão comercialmente disponíveis também estão contemplados para a síntese de outras etiquetas de massa de péptidos. A síntese moderna de péptidos é tipicamente realizada em suportes de fase sólida em instrumentos que distribuem todos os reagentes necessários para cada passo de uma síntese de péptidos ao suporte sólido e removem os reagentes gastos e os reagentes em excesso que não reagiram, no final de cada passo no ciclo. A síntese de fase sólida é, todavia, frequentemente realizada manualmente, particularmente quanto estão a ser testados reagentes especiais pela primeira vez. Na sua essência, a síntese de péptidos envolve a adição de aminoácidos N-protegidos ao suporte sólido. 0 péptido é normalmente sintetizado com o grupo carboxilo C-terminal do péptido ligado ao suporte e a sequência do péptido é construída a partir do aminoácido C-terminal para o aminoácido N-terminal. 0 aminoácido C-terminal é acoplado ao suporte através de uma ligação de clivagem. 0 grupo amino N-protegido em alfa de cada aminoácido é desprotegido de modo a permitir a acoplagem do grupo carboxilo 33 ao aminoácido seguinte ao péptido em crescimento no suporte sólido. Para a maioria dos objectivos, a síntese de péptidos é realizada através de um de dois processos sintéticos diferentes que são distinguidos pelas condições necessárias para remover o grupo de N-protecção. 0 grupo terc-butiloxicarbonilo (t-BOC) é clivado por condições acídicas moderadas, e. g., ácido trifluoroacético em diclorometano, enquanto que o grupo fluorenilmetoxicarbonilo (FMOC) é clivado por condições básicos moderadas, e. g., piperidina a 20% em dimetilformamida. As cadeias laterais reactivas nos aminoácidos também necessitam de protecção durante os ciclos de formação de ligação amida. Estas cadeias laterais incluem o grupo amino épsilon da lisina, a cadeia lateral guanidino da arginina, a funcionalidade tiol da cisteína, as funcionalidades hidroxilo da serina, treonina e tirosina, o anel índole do triptofano e o imidazole da histidina. A selecção dos grupos protectores utilizados para protecção de cadeia lateral é determinada pelas condições de clivagem dos grupos de protecção alfa-amino, como os grupos de protecção de cadeia lateral devem ser resistentes às condições de desprotecção utilizadas para remover os grupos de protecção alfa-amino. Um primeiro grupo protector é referido como sendo "ortogonal " em relação a um segundo grupo protector se o primeiro grupo protector é resistente à desprotecção nas condições utilizadas para a desprotecção do segundo grupo protector e se as condições de i desprotecção do primeiro grupo protector não provocarem a desprotecção do segundo grupo protector.

Exemplos de grupos de protecção de cadeia lateral compatíveis com a síntese de FMOC são apresentados na Tabela 3. 34

Tabela 3

Cadeia Lateral Grupo de Protecçâo Grupo amino épsilon da lisina Grupo t-BOC Funcionalidade guanidino da arginina Grupo nitro ou grupo 2,2,5,7,8-pentametilcro-mano-6-sulfonilo Anel imidazole da histidina Grupo τ-tritilo, grupo π benzilmetilo (Bom). Funcionalidades hidroxilo de serina, treonina e tirosina Grupo terc-butilo Anel índole de triptofano t-BOC Funcionalidade tiol da cisteína Grupo tritilo ou benzilo Funcionalidades amida de glutamina e asparagina Normalmente não necessários mas o grupo Tritilo pode ser utilizado, por exemplo. Funcionalidades de ácido carboxílico de ácido glutâmico e ácido aspártico. Grupo terc-butilo Tioéter de metionina Algumas vezes protegido como sulfóxido

Outros grupos protectores de cadeia lateral que são ortogonais para a protecçâo de FMOC serão conhecidos dos especialistas na técnica e podem ser aplicados com esta invenção (ver por exemplo Fields G. B. & Noble R. L., Int J Pept Protein Res 35 (3) : 161-214, "Solid phase peptide synthesis utilizing 9 fluorenylmethoxycarbonyl amino acids". 1990). 35

Os grupos de protecção para funcionalidades reactivas de cadeia lateral compatíveis com a síntese de t-BOC são apresentados abaixo, na Tabela 4.

Tabela 4

Cadeia Lateral Grupo de Protecção Grupo amino épsilon da lisina Grupo benziloxicarbonilo (Z) Funcionalidade guanidino da arginina Normalmente não necessário, mas a nitratação pode ser utilizada Anel imidazole da histidina grupo π-benzilmetilo (Bom). Funcionalidades hidroxilo de serina, treonina e tirosina Grupo benzilo Funcionalidade hidroxilo da tirosina Grupo 2-bromobenziloxi- carbonilo Anel índole de triptofano Normalmente não necessário Funcionalidade tiol da cisteína Grupo benzilo Funcionalidades amida de glutamina e asparagina Normalmente não necessário. Funcionalidades de ácido carboxílico de ácido glutâmico e ácido aspártico. Grupo éster de benzilo Tioéter de metionina Algumas vezes protegido como sulfóxido

Novamente, o especialista na técnica conhecerá outros grupos protectores para utilização com cadeias laterais reactivas que são ortogonais em relação à protecção de alfa-amino de t-BOC. 36 Vários suportes sólidos e resinas diferentes estão disponíveis comercialmente para a síntese de péptidos, utilizando quer os processos FMOC ou t-BOC (para uma revisão de suportes sólidos ver Meldal. M., Methods Enzymol 289: 83-104, "Properties of solid supports". 1997).

Aminoácidos modificados na massa

Pode ser utilizada uma variedade de aminoácidos na unidade de marcador de massa e a unidade de normalização de massa. Os aminoácidos neutros são preferidos na unidade de normalização de massa e os aminoácidos com carga são preferidos nas unidades de marcador de massa (uma vez que isto facilita a ionização e aumenta a sensibilidade), e. g., na posição marcada aminoácido 1 e aminoácido 2 na primeira e quarta formas de realização desta invenção. São apresentados na Tabela 5 abaixo vários aminoácidos modificados na massa, isotopicamente comercialmente disponíveis. Qualquer combinação de 1, 2, 3, ou 4 ou mais aminoácidos desta lista são preferidos em cada das unidades, de acordo com a presente invenção. 37

Tabela 5

Aminoácido Formas de Isótopo alanina CH3CH(NH2)13C02H, CH3CD(NH2) co2h, CH313CH (15NH2) C02H, CDaCH (NH2) C02H, CD3CD (NH2) co2h, cd3ch (NH2) 13co2h, cd313ch (NH2) co2h, 13ch313ch (15nh2) 13co2h Arginina [ (15NH2) 2cnhch2ch2ch (NH2) co2h] + Asparagina h2n13coch2ch (NH2) co2h, H2N13C013CH21jCH (NH2) 13co2h, h215ncoch2ch (nh2) co2h, h215ncoch2ch (15nh2) co2h, Ácido H02"CCH2CH (NH2) C02H, H02C"CH2CH (NH2) C02H, Aspártico ho213cch2ch (NH2) co2h, ho2c13ch2ch (NH2) co2h, ho2cch2ch (NH2) 13co2h, H0213CCH2CH (NH2) 13co2h, ho2cch213ch (NH2) 13co2h, ho213c13cch2ch (NH2) co2h, ho213c13ch213ch (NH2) 13co2h, ho2ccd2cd (NH2) co2h, ho2cch2ch (15nh2)co2h, ho2cch2ch(15nh2) 13co2h Cisteína Não disponível Ácido ho2cch2ch2ch (NH2) 13co2h, H02CCH2CH2í3CH (NH2) co2h, Glutâmico ho2cch213ch2ch (NH2) co2h, ho2c13ch2ch2ch (NH2) co2h, ho213c13ch213ch213ch (NH2) 13co2h, ho2ccd2ch2ch (NH2) co2h, ho2ccd2cd2cd (NH2) co2h, ho213c13ch213ch213ch (15NH2) 13co2h Glutamina h2ncoch2ch2ch (nh2) 13co2h, h2n13coch2ch2ch (NH2) co2h, h2ncocd2cd2cd (NH2) co2h, h215ncoch2ch2ch (NH2) co2h, h2ncoch2ch2ch (15nh2) co2h, h215ncoch2ch2ch (15nh2) co2h, h215n13co13ch213ch213ch (15nh2) 13co2h Glicina h2nch21jco2h, h2n1jch2co2h, h2n1jch21jco2h, h2ncd2co2h, h215nch2co2h, h215n13ch2co2h, h215nch213co2h, h215n13ch213co2h 38 (continuação)

Aminoácido Formas de Isótopo Histidina (CH)2N2CCH2CH(NH2)13C02H, (CH) 2n2cch2ch (15nh2) co2h, (CH) 215n2cch2ch (NH2) co2h Isoleucina Não disponível Leucina (CH3)2CHCH2CH(NH2)13C02H, (CH3)2CHCH213CH(NH2)C02H, (CH3) 2chch213ch (NH2) 13co2h, (CH3) 2chch2cd (NH2) co2h, (CH3) 2chcd2cd (NH2) co2h, (CD3) (CH3)CHCH2CH(NH2)C02H, (CD3) 2cdch2ch (NH2) co2h, (CD3) 2cdcd2cd (NH2) co2h, (CH3)2CHCH2CH(15NH2)15C02H (CH3)2CHCH2CH(15NH2)13C02H Lisina h2nch2ch2ch2ch2ch (NH2) 13co2h, H2NCH2CH2CH2CH213CH (NH2) C02H, h2n13ch2ch2ch2ch2ch (NH2) co2h, h2nch2ch2ch2ch213ch (nh2) 13co2h, h2nch2cd2cd2ch2ch (NH2) co2h, h2ncd2cd2cd2cd2ch (NH2) co2h, h2nch2ch2ch2ch2ch (15nh2) co2h, h215nch2ch2ch2ch2ch (nh2) co2h, h215n13ch2ch2ch2ch2ch (NH2) co2h Metionina ch3sch2ch2ch (NH2) 13co2h, ch3sch2ch213ch (NH2) co2h, 13ch3sch2ch2ch (NH2) co2h, ch3sch2ch2cd (NH2) co2h, cd3sch2ch2ch (NH2) co2h, ch3sch2ch2ch (15nh2) co2h, 13cd3sch2ch2ch (NH2)co2h, ch3sch2ch213ch(15nh2)co2h Fenilalanina c6h5ch2ch(nh2)13co2h, c6h5ch213ch(nh2)co2h, 13c6h5ch2ch (NH2) co2h, c6h5ch2cd (NH2) co2h, c6h5cd2ch (NH2) co2h, c6d5ch2ch (NH2) co2h, c6d5cd2cd(NH2)co2h, c6h5ch2ch(15nh2) co2h 39 (continuação)

Aminoácido Formas de Isótopo Prolina Λ r^\NH Γ \—13C02H [ y—C02H fÀ p L^/c°2H 4v~c°2H Serina H0CH2CH (NH2) 13co2h, H0CH213CH (NH2) co2h, ho13ch2ch (nh2) co2h, HOCH2CH (15NH2) co2h, hoch213ch (15nh2) co2h Treonina CH3CH (OH) CH (NH2) 13C02H Triptofano u ch2 \ f \h-nh2 N-U I H \ / \ COM D Tirosina HO (C6H4) ch2ch (NH2) 13co2h, HO (C6H4) ch213ch (NH2) co2h, HO (C6H4) 13CH2CH (NH2) co2h, HO (C6H4) 13ch213ch (NH2) 13co2h, HO (13C6H4) ch2ch (NH2) co2h, HO (13C6H4) 13ch213ch (NH2) 13co2h, HO (C6H4) CD2CH (NH2) C02H, HO (C6D2H2) CH2CH (NH2) C02H, HO (C6D4) CH2CH (NH2) C02H, HO (C6H4) CH2CH (NH2) C02H, H170 (C6H4) ch2ch (nh2) co2h, h18o (C6H4) CH2CH (NH2) co2h, HO (c6h4) ch213ch (15nh2) co2h, HO (13C6H4) 13ch213ch (15nh2) 13co2h Valina (CH3)2CHCH(NH2)íjC02H, (CH3)2CH13CH(NH2)C02H, (CH3) 2chcd (NH2) co2h, (CD3) 2cdcd (NH2) co2h, (CH3)2CHCH(15NH2)C02H 40

Para muitos dos aminoácidos acima, ambas as formas D- e L-estão disponíveis (por exemplo de ISOTEC Inc., Miamisburg, Ohio,), ambas as quais podem ser utilizadas na preparação das etiquetas desta invenção. Misturas das formas D e L estão também disponíveis, mas são menos preferidas se as etiquetas desta invenção se destinam a ser utilizadas em separações cromatográficas. Para alguns, também estão disponíveis derivados protegidos em FMOC ou t-BOC. Os aminoácidos modificados em massa com base na substituição de deutério para hidrogénio e em substituição dos isótopos 13C e 1SN para os isótopos 12C e 13N que também estão disponíveis e são igualmente aplicáveis para a síntese dos marcadores desta invenção. Vários aminoácidos que não se encontram tipicamente em péptidos, podem também ser utilizados nas etiquetas desta invenção, por exemplo, formas deuteradas de ácido amino butírico estão comercialmente disponíveis. Para os objectivos desta invenção são preferidos isótopos estáveis não radioactivos, por questões de segurança, mas não há uma limitação necessária a isótopos estáveis.

Também estão disponíveis derivados fluorados de vários aminoácidos. Alguns dos aminoácidos fluorados comercialmente disponíveis, são apresentados na Tabela 6 abaixo. 41

Tabela 6

Aminoácido Formas Fluoradas Ácido Glutâmico HO2CCFHCH2CH (NH2) co2h Leucina (CH3) (CF3)CHCH2CH(NH2)C02H Fenilalanina CêFH4CH2CH (NH2) C02H, CêF2H3CH2CH (NH2) C02H, C6F3H2CH2CH(NH2)C02H Fenilglicina c6fh4ch (NH2) co2h, c6f2h3ch (NH2) co2h, C6F3H2CH (NH2) co2h Valina (CH3)2CFCH(NH2)C02H

Para a maioria dos aminoácidos fluorados acima, os reagentes estão disponíveis como misturas das formas D e L. Em geral, as variantes fluoradas de aminoácidos são menos preferidas do que variantes substituídas por isótopo. Os compostos fluorados podem ser utilizados para criar uma gama de etiquetas de massa com a mesma massa mas cada etiqueta será quimicamente diferente, o que significa que o seu comportamento no espectrómetro de massa irá variar mais do que etiquetas substituídas por isótopo.

Além disso, as etiquetas não temrão propriedades cromatográficas idênticas se as etiquetas forem utilizadas em separações cromatográficas.

Funcionalidades Reactivas

Em alguns aspectos desta invenção, como já explicados, as etiquetas de massa da invenção compreende uma funcionalidade reactiva. Nas formas de realização mais simples esta pode ser um éster de N-hidroxissuccinimida introduzido pela activação do 42 terminal C dos péptidos etiqueta desta invenção. Na síntese de péptidos convencionais, este passo de activação ocorreria após o péptido de etiqueta de massa foi clivado a partir do suporte sólido utilizado para esta síntese. Um péptido etiqueta de massa activado por N-hidroxissuccinimida pode também ser feito reagir com hidrazina para produzir uma funcionalidade reactiva de hidrazida que pode ser utilizada para marcar unidades de açúcar, por exemplo, oxidadas com periodato. Podem ser utilizados grupos amino ou tióis como funcionalidades reactivas em algumas aplicações e estas podem ser introduzidas adicionando lisina ou cisteína após o aminoácido 2 da etiqueta péptido. Pode ser utilizada lisina para acoplar etiquetas a funcionalidade carboxilo livres, utilizando uma carbodiimida como um reagente de acoplamento. A lisina também pode ser utilizada como o ponto de partida para a introdução de outras funcionalidades reactivas nos péptidos etiqueta desta invenção. A funcionalidade de maleimida reactiva ao tiol pode ser introduzida pela reacção do grupo amino épsilon da lisina com anidrido maleico. 0 grupo tiol da cisteína pode ser utilizado como o ponto de partida para a síntese de uma variedade de compostos de sulfona de alquenilo que são reagentes de marcação de proteínas úteis que reagem com tióis e aminas. Compostos tais como ácido amino-hexanóico podem ser utilizados para proporcionar um espaçador entre os aminoácidos modificados na massa e a funcionalidade reactiva.

