CN110609103A - 基于化学标记和质谱的蛋白与材料相互作用结构分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于化学标记和质谱技术研究蛋白和材料相互作用的结构分析新方法。其特征为首先对蛋白质和蛋白质‑材料复合物分别进行化学标记,随后进行蛋白质的变性、酶解、色谱‑质谱联用分析和数据库检索,对比材料加入前后蛋白质上特定氨基酸位点的化学标记效率变化情况,标记效率明显下降区域即为蛋白质‑材料相互作用区域,标记效率明显上升区域即为结合材料后蛋白质构象变化区域。该蛋白质‑材料相互作用分析方法具有快速简单、稳定高效,灵敏度高、可高通量动态分析、在标记过程中蛋白质依然保持生理结构和活性、分析结果不受蛋白质分子量大小、纯度等条件限制等优势。
Description
技术领域
本发明属于利用蛋白质组学分析技术研究蛋白质和材料相互作用的研究领域,具体涉及一种基于化学标记和质谱技术的结构分析新方法,研究蛋白质和材料相互作用后蛋白质的构象变化区域以及蛋白质和材料的相互作用区域。
背景技术
目前,纳米材料作为诊断和治疗的工具已经被应用于生命科学、医学等领域,而一些纳米药物也已经进入到临床试验或者临床应用阶段。当这些材料进入机体后,材料会与机体内的蛋白质发生相互作用,引起一系列生物反应,这些材料是怎样和不同蛋白质结合,蛋白质在结合材料后构象会发生怎样的变化等这些机理却并不清楚。
目前常用的蛋白质结构分析技术包括X射线晶体衍射法和核磁共振法。但是,X射线晶体衍射需要制备蛋白质晶体样品,但是蛋白质的纯度等将会显著影响蛋白质晶体的生长。此外,蛋白质分子量的大小以及其水溶性同样影响着核磁共振的适用性。而基于质谱的结构分析技术则不受蛋白质分子量大小、纯度等条件限制。因此,与其他结构分析技术在提供蛋白质结构信息方面相比,基于质谱的结构分析技术有着巨大的优势。
在应用质谱技术对蛋白质结构进行分析时,通常需要结合化学标记方法,其中,氢氘交换和共价化学标记是最常用的标记方法。但是,氢氘的“回交”效应在很大程度上影响了结合氢氘交换和质谱技术方法的准确性和可信度。稳定共价化学标记方法通常是用于修饰具有高反应活性的氨基酸残基侧链,例如二甲基化共价化学标记法是修饰赖氨酸残基侧链的伯氨基团。但是为了确保较高的标记效率,一些共价化学标记方法需要使用高反应活性的酰胺化反应试剂,从而中和了赖氨酸侧链的正电荷,影响蛋白质间的静电相互作用,从而导致标记后蛋白质结构的改变和活性的丧失。
而通过甲醛和氰基硼氢化钠对赖氨酸侧链的伯氨进行修饰的二甲基化共价化学标记法是一种稳定高效、标记后依然保持蛋白质结构和活性的共价化学标记方法。因此,可以将基于质谱技术的活性二甲基化共价化学标记法应用于蛋白质和材料相互作用的结构分析中。
发明内容
本发明旨在开发一种基于化学标记法和质谱技术研究蛋白质和材料相互作用的结构分析新方法,将蛋白质层次活性二甲基化标记方法与“自下而上”的质谱技术相结合,基于位于蛋白质表面的赖氨酸残基比掩埋在内部或有相互作用的赖氨酸残基更容易被标记,揭示蛋白质和材料相互作用的结构相关信息。
本发明专利涉及一种基于化学标记和质谱技术研究蛋白质和材料相互作用的结构分析新方法。其特征为首先对蛋白质和蛋白质-材料复合物分别进行化学标记,随后进行蛋白质的变性、酶解、色谱-质谱联用分析和质谱数据库检索,对比材料加入前后蛋白质上特定氨基酸位点的化学标记效率变化情况,标记效率显著下降区域即为蛋白质-材料相互作用区域,上升区域即为蛋白质构象变化区域。
具体的,对于蛋白质和蛋白质-材料复合物,分别在蛋白质层次上通过甲醛和氰基硼氢化钠进行还原二甲基化标记反应,随后进行蛋白质的变性和酶解,得到的肽段溶液用色谱对肽段进行分离再用质谱进行肽段检测,将质谱结果进行数据库的检索,对比材料加入前后蛋白质上特定氨基酸位点的化学标记效率变化情况,若某一赖氨酸残基的标记效率下降10%以上,该位点视为和材料结合位点,某区域若有多个标记效率下降10%以上的赖氨酸残基,该区域则视为蛋白质和材料结合区域。若某一赖氨酸残基的标记效率上升10%以上,该位点则视为结合材料后,蛋白质构象发生变化的位点,某区域若有多个标记效率上升10%以上的赖氨酸残基,该区域则视为结合材料后,蛋白质构象发生变化的区域。所述蛋白质构象发生变化是指蛋白质原本紧密有序的空间结构变得松散,甚至有氨基酸发生脱落。
