CN1602422B - 标记样品分子的方法及组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了标记分子的方法,其通过下列达成:使样品分子与结合至化学基团(其包含可切割官能基、或多个官能基及用于该样品分子的反应性基团)的固态载体在允许该样品分子与该反应性基团共价结合的条件下接触;及切割该可切割官能基,由此释放该包含一或多个官能基(其可为标记物)的样品分子。本发明亦提供一种可共价结合至化学基团的固态载体,该化学基团包含一可切割官能基、质谱标记物及一用于共价结合样品分子的反应性基团,其中该可切割官能基、标记物及反应性基团彼此之间的位置允许该标记物在该可切割基团受到切割时转移至该样品分子上。
Description
背景技术
本发明由国家癌症研究院(National Cancer Institute)授予许可号1R33CA84698-0并在政府支持下进行。政府对本发明拥有一定权利。
本发明总体上涉及蛋白质组分析,更具体而言涉及将官能基转移至样品分子上以分析并定量分析分子的方法。
研究生物过程的经典生物化学方法一直基于下列:通过顺序分级分离及构成一过程的特定活性分析循环纯化至达成均一性、对每一分离组分进行详细的结构分析、功能分析和调节分析以及通过分离组分重复该过程。人类基因组计划(Human Genome Project)及其他基因组测序计划正陆续揭示出特定物种的完整基因序列,并由此原则上揭示了这些物种所可能编码的每一蛋白质的氨基酸序列。可以预期,该生物学史上从未有过的信息资源将改进传统研究方法并促进根本不同的研究范式(其中之一为蛋白质组学)的发展。
人们在整个人类基因组及许多其他物种基因组的测序方面已取得极大成功。目前已完成46种微生物物种的基因组(TIGR Microbial Database;www.tigr.org)的测序且120多种其他微生物物种的基因组正处于测序过程中。另外,真核生物的更为复杂的基因组,尤其是其遗传方面的特征已充分为人们所了解的单细胞生物酿酒酵母及多细胞物种秀丽新小杆线虫和黑腹果蝇的那些基因组已经完全测序完毕。此外,水稻、人类及阿拉伯芥基因组的“初稿序列”已经公开。尽管缺乏完整的基因组序列,但丰富的DNA序列数据库已向公众公开,包括那些含有210多万种人类及120多万种小鼠表达序列标记物(EST)的序列数据库。
EST是由约300至500个连续核苷酸组成的代表部分基因序列的段,该等序列是通过对cDNA库中之多个纯系进行系统单递测序获得的。在大多数生物过程的时间跨度内(进化为显著例外),可将基因组DNA序列视为静止,因此,基因组序列数据库可代表类似于库的信息资源。目前,人们正致力于将“功能”赋予序列数据库中的单个序列,并尝试通过对可表明一序列与一族具有已知功能的序列具有统计学显著相似性的线性序列基元或更高级结构基元进行计算机分析或通过其他方法(例如跨物种比较同源蛋白质功能)来实现这一目标。此外,人们还使用了其他方法来测定单个序列的功能,包括实验方法,例如基 因剔除及使用反义核苷酸技术抑制基因表达,但这些方法较费时且在某些情况下仍不能够将一生物功能赋予一由该序列编码的多肽。
蛋白质组被定义为由基因组表达的蛋白质补体。这一具有一定限制性的定义意指蛋白质组的性质较稳定。实际上,由于所表达蛋白质的类型、其丰度、修饰状态、亚细胞位置及与其他生物分子(例如多肽及核酸)的相互作用均依赖于细胞或组织的生理状况,故,蛋白质组处于高度变化状态。因此,蛋白质组可反映细胞状况或细胞所处的外部条件,且蛋白质组分析可视为一用于鉴别及研究细胞状况并测定控制该等状况的分子机制的泛基因组分析。由于一被鉴别细胞的蛋白质组预计由成千上万不同类型的蛋白质组成,且其动态表达范围预计至少为5个数量级,故蛋白质组分析的前景似乎令人生畏。然而,列出了每一可能被表达蛋白质序列的DNA数据库之可利用性与可鉴别实际被表达蛋白质的技术的快速发展一起使得蛋白质组学成为当前的实际议题。质谱分析是目前蛋白质组学技术的基本依据之一。
定量蛋白质组学是对细胞或组织表达的所有蛋白质之数量及特征进行的系统分析。一细胞、组织、生物体液或蛋白质复合物在一给定时间内所表达的蛋白质将精确界定该细胞或组织彼时的状态。同一类型细胞在不同状态下的蛋白质特性之间的定量及定性差异可用于了解相应状态之间的转变。蛋白质组分析通常使用用于分离蛋白质的高解析度凝胶电泳(尤其是双向凝胶电泳)及用于鉴别蛋白质的质谱分析二者之结合来进行。该方法需按顺序进行并且较慢,但更为重要的是,其根本局限性在于基本上未能检测出生物学上较为重要的蛋白质类(Gygi等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:9390-9395(2000))。
完成大量物种的基因组测序促成了一种新的生物学方法,该方法通常称为探索科学。探索科学的本质在于对由一细胞或组织表达的一特定类分子的所有成员进行系统及定量分析。探索科学的例示性实施包括:通过基因表达阵列及定量蛋白质组学对由一细胞或组织表达的mRNA分子进行系统分析,及对一生物样品中所含蛋白质进行系统分析。探索科学的一个主要目的是根据自生物分子系统测量及分子机制(其可控制一细胞自一状态至另一状态的转变)鉴别(其通过对代表两种不同状态的细胞分子之组成进行比较分析来进行)所获得的数据描述一细胞或组织的状态(活性、病理学、应激)。对一细胞状态及控制该状态的机制进行分子描述需要尽可能多的参数。目前的表达距阵方法可对一细胞中的mRNA分子进行系统分析。
最近,有人提出一种基于一类称为同位素标记亲和性标记物的试剂及质谱分析的方法可适用于系统地鉴别并定量分析生物样品中所含的蛋白质。使用目前技术很难系统及定量地测量其他与一细胞状态相关的特性(例如蛋白质磷酸化及其他转译后修饰)及除蛋白质或核酸以外的生物分子(例如脂质、第二信使、代谢产物)的定量特性。
因此,人们需要可用于分析细胞中分子的快速、有效及成本有效方法。本发明可满足该需要并可提供相关优点。
发明内容
本发明提供了标记分子的方法,其通过下列达成:使样品分子与结合至化学基团(其包含可切割官能基、或多个官能基及用于该样品分子的反应性基团)的固态载体在允许该样品分子与该反应性基团共价结合的条件下接触;及切割该可切割官能基,由此释放该包含一或多个官能基(其可为标记物)的样品分子。本发明亦提供一种共价结合至化学基团的固态载体,该化学基团包含一可切割官能基、质谱标记物及一用于共价结合样品分子的反应性基团,其中该可切割官能基、标记物及反应性基团彼此之间的位置允许该标记物在该可切割基团受到切割时转移至样品分子上。
附图说明
图1所示为一种基于固相的用于通过一光可切割连接体(其允许光恢复所捕获的多肽)捕获多肽的方法示意图。图1A所示为一具有下列四种成分的固相同位素标记试剂的示意图:珠粒、光可切割连接体、稳定同位素标记物及特异性反应性基团。图1B所示为硫氢基反应性固相同位素标记试剂。以邻硝基苄基为主的光可切割连接体结合至胺基丙基玻璃珠上。该光可切割连接体的周边结合有一同位素标记物,其表示为含7个氢(H)或7个氘(D)(以“X”表示)的白氨酸分子,其后为一作为SH-反应性基团的碘乙酰基。图1C显示了在捕获及释放多肽后使用固相同位素标记方法将一同位素标记物转移至该多肽上的过程。该连接体被构建为当切割时可使特异性官能基转移至所释放的多肽上。
图2显示了经叁(2-羧基乙基)膦(TCEP)还原后的肽层粘连蛋白B及对照肽磷酸血管紧张素的液相色谱-质谱(LC-MS)分析。图2A显示了通过反相HPLC对层粘连蛋白B与对照磷酸血管紧张素之混合物的LC分析(RT:8.95-13.04,NL:1.22E7基峰MS tcep30分钟)。图2B显示了对经TCEP处理的层粘连蛋白B的电喷雾离子化MS分析(tcep30分钟#384.RT:9.55,AV:1,NL:6.50EB,T:+C ESI Q3MS[400.00-1600.00])。
图3显示了与如图1所示珠粒接触后的经还原层粘连蛋白B与磷酸血管紧张素之混合物的LC-MS。图3A显示了一如图2中处理的上清液分液的LC分析(RT:8.97-13.08,NL:1.84E7基峰MS 60分钟珠粒)。图3B显示了保留时间与经还原层粘连蛋白B一致的图3A的9.62分钟LC组分的MS分析(60分 钟珠粒#387RT:9.62,AV:1,NL:1.14E5,T:+C ESI Q3MS[400.00-1600.00])。层粘连蛋白B的数量因与珠粒结合而减少。
图4显示了自如图3中所处理珠粒光切割的层粘连蛋白B的LC-MS分析。图4A所示为添加了对照磷酸血管紧张素(其浓度相当于图2中之用量)的经光切割层粘连蛋白B的LC分析(RT:9.19-15.18,NL:2.09E6基峰m/z=560.0-570.0 MS 1小时光照_0104 15121039)。图4B显示了图4A中10.72分钟时洗脱出的经光切割层粘连蛋白B峰的MS分析,质量因修饰而出现预期的增加(1小时光照_010415121039#430,RT:10.70,AV:1,NL:9.17E5,T:+c ESI Q3MS[400.00-1600.00])。
图5显示了一种标记多肽的第一胺基以纳入一硫氢基的方法。多肽的(若干)胺基由N-琥珀酰亚胺基S-乙酰基硫代乙酸(SATA)修饰。经羟胺处理并随后用叁(2-羧基乙基)膦(TCEP)还原,可将多肽的胺基转变成一硫氢基。
图6所示为经SATA修饰的磷酸血管紧张素的LC-MS分析。图6A所示为经SATA处理的磷酸血管紧张素的LC分析(RT:9.56-16.88,NL:3.29E7基峰MSsata 15分钟)。图6B所示为经SATA处理的磷酸血管紧张素的MS分析(sata15分钟#582,RT:14.48,AV:1,NL:2.75E7,T:+c ESI Q3MS[400.00-1600.00])。两个主要信号代表单价([M+H]+=1242.7质量单位)及双价([M+2H]2+=622.3质量单位)形式。
图7显示了进一步用羟胺处理并用TCEP还原的经SATA处理磷酸血管紧张素的LC-MS分析,如图5所示。图7A显示了经还原及修饰的磷酸血管紧张素的LC分析(RT:12.08-14.93,NL:1.32E7基峰MS 30分钟10m MTCEP)。图7B显示了经还原及修饰的磷酸血管紧张素的MS分析,其显示了因修饰而造成的预期质量变化(30分钟10mMTCEP #557 RT:13.86,AV:1,NL:1.32E7,T:+c ESI Q3MS[400.00-1600.00])。两个主要信号代表单价([M+H]+=1200.7质量单位)及双价([M+2H]2+=601.1质量单位)形式。
