WO2006011673A1 - 光切断型リンカーを利用したリガンド固定化固相担体 - Google Patents

光切断型リンカーを利用したリガンド固定化固相担体 Download PDF

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ligand
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Masayuki Haramura
Akito Tanaka
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Reverse Proteomics Research Institute Co., Ltd.
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    • Y10T436/20—Oxygen containing
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Definitions

  • the present invention relates to a ligand-immobilized solid phase carrier. More specifically, the present invention relates to a ligand-immobilized solid phase carrier obtained by immobilizing a ligand via a linker, its preparation, and use thereof.
  • the present inventors are based on the basic technology related to the high affinity resin developed by the present inventors, and do not use a high concentration of ligand compound or salt.
  • the study was conducted with the aim of establishing a new technology that would allow free protein elution from sucrose.
  • we succeeded in developing a novel high-purity protein purification method that satisfies this objective by interposing a linker that is specifically cleaved by light between the ligand molecule and the resin solid phase carrier.
  • a selective binding protein that binds to the ligand is displayed on the affinity resin. And there is a non-specific binding protein bound to a part other than the ligand.
  • conventional elution methods such as high-concentration salts or detergents that denature and elute proteins
  • selective binding proteins and non-selective proteins are eluted at the same time. It was difficult to elute and recover.
  • the present inventors can elute and collect only a selective binding protein by interposing a linker specifically cleaved by light irradiation between a ligand molecule and a resin solid phase carrier. The method could be developed.
  • the present invention is as follows.
  • a solid-phase carrier for analyzing a specific interaction between a ligand and a target molecule in which a ligand is immobilized via a linker that is cleaved by light irradiation.
  • X is a ligand and is cleaved by light irradiation; Y is a single bond or an alkylene group which may be substituted; A is a group used for binding to a solid support; Z Is a solid support; Q is NH, O or S; is a hydrogen atom, an optionally substituted alkyl group or an optionally substituted aryl group; R 2 is a hydrogen atom, substituted An alkyl group which may be substituted, an aryl group which may be substituted, an alkoxy group which may be substituted, a halogen atom or a cyano group; R 3 is a hydrogen atom, an alkyl group which may be substituted, An aryl group which may be substituted, an alkoxy group which may be substituted, a halogen atom or a cyan group; R 4 is a hydrogen atom, an alkyl group which may be substituted, an aryl group which may be substituted, or a substituent An
  • R 2 is a hydrogen atom, an optionally substituted alkyl group or an optionally substituted alkoxy group
  • R 3 is a hydrogen atom, an optionally substituted alkyl group or a substituted
  • R 4 is a hydrogen atom, an optionally substituted alkyl group or an optionally substituted alkoxy group
  • R 5 is a hydrogen atom, an optionally substituted alkyl group or The solid phase carrier according to the above [4], which is an alkoxy group which may be substituted.
  • P i is a hydrogen atom, or a protective group for an amino group, a hydroxyl group or a sulfhydryl group
  • Y is a single bond or an alkylene group which may be substituted
  • A is a bond to a solid phase carrier
  • P 2 is a hydrogen atom, or a protective group for an amino group, a hydroxyl group, a sulfhydryl group, a carbonyl group or a carboxyl group
  • Q is NH, O or S, or a hydrogen atom, substituted R 2 is a hydrogen atom, an optionally substituted alkyl group, an optionally substituted aryl group, an optionally substituted alkoxy group, a halogen atom, or an optionally substituted aryl group
  • It is atomic or Shiano group
  • R 3 is a hydrogen atom, an optionally substituted aralkyl kill group, an optionally substituted Ariru group, an optionally substituted alkoxy group, It
  • P i is a hydrogen atom, or a protective group for an amino group, a hydroxyl group or a sulfhydryl group
  • Y is a single bond or an alkylene group which may be substituted
  • A is a bond to a solid phase carrier
  • P 2 is a hydrogen atom, or a protecting group for an amino group, a hydroxyl group, a sulfhydryl group, a carbonyl group or a carboxyl group
  • Q is NH, O or S
  • R i is a hydrogen atom, An optionally substituted alkyl group or an optionally substituted aryl group
  • R 2 is a hydrogen atom, an optionally substituted alkyl group, an optionally substituted aryl group, or an optionally substituted An alkoxy group, a halogen atom or a cyan group
  • R 3 is a hydrogen atom, an optionally substituted alkyl group, an optionally substituted aryl group, an optionally substitute
  • [1 1] (1) a step of immobilizing a ligand on a solid phase carrier via a linker cleaved by light irradiation, (2) a solid phase carrier on which the ligand obtained in (1) above is immobilized When, (3) a step of irradiating light to cleave the ligand from the solid support, and (4) whether the target molecule is bound to the ligand.
  • a method for searching for a target molecule including a step of confirming force.
  • the method according to [11] above, wherein the solid phase carrier on which the ligand is immobilized is represented by the following formula (I) or (II).
  • X is a ligand and is cleaved by light irradiation; Y is a single bond or an alkylene group which may be substituted; A is a group used for binding to a solid support; Z Is a solid support; Q is NH, O or S; is a hydrogen atom, an optionally substituted alkyl group or an optionally substituted aryl group; R 2 is a hydrogen atom, substituted An alkyl group which may be substituted, an aryl group which may be substituted, an alkoxy group which may be substituted, a halogen atom or a cyano group; R 3 is a hydrogen atom, an alkyl group which may be substituted, An aryl group which may be substituted, an alkoxy group which may be substituted, a halogen atom or a cyan group; R 4 is a hydrogen atom, an alkyl group which may be substituted, an aryl group which may be substituted, or a substituent An
  • R 2 force hydrogen atom, optionally substituted alkyl group or optionally substituted alkoxy group
  • R 3 is hydrogen atom, optionally substituted alkyl group or optionally substituted A good alkoxy group
  • R 4 is a hydrogen atom, an optionally substituted alkyl group or an optionally substituted alkoxy group
  • R is hydrogen
  • [15] (1) a step of immobilizing a ligand on a solid phase carrier via a linker cleaved by light irradiation; (2) a solid phase carrier on which the ligand obtained in (1) above is immobilized; Mixing with a sample containing the target molecule of the ligand, (3) irradiating light to cleave the ligand from the solid support, and (4) recovering the target molecule bound to the ligand. Purification method of the target molecule.
  • X is a ligand and is cleaved by light irradiation; Y is a single bond or an alkylene group which may be substituted; A is a group used for binding to a solid support; Z Is a solid support; Q is NH, O or S; is a hydrogen atom, an optionally substituted alkyl group or an optionally substituted aryl group; R 2 is a hydrogen atom, substituted Alkyl group, optionally substituted aryl group, substituted An optionally substituted alkoxy group, a halogen atom or a cyano group; R 3 is a hydrogen atom, an optionally substituted alkyl group, an optionally substituted aryl group, an optionally substituted alkoxy group, halogen R 4 is a hydrogen atom, an optionally substituted alkyl group, an optionally substituted aryl group, an optionally substituted alkoxy group, a halogen atom or a cyan group; R 5 Is
  • R 2 is a hydrogen atom, an optionally substituted alkyl group or an optionally substituted alkoxy group
  • R 3 is a hydrogen atom, an optionally substituted alkyl group or a substituted
  • R 4 is a hydrogen atom, an optionally substituted alkyl group or an optionally substituted alkoxy group
  • R 5 is a hydrogen atom, an optionally substituted alkyl group or a substituted The method according to [16] above, which is an optionally substituted alkoxy group.