Ligandos de Captura de Afinidade

Em determinadas formas de realização do primeiro aspecto desta invenção, os marcadores de massa compreendem um ligando de captura de afinidade. Os ligandos de captura de afinidade são ligandos que possuem parceiros de ligação altamente específicos. 43

Estes parceiros de ligação permitem que moléculas etiquetadas com o ligando sejam capturadas selectivamente pelo parceiro de ligação. De um modo preferido, um suporte sólido é derivado com o parceiro de ligação de modo a que as moléculas etiquetadas com ligando de afinidade podem ser capturadas selectivamente no suporte da fase sólida. Um ligando de captura de afinidade preferido é a biotina que pode ser introduzida nos péptidos etiquetas de massa desta invenção através de métodos convencionais conhecidos na técnica. Em particular, um resíduo de lisina podem ser incorporado após o aminoácido 2, através do qual uma biotina reactiva a amina pode ser ligada aos péptidos etiquetas de massa (ver, por exemplo, Geahlen R.L. et al., Anal Biochem 202 (1): 68-67, "A general method for preparation of peptides biotinylated at the carboxy terminus". 1992; Sawutz D.G. et al., Peptides 12 (5): 1019- 1012, "Synthesis and molecular characterization of a biotinylated analog of [Lys] bradykinin". 1991; Natarajan S. et al., Int J Pept Protein Res 40 (6) : 567-567, "Site-specific biotinylation. A novel approach and its application to endothelin-1 analogs and PTH-analog"., 1992). A iminobiotina também é aplicável. Estão disponíveis uma variedade de contra-ligandos de avidina para biotina que incluem avidina e estreptavidina monomérica e tetramérica, estando todos disponíveis em vários suportes sólidos.

Outros ligandos de captura de afinidade incluem unidades de digoxigenina, fluoresceína, nitrofenilo e vários epitopos de péptido, tais como o epitopo c-myc, para os quais existem anticorpos monoclonais selectivos como contra-ligandos. Ligandos de ligação a ião metálico, tais como hexa-histidina que se ligam rapidamente a iões Ni2+, também são aplicáveis. Estão comercialmente disponíveis resinas cromatográficas que apresentam, por exemplo iões Ni2+ quelados com ácido 44 iminodiacético. Estas colunas de níquel imobilizado podem ser utilizadas para capturar etiquetas de massa de péptido que compreendem histidina oligomérica. Como outra alternativa, pode ser selectivamente feita reagir uma funcionalidade de captura de afinidade com um suporte de fase sólida apropriadamente derivado. Ácido borónico, por exemplo, é conhecido por reagir selectivamente com cis-dióis vicinais e ligandos quimicamente semelhantes, tal como ácido salicil-hidroxâmico. Reagentes compreendendo ácido borónico foram desenvolvidos para capturar proteína em suportes sólidos derivados com ácido salicil-hidroxâmico (Stolowitz M.L. et al., Bioconjug Chern 12 (2): 229— 239, "Phenylboronic Acid-Salicylhydroxamic Acid Bioconjugates. 1. A Novel Boronic Acid Complex for Protein Immobilization". 2001; Wiley J. P. et al., Bioconjug Chem 12(2): 240-250, "Phenylboronic Acid-Salicylhydroxamic Acid Bioconjugates. 2. Polyvalent Immobilization of Protein Ligands for Affinity Chromatography". 2001, Prolinx, Inc, Washington State, EUA). Antecipa-se que deverá ser relativamente simples ligar uma funcionalidade de ácido fenilborónico com um péptido etiqueta de massa, de acordo com esta invenção para criar reagentes de captura que podem ser capturados por reacções químicas selectivas. A utilização deste tipo de química não seria directamente compatível com biomoléculas comportando açúcares contendo cis-diol vicinal, todavia estes tipos de açúcares poderiam ser bloqueados com ácido fenilborónico ou reagentes relacionados antes da reacção com reagentes de etiqueta de massa de péptidos derivados de ácido borónico. 45

Grupos de Aumento da Sensibilidade de Espectro de Massa e Diferenciação de Massa

Em formas de realização preferidas do primeiro e quarto aspectos desta invenção as etiquetas de massa de péptidos compreendem Grupos de Aumento de Sensibilidade. As Figuras 1 a 5 ilustram a utilização de metilação e guanidinação como métodos de melhorar a sensibilidade. Adicionalmente, estes Grupos de Aumento da Sensibilidade podem diferenciar os produtos de fragmentação do aminoácido N-terminal dos produtos de fragmentação do segundo aminoácido no péptido etiqueta e resíduos de aminoácidos naturais na proteína, se isto for igual ao primeiro aminoácido. 0 grupo de aumento da sensibilidade pode também distinguir os produtos de fragmentação do aminoácido N-terminal da etiqueta de massa do péptido dos produtos de fragmentação dos aminoácidos naturais quando as etiquetas desta invenção são utilizadas para marcar péptidos e proteínas. 0 grupo guanidino e o grupo amino terciário são ambos Grupos de Aumento de Sensibilidade, úteis para espectrometria de massa por electroaspersão.

Também foram desenvolvidos vários outros métodos para derivar péptidos. Estes incluem a utilização de derivados de amónia quaternários, derivados de fosfónio quaternários e derivados de piridilo para espectrometria de massa de iões positiva. Compostos halogenados, particularmente compostos halogenados aromáticos, são electróforos bem conhecidos, i. e., captam electrões térmicos muito facilmente. Foram desenvolvidos uma variedade de reagentes derivados baseados em compostos aromáticos fluorados (Bian N. et al., Rapid Commun Mass Spectrom 11 (16) : 1781-1784, "Detection via laser desorption and mass spectrometry of multiplex electrophore-labelled albumin". 1997), para detecção de captura de electrões que é um processo de ionização e detecção altamente sensível que pode ser utilizado com espectrometria de massa de ião negativo (Abdel-Baky S. & Giese R.W., Anal Chem 63 (24): 2986-2989, "Gas chromatography/electron capture negative-ion mass spectrometry at the zeptomole levei". 1991). Um grupo fluorado aromático também pode ser utilizado como um grupo de aumento de sensibilidade. Também foram utilizados ácidos sulfónicos aromáticos para melhorar a sensibilidade em espectrometria de massa de iões negativos.

Cada tipo de Grupo de Aumento de Sensibilidade tem diferentes benefícios que dependem do método de ionização utilizado e dos métodos de análise de massa utilizados. 0 mecanismo pelo qual a sensibilidade é aumentada pode também ser diferente para cada tipo de grupo. Alguns métodos derivados aumentam a basicidade e desse modo promovem a protonação e a localização de carga, enquanto que outros métodos aumentam a actividade de superfície dos péptidos etiquetados que melhora a sensibilidade nas técnicas de desabsorção de superfície, como Ionização de Desabsorção de Laser Assistida pela Matriz (MALDI) e Bombardeamento Atómico Rápido (FAB). A espectrometria de massa de iões negativos é, frequentemente, mais sensível porque há menos ruído de fundo. A derivação da carga também pode alterar os produtos de fragmentação dos péptidos derivados, quando é utilizada a dissociação induzida pela colisão. Em particular, algumas técnicas de derivação simplificam os padrões de fragmentação que são altamente vantajosos. A escolha do Grupo de Aumento de Sensibilidade é determinada pelas técnicas espectrométricas de massa que serão empregues (para uma revisão ver Roth et al., Mass Spectrometry Reviews 17: 255-274, "Charge derivatisation of peptides for analysis by mass spectrometry", 47 1998). Para os objectivos desta invenção todas as técnicas de derivação conhecidas podem ser utilizadas com as etiquetas de massa de péptido desta invenção. Os protocolos publicados podem ser utilizados sem modificação para derivar as etiquetas de massa de péptido desta invenção após síntese de péptido em fase sólida ou os protocolos podem ser rapidamente adaptados para utilização durante a síntese em fase sólida, se desejado.

Análise de péptidos por espectrometria de massa

As características essenciais de um espectrómetro de massa são as seguintes:

Sistema de Entrada -> Fonte de Iões -> Analisador de Massa -> Detector de Iões -> Sistema de Captura de Dados

Existem sistemas de entrada, fontes de iões e analisadores de massa preferidos, para os objectivos de analisar péptidos.

Sistemas de Entrada

No segundo aspecto desta invenção, é preferida uma separação cromatográfica ou electroforética para reduzir a complexidade da amostra antes da análise por espectrometria de massa. Várias técnicas de espectrometria de massa são compatíveis com tecnologias de separação, particularmente electroforese de zona de capilar e Cromatografia Líquida de Elevado Desempenho (HPLC). A escolha da fonte de ionização está limitada, até determinado ponto, se é necessária uma separação como técnicas de ionização, tais como MALDI e FAB (discutido abaixo) que retiram material de 48 uma superfície sólida são menos adequados a separações cromatográficas. Para a maioria dos objectivos, tem sido muito dispendioso ligar uma separação cromatográfica em linha com análise espectrométrica de massa por uma destas técnicas. Técnicas de FAB Dinâmica e ionização baseadas na aspersão, tais como electroaspersão, termoaspersão e APCI são todas rapidamente compatíveis com separações cromatográficas em linha e equipamento para realizar essa análise de espectrometria de massa de cromatografia líquida estão comercialmente disponíveis. Técnicas de ionização

Para muitas aplicações de espectrometria de massa biológicas, são utilizadas as denominadas técnicas de ionização "moderada". Estas permitem que moléculas grandes, tais como proteínas e ácidos nucleicos sejam ionizadas, essencialmente, intactas. As técnicas de fase líquida permitem que biomoléculas grandes entrem no espectrómetro de massa em soluções com pH moderado e a concentrações baixas. São apropriadas várias técnicas para utilização com esta invenção incluindo, mas não limitadas a Espectrometria de Massa por Ionização de

Electroaspersão (ESI-MS), Bombardeamento Atómico Rápido (FAB), Espectrometria de Massa de Desabsorção de Laser Assistida por Matriz (MALDI MS) e Espectrometria de Massa de Ionização Química a Pressão Atmosférica (APCI-MS).

Ionização por Electroaspersão A ionização por electroaspersão requer que a solução diluída da molécula de analito seja "atomizada" para o espectrómetro, 49 i. e., injectada como uma aspersão fina. A solução é, por exemplo, aspergida da ponta de uma agulha carregada num fluxo de azoto seco e um campo electrostático. 0 mecanismo de ionização não está totalmente compreendido, mas pensa-se que funciona grosseiramente como se segue. Num fluxo de azoto o solvente é evaporado. Com uma pequena goticula, isto resulta na concentração da molécula de analito. Dado que a maioria das biomoléculas possuem uma carga liquida isto aumenta a repulsão electrostática da molécula dissolvida. À medida que a evaporação continua, esta repulsa, em última análise torna-se maior do que a tensão de superfície da goticula e a goticula desintegra-se em goticulas mais pequenas. Este processo é por vezes referido como uma "explosão Coulombica". 0 campo electrostático ajuda a superar ainda mais a tensão de superfície das goticulas e auxilia no processo de aspersão. A evaporação continua a partir das goticulas mais pequenas que, por sua vez, explode iterativamente até que as biomoléculas estejam, essencialmente, na fase de vapor, como está todo o solvente. Esta técnica é de particular importância na utilização de marcadores de massa em que a técnica transmite uma quantidade relativamente pequena de energia aos iões no processo de ionização e a distribuição da energia numa população tende a cair num intervalo mais estreito quando comparado com outras técnicas. Os iões são acelerados para fora da câmara de ionização através da utilização de campos eléctricos que são estabelecidos através de eléctrodos apropriadamente posicionados. A polaridade dos campos podem ser alterados para extrair quer iões negativos ou positivo. A diferença potencial entre Estes eléctrodos determina se os iões positivos ou negativos passam para o analisador de massa e também a energia cinética com o qual estes iões entram no epectrómetro de massa. Isto é significativo quando se considera a fragmentação de iões no espectrómetro de massa. Quanto mais 50 energia for transferida para uma população de iões tanto mais provável será que a fragmentação ocorra através da colisão de moléculas de analito com o gás de lavagem presente na fonte. Ajustando o campo eléctrico utilizado para acelerar iões da câmara de ionização é possível controlar a fragmentação de iões. Isto é vantajoso quando a fragmentação de iões se destina a ser utilizada como um meio de remoção de etiquetas de uma biomolécula marcada. A ionização por electroaspersão é particularmente vantajosa na medida em que pode ser utilizada em linha com cromatografia líquida, referida como uma Espectrometria de Massa de Cromatografia Líquida (LC-MS).

Ionização de Desabsorção com Laser Assistida por Matriz (MALDI) MALDI requer que a solução de biomoléculas seja encaixada num grande excesso molar de uma "matriz" foto-excitável. A aplicação de luz laser de frequência apropriada resulta na excitação da matriz que, por sua vez conduz à evaporação rápida da matriz ao longo da sua biomolécula presa. A transferência de protões da matriz acídica para a biomolécula dá origem a formas protonadas da biomolécula que podem ser detectadas através de espectrometria de massa de iões positivos, particularmente através de espectrometria de massa de Tempo-De-Voo (TOF). Também é possível espectrometria de massa de iões negativos por MALDI TOF. Esta técnica transfere uma quantidade significativa de energia da transferência aos iões, mas, apesar disto tende a não induzir fragmentação excessiva. No entanto, podem ser novamente utilizadas voltagens de aceleração para controlar a fragmentação com esta técnica. 51

Bombardeamento Atómico Rápido 0 bombardeamento atómico rápido (FAB) veio descrever várias técnicas para vaporizar e ionizar moléculas relativamente não voláteis. Nestas técnicas, uma amostra é desabsorvida de uma superfície por colisão da amostra com um raio de energia elevada de átomos de xénon ou iões de césio. A amostra é revestida numa superfície com uma matriz simples, tipicamente um material não volátil, e. g., álcool m-nitrobenzílico (NBA) ou glicerol. As técnicas de FAB também são compatíveis com sistemas de entrada de fase líquida -o líquido que elui a partir de uma entrada de electroforese capilar ou um sistema de cromatografia líquida de elevada pressão passa através de uma frita, essencialmente revestindo a superfície da frita com solução de analito que pode ser ionizada da superfície da frita por bombardeamento atómico.

Analisadores de Massa A fragmentação de péptidos por dissociação induzida pela colisão é utilizada nesta invenção para identificar etiquetas nas proteínas. Várias geometrias de analisador de massa podem ser utilizadas para fragmentar péptidos e para determinar a massa dos fragmentos.