图8所示为使用固相捕获通过不同修饰方式对两种样品进行比较的示意图。将两种待比较的样品(例如)用胰蛋白酶进行蛋白酶解。若为一硫氢基反应试剂,则含Cys的肽被还原并被载有不同同位素标记试剂(例如分别含0或7个氘的d0-白氨酸或d7-白氨酸标记物)的珠粒捕获。合并且洗涤珠粒,被标记的肽通过光切割释放。所释放肽的特征可使用(例如)质谱(MS)(例如毛细管液相色谱及串列质谱(μLC-MS/MS))来进一步表征。
图9所示为通过固相及ICAT方法鉴别及定量分析的蛋白质之数量的概览。图9A显示了经大规模实验(L)鉴别的蛋白质数,其中共标记了100μg蛋白质样品并用μLC-MS/MS分析了20μg。固相方法定量分析了82种蛋白质,而ICAT方法定量分析了33种蛋白质,其中有25种蛋白质相同。图9B显示了由小规模实验(S)鉴别的蛋白质数,其中共标记了10μg样品并分析了5μg。 固相方法定量分析了57种蛋白质,ICAT方法定量分析了18种蛋白质,其中有13种蛋白质相同。图9C显示了在大规模(L)及小规模(S)实验中通过固相方法鉴别的蛋白质数量。Venn图的片段数表示所定量分析的蛋白质数。
具体实施方式
本发明提供通过捕获一固态载体上的样品分子来标记这些分子的方法及组合物,其中该固态载体具有使所需官能基(包括用于增强检测并可有助于鉴别及定量分析所标记分子的标记物)转移至这些分子上的化学基团。这些方法的优点在于其可用于选择性地分离及标记样品分子且允许对分析物的复杂混合物进行定量分析,包括通过(例如)质谱等方法进行分析。因此,这些方法基本上可用于分离一特定类分子或分子亚型的全部分子,例如基本上全部多肽或磷酸蛋白、糖蛋白或以其他方式修饰的多肽之亚型。
使用一般的共价捕获及释放化学过程可将特异性官能基转移至一复杂样品的组分中。此外,由于纳入了释放一被捕获分子的能力,这些方法亦可较佳用于分离或纯化样品分子,这对于降低所分析样品的复杂性非常有用。这些方法极适用于对蛋白质组进行定量分析及对蛋白质磷酸化及其他转译后修饰进行系统及定量分析,且可扩展至用于对除蛋白质及肽以外的分子进行系统及定量分析。并且,本发明方法的优点在于样品分子可被有效捕获及释放,因而可使用较少量的起始样品,这对于分析用于蛋白质组学分析的复杂生物样品特别有用。
本发明方法特别适用于对生物样品中所包含的分子进行鉴别及定量分析,尤其适用于对定量蛋白质组学所用的蛋白质进行分析。这些方法亦可用于对蛋白质磷酸化状况或对以其他方式修饰的蛋白质的其他修饰状况进行系统及定量分析。本发明亦提供了用于标记分子的试剂。除蛋白质组学分析外,这些方法亦可用于对包括蛋白质在内的其他生物分子进行系统及定量分析。这些方法尤其可用于将标记或标记物转移至适用于质谱(MS)分析的分子中。
本文所用术语“多肽”指由2或多个氨基酸构成的肽或多肽。多肽亦可通过自然修饰方式例如转译后修饰或合成修饰方式来修饰,包括磷酸化、脂质化、异戊二烯化、棕榈酰化、十四烷基化、硫酸盐化、羟基化、乙酰化、糖基化、泛素化、添加辅基或辅因子、形成二硫键、蛋白酶解、组合至大分子复合物中及诸如此类。
多肽包括具有几个或数个氨基酸的小分子多肽及具有几百个或更多氨基酸的大分子多肽。通常,2或多个氨基酸残基之间的共价键为酰胺键。然而,氨基酸可通过肽及化学技艺中的技术人员所熟知的各种其他方法连接在一起。因此,术语多肽意欲包括整体或部分地含有位于氨基酸、氨基酸类似物及模拟物间之非酰胺键的分子。类似地,该术语亦包括环状多肽及其他构象上受限制 的结构。
对多肽(尤其是配体多肽)的修饰亦可包括其由化学合成生成的非天然衍生物、类似物及功能模拟物,但须该多肽修饰展示类似于亲本多肽的功能活性。例如,衍生物可包括对多肽的化学修饰形式,例如烷基化、酰基化、氨甲酰化、碘化或可衍生该多肽的任何修饰形式。该类衍生分子包括(例如)其中游离胺基经衍生形成盐酸胺、对甲基苯磺酰基、苄酰羰基、叔丁氧基羰基、氯乙酰基或甲酰基的那些分子。游离羧基可经衍生形成盐、甲基和乙基酯或其他类型的酯或酰肼。游离羟基可经衍生形成邻酰基或邻烷基衍生物。组氨酸的咪唑氮可经衍生形成N-im-苄基组氨酸。衍生物或类似物亦包括那些含有20种标准氨基酸的一或多个天然氨基酸衍生物(例如,4-羟基脯氨酸、5-羟基赖氨酸、3-甲基组氨酸、高丝氨酸、鸟氨酸或羧基谷氨酸盐)的多肽,且可包括不通过肽键连接的氨基酸。
特别有用的多肽衍生物包括使用本文所揭示方法纳入所需功能特性的修饰形式。该类修饰形式包括纳入一标记或标记物,尤其是可用于MS分析的标记或标记物。
当提及一生化系统的组分时,本文所用术语“核酸”意指2或多个共价结合在一起的核苷酸(例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA))且包括(例如)单链及双链核酸。类似地,该术语意欲包括(例如)基因组DNA、cDNA、mRNA及与其对应的可代表有义链、反应链或二者的合成寡核苷酸。
本文所用术语“氨基酸”意指天然或非天然的氨基酸及氨基酸类似物和模拟物。天然氨基酸包括蛋白质生物合成期间使用的20个(L)-氨基酸及其他氨基酸,例如4-羟基脯氨酸、羟基赖氨酸、锁链氨素、异锁链氨素、高半胱氨酸、瓜氨酸及鸟氨酸。非天然氨基酸包括(例如)(D)-氨基酸、正亮氨酸、正缬氮酸、对氟代苯丙氨酸、乙硫氨酸及诸如此类。氨基酸类似物包括天然及非天然氨基酸的修饰形式。该类修饰形式可包括(例如)取代或置换氨基酸上的化学基团及部分或氨基酸衍生物。氨基酸模拟物包括(例如)其功能特性(例如电荷及电荷空间分布特性)类似于对照氨基酸的有机结构。例如,一模拟赖氨酸(Lys或K)的有机结构可具有一位于类似分子空间且活动性与天然赖氨酸侧链的ε-胺基相同的正电荷部分。模拟物亦包括受限结构,以便维持氨基酸或氨基酸官能基的最佳空间分布及电荷相互作用。
本文所用术语“官能基”指具有所需功能特性的化学基团。所需功能特性为任何可使分子具有所需化学特性的特性。官能基可包括能够改变分子的物理化学特性(例如,改变质量、电荷、疏水性及诸如此类)的基团。一特别有用的官能基为一标记或标记物,例如,荧光团、发色团、旋光标记物、同位素分布标记物及诸如此类。
本文所用术语“标记”意指任何可结合至一分子并导致该分子质量发生改 变的部分。标记可共价或非共价结合至分子上,但其通常以共价方式结合。应了解,若标记与分子之间存在非共价相互作用,则这些非共价相互作用具有足够高的亲和力,以使该标记在本发明方法中所用的化学及/或物理处理期间仍保持与分子结合。
一特别有用的标记为一用于通过MS分析一样品的质量标记。分子因结合一质量标记而发生的质量改变应位于选定用于质量测定的仪器的灵敏度范围内。另外,所属技术领域的技术人员将了解或可确定大小不同且组成不同的分子所用标记物的质量。此外,当使用重及轻质量标记时(例如,用于对分子进行差示标记),可根据需要使用小至介于约1-3质量单位之间的质量差或大至超过约10个质量单位的质量差,例如,约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约12、约15或约20质量单位或更大。适于以差示方式标记两个样品的质量标记的化学性质相同但质量不同。
本文所用“标记物”指可检测标记。标记物将一特征赋予分子,以使其可被多种分析方法中的任何一种检测到,这些方法包括MS、色谱法、荧光显影术、分光光度法、免疫技术及诸如此类。标记物可为(例如)一同位素、氟、显色剂、铁磁体物质、发光标记物或一可被抗体或抗体片段识别的表位标记物。一特别有用的标记物为一质量标记物,其为一可适于通过MS检测及分析一分子的质量标记物。例示性质量标记物包括,例如,一稳定同位素标记物、一同位素分布标记物、一带电荷氨基酸、差示同位素标记标记物及诸如此类。标记物亦可为气相碱性基团例如吡啶基或疏水性基团。标记物亦可为具有一特征同位素分布的元素(例如,氯、溴)或任何具有可区别同位素分布的元素。另外,标记物可具有一可于适宜条件下在质谱仪的碰撞室或离子源内断裂并产生一报道离子的键。
标记物亦可为一亲和性标记物,其可使结合于亲和性试剂的分子通过与该亲和性标记物的一同性质结合体结合而获得分离。对于多肽标记而言,可使样品中的一个或若干多肽变性,视情况可予以还原,且用一化学修饰试剂共价衍生该多肽的一化学反应性基团。可轻易地将经标记的多肽与未经标记的多肽及样品内的其他成分分离,由此可降低欲通过质谱进行分析的样品的复杂性。类似地,该类亲和性标记可用于其他分子,例如核酸、脂质、碳水化合物、第二信使、代谢物及诸如此类。此外,可通过一化学或酶促反应引入标记物。
本文所用“可切割官能基”为一可通过各种方法(包括输入能量、化学物质、酶及诸如此类)切割的化学基团。本发明方法中所用的可切割官能基通常具有特异性,即可将其特定分离而不改变或损害所分离分子或以一可重现方式相对均匀地改变分子。例如,该可切割官能基可为一光可切割基团。在该情形下,该光可切割基团通常在一不损害所释放分子的光波长下受到切割,例如介于紫外线至可见光之间(参见实例I)。例示性光可切割连接体包括(例如) 含有邻硝基苄基、二苯乙酮基、反式邻肉桂酰基、间硝基苯基、苄砜基及诸如此类的连接体(参见,例如,Dorman及Prestwich.Trens Biotech.18:64-77(2000);Green及Wuts,“有机合成中的保护基”(Protective Groups inOrganic Synthesis),第2版,John Wiley&Sons,纽约(1991);美国专利第5,143,854号、5,986,076号、5,917,016号、5,489,678号、5,405,783号)。
该可切割官能基亦可为一可被诸如酸或碱的化学物质切割的可化学切割基团。若需要,一化学切割反应可于相对温和的条件下进行,其中该可化学切割基团基本上是唯一受到切割的化学键。一可化学切割基团亦可为一可被诸如CNBr的化学物质(其可切割蛋氨酸残基)切割的基团。CNBr可特别用于释放一其中已加入一可化学切割基团(例如蛋氨酸)的分子,尤其是在一不具有蛋氨酸残基的多肽中。适宜的可化学切割基团已为所属技术领域的技术人员所熟知(参见,例如Wilson及Czarnik编辑的“组合化学:合成及应用”(Combinatorial Chemistry:Synthesis and Application),John Wiley&Sons,纽约(1997);Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85:2149(1964);Bodanszky,M.,“肽合成原理”(Principles of Peptide Synthesis)(Springer-Verlag,1984);Houghten,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 82:5131(1985))。例示性可化学切割连接体可包含:一可用还原剂切割的二硫化物、一可用高碘酸切割的二元醇、一可用连二硫酸盐切割的重氮键、一可用羟胺切割的酯、一可用碱切割的砜,及诸如此类(参见Hermanson,“生物共轭技术”(BioconjugateTechniques),Academic Press,San Diego(1996);Pierce化学公司,RockfordIL)。