  • FIG. 1 shows the present invention characterized in that a ligand is immobilized on a solid phase carrier via a photocleavable linker, and the ligand is cleaved from the solid phase carrier by light irradiation, and a high concentration of ligand
  • FIG. 5 is a schematic diagram comparing a conventional method for eluting a ligand from a solid phase carrier by adjusting a salt concentration.
  • Figure 2 shows that FK 506 specific binding protein FKBP 12 can be obtained with high purity from rat brain lysate by immobilizing FK 506 on a solid support via a photocleavable linker. It is.
  • the solid phase carrier of the present invention using a photocleavable linker and the target molecule search method and purification method using the solid phase carrier are compared with the conventional method (method of elution with a high concentration of ligand salt). This is schematically shown in Fig. 1.
  • the “linker that is cleaved by light irradiation” is not particularly limited as long as it is a linker that is cleaved by light irradiation, and is a compound (or group) that binds a ligand and a solid phase carrier. Yes (hereinafter also referred to as photo-cutting linker).
  • photo-cutting linker 0 -nitrobenzyl linker (JOC 1 995, 60, 2 3 1 8-2 3 1 9) and various derivatives having a nitrobenzyl group used in the synthetic synthesis are listed.
  • a compound represented by the following formula () or (I) is also suitable as a linker cleaved by light irradiation.
  • P i is a hydrogen atom, or a protective group for an amino group, a hydroxyl group or a sulfhydryl group
  • Y is a single bond or an alkylene group which may be substituted
  • A is a bond to a solid phase carrier
  • P 2 is a hydrogen atom, or a protecting group for an amino group, a hydroxyl group, a sulfhydryl group, a carbonyl group or a carboxyl group
  • Q is NH, O or S
  • R i is a hydrogen atom, An optionally substituted alkyl group or an optionally substituted aryl group
  • R 2 is a hydrogen atom, an optionally substituted alkyl
  • R 3 is a hydrogen atom, an optionally substituted alkyl group, or an optionally substituted group
  • the site cleaved by light irradiation in the photocleavable linker is a binding site between the linker and the ligand, and differs depending on the linker used and the mode of binding between the linker and the ligand.
  • the bond between Q and X is cleaved by light irradiation.
  • the light source and the amount of light irradiating the linker are appropriately determined and determined according to the type of linker so that the ligand is released, but when a 0-nitrobenzyl linker is used, the wavelength is 300 to 4 Near-ultraviolet light of 0 nm, preferably 3500 to 3700 nm, at 0 to 40 ° C, preferably 4 to 25 ° C for several seconds to 3 hours, preferably several seconds to 1 hour, particularly preferably Irradiate for 30 seconds to 1 hour.
  • an appropriate additive can be used to avoid the reaction between the product produced by photocleavage and the linker again.
  • the type and concentration of additives are appropriately set according to the type of linker used.
  • 2-mercaptoethanol, hydrazine and imidazole When 2-mercaptoethanol, hydrazine or imidazole is used as an additive, it is used at a concentration of from 0.01 to: L00 O mM, preferably from 0.0 to!
  • 2-mercaptoethanol, hydrazine or imidazole is used as an additive, it is used at a concentration of from 0.01 to: L00 O mM, preferably from 0.0 to!
  • When using multiple types of additives set the total amount within the above range.
  • the solid phase carrier of the present invention is characterized in that the ligand is immobilized on the solid phase carrier via the linker, but the immobilization method is not particularly limited.
  • the conjugate obtained after binding the ligand and the linker may be immobilized on the solid phase carrier, or after the linker is first immobilized on the solid phase carrier, the linker and the ligand are bound. Also good.
  • the linker is dissolved in an aqueous or organic solvent or a mixed solvent thereof, and the obtained linker solution and a solid phase carrier (for the solid phase carrier, an aqueous or organic solvent or a mixed solvent thereof in advance). It is preferable to be suspended in a solid phase), or an amide bond between a linker and a solid phase carrier, a bond by Schiff base formation, a C-C bond, an ester bond, a hydrogen bond,
  • the linker is immobilized on a solid support by being attached to a covalent bond such as a hydrophobic interaction or a non-covalent bond.
  • the aqueous or organic solvent in which the linker and the solid phase carrier are dissolved or suspended may be the same or different.
  • an aqueous solvent such as water or a buffer solution, alcohol ( Organic solvents such as methanolol, ethanol and the like), dimethinorephonolamide, dichloromethane, and acetonitrile. These mixed solvents can also be suitably used.
  • an aqueous solvent such as water or a buffer solution, alcohol ( Organic solvents such as methanolol, ethanol and the like), dimethinorephonolamide, dichloromethane, and acetonitrile.
  • these mixed solvents can also be suitably used.
  • the reaction used for immobilization of the linker to the solid phase carrier is set, and the linker is immobilized on the solid phase carrier by a known method as appropriate.
  • the temperature for performing a series of reactions and treatments is not particularly limited as long as the temperature is suitable for the set immobilization reaction and the linker is stable, but is usually 0 ° C to 100 ° C, preferably room temperature to Performed at 70 ° C.
  • the mixing time of the solid phase carrier and the linker is not particularly limited as long as the linker is immobilized on the solid phase carrier, and the set immobilization reaction or the linker intended for immobilization is used. It is set as appropriate according to the type of phase carrier. Usually from 1 hour to several days, preferably from 2 hours to overnight.
  • the binding reaction is appropriately set according to the immobilization reaction to be used. In general, an excessive amount of linker is used with respect to the solid phase carrier.
  • Reactions used for immobilization of linkers such as amide bonds, Schiff bases, C 1 C bonds, ester bonds, hydrogen bonds, and hydrophobic interactions to solid phase carriers are known in the art.
  • Reagents, reaction conditions, and the like can be performed according to conventional methods, and may be appropriately changed as necessary.
  • solid phase carriers in which a ligand is immobilized via a photocleavable linker are listed below together with their sources. None of the solid-phase carriers are known for use in analyzing the interaction between the ligand and the target, or for searching and purifying the target molecule. These solid phase carriers can be produced by appropriately combining known literatures or known techniques. A portion corresponding to the linker is shown in a box for convenience.
  • a solid phase carrier represented by (I) or (I I) is also preferred.