该蛋白质-材料相互作用分析方法具有快速简单、稳定高效,灵敏度高、可高通量动态分析、在标记过程中蛋白质依然保持生理结构和活性、分析结果不受蛋白质分子量大小、纯度等条件限制等优势。
本发明提供但不限制于下述基于质谱技术分析蛋白质和材料相互作用的方法:
1)取相同质量的蛋白质样品分成两组并溶于pH 2.0-10.0的HEPES、TEAB或PB溶液中,蛋白质浓度为0.01-50μg/μL,加入材料的一组为实验组,另一组则为对照组,蛋白质和材料的质量比为1:1-1:1000;
2)将上述步骤1)得到的两组蛋白质溶液在4-40℃下同时进行孵育,孵育时间为2-200min;
3)向上述步骤2)得到的两组溶液中分别加入终浓度均为0.01-100mmol/L的甲醛(CH2O)或氘带甲醛(CD2O)或13C氘带甲醛(13CD2O)中的一种或二种以上和0.01-100mmol/L的氰基硼氢化钠(NaBH3CN)或氘带氰基硼氢化钠(NaBD3CN)中的一种或二种,反应温度为4-40℃,反应时间为5-120min;
4)向上述步骤3)得到的两组溶液中分别加入与甲醛(或氘带甲醛或13C氘带甲醛中的一种或二种以上)摩尔浓度比为10:1-100:1的醋酸铵(CH3COONH4)或碳酸氢铵(NH4HCO3);
5)向上述步骤4)得到的两组溶液中分别加入变性剂,煮沸,加入蛋白酶,20-40℃酶解;
6)对上述步骤5)得到的两组肽段溶液进行酸化处理,将对照组溶液和实验组的上清溶液进行色谱分离和质谱检测;
本发明提供但不限于下述色谱质谱条件检测活性标记后的酶解肽段的方法:
液相色谱仪:Thermo Accela 600;
色谱柱:C18填料填装的毛细管柱(75μm内径,15cm长);
流动相:水(A)和乙腈(B);
梯度洗脱程序:0-2min,1%B-10%B;2-92min,10%B-35%;92-95min,35%B-80%B;95-105min,80%B;105-120min,0%B;
流速:300nL/min;
进样量:10μL;
质谱仪:Thermo LTQ-Orbitrap Velos;
离子传输毛细管:250℃;
喷雾电压:1.8kV;
归一化碰撞能量:35%;
采用数据依赖模式进行采集,包含一次全扫描(m/z 350-1800);
分辨率:60000(m/z 400);
动态排除设置为:重复次数为1,重复容忍时间为30s,动态排除时间为120s。
计算对比出对照组赖氨酸残基标记效率和实验组赖氨酸残基标记效率差异大的位点,再结合蛋白质晶体结构,确定对照组标记效率高于实验组标记效率的赖氨酸位点所在区域即蛋白质和材料相互作用区域;实验组标记效率高于对照组标记效率的赖氨酸位点所在区域即结合材料后蛋白质构象变化区域。
本发明的优点:
通过基于化学标记和质谱技术的方法,与材料相互作用区域的赖氨酸残基的标记效率会低于未与材料相互作用或暴露在溶液中的赖氨酸残基的标记效率;同时,蛋白质在与材料相互作用后会有部分区域发生构象变化而导致该区域的赖氨酸残基标记效率反而增高。该分析方法具有快速简单、稳定高效,灵敏度高、可高通量动态分析、在标记过程中蛋白质依然保持生理结构和活性、分析结果不受蛋白质分子量大小、纯度等条件限制等优势,可以进行规模化地蛋白质和材料相互作用的结构分析。
附图说明
图1为基于质谱的二甲基化活性共价化学标记方法示意图。
图2为基于质谱技术的蛋白质与材料相互作用结构分析方法应用于photosystemⅡ蛋白和氧化铁相互作用的晶体结构图。(A)实施例1、(B)实施例2、(C)实施例3。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明,但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