可切割官能基亦可为一可酶切割基团。例如,可使用一蛋白酶来切割具有一适当蛋白酶识别序列的可切割官能基。特别有用的蛋白酶为内肽酶,例如Xa因子、烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、金黄色葡萄球菌蛋白酶、颌下腺蛋白酶及诸如此类。蛋白酶可根据并入作为官能基的特定可切割识别序列来选择。选择蛋白酶需考虑的其他因素包括在被捕获及释放的分子中是含有还是不含一鉴别序列。
例如,可使用一稀有切割蛋白酶(例如TEV蛋白酶或Xa因子)切割一含有相应蛋白酶识别序列的官能基,从而释放出所捕获分子。该类稀有切割蛋白酶可特别用于释放一完整多肽分子,因为大多数多肽中不含有这些蛋白酶的识别序列。或者,可用一特异性蛋白酶处理多肽样品,且所消化的肽通过本发明所揭示方法分离。在该情形下,所捕获的肽将不含用于切割的蛋白酶的识别序列,因为该多肽已经被消化。另外,若需要,可捕获一完整多肽并于结合至固态载体后使用蛋白酶对其进行消化,从而并入并释放固态载体上所捕获多肽的肽片段上的标记。因此,视需要,蛋白酶消化可于捕获样品分子(尤其是多肽样品分子)之前或之后进行。
除蛋白酶外,一可切割官能基可为一内切核酸酶(例如限制酶)的识别序列。因此,一限制酶的合适识别序列可作为一可切割官能基纳入并用相应的限制酶切割。应了解,视需要,此一核苷酸官能基可用于捕获及释放一核酸或多肽或任何其他类型的分子。类似地,视需要,多肽识别序列可用于捕获及释放多肽、核酸或任何其他类型的分子。
本文所用术语“反应性基团”意指多种具有适于与一分子(例如多肽、核酸、脂质、碳水化合物、一第二信使、一代谢物及诸如此类)反应并共价结合的有用化学特性的化学基团中的任何一种。例如,一反应性基团可与Asp或Glu中的羧基反应,或该反应性基团可与其他氨基酸(例如His、Tyr、Arg及Met)反应。一反应性基团亦可与胺(例如Lys)反应,例如亚氨酸酯及N-羟基琥珀酰亚胺酯。另外,一反应性基团亦可使用所属技术领域熟知的化学方法与氧或硫反应。一反应性基团亦可与一用于选择性标记磷酸肽或核酸的磷酸根基团反应,或与其他以共价方式修饰的肽(包括糖肽、脂肽或任何共价多肽修饰形式,例如本文所揭示的修饰形式)反应。
本文所用术语“同位素标记”或“同位素标记物”指一可以两种完全不同的同位素形式(例如,构成化学基团的组成元素的重及轻同位素形式)生成的化学基团。该类组成元素包括(例如)碳、氧、氢、氮及硫。另外,可用在化学性质或功能上相似的其他元素代替上述天然元素。例如,可用硒代替硫。特别有用的同位素标记或标记物为那些可允许通过MS方便地进行分析者。例如,一氨基酸的重及轻同位素形式可用于以差示同位素方式标记多肽(参见实例I)。
本文所用“结合”或其若干语法形式皆指分子之间的结合作用。例如,一固态载体可通过其一化学部分与化学基团的化学部分之间的相互键结作用与该化学基团结合。所结合分子之间的相互键结作用可为共价或非共价形式。化学基团通常通过共价相互作用与一固态载体或其他分子结合。应了解,在固态载体与所结合分子之间存在非共价相互作用的状况下,该类非共价相互作用具有足够高的亲和力以在本发明方法中所用的化学及/或物理处理期间(例如对与固态载体结合的分子进行的化学修饰或洗涤步骤)使二者保持结合状态。
本发明提供了一种标记分子的方法,其通过下列达成:使样品分子与结合至化学基团(其包含可切割官能基、或多个官能基及用于该样品分子的反应性基团)的固态载体在允许该样品分子与该反应性基团共价结合的条件下接触。该方法可进一步包括切割该可切割官能基这一步骤,由此释放该结合有一或多个官能基的样品分子。这些方法的优点在于:可捕获并标记一复杂样品混合物中的分子以方便地进行分析,且由于该分子可自固态载体中释放,所以亦可将其纯化。
本发明提供若干种通过一可切割连接体(例如一可使所捕获分子经光催化 复原的光可切割连接体)利用一基于固相的方式共价捕获相关多肽或其他分子的方法。该可切割连接体被构建为当切割时可使特异性官能基转移至所释放分子上。该类官能基包括(例如):依据同位素稀释理论可通过质谱准确定量肽的稳定同位素标记物、可通过其同位素分布鉴别经标记的肽或其片段的同位素分布标记物、带电荷的氨基酸或其他可在质谱仪中引发有效离子化反应或在串列质谱仪的碰撞室中引导断裂反应型式的化合物。此外,该方法可在分子(例如多肽)固定在固态载体上时对其进行化学或酶促修饰、去修饰、切割或其他处理。尽管一光可切割连接体特别有用,但应了解可使用任何可特异性切割的连接体,如本文所揭示。光可切割连接体的替代物包括可酸或碱切割的连接体、可通过热切割的连接体及含有一适于酶的靶切割位点的连接体,如本文所述。
本发明方法基于较有利地使用一固相化学方法固定来自样品的分子并可将一标记(例如标记物)方便地转移至所捕获的样品分子上。该方法基于将化学基团结合至一固态载体上。该化学基团具有图1中所例示的基团。该化学基团的一个基团为一允许可逆捕获及释放分子的可切割官能基。该化学基团的第二基团为一或多个具有所需化学特性的官能基。该类官能基可为(例如)一便于对该分子或一可将所需化学特性(例如电荷、疏水性或质量变化)赋予该分子的化学部分进行后续分析的标记或标记物。该化学基团的第三基团为一可使该化学基团共价结合至样品中一分子上的反应性基团。这三个基团在该化学基团上的布置方式可使样品分子通过该反应性基团被捕获且这些官能基可在切割时转移至所释放分子上(参见图1)。
该化学基团亦含有一可使该化学基团结合于一固态载体上且同时允许利用上述基团的化学部分。若需要,具有上述基团的化学基团可通过依次添加可提供这些基团的化学部分合成于一固态载体上或可作为化学基团合成并随后结合至该固态载体上。
图1阐释了本发明方法的一具体实施例。一具有一可切割官能基、一或多个所需官能基(例如标记物)及一反应性基团的化学基团结合至固态载体上。图1显示了一光可切割连接体,其具有一共价结合至固态载体上的胺基官能基。该光可切割连接体允许在以固相形式捕获分子后对其实施光切割。一具有所需特异性官能基的连接体分子通过该胺基官能基结合至该光可切割连接体上。光切割时,该含有若干官能基的连接体分子被转移至所捕获分子(在图1C中表示为肽)上,由此将所需官能基转移至该分子上。例如,如本文中所揭示,所转移的官能基可为一用于定量质谱的稳定同位素标记氨基酸。自该具有一或多个官能基的功能连接体延伸的是一其对该分子上的一化学部分具有特异性的反应性基团,例如,一可与胺基、硫氢基、羧基或多肽的其他基团反应的基团。
如上述使一分子(例如样品中的一分子)与结合有化学基团的固态载体接 触。在可使该样品分子通过该化学基团共价结合至该固态载体的条件下培养分子。所属技术领域的技术人员根据该化学基团上的反应性基团及样品分子易于确定可允许共价结合的合适条件。类似地,如本文中所揭示,所属技术领域的技术人员可不难确定用于非共价相互作用的合适条件。
在实例I所例示及图1所示的具体实施例中,固相载体为一已通过硅烷键结合有该光可切割连接体的控制孔隙玻璃珠。图1所示的光可切割连接体可用360nm UV光切割。一氘化或未氘化的氨基酸(例如白氨酸)可用作转移至图1所例示多肽上的官能基。若使用两种不同的样品源进行比较或定量分析,则两种同位素标记物的质量通常相差7或10个质量单位,具体情况视白氨酸的氘化状况而定。如本文中所揭示,具有不同同位素分布的其他氨基酸或不同于氨基酸的分子亦可用作稳定同位素标记物。图1所示的肽反应性基团为一与硫氢基发生特异性反应的碘乙酰基。光切割时,所释放的图1C所示多肽中含有由经修饰白氨酸添加的质量标记物。尽管本发明使用氘化氨基酸例示,但应了解,在本发明方法中可使用任何适宜的同位素形式,例如,其他组成元素的同位素例如13C、15N及诸如此类。尽管通常使用非放射性同位素,但本发明亦可使用放射性同位素,例如氚。
本发明亦提供例如图1所例示的试剂。这些试剂可用于分离及标记样品分子,包括复杂样品(参见实例V)。因此,如图1A所示,本发明提供一种含有一珠粒、一可切割官能基、一官能基(例如标记物)及一反应性基团的试剂。
因此,本发明另外提供一种组合物,其包含结合至化学基团的固态载体,该化学基团包含一可切割官能基、一官能基(例如标记物)及一共价连接至样品分子的反应性基团,其中该可切割官能基、标记物及反应性基团彼此之间的位置允许该标记物在该可切割官能基受到切割时转移至该样品分子上。本发明进一步提供一种组合物,其包含一共价结合至化学基团的固态载体,该化学基团包含一可切割官能基、质谱标记物及一用于共价结合样品分子的反应性基团,其中该可切割官能基、标记物及反应性基团彼此之间的位置允许该标记物在该可切割官能基受到切割时转移至该样品分子上。
本发明方法的优点在于:其可选择性分离一分子并在其释放时将一或多个官能基(包括一标记或标记物)转移至该分子上。因此,该化学基团的官能基,即可切割官能基、一或多个官能基及反应性基团彼此之间的位置可允许一官能基(例如标记物)转移至该分子上。因此,化学基团的官能基通常被布置为使官能基(例如,标记物)位于可切割官能基与反应性基团之间,如图1所示,从而可允许该官能基在该可切割官能基受到切割及分子释放时转移至所捕获分子上。
本发明方法之所以具有优势是因为其利用了捕获样品分子、将一官能基转移至这些分子上并释放这些结合有一官能基的分子的能力。因此,这些方法可 用于仅在一个步骤中即可标记样品分子并同时纯化该样品分子。纳入一可切割官能基可有助于释放结合有官能基的样品分子,然后可进一步分析该样品分子。尽管本发明方法通常使用一可切割官能基,但应了解,本发明方法亦可用于在进一步分析前转移一官能基(例如一标记或标记物)而无需释放所捕获分子。在不存在一可通过化学或酶促反应切割的可切割化学基团的情况下,本发明方法可适用于分析性方法,例如MS,尤其是MALDI-TOF,其中使用激光来切割结合分子并同时使该分子离子化。
本发明方法可易于用于多种分子。如上所述,在某些情况下,一分子可具有一适于本文所揭示捕获方法的反应性化学部分。然而,若需要,可修饰这些分子以纳入一所需官能基,尤其是一适于本文所揭示捕获方法的反应性基团。