  • X is a ligand and is cleaved by light irradiation; Y is a single bond or an alkylene group which may be substituted; A is a group used for binding to a solid support; Z Is a solid support; Q is NH, O or S; is a hydrogen atom, an optionally substituted alkyl group or an optionally substituted aryl group; R 2 is a hydrogen atom, substituted An alkyl group which may be substituted, an aryl group which may be substituted, an alkoxy group which may be substituted, a halogen atom or a cyano group; R 3 is a hydrogen atom, an alkyl group which may be substituted, An aryl group, an optionally substituted alkoxy group, a halogen atom or a cyan group; R 4 is hydrogen An atom, an optionally substituted alkyl group, an optionally substituted aryl group, an optionally substituted alkoxy group, a halogen atom
  • the solid phase carrier Z is intended to be a solid phase carrier in a state before the linker or ligand is bound.
  • the compounds of formula () and formula (I) are synthesized, for example, by the method described in the literature (J. Org. Chem 1995, 60, 2318-231 9). Specifically, a group (Q) capable of binding a ligand, a nitro group, and a group (A) used for binding to a solid phase carrier are introduced into a benzene derivative to which an alkyl group is bonded.
  • a group (Q) capable of binding a ligand, a nitro group, and a group (A) used for binding to a solid phase carrier are introduced into a benzene derivative to which an alkyl group is bonded.
  • the order in which these substituents are introduced and the introduction reaction to be used are not particularly limited, and are appropriately set according to the structure of the linker to be synthesized.
  • a generally known substituent introduction reaction for example, a reaction described in Ad f a n c e d O r g a n i c Ch e i s t r y (J e r y Mar c h, 1992, J o n Wi y e y & S o n s) is used.
  • the compounds (1 ′) and (I) obtained by the above method can be used as a linker used for immobilizing a ligand on a solid support, preferably a linker cleaved by light irradiation.
  • the solid phase carriers (I) and (II) of the present invention can be obtained by immobilizing the ligand to the solid phase carrier via the linker.
  • “ligand” immobilized on a solid phase carrier via a photocleavable linker, for example, X in the solid phase carrier represented by formula (I) and formula (II) is not particularly limited.
  • the compound may be a known compound or a new compound developed in the future. Moreover, it may be a low molecular compound or a high molecular compound.
  • the low molecular weight compound is a compound having a molecular weight of less than about 1000, and examples thereof include organic compounds that can be normally used as pharmaceuticals and their derivatives and inorganic compounds. Derivatives, naturally derived compounds and their derivatives, small nucleic acid molecules such as promoters, various metals, etc. It refers to compounds and their derivatives, nucleic acid molecules.
  • the polymer compound is a compound having a molecular weight of about 100 or more, and includes proteins, polynucleic acids, polysaccharides, and combinations thereof, and is preferably a protein. These low molecular compounds or high molecular compounds are commercially available as long as they are known, and can be obtained through steps such as collection, production, and purification according to each report literature. These may be naturally derived, prepared by genetic engineering, or obtained by semi-synthesis.
  • the bond between the ligand and the linker is an amide bond, a Schiff base, a C—C bond, an ester bond, a hydrogen bond, a hydrophobic bond or a non-covalent bond. Formed by known materials and reactions.
  • the ligand is bound by an amide, thioamide, or esterole bond with NH, S or O of the linker moiety.
  • the solid phase carrier used in the present invention and the solid phase carrier Z in the formulas (I) and (II) are a ligand (immobilized on the solid phase carrier via a linker) and a target.
  • a specific interaction with a molecule it is not particularly limited, and those commonly used in the art can be used.
  • the material include resin (polystyrene, methacrylate resin, polyacrylamide, etc.), glass, metal (gold, silver, iron, silicon, etc.) and the like.
  • These solid phases may have any shape, and the methods used for the above-mentioned types of materials and the subsequent analysis of the interaction with the target molecule, search for the target molecule, and purification.
  • a plate shape, a bead shape, a thin film shape, a thread shape, a coil shape and the like can be mentioned. If the beads are made of resin, the subsequent operation is simplified by filling the column. It is also preferable to use a glass plate.
  • the “group used for binding to the solid phase carrier” in A is a linking group necessary for binding the nitrobenzyl group linker moiety (photocleavable linker) to the solid phase carrier (Z).
  • Examples include groups such as 0, S, NH, and carbonyl groups, and combinations of two or more of these groups via an alkylene group (for example, —O— (CH 2 ) 3 —CO— Etc.), or repeating structures such as polyethylene glycol (eg 1 o-
  • examples of the halogen atom include fluorine, chlorine, bromine and iodine.
  • the “optionally substituted alkyl group” means a linear or branched alkyl group having 1 to 3 carbon atoms which may have 1 to 2 or more substituents. .
  • C1-C3 linear or branched alkyl group examples include methyl, ethyl, propyl, isopropyl and the like.
  • a substituent a halogen atom
  • the “optionally substituted aryl group” means an aryl group having 6 to 14 carbon atoms which may have 1 to 2 or more substituents.
  • Specific examples of the “aryl group having 6 to 14 carbon atoms” include phenyl, 1-naphthyl, 2-naphthyl, 2 1-indul, 2-anthryl and the like.
  • substituents examples include a nitro group, a halogen atom (as defined above), an alkyl group (a linear or branched alkyl group having 1 to 3 carbon atoms), an alkoxy group (as defined above), and the like.
  • substituted aryl groups include 2-nitropheny ⁇ , 2-chlorophenenoyl, 2,4-dimethoxyphenol and the like.
  • the “optionally substituted alkoxy group” refers to a linear, branched or cyclic alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms which may have 1 to 2 or more substituents.
  • C1-C6 linear, branched or cyclic alkoxy group Specifically, methoxy, ethoxy, n-propoxy, isopropoxy, butoxy, isobutoxy, sec-butoxy, tert-butoxy, pentyloxy, hexyloxy, cyclopropyloxy, cyclobutyloxy and the like can be mentioned.
  • substituents examples include a halogen atom (as defined above), a hydroxyl group, an alkoxy group (as defined above), a polyethylene glycol group, and the like.
  • substituted alkoxy group examples include trifluoromethoxy and 2-hydroxymethyl. Toxic, 2-methoxetoxy, polyethylene darikoloxy and the like.
  • the “optionally substituted alkylene group” means a linear or branched alkylene group having 1 to 3 carbon atoms.
  • Specific examples of the “C1-C3 linear or branched alkylene group” include methylene, ethylene, propylene, isopropylene and the like.
  • Examples of the substituent include a halogen atom (as defined above), a hydroxyl group, and an aralkoxy group (as defined above).
  • Y is preferably a single bond
  • A is preferably 1_ (CH 2 ) 3 —CO —
  • Q is preferably NH, and is preferably an optionally substituted alkyl group (particularly preferably methyl
  • R 2 to R 5 are preferably a hydrogen atom, an optionally substituted alkyl group (particularly preferably a methyl group) or an optionally substituted alkoxy group (particularly preferably a methoxy group). is there.