Análise de péptidos por MS/MS e MSn

Os espectrómetros de massa em tandem permitem que sejam seleccionados iões com uma proporção de massa-para-carga predeterminada e fragmentados por dissociação induzida por 52 colisão (CID). Os fragmentos podem então ser detectados proporcionando informação estrutural acerca do ião seleccionado. Quando os péptidos são analisados por CID num espectrómetro de massa em tandem, são observados padrões de clivagem caracteristicos que permitem que a sequência do péptido seja determinada. Péptidos naturais fragmentam tipicamente de modo aleatório nas ligações de amida da coluna dorsal do péptido para produzir uma série de iões que são caracteristicos do péptido. As séries de fragmentos CID são representadas como an, bn, cn, etc., para clivagem na n-ésima ligação peptidica, em que a carga do ião é retida no fragmento N-terminal do ião. De um modo semelhante, as séries de fragmentos são representadas como xn, yn, zn, etc., em que a carga é retida no fragmento C-terminal do ião.

z y x A tripsina e trombina são agentes de clivagem favorecidos para espectrometria de massa em tandem, na medida em que produzem péptidos com grupos básicos em ambas as extremidades da molécula, i. e., o grupo alfa-amino no terminal N e cadeias laterais de lisina ou arginina no terminal C. Isto favorece a formação de iões com carga dupla, nos quais os centros carregados estão nos terminais opostos da molécula. Estes iões duplamente carregados produzem séries de iões tanto no terminal C como no terminal N após CID. Isto auxilia na determinação da 53 sequência do péptido. De um modo geral, apenas uma ou duas das possíveis séries de iões são observadas nos espectros de CID de um dado péptido. Em colisões de baixa energia, típicas de instrumentos à base de quadrupolo, a série b- de fragmentos N-terminais ou a série y- de fragmentos C-terminais predominam. Se são analisados iões duplamente carregados, então ambas as séries são detectadas frequentemente. Em geral, a série de iões y- predomina em relação à série b-.

Em geral, a fragmentação de péptidos através de um mecanismo que envolve a protonação da coluna dorsal de amida seguido por ataque nucleofílico intramolecular conduz à formação de uma estrutura de oxazolona de 5-membros e clivagem da ligação amida que foi protonada (Schlosser A. e Lehmann W.D.J. Mass Spectrom. 35: 1382-1390, "Five-membered ring formation in unimolecular reactions of peptides: a key structural element controlling low-energy collision induced dissociation", 2000). A Figura 16a apresenta um mecanismo proposto pelo qual ocorre este tipo de fragmentação. Este mecanismo requer um grupo carbonilo de uma ligação amida adjacente a uma amida protonada no lado N-terminal da amida protonada para realizar o ataque nucleofílico. Um ião de oxazolónio carregado dá origem a iões de série b-, enquanto que a transferência de protões do fragmento N-terminal para o fragmento C- terminal dá origem a um iões de série y- como apresentado na figura 16a. Esta necessidade para um grupo carbonilo localizado apropriadamente não explica a clivagem nas ligações amida adjacentes ao aminoácido N-terminal, quando o terminal N não está protegido e, em geral, os iões de série b-não são observados para a amida entre o N-terminal e o segundo aminoácido num péptido. Todavia, os péptidos com terminais N acetilados respeitam os requisitos estruturais deste mecanismo e a fragmentação pode ocorrer por este mecanismo na ligação amida 54 imediatamente após o primeiro aminoácido. Péptidos com terminais N tioacetilados, como apresentado na figura 16c, irão clivar facilmente, de modo particular pelo mecanismo oxazolona como o átomo de enxofre é mais nucleofilico do que um átomo de oxigénio na mesma posição. A fragmentação da cadeia dorsal de amida de um péptido também pode ser modulada por metilação da coluna dorsal. A metilação de um azoto de amida num péptido pode promover a fragmentação da ligação da amida seguinte C-terminal para a amida metilada e também favorece a formação de iões b-. A fragmentação aumentada pode ser parcialmente devida ao efeito dador de electrões do grupo metilo aumentando a nucleofilicidade do grupo carbonilo da amida metilada, enquanto que a formação aumentada de iões b- pode ser um resultado da incapacidade do ião oxazolónio que se forma para transferir protões para o fragmento do terminal C como apresentado na figura 16b. No contexto desta invenção, tioacetilação do terminal N de uma etiqueta dipéptido pode ser utilizada para aumentar a clivagem da etiqueta péptido na ligação amida seguinte. De um modo semelhante, a metilação do átomo de azoto de um grupo N-terminal acetilo ou tioacetilo irá também aumentar a clivagem da ligação amida adjacente. As Figuras 17a e 17b ilustram pares de etiquetas que exploram estes métodos de aumento da clivagem na ligação da amida marcada. A facilidade de fragmentação da cadeia dorsal da amida de um polipéptido ou péptido é também significativamente modulada pelas funcionalidades da cadeia do péptido. Assim, a sequência de um péptido determina onde se irá fragmentar mais facilmente. Em geral, é dificil prever que ligações de amida irão fragmentar facilmente numa sequência de péptido. Isto tem consequências importantes para a concepção das etiquetas de massa de péptido desta invenção. Todavia, foram feitas determinadas observações 55

que permitem que as etiquetas de massa de péptido que fragmentam na ligação amida desejada a ser concebida. Prolina, por exemplo, é conhecido que promove a fragmentação nesta ligação amida N-terminal (Schwartz B.L., Bursey Μ. M., Biol. Mass Spectrom. 21: 92, 1997) na medida em que a fragmentação na amida C-terminal dá origem a uma estrutura de oxazolona biciclica desfavoravelmente distendida energeticamente. 0 ácido aspártico também promove a fragmentação na sua ligação amida N-terminal. Todavia, as ligações Asp-Pro são particularmente lábeis em análise de CID de baixa energia (Wysocki V.H. et al., J Mass Spectrom. 35(12): 1399-1406, "Mobile and localized protons: a framework for understanding peptide dissociation". 2000) e nesta situação, o ácido aspártico parece promover a clivagem desta ligação amida no seu lado C-terminal. Assim, a prolina, e as ligações asp-pro também podem ser utilizadas nos péptidos etiqueta desta invenção para promover a fragmentação nas localizações especificadas num péptido. As Figuras 17c e 17d ilustram pares de etiquetas que exploram estes métodos de aumentar a clivagem na ligação amida marcada. A Figura 17c ilustra um par de etiquetas tripéptido com a sequência alanina-prolina-alanina. A ligação de prolina promove a clivagem na sua amida N-terminal. Isto é aumentado pela presença de um grupo de protecção tioacetilo no terminal N do tripéptido e a capacidade de clivagem é ainda aumentada pela metilação do azoto N-terminal. As etiquetas possuem a mesma massa, mas na primeira etiqueta há um resíduo de alanina com isótopos pesados na terceira posição do tripéptido, enquanto que na segunda etiqueta há um resíduo de alanina com isótopos pesados na primeira posição do tripéptido. A Figura 17d ilustra um par de etiquetas tripéptido com a sequência ácido aspártico-prolina-alanina. A ligação da prolina promove a clivagem na sua amida N-terminal. Isto é aumentado pela presença do resíduo de ácido aspártico. O 56 terminal N do tripéptido é metilado para promover a protonação aqui localizada. As etiquetas possuem a mesma massa, mas na primeira etiqueta há um residuo de alanina com isótopos pesados na terceira posição do tripéptido, enquanto na segunda etiqueta há um residuo de ácido aspártico com isótopos pesados na primeira posição do tripéptido.

Uma geometria de espectrómetro de massa em tandem típica é um quadrupolo triplo que compreende dois analisadores de massa quadrupolos separados por uma câmara de colisão, também um quadrupolo. Este quadrupolo de colisão actua como um guia de iões entre os dois quadrupolos analisadores. Um gás pode ser introduzido no quadrupolo de colisão para permitir a colisão com o fluxo de iões do primeiro analisador de massa. 0 primeiro analisador de massa selecciona iões com base na sua proporção de massa/carga que passa através da célula de colisão onde se fragmentam. Os iões de fragmento são separados e detectados no terceiro quadrupolo. A clivagem induzida pode ser realizada noutras geometrias para além dos analisadores em tandem. Os espectrómetros de massa com captura de iões podem promover a fragmentação através da introdução de um gás na própria captura com a qual os iões capturados irão colidir. As capturas de iões contêm geralmente um gás de lavagem, tal como hélio mas a adição de néon, por exemplo, promove a fragmentação. De um modo semelhante a fragmentação induzida por fotões pode ser aplicada a iões capturados. Outra geometria favorável é um instrumento em tandem de Tempo de Voo Quadrupolo/Ortogonal, em que a taxa de rastreio elevada de um quadrupolo está acoplado a uma sensibilidade maior de um reflectirão de analisador de massa TOF para identificar os produtos de fragmentação. 57

Os instrumentos de "sector" convencionais são outra geometria comum utilizada em espectrometria de massa em tandem. Um analisador de massa de sector compreende dois "sectores" separados, um sector que foca um raio de iões deixando uma fonte num fluxo de iões com a mesma energia cinética utilizando campos eléctricos. 0 sector magnético separa os iões com base na sua massa para criar um espectro num detector. Para a espectrometria de massa em tandem, pode ser utilizado um analisador de massa de dois sectores deste tipo, em que o sector eléctrico proporciona o estádio do primeiro analisador de massa, o sector magnético proporciona o segundo analisador de massa, com uma célula de colisão colocada entre os dois sectores. Dois analisadores de massa de sector completo separados por uma célula de colisão também podem ser utilizados para análise de péptidos etiquetados em massa.

Capturas de Iões

Os analisadores de massa por captura de iões estão relacionados com os analisadores de massa de quadrupolo. A captura de iões normalmente tem uma construção de 3 eléctrodos -um eléctrodo cilíndrico com eléctrodos "de protecção" em cada extremidade formando uma cavidade. É aplicada frequência de rádio sinusoidal ao eléctrodo cilíndrico enquanto que os eléctrodos de protecção são enviesados com potenciais DC ou AC. Os iões injectados na cavidade são constrangidos a uma trajectória circular estável através de um campo eléctrico oscilante do eléctrodo cilíndrico. Todavia, para uma dada amplitude do potencial oscilante, determinados iões temrão uma trajectória instável e serão ejectados da captura. Uma amostra de iões injectados para a captura, podem ser sequencialmente 58 ejectados da captura de acordo com a sua proporção massa/carga alterando o potencial da frequência de rádio de oscilação. Os iões ejectados podem, então, ser detectados permitindo que seja produzido um espectro de massa.

As capturas de iões são normalmente operadas com uma pequena quantidade de um "gás de lavagem", tais como hélio, presente na cavidade de captura de iões. Isto aumenta tanto a resolução como a sensibilidade do dispositivo na medida em que os iões que entram na captura são essencialmente arrefecidos até à temperatura ambiente do gás de lavagem através de colisão com o gás de lavagem. As colisões tanto aumentam a ionização quando uma amostra é introduzida na captura como diminuem a amplitude e a velocidade das trajectórias de iões, mantendo-os mais próximo do centro da captura. Isto significa que, quando o potencial de oscilação é alterado, os iões cujas trajectórias se tornam instáveis ganham energia mais rapidamente, em relação aos iões em circulação diminuídos e saem da captura num conjunto mais apertado originando picos mais largos mais estreitos.

As capturas de iões podem mimetizar geometrias de espectrómetro de massa em tandem, de facto elas podem mimetizar múltiplas geometrias de espectrómetro de massa permitindo análises complexas de iões capturados. Uma única espécie de massa de uma única amostra pode ser retida numa captura, i. e., todas as outras espécies podem ser ejectadas e depois a espécie retida pode ser cuidadosamente excitada por super-imposição de uma segunda frequência oscilante da primeira. Os iões excitados irão então colidir com o gás de lavagem e irão fragmentar se suficientemente excitados. Os fragmentos podem então ser ainda mais analisados. É possível reter um ião de fragmento para posterior análise ejectando outros iões e depois excitando o ião 59 de fragmento para o fragmento. Este processo pode ser repetido enquanto existir suficiente amostra para permitir análise posterior. Deve ser notado que estes instrumentos normalmente retêm uma proporção elevada de iões de fragmento após fragmentação induzida. Estes instrumentos e espectrómetros de massa FTICR (discutidos abaixo) representam uma forma de espectrometria de massa em tandem resolvida temporalmente em vez de espectrometria de massa em tandem resolvida espacialmente que se encontra em espectrómetros de massa lineares.

Espectrometria de Massa por Ressonância de Ciclotrão de Iões de Transformada de Fourier (FTICR MS) A espectrometria de massa FTICR tem caracteristicas semelhantes a capturas de iões em que uma amostra de iões é retida na cavidade, mas em FTICR MS os iões são capturados numa câmara de alto vácuo através de campos eléctricos e magnético cruzados. 0 campo eléctrico é criado por um par de eléctrodos de placa que formam os dois lados de uma caixa. A caixa está contida no campo de um magnete supercondutor que, em conjunção com as duas placas, as placas de captura, limitam os iões injectados a uma trajectória circular entre as placas de captura, perpendicular a um campo magnético aplicado. Os iões são excitados para órbitas maiores, aplicando um pulso de frequência de rádio para duas "placas de transmissor" que formam dois outros lados opostos da caixa. 0 movimento cicloidal dos iões cria campos eléctricos correspondentes nos dois lados opostos restantes da caixa que compreende as "placas do receptor". Os pulsos de excitação excitam iões até órbitas maiores que decaem à medida que os movimentos coerentes dos iões se perdem através das colisões. Os sinais correspondentes 60 detectados pelas placas do receptor são convertidos numa análise de espectro de massa pela Transformada de Fourier (FT).

Para experiências de fragmentação induzida, estes instrumentos podem actuar de um modo semelhante a uma captura de iões - todos os iões excepto uma única espécie de interesse podem ser ejectados da captura. Pode ser introduzido um gás de colisão na captura e a fragmentação pode ser induzida. Os iões do fragmento podem ser subsequentemente analisados. De um modo geral, os produtos de fragmentação e gás de lavagem combinados para proporcionar resolução pobre se analisado por análise FT dos sinais detectados pelas "placas receptoras", todavia os iões de fragmento podem ser, por exemplo, ejectados da cavidade e analisados numa configuração em tandem com a quadrupolo.

Separação de péptidos marcados por cromatografia ou electroforese

No segundo passo opcional do segundo aspecto desta invenção, as biomoléculas marcadas são submetidas a uma separação cromatográfica antes da análise por espectrometria de massa. Esta é, de um modo preferido, Cromatografia Líquida de Elevado Desempenho (HPLC) que pode ser acoplada directamente a um espectrómetro de massa para análise em linha dos péptidos à medida que estes eluem da coluna cromatográfica. Podem ser realizadas uma variedade de técnicas de separação através de HPLC, mas a cromatografia de fase reversa é um método popular para a separação dos péptidos antes da espectrometria de massa. A electroforese de zona de capilar é outro método de separação que pode ser acoplado directamente a um espectrómetro de massa para análise automática de amostras de eluição. Estas e outras 61 técnicas de fraccionamento podem ser aplicadas para reduzir a complexidade de uma mistura de biomoléculas antes da análise por espectrometria de massa.

Aplicações da invenção

Marcação de péptidos e polipéptidos e análise por LC-MS-MS

Em formas de realização preferidas do segundo aspecto desta invenção, as etiquetas são utilizadas para a análise de misturas de péptidos por espectrometria de massa em tandem cromatografia liquida (LC-MS-MS). A utilização dos marcadores de massa desta invenção, de acordo com o segundo aspecto, será agora discutida no contexto da análise de péptidos. Etiquetas de massa de péptido, tais como aquelas nas figuras 1 e 2, podem ser utilizadas para marcar péptidos. Se a funcionalidade reactiva destes compostos é um éster de N-hidroxissuccinimida, então as etiquetas serão reactivas com grupos amino livres, tais como grupos alfa-amino e grupos épsilon amino na lisina.