例如,不含胱氨酸残基(即不含具有一硫氢侧链的天然氨基酸)的多肽将不会与图1所示的固相试剂结合。虽然在某些情况下期望选择性分离含胱氨酸的多肽,但在其他情况下却期望分离、鉴别并定量分析样品中所含的其他或额外的多肽。例如,可合成胺反应性基团(例如琥珀酰亚胺酯)作为固相试剂的反应性基团。或者,可以化学方式修饰欲捕获分子以纳入一特定官能基。
例如,在本文所揭示的一具体实施例中,将多肽的第一胺基修饰成为硫氢基,由此可允许使用如图1所示的SH反应性固相珠粒来捕获该多肽。在该方法中,多肽的胺基可通过图5所示的同一化学过程转化成硫氢基。首先,用N-琥珀酰亚胺基S-乙酰基硫代乙酸(SATA)修饰胺基。经羟胺处理后,随后用叁(2-羧基乙基)膦(TCEP)还原,即可将该肽的胺基转化成硫氢基。如本文中所例示,基本上样品分子中的每一胺基均可转化成硫氢基(参见实例II)。经修饰的肽视情况可通过(例如)在一C18反相管柱上脱盐纯化并随后可结合至例如图1中所示的珠粒上。
将胺基转化成硫氢基后,质子化位点消失。因此,可使用带电荷的胺基酸(例如赖氨酸)而非(例如)白氨酸来标记多肽。由此,赖氨酸侧链的游离胺基可提供另一个质子化位点且该肽的电荷状态不因该过程而改变。用于添加一含一带电荷基团的标记物的其他适宜基团包括(例如)精氨酸、吡啶基、三甲基胺及诸如此类,其在溶液或气相中均为强碱,即其为可促进离子化的基团。这一点很重要,因为在典型质谱实验中肽的电荷状态可影响质谱仪中因碰撞而引发的用于肽测序及检测的断裂反应。
用于修饰多肽中的氨基酸侧链的方法及化学原理已为所属技术领域的技术人员所熟知(参见,例如,Glazer等人,“生物化学及分子生物学实验室技术:蛋白质化学修饰”(Laboratory Techniques in Biochemisstry andMolecular Biology:Chemical Modificaticn of Proteins),第3章,第68-120页,Elsevier Biomedical Press,纽约(1975),其以引用方式并入本文中;及Pierce Catalog(1994),Pierce,Rockfcrd IL)。
亦可使用用于修饰多肽胺基端的方法。除本文所例示的用于修饰胺基(包括N端(参见实例II))的方法外,所属技术领域的技术人员亦熟知用于修饰N端的其他方法(参见,例如,Brancia等人,电泳(Electrophoresis)22:552-559(2001);Hoving等人,分析化学(Anal.Chem.)72:1006-1014(2000);Munchbach等人,分析化学(Anal.Chem.)72:4047-4057(2000),上述每一参考文献均以引入方式并入本文中)。
另外,可在一分子上生成一反应性基团,随后修饰该反应性基团以纳入一所需化学部分。例如,用CNBr切割可产生一高丝氨酸内酯。因此,一含蛋氨酸的多肽可被CNBr化学切割而产生一高丝氨酸内酯。所生成的高丝氨酸内酯可用一胺修饰,由此可纳入一具有一反应性胺的化学基团。
视需要,可以化学方式或酶促方式修饰分子。例如,可使用例如上文所阐述的方法以化学方式修饰分子。另外,亦可以酶促方式修饰分子。可以酶促方式修饰一所捕获分子以将一基团纳入该分子中或将其自该分子除去。例如,可用一激酶将多肽予以磷酸化或用一磷酸酶使其去磷酸化,或使用任何其他能够以转译后方式修饰多肽的酶来添加或除去该分子之一化学部分。类似地,核酸可在捕获后用任何熟知的可将化学部分添加至一核酸或自该核酸上除去的酶来修饰(参见,例如,Sambrook等人,“分子克隆:室验室手册”(MolecularCloning:A Laboratory Manual)第2版,ColdSpring Harbor Press,Plainview,纽约(1989);Ausubel等人,“当前分子生物学方案”(Current Protocols inMolecular Biology)(增补刊47),John Wiley&Sons,纽约(1999);Sambrook及Russel,“分子克隆:实验室手册”(Molecular Cloning:A LaboratoryManual),第3版,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor(2001))。可用于修饰一捕获分子(包括多肽或核酸)的例示性酶包括激酶、磷酸酶、甲基化酶、脱羧酶及诸如此类,或任何可将一化学部分添加至一捕获分子上或自其上除去的酶。
可将多种反应性基团中的任何一种纳入化学基团中以与样品分子反应,只要该反应性基团可共价结合于分子(例如多肽)上。反应性基团已为所属技术领域的技术人员所熟知(参见,例如,Hermanson,见上文所述文献,1996;Glazer等人,“生物化学及分子生物学实验室技术:蛋白质的化学修饰”(LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology:ChemicalModification of Proteins)第3章,第68-120页,Elsevier Biomedical Press,纽约(1975);Pierce Catalog(1994),Pierce,Rockford IL)。例如,一反应性基团可与Asp或Glu中的羧基反应,或该反应性基团可与其他氨基酸(例如His、Tyr、Arg及Met)反应。一反应性基团亦可与胺(例如Lys)反应,例如亚氨酸酯及N-羟基琥珀酰亚胺酯。另外,亦可使用所属技术领域中熟知的化学方法使一反应性基团与氧或硫反应。一反应性基团亦可与一用于选择性 标记磷酸肽的磷酸根基团反应或与其他以共价方式修饰的肽(包括糖肽、脂肽或本文所揭示的任何共价多肽修饰形式)反应。另外,所属技术领域的技术人员将了解或易于确定本发明方法所用的使用已知试剂修饰多肽的条件、获得最佳的多肽或其他分子修饰条件所需的培养条件及培养时间。
一例示性硫氢基反应性基团包括一碘乙酰胺基(参见Gygi等人,自然生物技术(Nature Biotechnol.)17:994-999(1999))。其他例示性硫氢基反应性基团包括马来酰亚胺基、卤代烷烃基和卤代芳烃基、卤代乙酰基、α-卤代酰基、吡啶基二硫化物、氮丙啶、丙烯酰基及芳基化试剂。若需要,多肽可在与本发明之一试剂反应前还原,这一点在该试剂含有一硫氢基反应性基团时特别有用。
一反应性基团亦可与胺基(例如一肽的α-胺基或Lys侧链的ε-胺基)反应,例如亚氨酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)、异硫氰酸酯、异氰酸酯、酰基叠氮化物、磺酰基氯、醛、酮、乙二醛、环氧化合物、环氧乙烷、碳酸盐、芳基化试剂、碳化二亚胺、酸酐及诸如此类。一反应性基团亦可与Asp或Glu中的羧基或一肽的C端反应,例如,重氮烷烃、重氮乙酰基、羰基二咪唑、碳化二亚胺及诸如此类。可与一羟基反应的反应性基团包括,例如,环氧化物、环氧乙烷、羰基二咪唑、碳酸N,N′-二琥珀酰亚胺酯、氯甲酰N-羟基琥珀酰亚胺酯及诸如此类。一反应性基团亦可与氨基酸、例如His、Tyr、Arg、及Met)反应。另外,一反应性基团亦可与用于选择性标记磷酸肽的磷酸根基团反应或与其他以共价方式修饰的肽(包括糖肽、脂肽或任何一种已知的共价多肽修饰形式)反应。所属技术领域的技术人员可易于确定本发明方法所用的使用各种试剂修饰样品分子的条件、获得最佳的样品分子修饰条件所需的培养条件及培养时间。
本发明方法的优点在于,通过捕获样品分子,可在所结合分子上进行各种化学及/或酶促修饰同时样品分子仍保持与固态载体结合。由于样品分子在物理、化学及/或酶促处理期间仍保持与固态载体结合,因此,经修饰样品分子的得率较溶液相方法为高。因此,本发明方法可用于捕获至少约5%、约10%、约20%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、约90%、约95%、约98%、约99%或甚至基本上所有的一或若干特定类分子,该等分子具有能够与本发明的固相捕获及标记试剂的反应性基团反应的化学性质。并且,本发明方法可用于捕获及释放一样品中至少约5%、约10%、约20%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、约90%、约95%、约98%、约99%或甚至基本上所有的一或若干特定类分子,该等分子与含有一捕获及标记试剂的本发明固态载体接触并与其结合。例如,如本文中所揭示,基本上100%的分子可被捕获并释放(参见实例I)。所属技术领域的技术人员可不难确定捕获样品分子及/或自固态载体释放样品分子的最佳条件。
本发明进一步提供一种标记一分子的方法。本方法包括下列步骤:使样品分子与结合至化学基团(其包含可切割官能基、或多个官能基及用于该样品分子的反应性基团)的固态载体在允许该样品分子与该反应性基团共价结合的条件下接触;修饰该结合于该固态载体的样品分子;及切割该可切割官能基,由此释放该经修饰的包含一或多个官能基的样品分子。
视需要,本发明方法可用于修饰捕获分子。例如,这些方法可用于自一样品捕获多肽(包括磷酸化及非磷酸化多肽两者)。最近,有人阐释了一种系统分析蛋白质磷酸化的方法(Zhou等人,自然生物技术(Nature Biotechnol.)19:375-378(2001))。与Zhou等人在溶液中进行化学反应不同,可首先使用本文所揭示的方法捕获多肽并在其结合于固态载体时对其进行修饰(参见实例IV)。或者,可在实施Zhou等人(见上文所述文献,2001)所述反应或任何其他化学或酶促修饰后应用本文所揭示的用于捕获并标记一分子的方法。
本发明之组合物及方法可较佳用于多种应用中。一种特别有用的应用为定量蛋白质表达分析。例如,本文所揭示的方法及试剂可用于将特定同位素特征赋予一分子(例如一复杂样品中所含的多肽)。在定量分析的一种特定应用中,可对两或多种样品进行比较(参见图8,实例III)。可根据稳定同位素稀释概念以与用于相对定量蛋白质表达的ICAT技术类似的方式对两种不同样品的肽进行定量分析(Gygi等人,自然生物技术(Nature Biotechnol.)17:994-999(1999);参见实例V)。可使用一经差示同位素标记的分子来标记两种样品以进行比较,例如,该分子可为一例如氘化白氨酸或未氘化白氨酸的氨基酸或其他可作为两种不同样品的质量标记物纳入的氨基酸。本发明方法的优点在于,分子的分离和标记物(例如一稳定同位素)的纳入二者均可实现。因此,本发明方法对定量质谱分析而言特别有用。