  • protecting group for an amino group, hydroxyl group S or sulfhydryl group of Pi and “protecting group for an amino group, hydroxyl group, sulfhydryl group, carbonyl group or carboxyl group” of P 2 are usually used. Commonly used protections such as those described in “Protective Group Organic Synthesis, Greenand Wu ts, John Wiley & Sons, Inc. 1999” are available. A group is available. Specifically, “amino protecting group” includes 9-fluorenylmethyloxycarbonyl, tert-butyloxycarbonyl and the like, and “hydroxyl protecting group” includes trityl, tert-butyl, benzyl and the like.
  • examples of the “protecting group for the sulfhydryl group” include benzinole, trityl, acetamidomethyl and the like. ⁇ Preserving carboxyl groups
  • examples of the “protecting group” include an alkyl group (as defined above, preferably methyl, tert-butyl), an aralkyl group (having 7 to 10 carbon atoms, specifically, benzyl, methylbenzyl, phenethyl, etc., and preferably Is a benzyl group).
  • a particularly preferred solid phase carrier is represented by the formula (I I), and for example, a solid phase carrier represented by the following formula is preferred.
  • the solid phase carrier is represented by the following formula. It is prepared by immobilizing ligand (X) on a solid support (Z) via a single nitrobenzyl linker. Specific procedures will be described later in Examples.
  • the target molecule is not particularly limited as long as it specifically interacts with the ligand, and it may be a known compound or a novel substance.
  • T The target molecule may be a low molecular compound or a high molecular compound.
  • the target molecule is a low molecular weight compound, it is based on a specific interaction between a low molecular weight compound and a low molecular weight compound with a low molecular weight compound or with a high molecular weight compound with a high molecular weight compound.
  • Target molecules can be selected based on specific interactions with small molecule compounds.
  • the polymer compound is based on a specific interaction between the polymer compound and the low-molecular compound with a ligand that is a low-molecular compound, or with a ligand that is a polymer compound.
  • Target molecules can be selected on the basis of the specific interaction between and the polymer compound.
  • a preferable combination of a ligand and a target molecule is a combination of a low molecular compound and a high molecular compound, or a combination of a high molecular compound and a high molecular compound.
  • the interaction with the target molecule and the selection of the target molecule are conveniently performed on the solid phase.
  • a candidate substance is predicted in advance as a target molecule
  • the candidate substance is contacted with the ligand immobilized on the solid phase carrier alone to measure the interaction between them, and the candidate substance is the target molecule.
  • a sample containing multiple substances polymer compound and / or low molecular compound
  • multiple substances polymer compound and Z or low molecular compound
  • the sample containing a plurality of substances may be composed entirely of known compounds, partially composed of novel compounds, or composed entirely of novel compounds. May be.
  • the structure is all a mixture of compounds having known structures.
  • Samples composed of all known compounds are protein mixtures prepared by genetic engineering using Escherichia coli, etc., and those containing some new compounds include extracts of cells and tissues. Examples of (lysates) that are all composed of novel compounds include mixtures of novel proteins and newly synthesized compounds whose functions and structures are not yet known. If the sample is a mixture, especially if it contains known compounds, Optionally, the content of these compounds in the sample can be set to a desired value.
  • a low molecular compound and a high molecular compound are preferable, and a high molecular compound is preferable for searching for a target molecule in an animal body such as a human.
  • the terms ligand and target molecule are intended for combinations having specific intermolecular interactions, and if one of the combinations is immobilized on a solid phase as a ligand, the other The target molecule can be changed, that is, depending on which one is immobilized on the solid phase.
  • the terms ligand and target molecule are not intended to refer to a specific molecule, but to each of molecules having specific interactions.
  • a “specific interaction” is an action that exerts the characteristic of specifically recognizing and binding only a specific ligand (specific target molecule), and specific reception for agonist or antagonist. body, the enzyme on the substrate and or e.g. FK506 FK 506 'binding protein to (ligand) (target molecule), steroid Dohonoremon receptors for steroid hormones (eg; dex ame thasone and Glucocorticoidrecepto r), for N anti mosquito s Hitoshi trapoxin
  • the relationship such as HD AC corresponds to “specific interaction”.
  • non-specific interaction refers to an action that causes a situation in which the target of binding is not limited to a specific molecule but varies depending on reaction conditions.
  • Ligand on the solid phase means unspecific intermolecular action that binds and adsorbs to the surface of the solid support itself. “Non-specific interaction” is an obstacle to the binding between the ligand and the target molecule based on “specific interaction” or the risk of overlooking the binding due to “specific interaction” due to confusion There is.
  • “analyzing a specific interaction” is to obtain the degree of specificity of interaction between a ligand and a target molecule as interaction information, for example, For example, it can be obtained as numerical values such as Kd (dissociation rate constant) and Ka (binding rate constant).
  • the solid phase carrier of the present invention that can identify a target molecule by determining whether or not it has a specific interaction with a ligand can be used for target molecule search, Further, the target molecule can be purified using the solid phase carrier of the present invention by utilizing the specific interaction between the ligand and the target molecule.
  • EDC 1 1 [3- (Dimethylamino) propyl] _ 3-Ethylcarbodiimide
  • Fmoc 9-Fluorenylmethyloxycarbonylolbonyl
  • Example 1 Synthesis of a resin in which FK 500 is immobilized via a photocleavable linker
  • Photocleavable Linker (4— ⁇ 4-[1— (Fmo c-Amino) Ietyl] _ 2—Methoxy-1-5-nitrophenoxy ⁇ Butyric acid, F luka) (1 24 mg, 0.24 mm o 1)
  • N TOYO Pearl resin T SKg el AF—amino, 600 ⁇ 1, freeamino group f available 0.06 mm o 1)
  • EDC 44 mg, 0.28 mm o 1
  • HOB t 3 9 mg , 0.28 mmo 1
  • DMF (6 ml)
  • FK506 prepared in Example 1 was converted into a photocleavable linker (4- ⁇ 4- [1— (Fmoc-amino) monoethyl] —2-methoxy-1-5-nitrophenoxy ⁇ butyric acid, F 1 uka) TOYOPEARL AF, immobilized via, was mixed with rat brain lysate prepared in (1) above, and the adhering substance was mixed with buffer B (25 mM Tris).
  • Example 3 Synthesis of Resin with Cromoglycic Acid Immobilized via Photocleavable Linker Resin bound with photocleavable linker (500 ⁇ 1) prepared according to the method described in Example 1, and cromoglycol A mixture of acid (93 mg, 0.2 mmo 1), EDC (37 mg, 0.24 mmo 1), HOB t (32 mg, 0.24 mm o 1) and NM P (5 ml) was stirred at room temperature for 20 hours. The end point of the reaction was confirmed by the ninhydrin reaction that the remaining amino groups could not be observed with the naked eye. The reaction rate at this time was approximately 76%. After confirming the completion of the reaction, the resin was washed 5 times with NMP.
  • E. co 1 i (0.5 2 g) expressing cromoglycate binding protein according to a standard method was mixed with mixture C (0.25 M sucrose, 25 mM Tris buffer (pH 7. 4), 1% Ch aps, 4 ml) to prepare a homogenate, and then centrifuged at 1000 rpm for 60 minutes. The supernatant thus obtained was used as a lysate. All experiments were performed at 4 ° C or on ice.