Após ligação das etiquetas, os péptidos marcados temrão uma massa que é desviada pela massa da etiqueta. A massa do péptido pode ser suficiente para identificar a proteína da fonte. Neste caso, apenas a etiqueta precisa de ser detectada, o que pode ser alcançado monitorizando a reacção seleccionada com um triplo quadrupolo, discutido em maior detalhe abaixo. Resumidamente, o primeiro quadrupolo do triplo quadrupolo é estabelecido de modo a deixar passar iões cujas proporções de massa-para-carga correspondem às do péptido de interesse, ajustadas para a massa do marcador. Os iões seleccionados são então submetidos a dissociação induzida por colisão (CID) no segundo quadrupolo. 62

Sob o tipo de condições utilizadas na análise de péptidos, os iões irão fragmentar principalmente nas ligações amida na molécula. Os marcadores nas figuras 1 e 2 possuem uma ligação amida que liberta a porção N-terminal da etiqueta na clivagem. Embora as etiquetas possuam todas a mesma massa, a porção terminal é diferente devido às diferenças nos substituintes em qualquer dos lados da ligação amida. Assim, os marcadores podem ser distinguidos um do outro. A presença do fragmento marcador associado a um ião de uma massa especifica deve confirmar que o ião foi um péptido e as alturas relativas do pico das etiquetas das diferentes amostras darão informação sobre as quantidades relativas dos péptidos nas suas amostras. Se a massa não é suficiente para identificar um péptido quer porque vários péptidos terminais na amostra possuem a mesma massa terminal ou porque o péptido não é conhecido, então a informação de sequência pode ser determinada por análise do espectro de CID completo. Os picos de fragmentação do péptido podem ser utilizados para identificar os péptidos, enquanto que os picos da etiqueta de massa são informação acerca das quantidades relativas dos péptidos. A análise de proteínas por espectrometria de massa em tandem, particularmente misturas de péptidos, é complicada pelo "ruído" dos espectros obtidos. Os péptidos isolados a partir das amostras biológicas estão frequentemente contaminados com reagentes tamponantes, desnaturantes e detergentes, todos eles introduzem picos no espectro de massa. Como resultado, existem frequentemente mais picos de contaminação no espectro do que os picos de péptido e identificar os picos que correspondem aos péptidos é o problema principal, especialmente com amostras pequenas de proteínas que são difíceis de isolar. Como um resultado, são utilizados vários métodos para determinar que picos correspondem aos péptidos antes de ser realizada a análise de CID detalhada. Os fragmentos 63 baseados em triplo quadrupolo permitem "rastreio de ião precursor" (ver Wilm M. et ai., Anal Chem 68(3): 527-33, "Parent ion scans of unseparated peptide mixtures". (1996)). 0 triplo quadrupolo é operado no modo de "monitorização de reacção única", no qual o primeiro quadrupolo rastreia mais do que o intervalo de massa completo e cada ião conduzido é submetido a CID no segundo quadrupolo. 0 terceiro quadrupolo é estabelecido para detectar apenas um ião de fragmento especifico que é normalmente um ião de fragmento caracteristico de um péptido, tal como iões de amónia. A presença de grupos fosfato pode também ser detectada utilizando este tipo de técnica. Um método alternativo utilizado com rastreios de espectrómetros de massa de quadrupolo/tempo-de-voo para iões duplamente carregados por identificação de iões que, quando submetidos a CID produzem iões filhos com proporções de massa-para-carga superiores aos do ião parental. Outro método para identificar iões duplamente carregados é procurar conjuntos de picos no espectro que estão a apenas 0,5 daltons de distância com proporções de intensidade apropriadas que indicariam que os iões são iguais, diferindo apenas na proporção de 13C presente na molécula.

Por marcação de péptidos com os marcadores de massa desta invenção, pode ser encarada uma nova forma de rastreio de ião precursor na qual os picos de péptidos são identificados pela presença de fragmentos correspondentes aos marcadores de massa desta invenção após submeter os péptidos marcados a CID. Em particular, os péptidos isolados de cada amostra através dos métodos desta invenção podem ser marcados com mais do que um etiqueta. Uma mistura equimolar de um "rastreio de ião precursor" etiqueta que é utilizada em todas as amostras e uma etiqueta especifica para a amostra pode ser utilizada para marcar os péptidos em cada amostra. Deste modo, as alterações no 64 nível de péptidos em diferentes amostras não temrá um efeito adverso na identificação dos picos do péptido num rastreio de ião precursor.

Tendo identificado e seleccionado um ião de péptido, este é submetido a CID. Os espectros de CID são frequentemente muito complexos e determinam que picos no espectro de CID correspondem a séries de fragmento de péptido significativos é um problema sério na determinação da sequência de um péptido por espectrometria de massa. Shevchenko et al., Rapid Commun. Mass Spec. 11: 1015-1024 (1997) descreve outro método que envolve tratar proteínas para análise com tripsina em 1:1 água 160/180. A reacção de hidrólise resulta em duas populações de péptidos, a primeira cujo terminal carboxilo contém 1βΟ e a segunda cujo terminal carboxilo contém 180. Assim, para cada péptido na amostra deve existir um pico duplo de igual intensidade para cada péptido, em que o pico duplo está a 2 Daltons de distância. Isto é ligeiramente complicado pelos picos de isótopos de péptidos intrínsecos, mas permite o rastreio automatizado do espectro de CID para dupletos. As diferenças em massa entre dupletos podem ser determinadas para identificar o aminoácido pela diferença dos dois fragmentos. Este método pode ser aplicável com os métodos desta invenção se os péptidos N-terminal forem isolados.

Perfil de Expressão de Proteínas

Para compreender as alterações num tecido canceroso, por exemplo, requer um entendimento de todas as alterações moleculares nesse tecido, idealmente relacionadas com estas alterações no tecido normal. Para determinar todas as alterações 65 moleculares requer a capacidade para medir alterações na expressão genética, expressão proteica e, em última instância, alterações de metabolitos. É possível comparar a expressão, entre diferentes amostras de tecido, de números elevados de genes simultaneamente ao nível do ARN mensageiro (mRNA) utilizando a tecnologia dos microarray (ver, por exemplo Iyer V.R. et al., Science 283 (5398): 83-87, "The transcriptional program in the response of human fibroblasts to serum". 1999), todavia, os níveis de ARNm não estão correlacionados directamente com os níveis de proteína num tecido. Para determinar um perfil de expressão de proteínas para um tecido, é largamente utilizada a electroforese em gel bidimensional. Infelizmente, esta técnica é extremamente trabalhosa e é difícil de comparar duas ou mais amostras simultaneamente num gel de 2-D devido à dificuldade de obter reprodutibilidade. Como discutido acima, os péptidos podem ser analisados eficazmente utilizando os métodos desta invenção.

As etiquetas desta invenção permitem que o mesmo péptido de diferentes amostras seja identificado utilizando LC-MS-MS. Adicionalmente, as quantidades relativas do mesmo péptido em diferentes amostras podem ser determinadas. A capacidade de determinar rapidamente e sensivelmente a identidade e as quantidades relativas de péptidos em várias amostras permite a obtenção do perfil de expressão. Por isso, é um objectivo desta invenção proporcionar métodos melhorados para a análise comparativa de amostras de proteína complexas, com base no isolamento selectivo e no isolamento e marcação de péptidos. São discutidas duas abordagens publicadas para a análise global da expressão de proteínas e vários métodos para a análise de estados de proteínas particulares, tais como fosforilação e modificação de carbo-hidratos são também aqui descritos abaixo. 66

Isolamento do péptido terminal para o perfil global da expressão de proteínas 0 isolamento de péptidos N- ou C-terminais foi descrito como um método para determinar um perfil de expressão global de uma amostra de proteína. 0 isolamento de péptidos terminais assegura que pelo menos um e apenas um péptido por proteína é isolado, assegurando assim que a complexidade da amostra que é analisada não tem mais componentes do que a amostra original. Reduzindo grandes polipéptidos para péptidos mais curtos torna a amostra mais adequada a análise por espectrometria de massa. Os métodos para isolar péptidos dos terminais dos polipéptidos são discutidos nos documentos PCT/GB98/00201, PCT/GB99/03258.

Isolamento de péptidos contendo cisteina

Como discutido anteriormente, Gygi et al. (Nature Biotechnology 17: 994-999 1999) revela a utilização de "etiquetas de afinidade contendo isótopo" para a captura de péptidos das proteínas, para permitir a análise da expressão de proteína. Os autores relatam que uma grande proporção de proteínas (>90%) em leveduras tem, pelo menos, um resíduo de cisteina (em média existem 5 resíduos de cisteina por proteína) . A redução de ligações persulfureto numa amostra de proteína e protecção de tióis livres com iodoacetamidilbiotina resulta na marcação de todos os resíduos de cisteina. As proteínas marcadas são então digeridas com tripsina, por exemplo, e os péptidos marcados com cisteina podem ser isolados utilizando esferas avidinadas. Estes péptidos capturados podem ser então analisados 67 por espectrometria de massa em tandem cromatografia líquida (LC-MS/MS) para determinar um perfil de expressão para a amostra de proteína. Podem ser comparadas duas amostras de proteína por marcação dos resíduos de cisteína com uma etiqueta de biotina modificada isotopicamente diferente. Esta abordagem é ligeiramente mais redundante do que uma abordagem baseada no isolamento de péptidos terminais como, em média, mais do que um péptido por proteína é isolado por isso existem mais espécies de péptidos na amostra do que espécies de proteína. Este aumento na complexidade é piorado pela natureza das etiquetas utilizadas por Gygi et al.

Como discutido acima, as etiquetas de afinidade descritas por Gygi et al. possuem algumas desvantagens. A marcação de cada amostra com uma variante de isótopo diferente da etiqueta de afinidade resulta num pico adicional no espectro de massa para cada péptido em cada amostra. Isto significa que, se duas amostras são analisadas em conjunto, existirão o dobro dos picos no espectro. De um modo semelhante, se são analisadas três amostras em conjunto, o espectro será três vezes mais complexo do que para uma amostra isoladamente. Outra limitação que é relatada pelos autores de cada artigo acima, é a alteração de mobilidade provocada pelas etiquetas. Os autores relatam que os péptidos marcados com uma etiqueta de biotina deuterada eluem ligeiramente após o mesmo péptido marcado com uma etiqueta não deuterada. Isto significa que a análise comparativa de amostras múltiplas será muito difícil utilizando os métodos de Gygi et al. devido à complexidade dos espectros de massa e à complexidade dos passos cromatográficos se forem analisadas mais do que 2 amostras. 68

Um método melhorado para analisar amostras de proteína através da marcação de resíduos de cisteína é contemplado utilizando etiquetas da forma apresentada na Figura 8. Esta Figura ilustra um par de etiquetas de afinidade melhoradas derivadas de metionina. Formas diferentes de metionina isotopicamente substituídas seriam utilizadas para preparar as duas etiquetas diferentes. A massa total de cada das duas etiquetas é igual, mas a metionina N-terminal em cada etiqueta diferem uma da outra etiqueta em três Daltons. 0 grupo alfa amino da etiqueta dipéptido foi guanidinada para diferenciar o produto de fragmentação deste aminoácido do produto de fragmentação do segundo resíduo de metionina e os resíduos de metionina naturais em proteína e para promover a protonação nesta posição na etiqueta durante a ionização num espectrómetro de massa. Adicionalmente, estas etiquetas compreendem uma funcionalidade de maleimida reactiva ao tiol.

Numa forma de realização do segundo aspecto desta invenção, um protocolo para a análise de uma amostra de proteína contendo polipéptidos com resíduos de cisteína compreende os passos de: 1. Reduzir e reagir todos os resíduos de cisteína em pelo menos uma amostra de proteína com uma etiqueta de massa de ligando de afinidade de maleimida; 2. Clivar os polipéptidos com uma endoprotease específica para a sequência; 3. Capturar péptidos etiquetados num suporte sólido derivado da avidina; e 4 Analisar os péptidos etiquetados capturados por LC-MS-MS. 69

As amostras de proteína podem ser digeridas com a endoprotease específica para a sequência antes ou após a reacção da amostra com a etiqueta de massa do ligando de afinidade.

Isolamento de proteínas modificadas com carbo-hidratos

Os carbo-hidratos estão frequentemente presentes como uma modificação pós-tradução das proteínas. Várias técnicas de cromatografica de afinidade para o isolamento destes tipos de proteínas são conhecidos (Para uma revisão, ver Gerard C., Methods Enzymol. 182: 529-539, "Purification of glycoproteins". 1990). São conhecidos uma variedade de receptores de proteína naturais para carbo-hidratos. Os membros desta classe de receptores, conhecidos como lectinas, são altamente selectivos para funcionalidade de carbo-hidratos particulares. As colunas de afinidade derivadas com lectinas específicas podem ser utilizadas para isolar proteínas com modificações de carbo-hidratos particulares, enquanto que as colunas de afinidade que compreendem uma variedade de diferentes lectinas podem ser utilizadas para isolar populações de proteínas com uma variedade de diferentes modificações de carbo-hidratos. Numa forma de realização do segundo aspecto desta invenção, um protocolo para a análise de uma amostra de proteínas que contém proteínas modificadas com carbo-hidratos, compreende os passos de: 1. Tratar a amostra com um reagente de clivagem específico da sequência, tal como Tripsina ou Lys-C; 2. Passar a amostra de proteína através de colunas de afinidade contendo derivados de lectinas ou de ácido borónico para isolar apenas péptidos modificados com carbo-hidratos; 70 3. Marcar os péptidos modificados com açúcar capturado no grupo alfa amino livre, criados por clivagem especifica da seguência, utilizando as etiguetas de massa péptido desta invenção; e 4. Analisar os péptidos etiguetados por LC-MS-MS.

Uma etiqueta activada por N-hidroxissuccinimida pode ser utilizada para marcar os grupos alfa-amino livres. Se é utilizado Lys-C, então cada péptido modificado por carbo-hidrato temrá um grupo épsilon-amino livre, bem como um grupo alfa amino livre, podendo ser ambos etiquetados.

Muitos carbo-hidratos possuem grupos diol vizinhos presentes, i. e., grupos hidroxilo presentes em átomos de carbono adjacentes. Os dióis contendo carbo-hidratos que contêm dióis vizinhos numa configuração 1,2-cis-diol reagirão com derivados de ácido borónico para formar ésteres cíclicos. Esta reacção é favorecida a pH básico mas é facilmente revertida a pH ácido. Os derivados de ácido fenilborónico imobilizados na resina foram utilizados como ligandos para captura de afinidade de proteínas com cis-diol contendo carbo-hidratos. Numa forma de realização do quarto aspecto desta invenção, pode ser sintetizado um conjunto de ligandos de afinidade de etiquetas de massa de péptido compreendendo biotina ligada a uma entidade de ácido fenilborónico, como apresentado na Figura 6b. Estas etiquetas de ácido borónico podem ser utilizadas para marcar duas amostras separadas compreendendo péptidos ou proteínas com modificações de carbo-hidrato que contêm cis-dióis vizinhos. Noutra forma de realização do segundo aspecto desta invenção, um protocolo para a análise de uma amostra de proteína contendo polipéptidos modificados com carbo-hidratos compreende os passos de: 71 1. Reagir, pelo menos, uma amostra de proteína a pH básico com uma etiqueta de massa de ligando de afinidade de ácido borónico, 2. Clivar os polipéptidos com uma endoprotease específica para sequência, 3. Capturar péptidos marcados para uma avidina derivada de suporte sólido; e 4. Analisar os péptidos etiquetados capturados por LC-MS-MS. A amostra pode ser digerida com uma endoprotease específica para a sequência antes ou após a reacção da amostra com a etiqueta de massa de ligando de afinidade.