如本文中所揭示,亦可通过一肽的胺基将官能基纳入多肽中,当一捕获方法之实施基于多肽中存在硫氢基时,若待分析的多肽中不含游离丝氨酸残基,则这一点特别有用。由于大多数多肽在其N端至少含有一个胺基,因此,即使是不含丝氨酸残基的多肽亦可使用基于固相的方法进行标记,以便将硫氢基纳入该多肽中。若一样品中的多肽具有一阻断胺基端,则可使该等多肽断裂以在所切割片段上产生一游离胺基端。因此,本发明方法可适于使用特定化学修饰形式分离多种分子。
此外,在转移标记物的选择方面存在很大的结构灵活性。因此,可有意选择标记物的结构以达成特定目的。例如,转移一疏水标记物可使极性极强的肽更具疏水性且因此可更好地保留在反相管柱上,转移一强气相碱性基团(例如吡啶基)可引导质谱仪碰撞室中的断裂反应,或可加入具有特征同位素分布的元素(例如氯或溴)以便为经标记的肽提供不同的同位素特征。
本发明方法亦可用于分析经修饰的分子,例如,通过转译后修饰方式修饰 的多肽。例如,这些方法可用于定量分析蛋白质磷酸化形式。用于系统分析蛋白质磷酸化形式的方法先前已有阐述(Zhou等人,自然生物技术(NatureBiotechnol.)19:375-378(2001))。在溶液中进行一系列化学反应,以选择性地自含有磷酸化多肽和未磷酸化多肽的复杂肽溶液中分离出磷酸化肽(Zhou等人,见上文所述文献,2001)。本文所揭示的使用固相捕获及释放的方法亦可用于选择性分离磷酸肽。如本文中所揭示,经磷酸化及未经磷酸化的多肽均被捕获于固相珠粒上。固定后,进行一系列化学反应,从而可以磷酸基特异性方式标记磷酸肽(Zhou等人,见上文所述文献,2001)。通过切割释放这些肽,由此将一稳定同位素特征赋予每一肽以便于准确定量。可使用本文揭示用于分离含硫氢基分子的方法来捕获最初经磷酸化的多肽(现已转化成硫氢基)。可将所捕获的多肽洗涤至不含未经磷酸化的肽并将其释放以用于(例如)质谱分析。本文所揭示的本发明方法相对于溶液化学方法而言具有明显优势,因为在每一化学反应后用于除去过量试剂所需的样品处理步骤数量显著降低并简化。
除磷酸化形式外,本发明方法亦可容易地应用于具有许多不同转译后修饰形式(例如糖基化、泛素化、乙酰化、棕榈酰化、十四烷基化及诸如此类)的多肽,如本文中所揭示。因此,本发明方法可用于选择性地分离其他经转译后修饰的分子(包括多肽)同时可将各种官能基转移至肽上。选择性分离一特定类型的转移后修饰形式可使用本发明方法达成。例如,可使用一其对泛素化形式具有特异结合活性的抗体来分离泛素化多肽,由此可以与定量分析蛋白质磷酸化形式大致相同的方式定量分析多肽的泛素化形式。若需要,这些方法亦可应用于其他分子修饰形式。
亦可使用抗体对利用表位标记物修饰的样品分子进行后续分析及/或分离。用于制备抗体的方法已为所属技术领域的技术人员所熟知。术语“抗体”以其最宽泛意义使用,其包括多克隆和单克隆抗体以及这些抗体的抗原结合段。一可用于本发明的抗体或此一抗体的抗原结合段的特征在于:其对多肽或其一肽部分的特异性结合活性至少约为1×105M-1。因此,一抗体的Fab、F(ab′)2、Fd、Fv、单链Fv(scFv)段及诸如此类可保持对多肽的特异性结合活性。所属技术领域的技术人员通过(例如)比较一抗体对一特定抗原的结合活性及其对一对照抗原的结合活性可不难确定一抗体对多肽的特异性结合活性。制备多克隆或单克隆抗体及测定结合活性及/或特异性的方法已为所属技术领域的技术人员所熟知(参见,例如,Harlow及Lane,“抗体:实验室手册”(Antibodies:A Laboratory Manual),Cold Spring Harbor Laboratory Press(1988))。
尽管在本文中基本上用多肽例示本发明方法,但应了解,一样品中多种分子的任何一种均可轻易地用本文所揭示的方法来标记。通常,多种生物分子(例如寡聚核苷酸、代谢物及诸如此类)均可用本文所揭示方法进行官能化,以便 纳入用于改良的定性或定量分析所需的官能基。因此,本文所揭示的允许将特异性官能基可逆捕获并转移至一分子上的方法通常用于蛋白质组学领域、其他类型的探索科学及定量生物分析中的许多应用中。
本发明方法可用于有效捕获并释放一类分子(例如多肽、核酸、脂质、第二信使、代谢物及诸如此类)或该类分子的亚型。若需要,本发明方法亦可用于捕获两类或更多类分子及/或这些类分子的亚型。例如,视需要,这些方法可用于捕获多肽及核酸两者或两或多类分子的任一组合。
本发明亦提供一种用于分析一分子的方法。该方法包括下列步骤:使样品分子与结合至化学基团(其包含可切割官能基、或多个官能基及用于该样品分子的反应性基团)的固态载体在允许该样品分子与该反应性基团共价结合的条件下接触;及自该固态载体上切割该样品分子,其中一或多个特异性官能基被转移至所释放的样品分子上;及分析所释放的样品分子。可使用多种分析方法中的任何一种,例如质谱法、定序、液相色谱法、分光光度法、荧光光谱法及诸如此类。本发明方法的优点在于可以共价方式捕获分子,由此可在分析前进行彻底洗涤以除去非分析物物质。此外,欲转移至所捕获分子上的官能基可通过(例如)加入一发色团、荧光团、质量标记物及诸如此类纳入一有助于进行进一步分子分析的官能基。
质谱法是一种特别有用的样品分子分析方法。可使用多种质谱系统来分析用本发明方法所捕获的样品分子。可使用具有高质量精确度、高灵敏度及高解析度的质量分析仪且其包括(但不限于)基质辅助镭射解吸飞行时间(MALDI-TOF)质谱仪、电喷雾离子化飞行时间(ESI-TOF)质谱仪及付立叶变换离子回旋质量分析仪(FT-ICR-MS)。其他MS模式包括离子陷阱及三级四极质谱仪。在离子陷阱MS中,通过电喷雾离子化或MALDI将分析物离子化,然后将其置于一离子陷阱中。然后,在所捕获离子自离子陷阱选择性释放后可通过MS单独对其进行分析。亦可在离子陷阱中产生片段并进行分析。使用本发明方法以一质量标记物标记的样品分子可通过(例如)单阶段质谱法用一MALDI-TOF或ESI-TOF系统进行分析。另外,亦可使用LC-MS/MS或LC-ESI-TOF。应了解,可使用任何MS方法及MS方法的任何组合来分析样品分子。质谱分析方法已为所属技术领域的技术人员所熟知(参见,例如,Yates,J.Mass Spect. 33:1-19(1998);Kinter及Sherman,“使用串列质谱对蛋白质进行测序及鉴别”(Protein Sequencing and Identification Using Tandem MassSpectrometry),John Wiley&Sons,纽约(2000))。
本发明方法可用于分析一样品中的若干分子。举例而言,该样品可衍生自一生物样品。具体而言,一样品指一自一生物体或个体获得的样品。自一个体所获得的样品可为一液体或组织样品。例如,所获得的组织样品可为一活体组织检查样品,例如一皮肤活体组织检查样品、组织活体组织检查样品或肿瘤活 体组织检查样品。一液体样品可为血液、血清、尿液、唾液、脑脊液或其他体液。由于液体样品易于自一个体获得,因此,其在本发明方法中特别有用。样品收集方法已为所属技术领域的技术人员所熟知(参见,例如,Young及Bermes,“Tietz临床化学教科书”(Tietz Textbook of Clinical Chemistry)第3版,Burtis及Ashwood编辑,W.B.Saunders,Philadelphia,第2章,第42-72页(1999))。一样品亦可为一可衍生自微生物培养的微生物样品,包括自一个体样品培养所得者。因此,本发明方法可用于分析生物样品的复杂混合物。
尽管本发明方法的优点在于可直接分析复杂生物样品,但若需要,亦可对一样品进行处理。例如,可分级分离一血液样品以分离出特定细胞型,例如红细胞、白细胞及诸如此类。亦可根据(例如)结构或功能特性分级分离一血清样品以分离出特定类型的蛋白质,例如通过糖基化、磷酸化或其他转译后修饰方式修饰的血清蛋白质或具有一特定亲和性(例如对核酸的亲和性)的蛋白质。亦可根据物理化学特性(例如,大小、pI及诸如此类)对一血清样品进行分级分离。可进一步分级分离一血清样品以除去高含量主体蛋白质(例如白蛋白)以便于对低含量血清多肽进行分析。此外,可对一细胞样品进行分级分离以分离出亚细胞器。另外,可通过任何已知分级分离方法将一细胞或组织样品溶解或分级分离,这些方法包括层析技术,例如离子交换、疏水及反相、大小排除法、亲和性、疏水性电荷感应层析法及诸如此类(Ausubel等人,见上文所述文献,1999;Scopes,“蛋白质纯化:原理及实践”(Protein Purification:Principles and Practice),第3版,Springer-Verlag,纽约(1993);Burton及Harding,J.Chromatogr.A 814:71-81(1998))。
尽管本发明方法对分析复杂样品例如生物样品(参见实例V)特别有用,但这些方法亦可用于复杂性较低的样品。例如,可如上所述对样品进行分级分离以使固相上捕获的样品分子数量较少(包括先前的亲和层析)。另外,样品亦可为一通过(例如)重组方法高度纯化的样品,其基本上仅包括单一纯化分子(例如多肽或核酸)或在样品中表达水平很高的分子。
本发明方法可宜于采用自动化。例如,若需要,自动采样、机器人技术或任何适宜的自动化方法均可用于本发明方法。由于所有的反应均易于以自动方式进行,因此,本发明方法可允许大量制备样品。另外,由于实质上不存在样品处理(例如转移)步骤,所以可将所捕获分子的损失降至最小,从而提高分子复原产率。因为所捕获样品分子在洗涤步骤期间仍保持与固态载体结合,所以亦可彻底洗涤所捕获分子以除去未捕获的样品分子或任何试剂。视需要,本发明方法可用于捕获基本上样品中一类或多类分子的全部或样品分子的一部分。
本发明方法可用于测定样品中分子的表达水平。表达水平指一分子在一样品中的含量。一分子的表达水平可表示由一基因编码的信使RNA(mRNA)数量、 对应于一基因编码的给定氨基酸序列的多肽之数量或聚集在一细胞中的一分子的生物化学形式之数量,包括,例如,一分子(例如多肽、核酸或小分子)的特定合成后修饰形式的数量。表达水平可指一样品中一分子的绝对数量或指该分子与一标准相比的相对数量,包括在稳定状态或非稳定状态条件下测得的数量。一分子的表达水平可相对于样品中的一对照组成分子测定。如本文中所揭示,通常可直接比较两种或多种样品来测定表达水平(参见实例III)。