  • the cromoglycic acid prepared in Example 3 was converted into a photocleavable linker (4- ⁇ 4- [1- (Fmo c-amino) monoethyl] _ 2-methoxy-1-5-nitrophenoxy ⁇ butyric acid, F 1 uka ) Is mixed with the resin (TOYOP EAR L AF) immobilized via E. coli lysate prepared in (1) above, and the adhering substance is mixed with buffer D (25 mM Tris buffer (pH 7.4)).

Abstract

本発明は、光照射により切断されるリンカーを介してリガンドが固定化されている固相担体を用いる、リガンドとターゲット分子との相互作用を解析する方法、特にターゲット分子の探索、精製方法を提供し、光照射によって特異的に切断されるリンカーをリガンド分子と固相担体との間に介在させることにより、高濃度のリガンドや塩を用いることなく固相担体からターゲット分子を遊離溶出することが可能となり、また非特異的なタンパク質の遊離溶出を抑制することが可能となる。

Description

明細書
光切断型リンカーを利用したリガンド固定化固相担体
技術分野
本発明は、 リガンド固定化固相担体に関する。 より詳しくは、 リンカ一を介して リガンドを固定化してなるリガンド固定化固相担体およびその調製、 ならびにその 利用に関する。
背景技術
タンパク質を研究する際、 3次元構造純度にまで精製されたタンパク質が入手さ れれば各種の検討を精度よく行うことが出来る。 しカゝし、 一般にタンパク質をこの ようなレベルにまで精製する為には多大な労力を必要としてきた。 特に S D Sゲル 上での純度ばかりでなく （ 1次構造的純度） 、 その 3次元構造的にも高純度な a c t i v e c o n f o r m a t i o nに富む高純度タンパク質の入手は困難を極め てきた。 これまでこの目的に合致した方法として、 特異的結合能を有するリガンド を固定化したァフィ二ティー榭脂による精製が行われてきた。 し力 し、 従来技術で は樹脂上リガンドに結合したタンパク質を遊離溶出させるため、 高濃度のリガンド 化合物や塩を用いてきたが、 医薬品などの低分子化合物をリガンドとして使用した 場合、 一般に水に対する溶解性が充分ではなく、 タンパク質を遊離させるのに充分 な濃度の溶液を調製することが不可能なことが多い。 また、 高濃度のリガンド溶液 が調製できた場合においても、 高濃度リガンドによるタンパク質の変性が問題とな つてきた。 また、 高濃度の塩を用いる場合も理論上は高濃度の塩による非特異的な 水素結合の拮抗が機能ベースであるため、 特異的結合を行っている安定なリガンド —タンパク質複合体構造を強引に引き裂く程高濃度の塩を加える必要がある。 その 場合、 タンパク質の 3次元構造を保持するのにも必要な水素結合をも同時に切断す ることによるタンパク質の変性が問題となる。
本発明の目的は、 より高純度で選択的なタンパク質の精製を可能にする方法を提 供することである。 より具体的には、 高濃度のリガンド化合物や塩を使用すること なく、 ァフィ二ティ一樹脂からのタンパク質の遊離溶出を可能にする技術の提供を 目的とする。
発明の開示
本発明者らはこのような状況を背景とし、 本発明者らが開発してきた高いァフィ 二ティー樹脂に関する基盤技術をベースとし、 高濃度のリガンド化合物や塩を利用 せず、 ァフィ二ティ一樹脂からのタンパク質遊離溶出を可能にする新しい技術確立 を目指し検討を行った。 その結果、 光によって特異的に切断されるリンカ一をリガ ンド分子と樹脂固相担体との間に介在させることにより、 本目的を満足する新規な 高純度タンパク質精製方法の開発に成功した。
また、 リガンドを固定化したァフィ二ティー樹脂で、 リガンドに選択的に結合す るタンパク質以外のタンパク質を含むタンパク質混合物を処理した場合、 ァフィ二 ティー樹脂上には、 リガンドに結合した選択的結合タンパク質と、 リガンド以外の 部分に結合した非特異的結合タンパク質が存在する。 従来の溶出法である、 高濃度 の塩や、 タンパク質を変性させて溶出させる界面活性剤などで溶出した場合、 選択 的結合タンパク質と非選択的タンパク質が、 同時に溶出され、 選択的結合タンパク 質のみを溶出，回収することが困難であった。 本発明者らは、 光照射によって特異 的に切断されるリンカーをリガンド分子と樹脂固相担体との間に介在させることに より、 選択的結合タンパク質のみを溶出 ·回収することができる、 新たな方法を開 発することができた。
即ち本発明は下記の通りである。
〔1〕 光照射により切断されるリンカ一を介してリガンド、が固定化されている、 リ ガンドとターゲット分子との特異的相互作用を解析する為の固相担体。
〔2〕 ターゲット分子探索用である、 上記 〔1〕 記載の固相担体。
〔3〕 ターゲット分子精製用である、 上記 〔1〕 記載の固相担体。
〔4〕 下記式 （I ) または （I I ) で示される、 上記 〔1〕 〜 〔3〕 のいずれかに 記載の固相担体。
Figure imgf000004_0001
(式中、 Xはリガンドであり、 光照射により切断され； Yは単結合あるいは置換さ れていてもよいアルキレン基であり ； Aは固相担体との結合に用いられる基であ り ； Zは固相担体であり ； Qは、 N H、 Oまたは Sであり ； は水素原子、 置換 されていてもよいアルキル基または置換されていてもよいァリール基； R 2は水素 原子、 置換されていてもよいアルキル基、 置換されていてもよいァリール基、 置換 されていてもよいアルコキシ基、 ハロゲン原子またはシァノ基であり ； R 3は水素 原子、 置換されていてもよいアルキル基、 置換されていてもよいァリール基、 置換 されていてもよいアルコキシ基、 ハロゲン原子またはシァノ基であり ； R 4は水素 原子、 置換されていてもよいアルキル基、 置換されていてもよいァリール基、 置換 されていてもよいアルコキシ基、 ハロゲン原子またはシァノ基であり ； R 5は水素 原子、 置換されていてもよいアルキル基、 置換されていてもよいァリール基、 置換 されていてもよいアルコキシ基、 ハロゲン原子またはシァノ基である）
〔5〕 R 2が、 水素原子、 置換されていてもよいアルキル基または置換されていて もよいアルコキシ基であり ； R 3が水素原子、 置換されていてもよいアルキル基ま たは置換されていてもよいアルコキシ基であり ； R 4が水素原子、 置換されていて もよいアルキル基または置換されていてもよいアルコキシ基であり ； R 5が水素原 子、 置換されていてもよいアルキル基または置換されていてもよいアルコキシ基で ある、 上記 〔4〕 記載の固相担体。