Vicinal-dióis, em ácidos siálicos, por exemplo, também podem ser convertidos em grupos carbonilo por clivagem oxidativa com periodato. A oxidação enzimática de açúcares contendo galactose terminal ou galactosamina com oxidase de galactose também podem converter os grupos hidroxilo nestes açúcares em grupos carbonilo. Os carbo-hidratos complexos podem, também, ser tratados com enzimas de clivagem de carbo-hidratos, tal como neuramidase que remove selectivamente modificações específicas de açúcar deixando para trás açúcares que podem ser oxidados. Estes grupos carbonilo podem ser etiquetados permitindo que proteínas que comportam estas modificações sejam detectadas ou isoladas, os reagentes hidrazida, tais como hidrazida de

Biocitina (Pierce & Warriner Ltd, Chester, Reino Unido) reagirão com os grupos carbonilo em espécies de carbo-hidratos contendo carbonilo (E. A. Bayer et al., Anal. Biochem. 170: 271-281, "Biocytin hidrazide-a selective label for sialic acids, galactose, and other sugars in glycoconjugates using avidin 72 biotin technology", 1988). Alternativamente, um grupo carbonilo pode ser etiquetado com uma biotina modificada com uma amina, tal como Biocytin e EZ-LinkTM PEO-Biotin (Pierce & Warriner Ltd, Chester, Reino Unido), utilizando alquilação redutora (Means G. E., Methods Enzymol 47: 469-478, "Reductive alkylation of amino groups". 1977; Rayment I., Methods Enzymol 276: 171-179, "Reductive alkylation of lysine residues to alter crystallization properties of proteins". 1997). As proteínas que comportam modificações de carbo-hidratos contendo dióis vizinhos numa mistura complexa podem, deste modo, ser biotinilados. As proteínas biotiniladas, uma vez modificadas por carbo-hidratos, podem, então, ser isoladas utilizando um suporte sólido avidinado.

Pode ser sintetizado um conjunto de etiquetas de massa de péptido de acordo com esta invenção para a análise de péptidos modificados com carbo-hidratos que foram oxidados com periodato, como apresentado na Figura 6a. A Figura 6a apresenta um conjunto de duas etiquetas derivadas de metionina. Serão utilizadas diferentes formas de metionina isotopicamente substituída para preparar as duas etiquetas diferentes. A massa total de cada das duas etiquetas é a mesma, mas a metionina N-terminal em cada etiqueta difere da outra etiqueta por três Daltons. 0 grupo alfa amino do dipéptido etiqueta foi guanidinado para diferenciar o produto de fragmentação deste aminoácido a partir do produto de fragmentação do segundo resíduo de metionina e para promover a protonação nesta posição na etiqueta durante a ionização num espectrómetro de massa.

Uma segunda forma de realização do segundo aspecto desta invenção compreende os passos de: 73 1. Tratar a amostra de polipéptidos com periodato, de modo que os carbo-hidratos com cis-dióis vicinais em glicopéptidos ganhem uma funcionalidade carbonilo; 2. Marcação desta funcionalidade carbonilo com uma etiqueta de massa do péptido activado com hidrazida ligado a biotina, como apresentado na Figura 6a; 3. Digestão da amostra de proteína com uma endoprotease específica para a sequência; 4. Capturar péptidos etiquetados num suporte sólido derivado de avidina; e 5. Análise dos péptidos biotinilados por LC-MS-MS. A amostra de proteína pode ser digerida com endoprotease específica para a sequência antes ou depois da reacção da amostra com a etiqueta de massa do ligando de afinidade.

Isolamento de Fosfopéptidos A fosforilação é uma modificação pós-tradução ubíqua reversível que aparece na maioria das vias de sinalização de quase todos os organismos uma vez que a fosforilação é vastamente utilizada como um sinal transiente para mediar alterações no estado das proteínas individuais. É uma área importante de investigação e as ferramentas que permitem a análise da dinâmica da fosforilação são essenciais para a compreensão global de como as células respondem a estímulos, o que inclui as respostas de células a fármacos. 74

As técnicas para a análise de péptidos contendo fosfosserina e fosfotreonina são bem conhecidas. Uma classe destes métodos é baseada numa reacção bem conhecida para a beta-eliminação de fosfatos. Esta reacção resulta na formação de desidroalanina e metildesidroalanina por fosfosserina e fosfotreonina que são ambas aceitadores de Michael e reagem com tióis. Isto foi utilizado para introduzir grupos hidrofóbicos para cromatografia de afinidade (Ver por exemplo, Holmes C. F., FEBS Lett 215 (1): 21-24, "A new method for the selective isolation of phosphoserine-containing peptides". 1987). Os ligantes ditiol foram também utilizados para introduzir fluoresceína e biotina em péptidos contendo fosfosserina e fosfotreonina (Fadden P, Haystead TA, Anal Biochem 225 (1) : 81-8, "Quantitative and selective fluorophore labelling of phosphoserine on peptides and proteins: characterization at the attomole levei by capillary electrophoresis and laser-induced fluorescence". 1995; Yoshida 0. et al., Nature Biotech 19: 379-382, "Enrichment analysis of proteins phosphorylated as a tool for probing the fosfoproteome", 2001). 0 método de Yoshida et al. para o enriquecimento por afinidade de proteínas fosforiladas em serina e treonina pode ser melhorado utilizando a etiqueta maleimida apresentada na figura 8 para permitir a comparação de amostras múltiplas. Isto será, particularmente, útil para a análise da dinâmica das cascatas de fosforilação.

Um péptido etiqueta da forma apresentada na figura 7 deve permitir a marcação directa de resíduos fosfotreonina e fosfosserina beta-eliminados sem um ligante ditiol. A etiqueta tetrapéptido da figura 7 é derivada de metionina. As diferentes formas isotopicamente substituídas de metionina serão utilizadas para preparar as duas etiquetas diferentes. A massa total de cada das duas etiquetas é a mesma, mas a metionina N-terminal em 75 cada etiqueta difere da outra etiqueta por três Daltons. 0 grupo alfa amino da etiqueta dipéptido foi guanidinada para diferenciar o produto de fragmentação deste aminoácido a partir do produto de fragmentação do segundo residuo de metionina e resíduos naturais de metionina em proteínas e para promover a protonação nesta posição na etiqueta durante a ionização num espectrómetro de massa. 0 péptido etiqueta é guanidinado no terminal N para proporcionar sensibilidade melhorada e para distinguir o resíduo N-terminal do resíduo C-terminal. 0 resíduo de cisteína proporciona um tiol livre que pode atacar de modo nucleofílico a desidroalanina e metildesidroalanina. É conhecido um protocolo melhorado para o processo de marcação com base na beta-eliminação. Este processo melhorado envolve a catálise por bário. (Byford M. F., Biochem J. 280: 261-261, "Rapid and selective modification of phosphoserine residues catalysed by Ba2+ ions for their detection during peptide microsequencing". 1991). Esta catálise torna a reacção 20 vezes mais rápida

reduzindo as reacções colaterais a níveis não detectáveis. O péptido etiqueta apresentado na figura 7 pode ser facilmente acoplado a desidroalanina ou metildesidroalanina produzida a partir da beta-eliminação de fosfatos utilizando catálise por bário. Assim, numa outra forma de realização do segundo aspecto desta invenção, os péptidos fosforilados na serina e treonina podem ser analisados num método compreendendo os passos de: 1. Tratar a amostra de polipéptidos com hidróxido de bário para beta-eliminar grupos fosfato de fosfosserina e fosfotreonina; 2. Marcação das funcionalidades da desidroalanina ou metildesidroalanina resultantes com a etiqueta de massa 76 do péptido activado com tiol ligada a biotina, como apresentado na Figura 7; 3. Digestão da amostra de proteína com uma endoprotease específica para a sequência, 4. Captura dos péptidos etiquetados num suporte sólido derivado da avidina; e 5. Análise dos péptidos biotinilados por LC-MS-MS. A amostra de proteína pode ser digerida com a endoprotease específica para a sequência antes ou depois da reacção da amostra com a etiqueta de massa do ligando de afinidade. Vários grupos de pesquisa reportaram a produção de anticorpos que se ligam a resíduos de fosfotirosina numa vasta variedade de proteínas. (ver, por exemplo, A. R Frackelton et al., Methods Enzymol 201: 79-92, "Generation of monoclonal antibodies against phosphosfotyrosine and their use for affinity purification of phosphosfotyrosine-containing proteins"., 1991 e outros artigos deste tema de Methods Enzymol.) . Isto significa que uma proporção significativa de proteínas que foram modificadas pós-tradução por fosforilação da tirosina podem ser isoladas por cromatografia de afinidade utilizando estes anticorpos como o ligando da coluna de afinidade.

Estes anticorpos de ligação a fosfotirosina podem ser utilizados no contexto desta invenção para isolar péptidos a partir de proteínas contendo resíduos de fosfotirosina. As proteínas com tirosina fosforilada numa mistura complexa podem ser isoladas utilizando colunas de afinidade de anticorpo 77 anti-fosfotirosina. Numa forma de realização adicional do segundo aspecto desta invenção, um protocolo para a análise de uma amostra de proteínas que contém proteínas fosforiladas na tirosina, compreende os passos de: 1. Tratar a amostra com um reagente de clivagem específico da sequência tal como Tripsina ou Lys-C; 2. Passar a amostra de proteína através de colunas de afinidade que contêm anticorpos anti-fosfotirosina para isolar apenas péptidos modificados com fosfotirosina; 3. Marcação dos fosfopéptidos capturados no grupo alfa amino livre produzido pela clivagem específica da sequência, utilizando as etiquetas de massa do péptido desta invenção; e 4. Análise dos péptidos etiquetados por LC-MS-MS.

Uma etiqueta activada por N-hidroxissuccinimida pode ser utilizada para marcar os grupos alfa-amino livres. A Cromatografia de Afinidade com Metal Imobilizado (IMAC) representa uma outra técnica para o isolamento de fosfoproteínas e fosfopéptidos. Os fosfatos aderem a resinas compreendendo iões metálicos trivalentes particularmente a iões Gálio (III) (Posewitch, M. C. e Tempst, P., Anal. Chem., 71: 2883-2892, "Immobilized Gallium (III) Affinity Chromatography of Phosphopeptides", 1999) . Esta técnica é vantajosa uma vez que pode isolar péptidos e proteínas com serina/treonina fosforiladas e tirosina fosforilada simultaneamente. 78 A IMAC pode, deste modo, ser também utilizada no contexto desta invenção para a análise de amostras de proteínas fosforiladas. Numa outra forma de realização do segundo aspecto desta invenção, um protocolo para a análise de uma amostra de proteínas que contém proteínas fosforiladas, compreende os passos de: 1. Tratar a amostra com um reagente de clivagem específico de sequência tal como Tripsina ou Lys-C; 2. Passar a amostra de proteína através de uma coluna de afinidade compreendendo iões metálicos imobilizados para isolar apenas péptidos fosforilados; 3. Marcação dos fosfopéptidos capturados no grupo alfa amino livre produzido pela clivagem específica da sequência, utilizando as etiquetas de massa de péptido desta invenção; e 4. Análise dos péptidos etiquetados por LC-MS-MS.

Uma etiqueta activada por N-hidroxissuccinimida pode ser utilizada para marcar os grupos alfa-amino livres.

Numa forma de realização alternativa do segundo aspecto desta invenção, a amostra de proteínas fosforiladas pode ser analisada através do isolamento de proteínas fosforiladas seguido por análise dos péptidos N ou C terminais das fosfoproteínas. As técnicas para o isolamento de péptidos terminais são reveladas em vários pedidos de patentes, e. g., os documentos W098/32876, WO 00/20870 e EP 01304975.4. Um protocolo 79 para a análise de uma amostra de proteínas que contêm proteínas fosforiladas, deve compreender os passos de: 1. Passar a amostra de proteína através de uma coluna de afinidade compreendendo iões metálicos imobilizados para isolar apenas proteínas fosforiladas; 2. Isolar péptidos do terminal C e/ou N das proteínas fosforiladas capturadas; 3. Marcação dos péptidos terminais capturados, utilizando as etiquetas de massa de péptidos desta invenção; e 4. Analisar os péptidos etiquetados por LC-MS-MS.

Exemplos

Exemplo 1-Sínteses de X-Metd3-Met-Gly-0H (A) e de X-Met_Metd3-Gly-OH (B)

Um par de péptidos foram sintetizados utilizando técnicas de síntese convencionais automatizadas para ilustrar as caracteristicas desta invenção (ambos com início a partir de resina Fmoc-Gly-Trt-PS, comercialmente disponível de Rapp

Polymere, Alemanha) . Os dois péptidos A e B são apresentados na Figura 10 e serão referidos como os dois péptidos Met-Met-Gly (D3) . A metionina deuterada (Metd3) está disponível em ISOTEC Inc, Miamisburg, Ohio, EUA. O reagente Fmoc para utilização num 80 sintetizador de péptidos deve, contudo, ser sintetizado manualmente a partir da metionina deuterada não protegida. Síntese de N-(9-Fluorenilmetoxicarbonil)-L-metionina-metil-d3 (Fmoc-Metd3) A síntese de Fmoc-Metd3 (apresentada na Figura 9a) foi efectuada em dois passos. 1. Síntese de carbonato de 9-fluorerílmetíl-pentafluorfenílo

Foram adicionados 8,4 mL (60 mmol) de trietilamina a 0 °C a uma mistura de 11 g (60 mmol) de pentafluorofenol e 15,5 g (60 mmol) de éster de ácido clorofórmico e (9-fluorenilmetilo) em 100 mL de éter seco. Após 2 horas de reacção, foram vertidos 20 mL de água gelada na solução. A camada orgânica foi lavada duas vezes com água, seca. Após evaporação do solvente, o produto obtido foi cristalizado a partir de heptano. Rendimento: 16,4 g (67%) . 2. Síntese de N-(9-Fluorenilmetoxicarbonil)-L-metionina-metil-d3

Foram suspendidas 2,2 g (14,5 mmol) de L-metionina-metil-d3 (Metd3) em 50 mL de acetona. Foram adicionadas 2,5 g (29 mmol) de hidrogenocarbonato de sódio e 60 mL de água e depois 5,7 g (14 mmol) de carbonato de 9-fluorenilmetil-pentafluorofenilo à suspensão agitada. Após 48 horas de reacção, o pH da solução límpida foi alterada para pH 3 e a camada orgânica foi extraída 81 por acetato de etilo. Após secagem da camada orgânica extraída, o acetato de etilo foi evaporado e o produto foi precipitado por adição de heptano. Esse processo (diluição com acetato de etilo e precipitação por hexano) foi repetido duas vezes antes de obter o produto puro, Fmoc-Metd3. (Rendimento: 5,0 g (92%); Pf: 126-128 °C; [a]D20= -30°, c=l, DMF) .

As sequências da reacção do sintetizador de péptidos para a preparação dos dois péptidos apresentados na Figura 10 são listadas a seguir.

Sequência de Péptido (A) • Tumefacção de 50 mg de resina Fmoc-Gly-Trt-PS durante 5 min em 2 mL de dimetilformamida (DMF); • Remoção do grupo Fmoc com piperidina em DMF seguindo protocolos convencionais; • Dissolução de 49 mg (0,32 mmol) de 1-hidroxibenzotriazole (HOBt) em 800 pL de DMF; • Adição de 120 mg (0,32 mmol) de Fmoc-Met à solução de HOBt; esta solução foi adicionada à resina e incubada durante 3 min; • Foram então adicionados 50 pL (0,32 mmol) de diisopropilcarbodiimida (DIC); tempo de acoplamento (0,4 M de aminoácidos activados) • Remoção do grupo Fmoc com piperidina em DMF seguindo protocolos convencionais. • Dissolução de 49 mg (0,32 mmol) de HOBt em 800 pL de DMF; • Adição a 120 mg (0,32 mmol) de Fmoc-Metd3; esta solução foi adicionada à resina e incubada durante 3 min; 82

Foram então adicionados 0,50 pL (0,32 mmol) de DIC; tempo de acoplamento (0,4 M de aminoácidos activados)

Remoção do grupo Fmoc com piperidina em DMF seguindo protocolos convencionais;

Foram dissolvidos 150 mg (0,32 mmol) de "Boc2X-OSu" em 800 pL de DMF e esta solução foi adicionada à resina;

Foram, então, adicionados à resina 53 pL de

Diisopropiletilamina (DIPEA), e o acoplamento foi deixado prosseguir durante 3 horas (espécie activada com 0,4 M);

Após lavagem da resina, a substância desejada foi clivada a partir da resina com 1 pL de TFA contendo 2,5% de H2O, EtsSiH e tioanisole cada em 1 h;

Adição de 30 mL de água à solução de TFA após filtração, removendo todo o solvente por liofilização.