如本文中所揭示,固相可为玻璃珠,例如控制孔隙玻璃珠(参见实例I)。然而,可使用任何用于结合样品分子并实施所需化学过程及洗涤条件的适当固态载体。因此,固态载体可为玻璃、衍生玻璃、硅、塑料或其他物质。任何适于固相化学合成的固相材料均可用作本发明方法中的固态载体。固态载体可为多孔或无孔材料、表面薄膜、磁珠、胶体、膜片及诸如此类。固态载体可为珠粒、平面形式或适于使用本文所揭示方法捕获分子的构造。视需要,固态载体可经衍生以纳入适于结合其他化学基团的化学部分。
本发明亦提供含有本发明试剂或组合物的套组。因此,本发明提供一具有一固相捕获及标记试剂的套组,如图1所例示。本发明套组的内含物(例如,本发明之一固相捕获及标记试剂或组合物)包含于一封装材料内,且可置于(若需要)一无菌且无污染的环境中。另外,该封装材料包含有用于说明如何使用套组内的材料来标记样品分子的说明书。使用说明书通常包括说明试剂浓度或至少一分析方法参数的明确表述,例如欲混合试剂及样品的相对数量、试剂/样品混合物的保持时间、温度、缓冲条件及诸如此类。
应了解,基本不影响本发明各种实施例的活性的修饰形式亦包括在本文所提供的本发明的界定范围内。因此,下列实例意欲阐述本发明而非对其加以限制。
实例I
含半胱氨酸的肽与一固态载体之结合及复原
本实例用于说明一含半胱氨酸的肽与珠粒之结合及一经修饰的肽通过光切割之复原。
图1C所示示意图阐释了一含半胱氨酸的肽与固相珠粒之结合及经修饰的肽通过光切割之复原。图1提出了一种使用一固相同位素标记试剂对半胱氨酰基肽进行位置特异性稳定同位素标记的方法。首先通过固相肽合成使以邻硝基苄基为主的光可切割连接体结合于涂敷有胺基丙基的玻璃珠上(Holmes及Jones,J.Org.Chem.60:2318-2319(1995))。然后,再一次通过固相肽合成使同位素标记物即一含有7个氢原子(d0)或7个氘原子(d7)的白氨酸分子结合于该光可切割的连接体上(Holmes及Jones,见上文所述文献,1995)。 最后,结合一硫氢基特异性碘乙酰基基团。
使用具有序列CDPGYIGSR(SEQ ID NO:1;分子量为967)的市售层粘连蛋白B肽来阐述一含半胱氨酸肽的捕获及修饰。概言之,使用一由1nmol含半胱氨酸的层粘连蛋白B肽(CDPGYIGSR;SEQ ID NO:1)及500pmol不含半胱氨酸的磷酸血管紧张素(DRVY*IHPF,SEQ ID NO:2,其中星号表示经磷酸化的酪氨酸)组成的样品。在室温下用5mM溶于100μl 0.2M Tris(pH 8.0)中的叁(羧基乙基)膦(TCEP)、10mM乙二胺四乙酸(EDTA)将肽还原30分钟。
通过反相HPLC上的液相色谱及质谱法(LC-MS)分析肽。用叁(2-羧基乙基)膦(TCEP)还原该肽并测定为在9.55分钟时洗脱出的单峰,如预期,二价离子的质荷比(m/z)为m/z=484.6(参见图2)。在11.94分钟时洗脱出的第二峰为另一标样肽,即磷酸血管紧张素,其具有序列DRVYIHPF(SEQ ID NO:2;分子量为1126)并作为一对照物加至样品中。磷酸血管紧张素不含半胱氨酸且观测到其具有预期质量。
由控制孔隙玻璃制成的固相载体珠粒通过共价结合一具有一胺基官能基的光可切割连接体而获得修饰(参见图1)。该光可切割的连接体通过一硅烷键结合于该固态载体上。该反应性基团为一可与硫氢基反生特异性反应的碘乙酰基。将用胺基官能化的玻璃珠(Sigma Aldrich;St Louis MO)用作固态载体。经Fmoc保护的光连接体(4-[4-(1-(Fmoc胺基)乙基)-2-甲氧基-5-硝基苯氧基]丁酸或Fmoc-胺基乙基-光连接体;NovaBiochem,Merck KGaA分公司;Darmstadt Germany)及白氨酸使用标准固相肽合成步骤通过碳化二亚胺化学过程依次结合于经胺基官能化的珠粒上。然后通过哌啶处理除去白氨酸上的Fmoc保护,且白氨酸的游离α-胺基与碘醋酸酐反应形成反应性碘乙酰基。
简言之,固相同位素珠粒按下文所述方法合成。除非另有说明,否则,化学品均购自Aldrich(Milwaukee,WI)。首先,用无水二甲基甲酰胺(DMF)洗涤0.5克涂敷有胺基丙基的控制孔隙玻璃珠(胺含量约为400μmol/g;Sigma,St.Louis,MO)。然后,在室温下将各为600μmol的1-羟基苯并三唑(HOBt;Nova Biochem,Laufelfingen,瑞士)、Fmoc-胺基乙基光连接体(Nova Biochem)及二异丙基碳化二亚胺(DIC)混合30分钟,将该混合物加至珠粒上保持90分钟。然后依次用DMF及二氯甲烷洗涤珠粒并用2毫升溶于二氯甲烷中的40%醋酸酐/60%吡啶实施30分钟封端反应。再一次用DMF洗涤珠粒并用20%之吡啶溶于DMF的溶液实施30分钟处理以除去Fmoc保护。重复该过程以结合作为同位素标记物的Fmoc-白氨酸(Nova Biochem)。最后,如上所述将碘乙酰基结合于珠粒上(Zhou等人,Nat.Biotechnol.19:375-378(2001))。依次用DMF、水及甲醇洗涤珠粒、在低压下干燥并在室温下储存于暗处。对于合成具有重同位素的珠粒而言,基本上如上所述(Lapatsanis等人,合成方法 (Synthesis)671-673(1983))由d7-白氨酸(Isotec,Miamisberg,OH)及Fmoc-N-羟基琥珀酰亚胺(Nova Biochem)合成Fmoc-d7-白氨酸,其不同之处在于省略了纯化Fmoc-白氨酸的重结晶步骤。
在不断搅拌下使用5毫克如上所述制备的珠粒(2μmol结合能力)来捕获体积为100μl的肽。在加入珠粒前及其加入后的不同时间点上自该反应混合物中取出上清液分液(1μl)用于μLC-MS分析。经15分钟培养后,加入2μlβ-巯基乙醇保持5分钟使珠粒失活并依次用2.0M氯化钠、甲醇及水洗涤珠粒。为了实施光切割,需将珠粒重新悬浮于100μl 0.2M Tris(pH 8.0)、10mM EDTA、2%β-巯基乙醇中。加入磷酸血管紧张素(500pmol)作为内部标样。自Blak-Ray长波UV灯(100W,VWR Scientific,West Chester,PA)发出的光通过10%硫酸铜(II)溶液(路径长度为1厘米)过滤并用于自距珠粒10厘米处照射珠粒。在不同照射时间点上分别自上清液中取出1μl分液进行μLC-MS分析。不时搅拌珠粒以确保光照均匀。在光切割缓冲液中使用β-巯基乙醇可防止在光切割期间可能发生的甲硫胺酸氧化反应。
如图1中所示,在培养肽及珠粒后,再一次使用LC-MS分析一上清液分液。分析数据如图3所示。如预期,上清液中仅含有不含半胱氨酸的磷酸血管紧张素肽,而含半胱氨酸的层粘连蛋白B肽可能由于被珠粒定量捕获而从溶液中彻底消失。
用2M氯化钠、甲醇及水洗涤珠粒后,将珠粒重新悬浮在含0.2M Tris(pH8.0)、10mM乙二胺四乙酸(EDTA)的缓冲液中,并再一次掺加相同浓度的磷酸血管紧张素作为对照物。将珠粒暴露在360nm紫外光下以进行光切割。经光切割后,在与初始层粘连蛋白B肽相比略微滞后的洗脱时间(10.72分钟)处观察到具有预期质量修饰形式的层粘连蛋白B肽([M+2H]2+离子的m/z=569)(图4)。较长的保留时间与预期光切割产物的极性因加入被转移的白氨酸氨基酸而降低相一致。通过MS/MS定序分析进一步确定光切割产物的结构。通过经修饰的层粘连蛋白B肽与磷酸血管紧张素标样的相对峰强度可粗略估算出光切割效率。最初加入的层粘连蛋白B肽中至少有50%被复原。该产率可通过进一步优化捕获及释放反应而提高。
使用由一含半胱氨酸的层粘连蛋白B肽及不含半胱氨酸的层粘连蛋白B肽构成的混合物来说明捕获及释放反应的效率。层粘连蛋白B被定量捕获于固相上。经1小时光切割后,经标记的层粘连蛋白B被复原;其显示出因将白氨酸标记物加至半胱氨酸残基而产生的预期质量修饰形式(+170Da),其亦经MS/MS确认。与未经标记的形式相比,白氨酸标记物的疏水性质可增加经标记层粘连蛋白B的保留时间。与相同数量的磷酸血管紧张素相比,未经标记及经标记层粘连蛋白B的信号强度表明可特异性捕获并几乎可完全复原经标记的层粘连蛋白B。光切割时间较长并不影响经标记层粘连蛋白B的产率及质量, 表明所有经光催化的副反应均不明显。
上述结果表明,通过捕获及释放化学过程可将氨基酸白氨酸成功转移至一肽的硫氢基侧链上。这些结果例示了一种用于选择性捕获肽并将官能基(例如氨基酸)转移至这些肽上的常用方法。
实例II
修饰多肽的胺基以纳入一硫氢基
本实例描述了为纳入一硫氢基而对肽进行的N端修饰。
若肽中不含半胱氨酸残基,则可对肽进行修饰以纳入一硫氢基,以便将一胺基转变成一硫氢基并通过所纳入的硫氢基将肽捕获。用于修饰多肽的胺基的方法如图5所示。
使用磷酸血管紧张素来阐述将一胺基修饰成一硫氢基的原理。首先用N-琥珀酰亚胺基S-乙酰基硫代乙酸(SATA)(其可与第一胺发生特异性反应)修饰肽。如图5所示修饰磷酸血管紧张素。概言之,在室温下于0.1M K3PO4(pH8.0)中培养磷酸血管紧张素与10mM SATA30分钟。
用LC-MS分析经修饰的磷酸血管紧张素。可观察到肽的N端修饰形式。图6所示数据显示在14.5-14.55分钟时洗脱出一单一产物,[M+2H]2+离子的m/z=622.3。所测得的质量与经SATA衍生的磷酸血管紧张素肽的计算质量(m/z=622.3)相关性良好。
用pH为8的0.1M羟胺处理经修饰的肽2小时,随后用5mM TCEP还原30分钟。如图5所示,用羟胺处理及用TCEP还原可在经SATA衍生的磷酸血管紧张素中产生一游离SH基团。图7中示出了经此一处理的化合物的LC-MS分析数据。同样,可观察到一在13.86分钟时洗脱出的单一产物。MS分析表明[M+2H]2+离子的m/z=601。所测得的质量与预期肽产物的计算质量(m/z=601)一致。因此,可以定量方式将肽的胺基转变成游离SH基团且副产物的量最小。并且,随后可如实例I所述捕获此一经硫氢基修饰的多肽。
上述结果表明,可基本上以定量方式修饰多肽的胺基以纳入一硫氢基。
实例III
通过纳入重及轻标记分析蛋白质样品
本实例阐述了以差示方式标记两个样品以通过质谱法定性及定量分析样品多肽。
图8示出了以差示方式标记多肽的示意图。用一蛋白酶(例如胰蛋白酶)消化样品。如实例I所述处理经消化的多肽。若需要,可通过实例II中所阐 述的方法修饰样品多肽以检查不含半胱氨酸的多肽。
将一经消化的样品加至共价结合于化学基团(其包含一未经氘化的氨基酸,例如白氨酸或另一适当氨基酸)的珠粒中。将第二样品加至共价结合于一化学性质相同的基团的珠粒中,其不同之处在于该化学基团含有同一氨基酸的氘化形式。经差示同位素标记的白氨酸在质量上的差别为7或10个质量单位,具体情况视白氨酸的氘化状态而定。