〔6〕 下記式で表される、 上記 〔4〕 記載の固相担体。
Figure imgf000005_0001
(式中の記号は前記と同義である）
1 7 ) 下記式 （ ) または （I ) で示される化合物。
Figure imgf000005_0002
(式中、 P iは水素原子、 又はアミノ基、 水酸基もしくはスルフヒ ドリル基の保護 基であり ； Yは単結合あるいは置換されていてもよいアルキレン基であり ； Aは固 相担体との結合に用いられる基であり ； P 2は水素原子、 又はアミノ基、 水酸基、 スルフヒドリル基、 カルボニル基もしくはカルボキシル基の保護基であり ； Qは、 N H、 Oまたは Sであり は水素原子、 置換されていてもよいアルキル基また は置換されていてもよいァリール基； R 2は水素原子、 置換されていてもよいアル キル基、 置換されていてもよいァリール基、 置換されていてもよいアルコキシ基、 ハロゲン原子またはシァノ基であり ； R 3は水素原子、 置換されていてもよいアル キル基、 置換されていてもよいァリール基、 置換されていてもよいアルコキシ基、 ハロゲン原子またはシァノ基であり ； R 4は水素原子、 置換されていてもよいアル キル基、 置換されていてもよいァリール基、 置換されていてもよいアルコキシ基、 ハロゲン原子またはシァノ基であり ； R 5は水素原子、 置換されていてもよいアル キル基、 置換されていてもよいァリール基、 置換されていてもよいアルコキシ基、 ハロゲン原子またはシァノ基である） 〔8〕 下記式 （ ) または （I Γ ) で示される、 リガンドを固相担体に固定化 する際に用いられるリン力一。
Figure imgf000006_0001
(式中、 P iは水素原子、 又はアミノ基、 水酸基もしくはスルフヒ ドリル基の保護 基であり ； Yは単結合あるいは置換されていてもよいアルキレン基であり ； Aは固 相担体との結合に用いられる基であり ； P 2は水素原子、 又はアミノ基、 水酸基、 スルフヒ ドリル基、 カルボニル基もしくはカルボキシル基の保護基であり ； Qは、 N H、 Oまたは Sであり ； R iは水素原子、 置換されていてもよいアルキル基また は置換されていてもよいァリール基； R 2は水素原子、 置換されていてもよいアル キル基、 置換されていてもよいァリール基、 置換されていてもよいアルコキシ基、 ハロゲン原子またはシァノ基であり ； R 3は水素原子、 置換されていてもよいアル キル基、 置換されていてもよいァリ一ル基、 置換されていてもよいアルコキシ基、 ハロゲン原子またはシァノ基であり ； R 4は水素原子、 置換されていてもよいアル キル基、 置換されていてもよいァリール基、 置換されていてもよいアルコキシ基、 ハロゲン原子またはシァノ基であり ； R 5は水素原子、 置換されていてもよいアル キル基、 置換されていてもよいァリール基、 置換されていてもよいアルコキシ基、 ハロゲン原子またはシァノ基である）
〔9〕 光照射により切断されることを特徴とする上記 〔8〕 記載のリンカ一。
〔1 0〕 上記 〔9〕 記載のリンカ一を介してリガンドが固定化されている、 リガン ドとターゲット分子との特異的相互作用を解析する為の固相担体。
〔1 1〕 ( 1 ) 光照射により切断されるリンカ一を介してリガンドを固相担体上に 固定化する工程、 （2 ) 上記 （1 ) で得られたリガンドが固定化された固相担体と、 該リガンドのターゲット分子を含む力含まない試料とを混合する工程、 （3 ) 光を 照射してリガンドを固相担体から切断する工程、 および （4 ) リガンドにターゲッ ト分子が結合しているかどう力、確認する工程を含む、 ターゲット分子の探索方法。 〔1 2〕 リガンドが固定化された固相担体が、 下記式 （I ) または （I I ) で示さ れる、 上記 〔1 1〕 記載の方法。
Figure imgf000007_0001
(式中、 Xはリガンドであり、 光照射により切断され； Yは単結合あるいは置換さ れていてもよいアルキレン基であり ； Aは固相担体との結合に用いられる基であ り ； Zは固相担体であり ； Qは、 N H、 Oまたは Sであり ； は水素原子、 置換 されていてもよいアルキル基または置換されていてもよいァリール基； R 2は水素 原子、 置換されていてもよいアルキル基、 置換されていてもよいァリール基、 置換 されていてもよいアルコキシ基、 ハロゲン原子またはシァノ基であり ； R 3は水素 原子、 置換されていてもよいアルキル基、 置換されていてもよいァリール基、 置換 されていてもよいアルコキシ基、 ハロゲン原子またはシァノ基であり ； R 4は水素 原子、 置換されていてもよいアルキル基、 置換されていてもよいァリール基、 置換 されていてもよいアルコキシ基、 ハロゲン原子またはシァノ基であり ； R 5は水素 原子、 置換されていてもよいアルキル基、 置換されていてもよいァリール基、 置換 されていてもよいアルコキシ基、 ハロゲン原子またはシァノ基である）
〔1 3〕 R 2力 水素原子、 置換されていてもよいアルキル基または置換されてい てもよいアルコキシ基であり ； R 3が水素原子、 置換されていてもよいアルキル基 または置換されていてもよいアルコキシ基であり ； R 4が水素原子、 置換されてい てもよいアルキル基または置換されていてもよいアルコキシ基であり ； R =が水素 原子、 置換されていてもよいアルキル基または置換されていてもよいアルコキシ基 である、 上記 〔1 2〕 記載の方法。
〔14〕 該固相担体が下記式で表される、 上記 〔12〕 記載の方法。
Figure imgf000008_0001
(式中の記号は前記と同義である）
〔15〕 (1) 光照射により切断されるリンカ一を介してリガンドを固相担体上に 固定化する工程、 （2) 上記 （1) で得られたリガンドが固定化された固相担体と、 該リガンドのターゲット分子を含む試料とを混合する工程、 （3) 光を照射してリ ガンドを固相担体から切断する工程、 および （4) リガンドに結合したターゲット 分子を回収する工程を含む、 ターゲット分子の精製方法。
〔16〕 リガンドが固定ィ匕された固相担体が、 下記式 （I) または （I I) で示さ れる、 上記 〔15〕 記載の方法。
Figure imgf000008_0002
(式中、 Xはリガンドであり、 光照射により切断され； Yは単結合あるいは置換さ れていてもよいアルキレン基であり ； Aは固相担体との結合に用いられる基であ り ； Zは固相担体であり ； Qは、 NH、 Oまたは Sであり ； は水素原子、 置換 されていてもよいアルキル基または置換されていてもよいァリール基； R2は水素 原子、 置換されていてもよいアルキル基、 置換されていてもよいァリール基、 置換 されていてもよいアルコキシ基、 ハロゲン原子またはシァノ基であり ； R 3は水素 原子、 置換されていてもよいアルキル基、 置換されていてもよいァリール基、 置換 されていてもよいアルコキシ基、 ハロゲン原子またはシァノ基であり ； R 4は水素 原子、 置換されていてもよいアルキル基、 置換されていてもよいァリール基、 置換 されていてもよいアルコキシ基、 ハロゲン原子またはシァノ基であり ； R 5は水素 原子、 置換されていてもよいアルキル基、 置換されていてもよいァリール基、 置換 されていてもよいアルコキシ基、 ハロゲン原子またはシァノ基である）