Resultou um pó branco de sequência de péptido (A).

Sequência de Péptido (B)

Tumefacção de 50 mg de resina 5 min em 2 mL DMF;

Dissolução de 49 mg (0,32 mmol) de HOBt em 800 pL de DMF; Adição a 120 mg (0,32 mmol) deFmoc-Metd3; esta solução foi adicionada à resina e incubada durante 3 min; 50 pL (0,32 mmol) de DIC foi adicionado; tempo de acoplamento (0,4 M de aminoácidos activados);

Remoção do grupo Fmoc com piperidina em DMF seguindo protocolos convencionais; • Dissolução de 49 mg (0,32 mmol) de HOBt em 800 pL de DMF; • Adição a 120 mg (0,32 mmol) de Fmoc-Met; esta solução foi adicionada à resina e incubada durante 3 min; • Foram adicionados 50 yL (0,32 mmol) de DIC; tempo de acoplamento (0,4 M de aminoácidos activados). • Remoção do grupo Fmoc com piperidina em DMF seguindo protocolos convencionais; • Foram dissolvidos 150 mg (0,32 mmol)de "Boc2X-OSu" em 800 pL de DMF e esta solução foi adicionada à resina; • Foram adicionados 53 pL de DIPEA, 3 h de tempo de acoplamento (0,4 M de espécies activadas) • Após lavagem da resina, a substância desejada foi clivada a partir da resina com 1 mL de TFA contendo 2,5% de H20, Et3SiH e tioanisole, cada 1 h; • Adição de 30 mL de água à solução de TFA após filtração e remoção de todo o solvente por liofilização.

Resultou um pó amarelo claro da sequência de péptido (B).

HPLC

Após clivagem, cerca de 80% de produto puro foi obtido para cada péptido. Os produtos foram então purificados por HPLC.

MS A identidade dos péptidos A e B foi confirmada por espectrometria de massa. Uma proporção massa-para-carga de 496 foi observada como pico principal em ambos os espectros de massa MALDI e ESI para ambos os produtos que coincide com a massa 84 calculada de ambos os péptidos. Um espectro de massa da análise de uma mistura de péptidos A e B por espectrometria de massa ESI é apresentado na Figura 11. Pode ser observado que os dois péptidos possuem um espectro de massa que se sobrepõe quase exactamente, de acordo com o esperado.

MS/MS A figura 13 apresenta o mecanismo de reacçâo de fragmentação proposto para os produtos de dissociação induzida por colisão dos péptidos A e B modelo apresentados na figura 10. A figura 12 apresenta um par dos espectros ESI MS/MS produzidos por um espectrómetro de massa de captura de iões LCQ de Finnigan MAT. Os espectros ESI MS/MS mostram os produtos de fragmentação dos péptidos A e B. Os fragmentos ião b2 desejados (ver Figura 10) tem uma intensidade elevada para ambas as substâncias (273 após perda de amónia para A e 270 após perda de amónia para B) . A figura 14 apresenta um espectro ESI-MS/MS dos produtos de fragmentação a partir da análise de uma mistura de péptidos A e B. A e B estavam presentes na mistura numa proporção de 70:30, respectivamente. Esta proporção pode ser observada nas intensidades dos picos dos fragmentos ião b2 a m/z 273 e 270 para os péptidos A e B respectivamente. Este espectro mostra que as etiquetas podem revelar a proporção dos seus péptidos associados quando são comparados pares de amostras. A figura 15 mostra uma curva de regressão linear para uma série de experiências ESI-MS/MS com os péptidos A e B. O gráfico apresenta uma apresentação da proporção de A para B na mistura contra as intensidades observadas dos fragmentos iões b2 a partir da análise ESI-MS/MS das misturas. O gráfico mostra que 85 existe uma correspondência entre as proporções esperadas e observadas.

Exemplo 2 - Éster de ácido 6-[bis (terc-butil-oxicarbonil) guanidino]-hexanóico e N-hidroxissuccinimida A síntese do ligante éster de guanidino-activo apresentado na Figura 9b foi efectuada em 3 passos apresentados a seguir. 1. Síntese de ácido amino-iminometanossulfónico

Foram adicionados 50 mL de anidrido acético e 2 gotas de ácido sulfúrico conc. a 45 g (397 mmol) de peróxido de hidrogénio aquoso a 30% sob arrefecimento em gelo. Após 30 minutos, foram adicionados 100 mL (1157 mmol) de anidrido acético à solução a 10-12 °C mais uma vez. A mistura de reacção foi agitada durante a noite e alcançou a temperatura ambiente nessa altura. Após adição de 150 mL de metanol, a solução preparada a partir de 10 g (131 mmol) de tioureia em 500 mL de metanol foi gotejada lentamente na reacção a 15-20 °C. A reacção foi agitada a t.a. durante 48 horas. Após filtração, a solução foi condensada em 60 mL. o produto obtido foi filtrada e lavada com etanol e purificada por cristalização a partir de ácido acético (ca. 1 L). Rendimento: 6,0 g (37%). 2. Síntese de Ácido 6-Guanidino-hexanóico

Foram dissolvidas 6,5 g (50 mmol) de ácido 6-amino-hexanóico e 6,9 g (50 mmol) de carbonato de sódio e foram dissolvidas em 50 mL de água. Foram adicionadas 6,2 g (50 mmol) de ácido amino- 86 iminometanossulfónico com agitação da solução. Após 20 horas, o produto foi filtrado e lavado com ácido acético, metanol e depois, éter. Rendimento: 6,6 g (76%). 3. Síntese de Éster de ácido 6-[ (Bis (terc-butil-oxicarbonil)guanidino]-hexanóico e N-hidroxissuccinimida

Foram agitadas 9,5 g (55 mmol) de ácido 6-Guanidino-hexanóico e 55 g (270 mmol) de N,O-Bistrimetilsililacetamida em 100 mL de diclorometano e aquecidas sob refluxo até obter uma solução límpida (a reacção foi deixada durante aproximadamente 10 horas). Foram adicionadas 46 g (210 mmol) pirocarbonato de di-terc-butilo à solução à t.a. e a mistura de reacção foi aquecida sob refluxo durante 3 horas após ter sido agitada à t.a. durante 18 horas (durante a noite). A solução foi então arrefecida até à t.a. e lavada com uma solução de ácido cítrico a 10% e uma solução de cloreto de sódio. Após evaporação do solvente, o pirocarbonato foi destilado a 80-90 °C sob vácuo. O líquido viscose obtido (30 g) foi dissolvido em 100 mL de diclorometano com 8,6 g (75 mmol) de N-Hidroxissuccinimida. Foram adicionadas 15,5 g (75 mmol) de diciclo-hexilcarbodiimida (DCC) em porções a uma mistura de reacção com agitação à t.a. Após 17 horas, a ureia foi removida por filtração. A solução foi lavada com uma solução de ácido cítrico a 10% e após remoção do solvente, o produto foi purificado por cromatografia (sílica gel, solvente:diclorometano/acetato de etilo). O produto foi então cristalizado a partir de éter diisopropílico. Rendimento: 6,0 g (19%). Rf: 0,77 (diclorometano/acetato de etilo: 3/1). Pf: 108-109 °C. 87

Exemplo 3

Protocolos Experimentais

Dois pares de reagentes TMT são apresentados nas figuras 18a e 18b. Os reagentes são péptidos etiquetas de acordo com esta invenção compreendendo um aminoácido "etiqueta" ligado a um grupo de sensibilização ([1], [2], [3]) que é uma funcionalidade guanidino, um aminoácido de "normalização de massa" e no segundo par de etiquetas, um grupo de estimulação de clivagem que neste caso é a prolina ([4]). Estas etiquetas são concebidas para análise por dissociação induzida por colisão (CID) , o fragmento etiquetado é libertado para produzir um ião com uma proporção massa-para carga especifica. 0 modelo actualmente aceite de cisão de péptido durante CID requer protonação da coluna dorsal do péptido seguida por ataque nucleofilico da unidade carbonilo da amida protonada pelo seguinte resíduo carbonilo N-terminal na cadeia de péptido para formar uma oxazolona relativamente estável levando à cisão da ligação amida ([5]). 0 estimulador de sensibilização está ligado ao resíduo de metionina N-terminal por ligação amida mas a clivagem não ocorre nesta amida porque não existe uma amida correctamente posicionada para permitir a ciclização e a clivagem nesta posição, de modo que a clivagem só pode ocorrer entre os dois resíduos de metionina. Isto significa que a metionina N-terminal é distinguida da segunda metionina pela massa do grupo de sensibilização guanidino. Assim, cada par de etiquetas permite distinguir um par de péptidos por análise MS/MS. Cada etiqueta pode também comportar uma funcionalidade reactiva. Na figura, a funcionalidade reactiva, R, não é especificada mas pode ser um éster de N-hidroxissuccinimida que permite a marcação específica de grupos amino. Nitidamente, esta funcionalidade reactiva pode ser facilmente variada para permitir marcar diferentes nucleófilos biológicos. Adicionalmente, a concepção da etiqueta pode ser rapidamente modificada para acomodar um ligando de afinidade, tal como biotina. Além disso, deve ser óbvio que mais do que duas etiquetas podem ser produzidas para comparação de amostras adicionais ou para a introdução de padrões marcados.

Nos exemplos que se seguem, os péptidos, listados na Tabela 7, foram sintetizados como se fossem completamente marcados no grupo alfa amino com as etiquetas acima, i. e., a etiqueta foi "pré-incorporada" durante a sintese para testar o desempenho das etiquetas independentemente das reacções de marcação, de modo que, nos exemplos que se seguem o grupo "R" apresentado na Figura 18a e 18b é a sequência de péptido a que a etiqueta está ligada. Os péptidos etiquetados foram analisados por ESI-MS/MS e LC-ESI-MS/MS.

As figuras 18a e 18b apresentam as estruturas de duas versões dos marcadores TMT. As etiquetas são modulares compreendendo diferentes componentes funcionais que correspondem a componentes individuais sintéticos na sintese automatizada destes reagentes. Cada etiqueta compreende um grupo de sensibilização e um grupo de massa diferenciado que, em conjunto, compreendem o "fragmento etiqueta" que é realmente detectado. 0 fragmento etiquetado está ligado a um grupo de normalização de massa que assegura que cada etiqueta numa par de etiquetas partilha a mesma massa global e composição atómica. A primeira e segunda geração de etiquetas são distinguíveis pela presença de um grupo de estimulação de fragmentação adicional, prolina, na segunda geração de etiqueta. As etiquetas compreenderão adicionalmente uma funcionalidade reactiva (R) para permitir que a etiqueta seja acoplada a qualquer péptido, 89 mas nas presentes experiências, R é uma das várias sequências de péptidos. 0 fragmento proposto etiquetado que resulta dos marcadores é apresentado na Figura 18c com base em teorias correntes de mecanismos de fragmentação dependentes da protonação da coluna dorsal ([5]). Síntese de péptidos TMT marcados

Os péptidos apresentados na Tabela 7 foram sintetizados utilizando técnicas convencionais automatizadas de síntese Fmoc (ambas com início a partir de resina Fmoc-Gly-Trt-PS comercialmente disponível de Rapp Polymere, Alemanha). A metionina deuterada (Metd3) está disponível de ISOTEC lnc, Miamisburg, Ohio, EUA. Foi sintetizado um reagente Fmoc-Metd3 para utilização num sintetizador de péptidos manualmente a partir da metionina deuterada não protegida como descrito acima. 0 grupo guanidino de estimulação da sensibilização foi sintetizado como um éster de N-hidroxissuccinimida (NHS-éster) como descrito acima e adicionado a grupos desprotegidos alfa-amino de péptidos sintéticos por métodos convencionais durante a síntese automatizada de péptidos. 90

Tabela 7

Sequências de Péptido Geração 1 Geração 2 Mi Ião a (Z) m/ z Mi Ião a m/z (Z) IA TMT-GVATVSLPR 1319,7 660,9 (2 + ) 1415,7 708,9 (2 + ) 1B TMT-GVATVSLPR 1319,7 660, 9 (2 + ) 1415,7 708,9 (2 + ) 2A TMT- GLGEHNIDVLEGNEQFINAAK 2688,31 897,1 (3 + ) 2784,3 928,8 (3 + ) 2B TMT- GLGEHNIDVLEGNEQFINAAK 2688,31 897,1 (3 + ) 2784,3 928,8 (3 + ) 3A TMT-GNKPGVYTK 1383,7 462,2 (3 + ) 1479,7 494,3 (3 + ) 3B TMT-GNKPGVYTK 1383,7 462,2 (3 + ) 1479,7 494,3 (3+) 4A TMT- GDPAALKRARNTEAARRSRAR KLQRMKQGGC 3874,6 969,7 (4 + ) 3970,6 993,7 (4 + ) 4B TMT- GDPAALKRARNTEAARRSRAR KLQRMKQGGC 3874,6 969,7 (4 + ) 3970,6 993,7 (4 + )

Tabela 7: As experiências de proporção de abundância foram efectuadas com os péptidos listados acima. As experiências de HPLC foram efectuadas com as primeiras três sequências de péptido listadas acima. Os pares de péptidos sintéticos foram preparados com o primeiro ou segundo TMT pré-incorporado na 91 sequência de péptido no terminal N. Sequências, massa molecular mono-isotópica e proporções massa-para-carqa de espécies de iões predominantes são listadas para cada etiqueta.

Análise MS/MS de péptidos marcados com TMT

As análises foram efectuadas por espectrometria de massa cromatografia líquida utilizando um Finnigan LCQ Deca com um sistema Finnigan Surveyor HPLC (Coluna: 50 x 2,1 mm, 5 ym HyPURITY™ Elite C18) ou um QTOF 2 de Micromass Ltd, Manchester, RU, com um sistema Cap-LC HPLC de LEAP Technologies (Coluna: foi utilizada uma coluna PepMap C18 HPLC de Dionex com um diâmetro interno ampliado; a resina possuía um tamanho de partículas de 3 ym, 100 A de tamanho de poro).

As proporções de abundância dos iões foram determinadas por soma e determinação da média de vários espectros de um par de péptidos eluentes seguidos por determinação das proporções das intensidades dos picos para os fragmentos etiquetados.