色谱质谱条件检测活性标记后的酶解肽段的方法:
液相色谱仪:Thermo Accela 600;
色谱柱:C18填料填装的毛细管柱(75μm内径,15cm长);
流动相:水(A)和乙腈(B);
梯度洗脱程序:0-2min,1%B-10%B;2-92min,10%B-35%;92-95min,35%B-80%B;95-105min,80%B;105-120min,0%B;
流速:300nL/min;
进样量:10μL;
质谱仪:Thermo LTQ-Orbitrap Velos;
离子传输毛细管:250℃;
喷雾电压:1.8kV;
归一化碰撞能量:35%;
采用数据依赖模式进行采集,包含一次全扫描(m/z 350-1800);
分辨率:60000(m/z 400);
动态排除设置为:重复次数为1,重复容忍时间为30s,动态排除时间为120s。
实施例1
基于质谱技术的蛋白质与材料相互作用结构分析方法:
1、配置两组浓度为0.01μg/μL的photosystemⅡ蛋白用于对照组和实验组,实验组蛋白质和材料按照1:100的比例加入氧化铁,同时孵育10min;
2、分别加入终浓度为0.01mmol/L的甲醛和终浓度为0.01mmol/L的氰基硼氢化钠,4℃下反应120min;
3、加入终浓度为1mmol/L的NH4HCO3;
4、将上述步骤3得到的溶液置换成8M尿素并煮沸后加入糜蛋白酶,蛋白质与酶的质量比为50:1,25℃酶解过夜;
5、将上述步骤4得到的溶液进行酸化处理,进行色谱的分离和质谱的检测;
6、将得到的质谱数据进行数据库检索,根据检索结果计算所有赖氨酸残基的标记效率,计算方法如下:
L赖氨酸=(N1/N2)×100%
式中,L赖氨酸为某一赖氨酸残基的标记效率,N1为质谱鉴定到的标记形式肽段的谱图数,N2为质谱鉴定到的相应标记和非标记形式肽段的总谱图数。
将同一赖氨酸位点在对照组的标记效率和在实验组的标记效率做差值,再结合蛋白质晶体结构确定蛋白质和材料相互作用区域及结合材料后蛋白质构象发生变化的区域。
分析结果:
表一所示为将质谱数据进行数据库检索的结果中对照组与实验组标记效率相差10%以上的赖氨酸位点列表,图2(A)所示为photosystemⅡ蛋白的结构图,来源于PDB文件3WU2。由图2可看出,暖粉色标记位点是对照组标记效率高于实验组标记效率的赖氨酸位点,这些位点集中在photosystemⅡ蛋白的Lumen区的某一区域。因为材料和蛋白质相互作用后,降低了相互作用区域内赖氨酸的标记效率,则上述区域即材料和蛋白质的相互作用区域。橙黄色标记位点是实验组标记效率高于对照组标记效率的赖氨酸位点,这可能是由于蛋白质和材料相互作用后,蛋白质的构象发生了变化导致某些区域反而被暴露在溶液中而导致标记效率提高。
实施例2
基于质谱技术的蛋白质与材料相互作用结构分析方法:
1、配置两组浓度为0.1μg/μL的photosystemⅡ蛋白用于对照组和实验组,实验组蛋白质和材料按照1:20的比例加入氧化铁,同时孵育30min;
2、分别加入终浓度为2mmol/L的甲醛和终浓度为2mmol/L的氰基硼氢化钠,室温下反应30min;
3、加入终浓度为50mmol/L的CH3COONH4;
4、将上述步骤3得到的溶液置换成6M盐酸胍并煮沸后加入糜蛋白酶,蛋白质与酶的质量比为25:1,30℃酶解过夜;
5、将上述步骤4得到的溶液进行酸化处理,进行色谱的分离和质谱的检测;
6、将得到的质谱数据进行数据库检索,根据检索结果计算所有赖氨酸残基的标记效率,计算方法如下:
L赖氨酸=(N1/N2)×100%
式中,L赖氨酸为某一赖氨酸残基的标记效率,N1为质谱鉴定到的标记形式肽段的谱图数,N2为质谱鉴定到的相应标记和非标记形式肽段的总谱图数。
将同一赖氨酸位点在对照组的标记效率和在实验组的标记效率做差值,再结合蛋白质晶体结构确定蛋白质和材料相互作用区域及结合材料后构象发生变化的区域。