〔1 7〕 R 2が、 水素原子、 置換されていてもよいアルキル基または置換されてい てもよいアルコキシ基であり ； R 3が水素原子、 置換されていてもよいアルキル基 または置換されていてもよいアルコキシ基であり ； R 4が水素原子、 置換されてい てもよいアルキル基または置換されていてもよいアルコキシ基であり ； R 5が水素 原子、 置換されていてもよいアルキル基または置換されていてもよいアルコキシ基 である、 上記 〔1 6〕 記載の方法。
〔1 8〕 該固相担体が下記式で表される、 上記 〔1 6〕 記載の方法。
Figure imgf000009_0001
(式中の記号は前記と同義である)
図面の簡単な説明
図 1は、 光切断型リンカ一を介してリガンドを固相担体に固定ィ匕し、 リガンドの 固相担体からの切断を光照射によって行うことを特徴とする本願発明と、 高濃度の リガンドゃ塩濃度の調節によって固相担体からリガンドを溶出させる従来の方法と を比較した模式図である。 図 2は、 光切断型リンカ一を介して F K 5 0 6を固相担体に固定化し、 ラット脳 ライゼートから F K 5 0 6特異的結合タンパク質 F K B P 1 2を高純度に取得でき ることを示す図である。
発明の詳細な説明
光切断型リンカーを用いた本願発明の固相担体および当該固相担体を利用したタ —ゲット分子の探索方法並びに精製方法を従来法 （高濃度のリガンドゃ塩により溶 出する方法） と比較して模式的に図 1に示す。
本発明において、 「光照射により切断されるリンカ一」 とは、 光を照射すること によって切断されるリンカーであれば特に限定されず、 リガンドと固相担体とを結 ぶ化合物 （若しくは基） である （以下光切断型リンカ一ともいう） 。 例えば、 コン ピナトリアル合成において使用される 0—ニトロべンジルリンカ一 （J O C 1 9 9 5 , 6 0， 2 3 1 8— 2 3 1 9 ) およびニトロベンジル基を有する各種誘導体が 挙け'られる。
光照射により切断されるリンカ一として下記式 （ ) または （I ) で示さ れる化合物もまた好適である。
Figure imgf000010_0001
(式中、 P iは水素原子、 又はアミノ基、 水酸基もしくはスルフヒ ドリル基の保護 基であり ； Yは単結合あるいは置換されていてもよいアルキレン基であり ； Aは固 相担体との結合に用いられる基であり ； P 2は水素原子、 又はアミノ基、 水酸基、 スルフヒ ドリル基、 カルボニル基もしくはカルボキシル基の保護基であり ； Qは、 N H、 Oまたは Sであり ； R iは水素原子、 置換されていてもよいアルキル基また は置換されていてもよいァリール基； R 2は水素原子、 置換されていてもよいアル キル基、 置換されていてもよいァリール基、 置換されていてもよいアルコキシ基、 ハロゲン原子またはシァノ基であり ； R 3は水素原子、 置換されていてもよいアル キル基、 置換されていてもよいァリール基、 置換されていてもよいアルコキシ基、 ハロゲン原子またはシァノ基であり ； R 4は水素原子、 置換されていてもよいアル キル基、 置換されていてもよいァリール基、 置換されていてもよいアルコキシ基、 ハロゲン原子またはシァノ基であり ； R 5は水素原子、 置換されていてもよいアル キル基、 置換されていてもよいァリール基、 置換されていてもよいアルコキシ基、 ハロゲン原子またはシァノ基である）
光切断型リンカ一における光照射により切断される部位は、 リンカーとリガンド との結合部位であって、 用いるリンカ一、 並びにリンカ一とリガンドとの結合様式 に応じて異なる。 例えば後述する式 （I ) 又は式 （I I ) で示される固相担体にお いては Qと Xとの結合が光照射により切断される。
該リンカーに照射する光の光源ならびに光量は、 リガンドが放出されるようリン カーの種類に応じて適宜検討され決定されるが、 0—ニトロべンジルリンカーを用 いる場合には波長 3 0 0〜4 0 0 n m、 好ましくは 3 5 0〜 3 7 0 n mの近紫外光 を 0〜 4 0 °C、 好ましくは 4〜 2 5 °Cで数秒〜 3時間、 好ましくは数秒〜 1時間、 特に好ましくは 3 0秒〜 1時間照射する。
リンカーを光切断する際、 用いるリンカーの種類にもよるが光切断により産生さ れる産物とリンカーとが再び反応するのを回避する為に適当な添加剤を用いること ができる。 添加剤の種類や使用濃度は使用するリンカーの種類に応じて適宜設定さ れる。 0—ニトロべンジルリンカ一を用いる場合には 2—メルカプトエタノール、 ヒドラジン及びィミダゾールから選ばれる少なくとも 1種を添加することが好まし い。 添加剤として 2—メルカプトエタノール、 ヒドラジン又はイミダゾールを用い る場合にはそれぞれ 0 . 0 1〜： L 0 0 O mM、 好ましくは 0 . ：!〜 5 0 0 mMの濃 度で使用する。 複数種の添加剤を用いる場合には合計量が上記範囲内になるように 設定する。 本発明の固相担体は、 リガンドが上記リンカーを介して固相担体上に固定化され ていることを特徴とするが、 その固定方法は特に限定されない。 リガンドとリンカ 一を結合させた後得られた結合体を固相担体に固定ィヒしてもよいし、 リンカーをま ず固相担体に固定化した後、 そのリンカ一とリガンドを結合させてもよい。
具体的にはリンカ一を水性または有機性の溶媒あるいはそれらの混合溶媒に溶解 し、 得られたリンカ一溶液と固相担体 （固相担体についても予め水性または有機性 の溶媒あるいはそれらの混合溶媒に懸濁しておくことが好ましい） とを混合するこ とによって、 あるいはリンカ一と固相担体とのアミ ド結合や、 シッフ塩基形成によ る結合、 C一 C結合、 エステル結合、 水素結合、 疎水相互作用等の共有結合あるい は非共有結合に付すことによってリンカ一を固相担体に固定化する。 リンカーおよ び固相担体を溶解または懸濁しておく水性または有機性の溶媒としては、 同じもの であっても異なるものであってもよく、 例えば水、 緩衝液等の水性溶媒、 アルコー ノレ （メタノーノレ、 エタノーノレ等） 、 ジメチノレホノレムアミ ド、 ジクロロメタン、 ァセ トニトリル等の有機性溶媒が挙げられる。 これらの混合溶媒もまた好適に使用でき る。 固定化するリンカー上の官能基の種類等に応じてリンカーの固相担体への固定 化に利用する反応が設定され、 適宜公知の手法によりリンカ一を固相担体に固定化 する。