Exemplo 3a-Comparação de etiquetas TMT de Ia e 2a geração

Para demonstrar as vantagens de uma etiqueta concebida com um grupo de estimulação de fragmentação, foram exploradas duas concepções diferentes de TMT. As etiquetas diferem pela inclusão de prolina nas etiquetas de 2a geração (Figuras 18a e 18b). A prolina é conhecida por facilitar a clivagem da ligação amida na sua extremidade N-terminal ([4]). 92

Experiências iniciais de fragmentação da Ia geração de TMT num instrumento Micromass QTOF 2 mostrou que a intensidade dos fragmentos TMT era muito dependente da sequência de aminoácidos do péptido e a baixas energias de colisão os fragmentos etiquetados não reflectiram de modo preciso as abundâncias dos péptidos etiquetados. Como apresentado na figura lc os fragmentos etiquetados esperados possuem um m/z de 287 ou 290 mas, na primeira geração de etiquetas, é observado um segundo par de iões com proporções massa-para-carga de 270 ou 273. Pensa-se que estes fragmentos resultam da perda de amónia a partir dos fragmentos etiquetados esperados. Um exemplo de um espectro tipico CID para um péptido marcado com a primeira geração de etiquetas é apresentado na Figura 19. A baixas energias de colisão, as intensidades destas duas classes de fragmentos variaram com a sequência do péptido ligado, mas a energias CID elevadas, os fragmentos 270/273 são observados quase exclusivamente. A estas energias de colisão elevadas, os fragmentos etiquetados 270/273 reflectiram com precisão as abundâncias dos pares de péptidos. As experiências adicionais utilizando um espectrómetro de captura de ião Finnigan LCQ apresentaram o mesmo perfil de fragmentação de QTOF para as unidades TMT de primeira geração. A perda de amónia observada ocorre tanto nas experiências em LCQ e QTOF. Estes instrumentos diferem na forma em que a CID é efectuada (activação selectiva e fragmentação de apenas o ião parental em LCQ versus a fragmentação em série de todos os iões em QTOF) . Uma vez que a perda de NH3 ocorre em ambos os instrumentos, isto sugere que a perda de NH3 pode ocorrer directamente a partir do péptido ião parental, em vez de resultar de subsequentes colisões dos fragmentos ião esperados e é uma caracteristica intrínseca desta estrutura da etiqueta. Em ambos os instrumentos a aparência do fragmento 270/273 é favorecida por energias de colisão mais 93 elevadas. Isto significa que para ter um comportamento consistente a partir desta análise da etiqueta têm que existir energias de colisão elevadas.

Embora a CID seja mais selectivo na LCQ é, infelizmente, limitada na sua utilização com TMTs uma vez que não é possível detectar pequenos produtos de fragmentação CID de precursores maiores com este tipo de instrumento. No instrumento QTOF, contudo, energias de colisão mais elevadas, as fragmentações consecutivas foram problemáticas. No Q-TOF, a série de fragmentos ião b- ou y- que proporcionam a informação de sequência são ainda fragmentados para produzir espécies mais pequenas de modo que não pode ser obtida informação de sequência a partir do péptido. Como resultado da necessidade de uma energia elevada de CID para garantir a libertação dos fragmentos etiquetados e para obter quantificação exacta, as unidades de TMT de primeira geração podem apenas ser utilizados de forma fiável para os objectivos de quantificação sem identificação do péptido em QTOF. Isto será também verdade para outros instrumentos de série MS/MS.

As Figuras 19a e 19b apresentam espectros típicos de CID para um péptido marcado com o TMT de primeira geração a energias de colisão de 40 V (Figura 19a) e 70 V (Figura 19b) . Na 19a podem ser observados picos fracos e ambas as regiões 270/273 e 287/290 a 40V, mas não representam com precisão as abundâncias dos péptidos etiquetados. Contudo, alguns iões de série y-específicos para a sequência podem ser observados a este potencial de aceleração. Em 19b os picos correspondentes ao fragmento etiquetado podem ser observados claramente a m/z 270 e 273 para o TMT de primeira geração a um energia de colisão de 70V. A esta energia de colisão, as intensidades destes picos 94 representam com precisão as abundâncias relativas de cada péptido (ver inserção para zoom da região da etiqueta na Figura 19b), mas não foram determinados resultados de sequência.

Estes resultados levam ao desenvolvimento de uma 2a geração de TMT que tem um residuo de prolina na unidade TMT para estimular a fragmentação. Para quantificar o efeito da prolina na segunda geração de etiquetas foi analisada uma mistura 50:50 de um péptido marcado com a primeira e segunda geração de etiquetas, respectivamente, por MS/MS. Os dois péptidos resultantes, com as sequências Guanidinocaproil-Met(D3)-Met-GLGEHNIDVLEGNEQFINAAK e Guanidinocaproil-Met(D3)-Pro-Met-GLGEHNIDVLEGNEQFINAAK, possuiam iões correspondentes às espécies [M+3H]3+ a proporções massa-para-carga de, aproximadamente, 897 e 929 para a primeira e segunda geração de etiquetas, respectivamente. Para conseguir as mesmas condições de colisão para ambos os precursores, os péptidos foram primeiro misturados e depois analisados num instrumento QTOF com o quadrupolo seleccionado para seleccionar alternativamente iões com m/z de cerca de 897 ou 929. Cada ião seleccionado foi submetido a CID a energias de colisão crescentes. A energias de colisão de 20 V ou menos, não foi observada qualquer fragmentação para qualquer tipo de TMT. A uma energia de colisão de 30 V-35 V é possível observar os fragmentos iões TMT a m/z de 290 no espectro CID para o péptido com a segunda geração de etiqueta mas sem iões de fragmento de m/z de 273 observados no espectro para o péptido com a primeira geração de etiqueta á mesma energia, ver Figura 20, embora possa ser observado um fragmento a m/z de 290. O fragmento etiquetado para o péptido contendo o TMT de primeira geração não é observado até uma energia de colisão de 70 V ser utilizada (dados não 95 apresentados). Péptidos mais pequenos marcados com o TMT de primeira geração deram origem ao fragmento etiquetado a energias mais baixas, mas foram necessárias energias de colisão elevadas para libertar o fragmento etiquetado a partir de péptidos maiores. A dependência do tamanho do péptido da energia necessária para libertar o fragmento etiquetado foi muito menor para a segunda geração de TMT. A comparação do espectro CID de péptidos marcados com TMTs contendo prolina com péptidos marcados com TMTs sem prolina mostra nitidamente que a introdução do aminoácido prolina como um estimulador de fragmentação leva a fragmentação a favor do fragmento etiquetado com TMT esperado sem a re-separação a energias de colisão muito altas. A estas baixas energias as proporções de abundância, também dos fragmentos iões TMT, dos TMT contendo prolina, reflectem com precisão as proporções das concentrações dos péptidos etiquetados. Adicionalmente, a identificação do péptido através das suas séries b e y, pode também ser efectuada a estas energias de colisão mais baixas.

As figuras 20a, 20b e 20c apresentam o espectro MS e MS/MS para iões triplamente carregados do péptido 2 (ver5 Tabela 7) marcados com a primeira e segunda geração de TMTs. Os péptidos foram analisados num instrumento QTOF II. A figura 20a apresenta o modo MS do espectro TOF da mistura de péptidos. Para a análise CID o primeiro quadrupolo foi seleccionado para seleccionar alternativamente os iões com m/z cerca de 897 ou 929. O espectro de CID a 35 V para Guanidinocaproil-Met (D3) -Met-GLGEHNIDVLEGNEQFINAAK é apresentado na Figura 20b e o espectro de CID a 35 V de Guanidinocaproil-Met (D3) -Pro-Met-GLGEHNIDVLEGNEQFINAAK é apresentado na Figura 20c. A presença do fragmento etiquetado esperado a m/z de 273 não é detectada para o TMT de primeira geração na Figura 20b, mas o fragmento 96 esperado a 290 é nitidamente observado a 35V para segunda geração de TMT na Figura 20c. O comportamento melhorado da segunda geração de TMT pode ser observado na Figura 21 que apresenta um espectro típico de um péptido marcado com estas etiquetas. Os fragmentos etiquetados revelando as proporções de abundância são facilmente observados aos valores m/z esperados de 287 e 290. Adicionalmente, é possível observar ambas os iões de série b e série y, permitindo determinar a sequência do péptido. A CID foi efectuada a uma energia de colisão relativamente baixa de 40 V. Os picos m/z 287 e 290 para a segunda geração de TMT a 40 V representam as abundâncias relativas de cada péptido (ver inclusão com ampliação da região relevante do espectro de massa). A Figura 22 mostra claramente que o estado e carga do péptido marcado com TMT não afecta a aparência dos fragmentos etiquetados no espectro de CID dos péptidos marcados. Neste exemplo, é apresentado um péptido marcado com um TMT de primeira geração mas verifica-se o mesmo resultado para as etiquetas de segunda geração. Isto é vantajoso na medida em que significa que o varrimento do espectro pode ocorrer sem ajustamentos complexos do programa de varrimento para compensar o estado de carga de cada péptido. Noutros processos de etiquetagem por isótopo, tal como ICAT, o estado de carga altera a diferença de massa entre cada par de iões etiquetados, de modo que para iões duplamente carregados a diferença de massa é reduzida a metade, para iões triplamente carregados a diferença de massa é um terço da dos iões de carga única, etc. o programa de computador para varrimento de pares de péptidos utilizando técnicas convencionais de marcação com isótopos, como ICAT, devem deste 97 modo, compensar estes problemas de separação permitindo as possíveis diferenças de massa diferentes ou ignorando determinadas classes de ião que ou aumentam a hipótese de identificação errónea de pares de péptidos ou a perde em pares de iões potenciais que podem oferecer informação útil.

Na figura 22, a comparação do espectro para 4 péptidos da Tabela 7 em que foi efectuada CID em espécies [M+4H]4+ (espectro inferior) e [M+5H]5+ (espectro superior). 0 péptido acima contém a primeira geração de TMT. 0 ião 4+ tem um m/z de 969,3 enquanto o ião 5+ tem um m/z de 775,6. 0 ião fragmento etiquetado aparece na proporção esperada massa-para-carga de 273 em ambos os espectros indicando que apenas uma carga localiza o fragmento etiquetado. A Figura 23 apresenta os dados para as proporções esperadas e observadas péptidos das análises ESI-MS/MS de 4 péptidos listados na Tabela 7. Os péptidos com a primeira e segunda geração de TMT neles incorporados foram analisados. As proporções de abundância foram determinadas por análise do pico máximo a d3 (A) e dO (B) dos picos dos iões do fragmento etiquetado após normalização dos picos a 290 e 287 para TMT2. As medições foram efectuadas num instrumento QTOF. A tabela introduzida na Figura 23 apresenta as proporções esperadas e observadas dos fragmentos de iões b da análise MS/MS dos péptidos eluentes marcados com TMT. Pode ser observado que ambas as gerações de TMT proporcionam a representação precisa das proporções de abundância dos péptidos nas misturas e que as etiquetas apresentam um comportamento linear ao longo de todo o intervalo de proporções de péptido testado. 98

Exemplo 3b - Demonstração de idêntico comportamento cromatográfico de etiquetas TMT em LC-MS

Uma mistura de quatro pares de péptidos sintéticos foi sintetizada com a segunda geração de unidades TMT pré-incorporadas no terminal N de cada péptido. Os pares de péptidos foram todos analisados em conjunto. Cada par de péptidos foi preparado a diferentes proporções. As sequências, massas mono-isotópicas teóricas, as massas de ião duplamente carregado são apresentadas na Tabela 7. Os péptidos foram aplicados numa coluna C-18 de fase reversa de HPLC e separados. 0 objective desta experiência foi demonstrar a exacta co-eluição dos pares de péptidos correspondentes com diferentes etiquetas TMT sem quaisquer outras complicações. As proporções dos pares de péptidos eram esperadas e verificaram-se consistentes ao longo de todo o tempo de eluição para cada par de péptidos e, deste modo, um outro objectivo desta experiência foi demonstrar que a quantificação dos pares de péptidos pode ser efectuada com a determinação simultânea da sequência e que é possível pesquisar outros péptidos sem esperar a eluição completa do péptido. A eluição completa de pares de péptidos é necessária para a quantificação precisa utilizando a estratégia ICAT e outras técnicas de análise de péptidos utilizando marcação convencional de isótopo. Isto restringe amplamente o processamento destas abordagens. A Figura 24 apresenta a co-eluição de cada par de péptido, os péptidos A e B para cada péptido da Tabela 7, claramente observado nos traços de HPLC de fase reversa em C18. Para cada péptido são registadas as correntes de ião 287 e 290 m/z correspondentes aos fragmentos etiquetados de cada dos TMT. O traço da base para cada péptido é a corrente total do ião. São 99 apresentados os perfis de eluição de 3 péptidos monitorizados a cada proporção de massa-para-carga proporções massa-para-carga dos iões b2 dos fragmentos etiquetados. Pode ser claramente observado que os pares de péptidos eluem como uma única fracção. No modo MS/MS, a monitorização dos iões do fragmento etiquetado produz virtualmente resultados idênticos em cada caso. Para cada par de péptidos, as proporções observadas coincidiram com as proporções esperadas num grau razoável.

Uma vez que os péptidos etiquetados co-eluem exactamente, as proporções dos pares de péptidos são conservadas ao longo do perfil de eluição, o que significa que não é necessário integrar a corrente total do ião para os iões eluentes para determinar a abundância relativa de cada par de péptidos.

Exemplo 3c-Análise da sensibilidade e robustez da tecnologia

TMT

Para proporcionar uma melhoria efectiva face a marcação de isótopos convencional, a tecnologia TMT deve ser, pelo menos, tão sensivel como outros métodos de marcação isotópica e deve ter um vasto intervalo dinâmico semelhante. Adicionalmente, as propriedades das etiquetas devem ser consistentes ao longo de todo o intervalo dinâmico esperado das amostras a ser analisadas. Finalmente, a capacidade destas etiquetas ultrapassarem o ruido no espectrómetro de massa necessitava de ser demonstrada. Para testar o intervalo dinâmico do sistema e para mostrar que as propriedades das etiquetas TMT são consistentes ao longo de todo o intervalo dinâmico, a conservação das proporções do péptido foi estudada num intervalo de diferentes concentrações de um dos péptidos sintéticos 100 etiquetados (péptido 3A e 3B). Como pode ser observado da Figura 25, uma diluição seriada de péptidos 3A e 3B, misturada numa proporção de 40:60, de 100 pmoles a 100 fmoles, as proporções foram fielmente conservadas com um desvio de 5% na maioria dos casos, a partir da proporção esperada. Estes e outros resultados (não apresentado) indicam que os péptidos com etiqueta não reduzem a sensibilidade intrínseca com que um péptido é detectado no modo MS/MS, i. e., a análise dos péptidos marcados com TMT por CID tem essencialmente a mesma sensibilidade dos péptidos MS/MS não marcados. A sensibilidade intrínseca parece ser específica do instrumento com base em comparações entre o LCQ e QTOF na análise de pequenos péptidos (os fragmentos etiquetados de grandes péptidos marcados com TMTs não podem ser detectados em LCQ devido às limitações intrínsecas de CID com este tipo de instrumento) . A sensibilidade com que é possível determinar a sequência de péptidos etiquetados não parece ter sido, significativamente, alterada em qualquer dos péptidos testados até agora. Podem ser detectadas diferenças significativas nas proporções dos péptidos ao longo de toda a gama de concentrações testada (Figura 25).

As Figuras 26a 26b e 26c mostram os resultados de uma

experiência de réplica, em que os pares de péptidos 3A e 3B (500 fmol no total, numa proporção de 40:60 respectivamente) , comportando uma segunda geração TMT foi misturada com uma digestão tríptica de Albumina de Soro Bovino (2 pmol). A figura 26a mostra o cromatograma do pico base da análise no modo MS. Durante a separação, os primeiros cinco picos mais intensos analisados no modo MS foram automaticamente fragmentados no modo MS/MS a 30V. Os pares de péptidos TMT foram investigados e localizados no cromatograma dos picos base. A proporção dos fragmentos TMT2 foi, então, calculada a partir do espectro MS/MS 101 para a massa [M+3H]3+ (é apresentada uma amplificação dos fragmentos com etiqueta na figura 9b e todo o espectro é apresentado na figura 9c) por comparação da intensidade das proporções massa-para-carga do fragmento TMT d3 e dO (287 e 290) .