当样品多肽共价结合于各含经差示同位素标记的氨基酸的珠粒上后,合并珠粒并随后通过光切割进行切割。同时通过质谱法分析经光切割且此时经差示标记的多肽。MS可用于通过直接比较来自两个样品的MS信号的强度来定量分析样品,两者相差一预定质量且可易于通过MS区别为相差预定质量的双峰。另外,可通过MS测定样品的序列。
本实例阐述了样品分子的差示标记及通过质谱法对样品分子的分析。
实例IV
修饰所捕获的磷酸肽
本实例阐述了对多肽的捕获及对所捕获磷酸肽的修饰。
来自一样品的多肽基本上如实例I所述被捕获于珠粒上。基本上按下述文献阐述的方法修饰所捕获的多肽:Zhou等人,自然生物技术(NatureBiotechnol.)19:375-378(2001),其以引用方式并入本文中。
简言之,通过下列步骤修饰所捕获的多肽:(1)胺基保护:视情况可使用二碳酸特丁酯(tBoc)化学过程来保护肽的胺基以消除在随后的反应中发生分子内及分子间缩合反应的可能性。(2)缩合反应:用碳化二亚胺催化肽与过量胺之间的缩合反应以分别在肽的羧酸键及磷酸键处形成酰胺及氨基磷酸键。(3)重新生成磷酸根:通过氨基磷酸键的简单酸解重新生成游离磷酸根基团。(4)缩合反应及还原反应:通过一经碳化二亚胺催化的缩合反应将一胱胺结合于重新生成的磷酸根基团上。然后还原胱胺的内二硫键以生成一可用于所捕获磷酸肽每一磷酸根的游离硫氢基。(5)释放经修饰的多肽:使用(例如)如实例I所述的光通过切割可化学切割基团将所捕获的多肽自固态载体中释放。(6)固相捕获:通过使肽中的游离硫氢基与固定在玻璃珠上的碘乙酰基反应将所释放的多肽(包括含一游离硫氢基的经修饰磷酸肽)结合于一第二固相。(7)磷酸肽复原:经严格的树脂洗涤后,使用其浓度亦可除去tBoc保护基团的三氟醋酸(TFA)通过切割氨基磷酸键使磷酸肽复原,由此重新生成具有游离胺基及磷酸根基团的肽。羧酸根基团自步骤(2)起保持阻断状态。
下文更加详细地阐述了所进行的这些化学反应。在50%(体积/体积)0.1M磷酸盐缓冲液(pH11)及乙腈中培养含有所捕获多肽的固相。在室温下经4 小时加入0.1M tBoc。然后除去乙腈。将含有所捕获多肽的固相在室温下于1M乙醇胺、25mM N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)及0.5M N,N′-二甲胺基丙基-乙基-碳化二亚胺氢氯酸盐(EDC)中培养2小时。加入10%TFA并在室温下培养30分钟。洗涤固相以除去过量试剂并脱盐,且加入1M咪唑(pH 6.0)。在室温下经3小时加入0.5M EDC。洗涤固相,然后在50℃下与1M胱胺(pH 8.0)一起培养2小时。用水洗涤固相,然后用10m M二硫苏糖醇(DTT)还原以生成游离硫氢基。洗涤固相以除去DTT,然后通过切割可切割官能基释放所捕获分子。
所释放的多肽(包括用硫氢基修饰的磷酸肽)与第二种固相珠粒一起培养至少2小时,这些珠粒具有碘乙酰基并用1M Tris(pH 8.0)、50mM乙二胺四乙酸(EDTA)滴定至pH值为8.0。通过3当量碘醋酸酐和1当量胺基珠粒(G4643;Sigma;St Louis MO)与3.3当量二异丙基乙胺在二甲基甲酰胺中反应2小时来制备具有固定碘乙酰基的珠粒。由于酪氨酸与碳化二亚胺的加成反应为一可能发生的副反应,所以将捕获的经硫氢基修饰的磷酸肽在室温下于1M羟胺(pH10)中培养2小时,以恢复所有被修饰的酪氨酸。然后依次用2M NaCl、甲醇及水洗涤珠粒以除去以非特异性方式结合的分子。将珠粒与100%TFA一起培养30分钟以复原磷酸肽并同时除去经tBoc修饰的基团中的tBoc保护。然后通过(例如)质谱分析所复原的磷酸肽。
捕获于第一固态载体上的分子通常恰好于其重新捕获于第二固相(其可选择性地捕获经修饰的磷酸肽)上之前释放,由此可有效洗涤并除去用于修饰所捕获多肽的化学物质。然而,若于第一固相之结合仅意欲将一标记或标记物转移至所捕获多肽上,则多肽可在一更早阶段(甚至在起始捕获前)释放。或者,可基本上如Zhou等人所述对磷酸肽进行修饰,然后复原如实例I中所述捕获及标记的磷酸肽。
本实例阐述了磷酸肽的选择性修饰及分离。
实例V
酵母蛋白质之分离及同位素标记
本实例描述了一种通过一固相捕获及分离过程以位置特异性及稳定同位素方式标记复杂肽混合物中的半胱氨酰基肽并同时分离所标记肽的方法。
通过捕获于固相同位素标记试剂上并自其上释放来对酵母蛋白质进行差示同位素标记。通过毛细管液相色谱及串列质谱(μLC-MS/MS)分析所复原的肽以测定其序列及相对数量。该方法用于检测酿酒酵母中由半乳糖引发的蛋白度丰度变化。与同位素标记亲和标记物(ICAT)方法(Gygi等人,见上文所述文献,1999)的并列比较表明,用于以稳定同位素方式标记肽的固相方法相对而言更简单、更为有效且更灵敏。
将来自两个待比较样品的半胱氨酰基肽共价捕获于含有重或标准同位素标记物的固相上。然后将珠粒合并、洗涤并暴露于UV光(360nm,选择其以使任何可能的光催化副反应最小化)下。由此可光切割连接体并使同位素标记物自固相转移至半胱氨酸残基的侧链上。最后,基本上如上所述通过μLC-MS/MS分析所复原的经标记肽以测定每一肽的序列及相对丰度(Gygi等人,见上文所述文献,1999)。
稳定同位素标记是一种通过质谱来定量分析蛋白质的常用方法(Gygi等人,见上文所述文献,1999;Oda等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:6591-6596(1999);Ideker等人,Science 292:929-934(2001);Han等人,Nat.Biotechnol.19:946-951(2001))。为了对固相方法的效能与标准ICAT方法的效能进行比较(Gygi等人,见上文所述文献,1999),进行了一并列比较,其中使用这两种方法来检测酿酒酵母中由半乳糖引发的蛋白蛋表达变化。对两份皆来自同一酵母蛋白质的数量不同的起始蛋白质材料(大样品加载量为100μg,小样品加载量为10μg)进行评价。因为评价目的是比较标记方法而非肽分离或蛋白质鉴别方法的相对效能,所以仅对所有样品实施LC-MS/MS操作来进行蛋白质鉴别。由此可将因样品处理而非标记所造成的结果差别最小化,但这有可能使鉴别出的蛋白质数量少于原本用较多样品数量及优化的LC-MS/MS上游肽分离步骤所能获得者。
为制备酵母蛋白质样品,在100毫升YPR(1%酵母提取物、2%蛋白胨(Difco,Detroit,MI)及2%棉子糖)或YPR+2%半乳糖中将酵母菌株培育至A600为1。如上所述制备原生质球(Ausubel等人,见上文所述文献)。将原生质球溶于50mM Tris(pH 8.0)、5mM EDTA、6M尿素、0.5%SDS中。在15,000g(14,000rpm)下将细胞裂解物离心15分钟。收集上清液并通过Econo-Pac 10DG管柱(Bio-Rad,Hercules,CA)在50mM Tris(pH 8.0)、5mM EDTA中脱盐。通过Bio-Rad蛋白质分析测定蛋白质浓度。
实施大规模及小规模实验来通过固相捕获-释放方法分离并以同位素方式标记酵母蛋白质的胰蛋白酶消化液。对大规模实验而言,在100μl 200mM Tris(pH 8.0)、5mM EDTA中制备各为50μg的用或未用半乳糖培育的酵母细胞的蛋白质提取物(共100μg)。用5μg胰蛋白酶在37℃下消化每一蛋白质提取物3小时并用5mM TCEP还原,然后如实例I所述用具有d0-白氨酸或d7-白氨酸标记物的珠粒捕获半胱氨酰基肽15分钟。合并珠粒并洗涤,通过光照2小时释放经标记的肽。将所释放的肽加载于一MCX管柱(Waters,Milford,MA)上并依次用4毫升0.1%三氟醋酸(TFA)、4毫升80%乙腈/0.1%TFA及水(用于中和)洗涤。用1毫升9体积甲醇与1体积28%氨的混合物洗脱肽并在低压下干燥。将经干燥的肽重新悬浮在水中以进行μLC-MS/MS分析。然后,如上所述使用一LCQ离子陷阱质谱仪(Finnigan,San Joes,CA)通过μLC-MS/MS分 析20%所复原的肽(代表20μg经合并的蛋白质)(Zhou等人,Nat.Biotechnol. 19:375-378(2001))。使用Sequest及现有软件进行蛋白质鉴别及定量分析(Han等人,Nat.Biotechnol.19:946-951(2001);Eng等人,J.Am.Soc.Mass Spectrom.5:976-989(1994))。对于小规模实验而言,用0.5μg胰蛋白酶消化各为50μg的用或未用半乳糖培育的细胞的蛋白质提取物并如上所述进行处理,然后通过相同的μLC-MS/MS方法分析50%所复原的肽混合物(代表5μg合并的蛋白质提取物)。
为了通过ICAT对酵母蛋白质进行同位素标记及肽分离,制备了各为100μg的用或未用半乳糖培育的细胞的蛋白质提取物作为标记缓冲液(含200mM Tris(pH 8)、0.5mM EDTA、6M尿素及0.05%SDS)中的起始材料。用5mM TCEP将蛋白质还原30分钟,将100μg d0-ICAT或d8-ICAT分别加至用棉子糖或半乳糖培育的细胞的蛋白质提取物中。在室温下标记90分钟后,通过加入β-巯基乙醇至10mM使反应停止并合并反应物。用20mM Tris(pH 8.3)、0.01%SDS将每一样品稀释10倍。加入胰蛋白酶(10μg)在37℃下消化蛋白质3小时。用等体积缓冲液A,(5mM KH2PO4(pH 3)、25%CH3CN)稀释样品并用稀TFA将pH值调节至3。将100μg(大规模实验)或10μg(小规模实验)合并的蛋白质消化液施加至一在缓冲液A中平衡的阳离子交换管柱(Applied Biosystems,Foster市,CA)上。用2毫升缓冲液A洗涤该管柱,随后用2毫升缓冲液A+40mM KCl洗涤。用600μl缓冲液A+600mM KCl洗脱所结合的肽。在低压下将样品体积降至300μl,加入500μl 2×PBS及12μl 1M NH4HCO3。使样品通过一单体抗生物素蛋白管柱(Applied Biosystems)并用2毫升2×PBS、1毫升1×PBS及1毫升含有20%甲醇的50mM NH4HCO3洗涤。用1毫升含有30%乙腈的0.4%TFA洗脱经标记的肽、在低压下干燥并重新悬浮于10μl含有5%乙腈的0.4%醋酸。对于大规模或小规模实验,皆通过与固相方法中所用者相同的μLC-MS/MS方法分析相同数量的样品。
在小规模及大规模实验中,通过固相方法鉴别及定量的蛋白质数量均大于通过ICAT鉴别及定量的数量(图9)。确实,固相方法更灵敏,其可鉴别大多数由传统ICAT鉴别的蛋白质及ICAT未能鉴别的许多其他蛋白质(图9A、9B)。在多次实验中所鉴别的相同蛋白质的定量亦较一致。因此,蛋白质定量不受同位素标记物的结构或固相方法的捕获及释放化学过程的影响。