分析结果:
表二所示为将质谱数据进行数据库检索的结果中对照组与实验组标记效率相差10%以上的赖氨酸位点列表。图2(B)所示为photosystemⅡ蛋白的结构图,来源于PDB文件3WU2。由图2可看出,暖粉色标记位点是对照组标记效率高于实验组标记效率的赖氨酸位点,这些位点集中在photosystemⅡ蛋白的Lumen区的某一区域。因为材料和蛋白质相互作用后,降低了相互作用区域内赖氨酸的标记效率,则上述区域即材料和蛋白质的相互作用区域。橙黄色标记位点是实验组标记效率高于对照组标记效率的赖氨酸位点,这可能是由于蛋白质和材料相互作用后,蛋白质的构象发生了变化导致某些区域反而被暴露在溶液中而导致标记效率提高。
实施例3
基于质谱技术的蛋白质与材料相互作用结构分析方法:
1、配置两组浓度为10μg/μL的photosystemⅡ蛋白用于对照组和实验组,实验组蛋白质和材料按照1:10的比例加入氧化铁,同时孵育60min;
2、分别加入终浓度为100mmol/L的甲醛和终浓度为100mmol/L的氰基硼氢化钠,40℃下反应5min;
3、加入终浓度为1mmol/L的NH4HCO3;
4、将上述步骤3得到的溶液置换成6M尿素并煮沸后加入胰蛋白酶,蛋白质与酶的质量比为25:1,37℃酶解过夜;
5、将上述步骤4得到的溶液进行酸化处理,进行色谱的分离和质谱的检测;
6、将得到的质谱数据进行数据库检索,根据检索结果计算所有赖氨酸残基的标记效率,计算方法如下:
L赖氨酸=(N1/N2)×100%
式中,L赖氨酸为某一赖氨酸残基的标记效率,N1为质谱鉴定到的标记形式肽段的谱图数,N2为质谱鉴定到的相应标记和非标记形式肽段的总谱图数。
将同一赖氨酸位点在对照组的标记效率和在实验组的标记效率做差值,再结合蛋白质晶体结构确定蛋白质和材料相互作用区域及结合材料后构象发生变化的区域。
分析结果:
表三所示为将质谱数据进行数据库检索的结果中对照组与实验组标记效率相差10%以上的赖氨酸位点列表。图2(C)所示为photosystemⅡ蛋白的结构图,来源于PDB文件3WU2。由图2可看出,暖粉色标记位点是对照组标记效率高于实验组标记效率的赖氨酸位点,这些位点集中在photosystemⅡ蛋白的Lumen区的某一区域。因为材料和蛋白质相互作用后,降低了相互作用区域内赖氨酸的标记效率,则上述区域即材料和蛋白质的相互作用区域。橙黄色标记位点是实验组标记效率高于对照组标记效率的赖氨酸位点,这可能是由于蛋白质和材料相互作用后,蛋白质的构象发生了变化导致某些区域反而被暴露在溶液中而导致标记效率提高。
表一
表二
表三
该蛋白质-材料相互作用分析方法具有快速简单、稳定高效,灵敏度高、可高通量动态分析、在标记过程中蛋白质依然保持生理结构和活性、分析结果不受蛋白质分子量大小、纯度等条件限制等优势。
Claims (7)
1.基于化学标记和质谱的蛋白与材料相互作用结构分析方法,其特征为:首先对蛋白质和蛋白质与材料孵育后形成的蛋白质-材料复合物分别进行化学标记,随后进行蛋白质的变性、酶解、色谱-质谱联用分析和数据库检索,对比材料加入前后蛋白质上所有特定氨基酸位点的化学标记效率变化情况,标记效率明显下降的氨基酸所在区域即为蛋白质-材料相互作用区域,标记效率明显上升的氨基酸所在区域即为蛋白质在结合材料后构象变化区域。
2.根据权利要求1所述的分析方法,其特征为:在材料加入前后分别进行活性条件下蛋白质伯胺基团二甲基化反应,在标记过程中不影响蛋白质的结构、活性以及与材料的相互作用情况;
标记试剂为甲醛(CH2O)或氘带甲醛(CD2O)或13C氘带甲醛(13CD2O);中的一种或二种以上;标记过程采用的催化剂为氰基硼氢化钠(NaBH3CN)和氘代氰基硼氢化钠(NaBD3CN)中的一种或二种;
所述特定氨基酸为赖氨酸。
3.根据权利要求1所述的分析方法,其特征在于:无机材料包括但不限制于金纳米颗粒、氧化铁、氧化钨、二氧化硅、二氧化钛、石墨烯、沸石等无机或复合材料中的一种或二种以上;