Numa outra experiência, foi estudada a capacidade para detectar péptidos marcados num fundo de péptidos contaminantes. Os pares de péptidos 3A e 3B, comportando uma segunda geração de TMT, foram misturados com um excesso de 20 vezes de uma digestão triptica de Albumina do Soro Bovino. A mistura de péptidos foi então analisada num instrumento LC-QTOF. Os cinco iões mais intensos de cada eluição de varrimento foram submetidos a CID para identificar os péptidos. Os péptidos esperados foram detectados e a região do espectro correspondente aos fragmentos etiqueta foi analisada para determinar a proporção de abundância dos péptidos detectados. A análise por CID (energia de colisão de 30 V), proporciona o espectro apresentado na Figura 26c. Verificou-se que a proporção dos péptidos 3A e 3B era 39,3% a 60,7%, respectivamente, por comparação das intensidades dos picos nas proporções massa-para-carga do fragmento do ião de 290 (d3 unidades TMT) e 287 (dO unidades TMT). A proporção esperada era 4 0% de 3A a 60% de 3B, deste modo, a proporção de péptido foi detectada com um erro de 1,7%. A qualidade do espectro MS/MS obtido (Figura 26b e 26c) à baixa energia de colisão utilizada, permite uma clara identificação da sequência do péptido através de pesquisa em base de dados. Esta experiência mostra claramente que uma mistura complexa de péptidos trípticos não impede a análise de pares de péptidos marcados com etiquetas TMT de 2a geração e as TMTs podem ajudar a ultrapassar o ruído da amostra. Adicionalmente, não parecem existir quaisquer problemas de supressão - as proporções de péptidos presentes em baixas 102 concentrações podem ainda ser determinados na presença de outros péptidos que estão em concentrações elevadas.

Referências: 1. Brancia, F.L., S.G. Oliver, and S. J. Gaskell, Improved matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric analysis of tryptic hydrolysates of proteins followiozg guanidination of lysine-containing peptides. Rapid Commun Mass Spectrom, 2000.14(21): p. 2070-3. 2. Roth, K. D., et al., Charge derivatization of peptides for analysis by mass spectrometry. Mass Spectrom Rev, 1998.17 (4): p. 255-74. 3. Brancia, F. L., et al., A combination of Chemical derivatisation and improved bioinformatic tools optimises protein Identification for proteomics. Electrophoresis, 2001. 22(3): p. 552-9. 4. Schwartz, B. L. and Μ. M. Bursey, Some proline substituent effects in the tandem mass spectrum of protonated pentaalanine. Biol Mass Spectrom, 1992. 21(2): p. 92-6. 5. Schlosser, A. and W. D. Lehmann, Five-membered ring formation in unimolecular reactions of peptides. a key structural element controlling low-energy collision-induced dissociation of peptides. J Mass Spectrom, 2000.35(12): p. 1382-90. 103 6. Griffin, T. J., et al., Toward a high-throughput approach to quantitative proteomic analysis: expression-dependent protein Identification by mass spectrometry. J Am Soc Mass Spectrom, 2001.12 (12) : p. 1238-1246. 7. Zhou, H., J.D. Watts, and R. Aebersold, A systematic approach to the analysis of protein phosphorylation. Nat Biotechnol, 2001.19(4): p. 375-8. 8. Oda, Y., T. Nagasu, and B. T. Chait, Enrichment analysis of phosphorylated proteins as a tool for probing the phosphoproteome. Nat Biotechnol, 2001. 19 (4): p. 379- 82. 9. Ficarro, S. B., et al., Phosphoproteome analysis by mass spectrometry and its application to Saccharomyces cerevisiae. Nat Biotechnol, 2002. 20 (3): p. 301-5. 104

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> XZILLION GMBH & CO. KG <120> MARCADORES DE MASSA <130> 208649/CMH/AV <14 0> PCT/GB02/04240 <141> 2002-09-14 <150> EP01307830.8 <151> 2001-09-14 < 16 0 > 7 <17 0> Patentln versão 3.1 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> péptido marcado com TMT < 4 0 0 > 1

Gly Vai Ala Thr Vai Ser Leu Pro Arg 1 5 105 <210> 2 <211> 21 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <2 2 3> péptido marcado com TMT < 4 0 0 > 2 Gly Leu Gly Glu His Asn Ile Asp Vai Leu Glu Gly Asn Glu Gin Phe 1 5 10 15

Ile Asn Ala Ala Lys 20 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> péptido marcado com TMT < 4 0 0 > 3 Gly Asn Lys Pro Gly Vai Tyr Thr Lys 1 5 106 <210> 4 <211> 31 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> péptido marcado com TMT <400> 4

Gly Asp Pro Ala Ala Leu Lys Arg Ala Arg Asn Thr Glu Ala Ala Arg 15 10 15

Arg Ser Arg Ala Arg Lys Leu Gin Arg Met Lys Gin Gly Gly Cys 20 25 30 <210> 5 <211> 23 <212> PRT <213> Sequência Artificial <2 2 0> <22 3> péptido marcado com TMT de Ia geração <400> 5

Met Met Gly Leu Gly Glu His Asn Ile Asp Vai Leu Glu Gly Asn Glu 1 5 10 15 Gin Phe Ile Asn Ala Ala Lys 20 107 <210> 6 <211> 24 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <2 2 3> péptido marcado com TMT de 2a geração < 4 0 0 > 6

Met Pro Met Gly Leu Gly Glu His Asn Ile Asp Vai Leu Glu Gly Asn 1 5 10 15 Glu Gin Phe Ile Asn Ala Ala Lys 20 <210> 7 <211> 4 <212> PRT <213> Sequência Artificial <2 2 0> <223> péptido marcado com TMT de 2a geração < 4 0 0 > 7

Met Pro Met Gly 1

Lisboa, 18 de Dezembro de 2007 108

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Conjunto de dois ou mais marcadores de massa, cada marcador no conjunto compreendendo uma unidade de marcação de massa ligada via um ligante clivável tendo, pelo menos, uma ligação amida a uma unidade de normalização de massa, em que a massa agregada de cada marcador no conjunto pode ser a mesma ou diferente e a massa da unidade de marcação de massa de cada marcador no conjunto pode ser a mesma ou diferente, e em que o conjunto compreende um grupo de marcadores tendo uma unidade de marcação de massa de uma massa comum ou o conjunto compreende um grupo de marcadores tendo uma massa agregada comum, e em que qualquer grupo de marcadores no conjunto tendo uma unidade de marcação de massa de uma massa comum, cada marcador tem uma massa agregada diferente de todos os outros marcadores nesse grupo, e em que em qualquer grupo de marcadores no conjunto tendo uma massa agregada comum, cada marcador tem uma unidade de marcação de massa tendo uma massa diferente de todas as outras unidades de marcação de massa nesse grupo, de modo que todos os marcadores de massa no conjunto são distinguíveis uns dos outros por espectrometria de massa, e em que a unidade de marcação de massa compreende um aminoácido e a unidade de normalização de massa compreende um aminoácido.
2. Conjunto de marcadores de massa de acordo com a reivindicação 1, em que cada marcador no conjunto compreende uma unidade de marcação de massa tendo uma massa comum e cada marcador no conjunto tem uma massa agregada única. 1
3. Conjunto de marcadores de massa de acordo com a reivindicação 1, em que cada marcador no conjunto compreende uma unidade de marcação de massa tendo uma massa única.
4. Conjunto de marcadores de massa de acordo com a reivindicação 3, em que cada marcador de massa no conjunto tem uma estrutura básica comum, e cada unidade de normalização de massa no conjunto tem uma estrutura básica comum que pode ser igual ou diferente da estrutura básica comum das unidades de marcação de massa e em que cada marcador de massa no conjunto compreende uma ou mais unidades de ajustador de massa , estando as unidades de ajustador de massa ligadas a ou situadas na estrutura básica da unidade de marcação de massa e/ou na estrutura básica da unidade de normalização de massa, de modo que toda a unidade de marcação de massa no conjunto compreende um número diferente de unidades de ajustador de massa e cada marcador de massa no conjunto tem o mesmo número de unidades de ajustador de massa.
5. Conjunto de marcadores de massa de acordo com a reivindicação 4, tendo cada marcador de massa no conjunto a seguinte estrutura: M(A)y-L-X (A)z em que M é uma unidade de normalização de massa compreendendo um aminoácido, X é uma unidade de marcação de massa compreendendo um aminoácido, A é uma unidade de ajustador de massa, L é um ligante clivável compreendendo a 2 ligação amida, y e z são números inteiros de 0 ou superiores, e y+z é um número inteiro de 1 ou superior.
6. Conjunto de marcadores de massa de acordo com a reivindicação 4 ou reivindicação 5, em que a unidade de ajustador de massa é seleccionada de: a) um substituinte isotópico situado na estrutura básica da unidade de marcação de massa e/ou na estrutura básica da unidade de normalização de massa, e b) átomos ou grupos de substituintes ligados à estrutura básica da unidade de marcador de massa e/ou ligada à estrutura básica da unidade de normalização de massa.
7. Conjunto de marcadores de massa de acordo com a reivindicação 6, em que a unidade de ajustador de massa é seleccionada de um átomo de halogéneo substituinte, um grupo metilo substituinte e substituintes isotópicos 2H ou 13C.
8. Conjunto de marcadores de massa de acordo com a reivindicação 7, em que a unidade de ajustador de massa é um átomo de flúor substituinte.
9. Conjunto de marcadores de massa de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que o ligante clivável que liga a unidade de marcação de massa à unidade de normalização de massa é um ligante clivável por colisão induzida por dissociação. 3
10. Conjunto de marcadores de massa de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que o ligante clivável compreende prolina e/ou ácido aspártico.
11. Conjunto de marcadores de massa de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que a unidade de marcação de massa e/ou a unidade de normalização de massa compreende um grupo resistente a fragmentação.
12. Conjunto de marcadores de massa de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que a unidade de marcação de massa compreende um grupo de aumento de sensibilidade, tal como um grupo pré-ionizado.
13. Conjunto de marcadores de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que a unidade de marcação de massa ou a unidade de normalização de massa compreende uma funcionalidade reactiva.
14. Conjunto de marcadores de massa de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que cada marcador de massa no conjunto compreende um ligando de captura por afinidade, tal como biotina.
15. Conjunto de dois ou mais analitos, sendo cada analito diferente e estando ligado a um marcador de massa único ou a uma combinação única de marcadores de massa, de um conjunto de marcadores de massa como definido em qualquer das reivindicações 1-14.
16. Conjunto de analitos de acordo com a reivindicação 15, em que um ou mais analitos no conjunto é um analito padrão 4 tendo uma massa conhecida, ou tendo propriedades cromatográficas conhecidas.
17. Conjunto de duas ou mais sondas, sendo cada sonda no conjunto diferente e estando ligada a um marcador de massa único ou a uma combinação única de marcadores de massa, de um conjunto de marcadores de massa como definido em qualquer das reivindicações 1-14.
18. Conjunto de analitos ou sondas de acordo com qualquer das reivindicações 15-17, em que cada analito ou sonda está ligado a uma combinação única de marcadores de massa, sendo cada combinação distinguida pela presença e ausência de cada marcador de massa no conjunto de marcadores de massa e/ou a quantidade de cada marcador de massa ligada à sonda.
19. Conjunto de analitos ou sondas de acordo com qualquer das reivindicações 15-18, em que cada analito ou sonda compreende uma biomolécula.
20. Conjunto de analitos ou sondas de acordo com a reivindicação 19, em que a biomolécula é seleccionada de um ADN ou ARN, oligonucleótido, uma base de ácido nucleico, uma proteina e/ou um aminoácido.
21. Método de análise, que compreende detectar um analito por identificação por espectrometria de massa de um marcador de massa ou uma combinação de marcadores de massa relacionáveis com o analito, em que o marcador de massa é um marcador de massa de um conjunto de marcadores de massa como definido em qualquer das reivindicações 1-14. 5
22. Método de acordo com a reivindicação 21, em que os marcadores de massa empregues são marcadores compreendendo um ligando de captura por afinidade e os analitos marcados são separados dos analitos não marcados por captura através de ligando de captura por afinidade com um contra ligando.
23. Método de acordo com a reivindicação 21 ou reivindicação 22, em que dois ou mais analitos são detectados através de identificação simultânea dos seus marcadores de massa ou combinações de marcadores de massa por espectrometria de massa.
24. Método de acordo com qualquer das reivindicações 21-23, em que cada analito é identificado por uma combinação única de marcadores de massa de um conjunto ou matriz de marcadores de massa, sendo cada combinação distinguida pela presença e ausência de cada marcador de massa no conjunto ou matriz e/ou a quantidade de cada marcador de massa.
25. Método de acordo com qualquer das reivindicações 21-24 para identificar dois ou mais analitos, em que os analitos são separados de acordo com a sua massa, antes da detecção dos seus marcadores de massa por espectrometria de massa.
26. Método de acordo com a reivindicação 25, em que os analitos a ser identificados são misturados com um ou mais analitos padrão, tendo massa conhecida ou propriedades conhecidas no método de separação utilizado, para facilitar a caracterização dos analitos.
27. Método de acordo com a reivindicação 26, em que os analitos padrão são como definido na reivindicação 16. 6
28. Método de acordo com qualquer das reivindicações 25-27, em que a separação é efectuada através de um método cromatográfico ou electroforético.
29. Método de acordo com qualquer das reivindicações 21-28, em que o espectrómetro de massa empregue para detectar o marcador de massa compreende um ou mais analisadores de massa, analisadores de massa esses que são capazes de permitir que iões com uma massa particular, de intervalos de massa, passem para detecção e/ou são capazes de caEUAr a dissociação de iões.
30. Método de acordo com a reivindicação 29, em que os iões com uma massa particular ou de intervalo de massa específicos de um ou mais marcadores de massa conhecidos são seleccionados utilizando um analisador de massa, os iões seleccionados são dissociados e os produtos de dissociação são detectados para identificar perfis de iões indicativos dos marcadores de massa seleccionados.
31. Método de acordo com a reivindicação 29 ou reivindicação 30, em que o espectrómetro de massa compreende três ou mais analisadores de massa quadrupolos.
32. Método de acordo com a reivindicação 31, em que um primeiro analisador de massa é utilizado para seleccionar iões de uma massa ou intervalo de massa particular, um segundo analisador de massa é utilizado para dissociar os iões seleccionados e um terceiro analisador de massa é utilizado para detectar os iões resultantes. 7
33. Método de acordo com qualquer das reivindicações 21-32 que compreende: (a) contacto de um ou mais analitos com um conjunto de sondas, em que as sondas são as definidas em qualquer das reivindicações 17-20, (b) identificar um analito, por detecção de uma sonda relacionável com esse analito.
34. Método de acordo com a reivindicação 33, em que o marcador de massa é clivado da sonda antes da detecção do marcador de massa por espectrometria de massa.
35. Método de acordo com a reivindicação 33 ou reivindicação 34 que compreende o contacto de um ou mais ácidos nucleicos com um conjunto de sondas de hibridação.
36. Utilização de um marcador de massa de um conjunto de marcadores como definido em qualquer das reivindicações 1-14, num método de análise.
37. Utilização de acordo com a reivindicação 36 num método de análise electroforética bidimensional.
38. Utilização de acordo com a reivindicação 36 num método de análise de espectrometria de massa bidimensional.
39. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 36-38 num método de sequenciação de um ou mais ácidos nucleicos. 8
40. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 36-38 num método de perfil de expressão enica.
41. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 36-38 num método de perfil de expressão proteica.
42. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 36-38 num método de separação de ácidos nucleicos. Lisboa, 18 de Dezembro de 2007 9