已知半乳糖可强烈诱发几种与半乳糖使用有关的基因的表达,包括半乳糖激酶(GAL1)、半乳糖通透酶(GAL2)、半乳糖转移酶(GAL7)及UDP-葡萄糖-4-差向异构酶(GALX)(Johnston及Carlson,“酿酒酵母的分子及细胞生物学”(The Molecular and Cellular Biology of the Yeast Saccharomyces),Jones等人,eds.,第193-281页,Cold Spring Harbor Press,Cold SpringHarbor,NY(1992))。用半乳糖诱发后,通过固相方法鉴别并定量多个来自蛋 白质(包括GAL1、GAL2、GAL7及GALX)的肽。与此相反,在小及大样品加载量实验中使用ICAT方法均只鉴别出一个来自GAL1蛋白质的肽,且信噪比较使用固相方法为低。这些数据证实,固相方法的样品复原率及灵敏性均优于ICAT方法。另外,固相方法的重现性通过小及大规模实验鉴别出的蛋白质基本一致获得了验证(图9C)。
这些结果表明,对于定量蛋白质分析而言,固相方法较为简单、可重现、有效且灵敏。确实,与ICAT方法相比,其具有若干优点。首先,使用固相方法基本上可在一个步骤中达成分离含半胱氨酸肽及稳定纳入同位素二者。因此,固相方法与ICAT方法相比更快、更简单且需要更少的手动输入。第二,将肽共价捕获于一固相可容许使用严格的洗涤条件来除去非共价结合的分子。实际上,本文所述实验几乎仅复原半胱氨酰基肽。第三,该步骤不受所存在的蛋白酶(例如胰蛋白酶)或强变性剂及洗涤剂(例如尿素及SDS)的影响。因此无需额外步骤来除去这些分子。因为样品处理的最少化,所以该固相方法比ICAT方法更为灵敏。由于许多生物相关事件涉及丰度相对较低的调节蛋白,因此,可使用固相方法分析这些蛋白的诱发变化。第四,结合过程中所涉及的标准固相肽化学过程允许使用多种天然或非天然氨基酸来代替本文所用的d0-d7白氨酸作为同位素质量标记物。此便于在一个实验中使用多种用于分析多种样品(多于两种)的质量标记物来合成珠粒。第五,本文所用半胱氨酸上的质量标记物--d0-白氨酸标记物--重170Da。由于标记物很小以及其所具有的化学性质,与经ICAT标记的肽的状况相反,在MS/MS模式中观察到的肽断裂并未因标记物自身发生不期望的断裂而复杂化(Han等人,见上文所述文献,2001)。最后,在光切割前,若需要,以共价方式固定的肽可作为其他化学及酶促反应的理想基质(Zhou等人,见上文所述文献,2001)。
固相方法不同于ICAT方法的一个明显方面在于,固相试剂在蛋白酶解后标记肽,而在ICAT中,蛋白质在蛋白酶解前被标记。因此,若需要分离经标记的蛋白质,则以ICAT方法为佳,例如凝胶电泳。上述固相方法提供了一种适于定量蛋白质组学一般应用的工具且其适于自动化应用。因此,其在通过质谱进行定量蛋白质分析所用的稳定同位素标记的更广泛应用方面向前迈出了一步。
这些结果表明复杂蛋白质混合物的差示同位素标记适用于定量蛋白质组分析。
在本申请案中参照了各种公开案。这些公开案的全部揭示内容皆以引用方式并入本文中,以更完整地阐述本发明所涉及技术的发展动态。
尽管参照所揭示的实施例对本发明进行了阐述,但所属技术领域的技术人员应不难了解,所详细描述的具体实验仅用于阐述本发明。应了解,可实施各种修饰形式而不背离本发明的精神。
Claims (55)
1.标记样品分子的方法,其包含下述步骤:
(a)使样品分子与包含结合至包含可切割官能基、标记物和反应性基团的化学基团的固态载体的组合物在允许该样品分子与该所述反应性基团共价结合并由此将该样品分子共价结合至该固态载体的条件下接触,其中该可切割官能基与该固态载体共价结合,该标记物与该可切割官能基共价结合,且该反应性基团与该标记物共价结合,且其中该可切割官能基、该标记物和该反应性基团彼此相对放置以允许将该标记物转移到该样品分子并通过该可切割官能基从该固态载体上释放该样品分子;及
(b)切割该可切割官能基,由此将该标记物转移到该样品分子并从该固态载体上释放该标记物的样品分子,由此用该标记物标记该样品分子。
2.根据权利要求1所述的方法,其中该样品分子选自多肽、核酸、脂质、第二信使或代谢物。
3.根据权利要求1所述的方法,其中该样品分子为多肽。
4.根据权利要求3所述的方法,其中该多肽具有选自磷酸化、糖基化、泛素化、乙酰化、异戊二烯化、棕榈酰化、十四烷基化、硫酸盐化或羟基化的修饰形式。
5.根据权利要求4所述的方法,其中该多肽为磷酸多肽。
6.根据权利要求1所述的方法,其中该固态载体为玻璃珠。
7.根据权利要求1所述的方法,其中该可切割官能基为可通过光、酸、碱或酶切割的化学连接体。
8.根据权利要求1所述的方法,其中该标记物为质谱标记物。
9.根据权利要求1所述的方法,其中该标记物选自稳定同位素标记物、同位素分布标记物或带电荷氨基酸。
10.根据权利要求9所述的方法,其中该标记物为稳定同位素编码的氨基酸。
11.根据权利要求10所述的方法,其中该标记物为经氘化或未经氘化的氨基酸。
12.根据权利要求8所述的方法,其中该官能基之一包含具有特征同位素分布的元素。
13.根据权利要求3所述的方法,其中该化学基团的该反应性基团选自琥珀酰亚胺酯基或碘乙酰基。
14.根据权利要求3所述的方法,其中该多肽的第一胺基经利用N-琥珀酰亚胺基S-乙酰基硫代乙酸、羟胺及叁(2-羧基乙基)膦处理而加以修饰。
15.根据权利要求4所述的方法,其中该多肽在接触该固态载体前分离,其中该多肽使用一对该多肽的该修饰形式具有特异性结合活性的抗体进行分离。
16.根据权利要求1所述的方法,其中该方法的步骤通过自动化过程实施。
17.根据权利要求1所述的方法,其中至少50%与该固态载体接触的该样品分子被释放。
18.根据权利要求8所述的方法,进一步包含通过使用质谱分析该释放的样品分子。
19.一种组合物,其包含结合至化学基团的固态载体,该化学基团包含一可切割官能基、标记物及一共价结合至样品分子上的反应性基团,其中该可切割官能基与该固态载体共价结合,该标记物与该可切割官能基共价结合,且该反应性基团与该标记物共价结合,且其中该可切割官能基、该标记物和该反应性基团彼此之间的位置允许该标记物在该可切割官能基受到切割时转移至该样品分子上。
20.根据权利要求19所述的组合物,其中该样品分子选自多肽、核酸、脂质、第二信使或代谢物。
21.根据权利要求20所述的组合物,其中该样品分子为多肽。
22.根据权利要求21所述的组合物,其中该多肽具有一选自磷酸化、糖基化、泛素化、乙酰化、棕榈酰化、异戊二烯化、硫酸盐化、羟基化或十四烷基化的修饰形式。
23.根据权利要求22所述的组合物,其中该多肽为磷酸多肽。
24.根据权利要求19所述的组合物,其中该固态载体为玻璃珠。
25.根据权利要求19所述的组合物,其中该可切割官能基为一可通过光、酸、碱或酶切割的化学连接体。
26.根据权利要求19所述的组合物,其中该标记物为质谱标记物。
27.根据权利要求19所述的组合物,其中该标记物选自稳定同位素标记物、同位素分布标记物或带电荷氨基酸。
28.根据权利要求27所述的组合物,其中该标记物为一稳定同位素标记的氨基酸。
29.根据权利要求28所述的组合物,其中该标记物为经氘化或未经氘化的氨基酸。
30.根据权利要求19所述的组合物,其中该标记物包含具有特征同位素分布的元素。
31.根据权利要求19所述的组合物,其中该共价连接的反应性基团源自琥珀酰亚胺酯基或碘乙酰基。
32.根据权利要求21所述的组合物,其中该多肽的第一胺基经利用N-琥珀酰亚胺基S-乙酰基硫代乙酸、羟胺及叁(2-羧基乙基)膦处理而加以修饰。
33.一种组合物,其包含共价结合至包含用于共价连接样品分子的可切割官能基、质谱标记物和反应性基团的化学基团的固态载体,其中将该可切割官能基共价结合至该固态载体,将该标记物共价结合至该可切割官能基并将该反应性基团共价结合至该标记物,且其中该可切割官能基、该标记物和该反应性基团彼此相对放置以允许经由该可切割官能基将该标记物转移到连接到该反应性基团的样品分子上并从该固态载体上释放该样品分子。
34.根据权利要求33所述的组合物,其中该固态载体为玻璃珠。
35.根据权利要求33所述的组合物,其中该可切割官能基为一可通过光、酸、碱或酶切割的化学连接体。
36.根据权利要求33所述的组合物,其中该标记物选自稳定同位素标记物、同位素分布标记物或带电荷氨基酸。
37.根据权利要求36所述的组合物,其中该标记物为一稳定同位素标记的氨基酸。
38.根据权利要求37所述的组合物,其中该标记物为经氘化或未经氘化的氨基酸。
39.根据权利要求33所述的组合物,其中该标记物包含具有特征同位素分布的元素。
40.根据权利要求33所述的组合物,其中该化学基团的该反应性基团选自琥珀酰亚胺酯基或碘乙酰基。
41.根据权利要求33所述的组合物,其中该可切割基团为光可切割的基团,该官能基为质量标记物,该反应性基团与巯基反应。
42.根据权利要求41所述的组合物,其中该样品分子选自多肽、核酸、脂质、第二信使或代谢物。
43.根据权利要求42所述的组合物,其中该样品分子为多肽。
44.根据权利要求42所述的组合物,其中该多肽具有一选自磷酸化、糖基化、泛素化、乙酰化、棕榈酰化、异戊二烯化、硫酸盐化、羟基化或十四烷基化的修饰形式。
45.根据权利要求44所述的组合物,其中该多肽为磷酸多肽。
46.根据权利要求41所述的组合物,其中固态载体为玻璃珠。
47.根据权利要求41所述的组合物,其中该质量标记物为氨基酸。
48.根据权利要求47所述的组合物,其中该质量标记物为亮氨酸。
49.根据权利要求41所述的组合物,其中该质量标记物选自稳定同位素标记物、同位素分布标记物或带电荷氨基酸。
50.根据权利要求49所述的组合物,其中该质量标记物为稳定同位素标记的氨基酸。
51.根据权利要求49所述的组合物,其中该质量标记物为经氘化或未经氘化的氨基酸。
52.根据权利要求41所述的组合物,其中该质量标记物包含具有特征同位素分布的元素。
53.根据权利要求41所述的组合物,其中该反应性基团为碘乙酰基。
54.根据权利要求41所述的组合物,其中该光可切割基团包含4-氨基(乙基)-2-甲氧基-5-硝基苯氧基。
55.根据权利要求43所述的组合物,其中该多肽的第一胺基经利用N-琥珀酰亚胺基S-乙酰基硫代乙酸、羟胺及叁(2-羧基乙基)膦处理而加以修饰。
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