所述标记效率为质谱鉴定到的标记形式肽段的谱图数或对应标记形式肽段的质谱检测峰面积与质谱鉴定到的相应标记和非标记形式肽段的总谱图数或对应标记和非标记形式肽段的质谱检测峰总面积之比值;
所述明显下降是指某一氨基酸位点在蛋白质-材料复合物组中的标记效率比蛋白质组中的标记效率下降10%以上;
所述明显上升是指某一氨基酸位点在蛋白质-材料复合物组中的标记效率比蛋白质组中的标记效率上升10%以上。
4.根据权利要求1所述的分析方法,其特征在于:
所述的蛋白酶包括但不限制于胰蛋白酶、糜蛋白酶等蛋白水解酶中的一种或二种以上;
所述的色谱-质谱联用是色谱和质谱联用技术,先用色谱对肽段进行分离,再用质谱进行检测。
5.根据权利要求1-4任一所述的分析方法,其特征在于:
包括以下步骤:
1)取相同质量的蛋白质样品分成两组并溶于pH 2.0-10.0的HEPES、TEAB或PB溶液中,蛋白质浓度为0.01-50μg/μL,加入材料的一组为实验组,另一组则为对照组,蛋白质和材料的质量比为1:1-1:1000;
2)将上述步骤1)得到的两组蛋白质溶液在4-40℃下同时进行孵育,孵育时间为2-200min;
3)向上述步骤2)得到的两组溶液中分别加入终浓度均为0.01-100mmol/L的甲醛(CH2O)或氘带甲醛(CD2O)或13C氘带甲醛(13CD2O)中的一种或二种以上和0.01-100mmol/L的氰基硼氢化钠(NaBH3CN)或氘带氰基硼氢化钠(NaBD3CN)中的一种或二种,反应温度为4-40℃,反应时间为5-120min;
4)向上述步骤3)得到的两组溶液中分别加入与甲醛(或氘带甲醛或13C氘带甲醛中的一种或二种以上)摩尔浓度比为10:1-100:1的醋酸铵(CH3COONH4)或碳酸氢铵(NH4HCO3)中的一种或二种;
5)向上述步骤4)得到的两组溶液中分别加入变性剂,煮沸,加入蛋白酶,20-40℃酶解;
6)对上述步骤5)得到的两组肽段溶液进行酸化处理,将对照组溶液和实验组的上清溶液进行色谱分离和质谱检测。
6.根据权利要求5所述的分析方法,其特征在于:
本发明提供但不限于下述色谱质谱条件检测活性标记后的酶解肽段的方法:
液相色谱仪:Thermo Accela 600;
色谱柱:C18填料填装的毛细管柱(75μm内径,15cm长);
流动相:水(A)和乙腈(B);
梯度洗脱程序:0-2min,1%B-10%B;2-92min,10%B-35%;92-95min,35%B-80%B;95-105min,80%B;105-120min,0%B;
流速:300nL/min;
进样量:10μL;
质谱仪:Thermo LTQ-Orbitrap Velos;
离子传输毛细管:250℃;
喷雾电压:1.8kV;
归一化碰撞能量:35%;
采用数据依赖模式进行采集,包含一次全扫描(m/z 350-1800);
分辨率:60000(m/z 400);
动态排除设置为:重复次数为1,重复容忍时间为30s,动态排除时间为120s。
7.根据权利要求1-6任一所述的分析方法,其特征在于:
将得到的质谱数据进行数据库检索,根据检索结果统计计算并对比对照组(蛋白质组)和实验组(蛋白质-材料复合物组)共同鉴定到的所有赖氨酸残基的标记效率,所述赖氨酸残基标记效率的计算方法是:
L赖氨酸=(N1/N2)×100%
式中,L赖氨酸为某一赖氨酸残基的标记效率,N1为质谱鉴定到的标记形式肽段的谱图数或对应标记形式肽段的质谱检测峰面积,N2为质谱鉴定到的相应标记和非标记形式肽段的总谱图数或对应标记和非标记形式肽段的质谱检测峰总面积;
计算对比出对照组赖氨酸残基标记效率和实验组赖氨酸残基标记效率差异大(标记效率相差10%以上)的位点,再结合蛋白质晶体结构,确定对照组标记效率高于实验组标记效率的赖氨酸位点所在区域即蛋白质和材料相互作用区域;实验组标记效率高于对照组标记效率的赖氨酸位点所在区域即结合材料后蛋白质构象变化区域。
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