一連の反応や処理を行う際の温度は、 設定した固定化反応に好適で且つリンカ一 が安定な温度であれば特に限定されないが、 通常 0 °C〜1 0 0 °C、 好ましくは室温 〜7 0 °Cで実施される。 また、 固相担体とリンカ一とを混合する時間も、 固相担体 にリンカ一が固定ィヒされれば特に限定されず、 設定した固定化反応や固定化を意図 するリンカ一、使用する固相担体の種類等に応じて適宜設定される。 通常 1時間か ら数日間、 好ましくは 2時間から一晩程度である。 結合反応には、 利用する固定化 反応に応じて適宜設定されるが、 一般に固相担体に対して過剰量のリンカ一を用い る。 しかしながら、 固相担体上、 あるいはリンカ一の全ての結合可能部位が反応に 供せられる必要はなく、 固相担体にリンカ一が部分的に固定化されるものであって も、 本願発明の目的を達成することができるので、 必ずしも過剰量である必要はな レ、。
アミ ド結合や、 シッフ塩基、 C一 C結合、 エステル結合、 水素結合、 疎水相互作 用等のリンカーの固相担体への固定化に利用する反応は当分野では公知の技術であ り、 反応試薬や反応条件等は従来実施されている方法に準じて行うことができ、 ま た必要に応じて適宜変更してもよい。
リガンドが光切断型リンカーを介して固定化された固相担体の具体例をその出典 とともに以下に挙げる。 いずれの固相担体もリガンドとターゲットとの相互作用の 解析用、 あるいはターゲット分子探索 ·精製用としての用途は知られていない。 こ れらの固相担体は既知の文献、 あるいは公知技術を適宜組み合わせて製造すること ができる。 リンカ一に相当する部分を便宜上囲いで示す。
Figure imgf000013_0001
TL 2004, 2839-2811
(リガンド) 、
また、 ニトロベンジル基を有するリンカ一を介してリガンドを固定化した下記式
( I ) または （I I ) で示される固相担体も好ましい。
Figure imgf000014_0001
(式中、 Xはリガンドであり、 光照射により切断され； Yは単結合あるいは置換さ れていてもよいアルキレン基であり ； Aは固相担体との結合に用いられる基であ り ； Zは固相担体であり ； Qは、 N H、 Oまたは Sであり ； は水素原子、 置換 されていてもよいアルキル基または置換されていてもよいァリール基； R 2は水素 原子、 置換されていてもよいアルキル基、 置換されていてもよいァリール基、 置換 されていてもよいアルコキシ基、 ハロゲン原子またはシァノ基であり ； R 3は水素 原子、 置換されていてもよいアルキル基、 置換されていてもよいァリール基、 置換 されていてもよいアルコキシ基、 ハロゲン原子またはシァノ基であり ； R 4は水素 原子、 置換されていてもよいアルキル基、 置換されていてもよいァリール基、 置換 されていてもよいアルコキシ基、 ハロゲン原子またはシァノ基であり ； R5は水素 原子、 置換されていてもよいアルキル基、 置換されていてもよいァリール基、 置換 されていてもよいアルコキシ基、 ハロゲン原子またはシァノ基である）
尚、 式中、 固相担体 Zは、 リンカ一やリガンドが結合する前の状態の固相担体を 意図する。
式 （ ) および式 （I ) の化合物は、 たとえば、 文献 （J. Or g. Ch em 1995, 60, 2318— 231 9 ) に記載の方法で合成される。 具体的 には、 アルキル基が結合したベンゼン誘導体に、 リガンドが結合しうる基 （Q) 、 ニトロ基、 および固相担体との結合に用いられる基 （A) を導入する。 ここでこれ らの置換基が導入される順序、 および、 用いられる導入反応は特に限定されず、 合 成されるリンカーの構造に応じて適宜設定される。 一般に知られる置換基導入反応、 たとえ fま、 Ad v a n c e d O r g a n i c Ch em i s t r y (J e r r y Ma r c h, 1992， J o h n Wi l e y & S o n s) に記載さ れる反応などが用いられる。
上記方法により得られる化合物 （1 ' ) および （I ) は、 リガンドを固相担 体に固定化する際に用いられるリンカー、 好ましくは光照射により切断されるリン カーとして用いることができる。 リガンドを該リンカーを介して固相担体に固定化 することによって本発明の固相担体 （I) ならびに （I I) を得ることができる。 本発明において、 光切断型リンカ一を介して固相担体に固定化される 「リガン ド」 、 例えば式 （I) および式 （I I) で表される固相担体中の Xは特に限定され ず、 公知の化合物であっても今後開発される新規な化合物であってもよい。 また、 低分子化合物であつても高分子化合物であつてもかまわない。 ここで低分子化合物 とは分子量 1000未満程度の化合物であって、 例えば医薬品として通常使用し得 る有機化合物およびその誘導体や無機化合物が挙げられ、 有機合成法等を駆使して 製造される化合物やその誘導体、 天然由来の化合物やその誘導体、 プロモーター等 の小さな核酸分子や各種の金属等であり、 望ましくは医薬品として使用し得る有機 化合物およびその誘導体、 核酸分子をいう。 また、 高分子化合物としては分子量 1 0 0 0以上程度の化合物であって、 タンパク質、 ポリ核酸類、 多糖類、 およびこれ らを組み合わせたものなどが挙げられ、 望ましくはタンパク質である。 これらの低 分子化合物あるいは高分子化合物は、 公知のものであれば商業的に入手可能である 、 各報告文献に従って採取、 製造、 精製等の工程を経て得ることができる。 これ らは、 天然由来であっても、 また遺伝子工学的に調製されるものであってもよく、 また半合成等によっても得ることができる。
リガンドとリンカ一との結合は、 アミ ド結合や、 シッフ塩基、 C— C結合、 エス テル結合、 水素結合、 疎水相互作用等の共有結合あるいは非共有結合であり、 いず れも当分野で公知の材料ならびに反応により形成される。 式 （I ) または式 （I
I ) で表される固相担体の場合、 リガンドはリンカ一部分の N H、 Sまたは Oとの アミ ド、 チォアミ ド、 エステノレ結合によって結合している。
本発明において用いられる固相担体ならびに式 （I ) および式 （I I ) 中の固相 担体 Zは、 その上でリガンド （リンカ一を介して該固相担体上に固定化されてい る） とターゲット分子との特異的相互作用が生じるものであれば特に限定されず、 当分野で通常使用されるものが利用できる。 材質としては、 例えば、 樹脂 （ポリス チレン、 メタクリレート系樹脂、 ポリアクリルアミ ド等） 、 ガラス、 金属 （金、 銀、 鉄、 シリコン等） 等が用いられる。 これらの固相は、 いかなる形状のものであって もよく、 また上記した材質の種類や、 その後にターゲット分子との相互作用の解析、 ターゲット分子の探索、 精製の工程の為に利用される方法に応じて適宜決定される。 例えば板状、 ビーズ状、 薄膜状、 糸状、 コイル状等が挙げられるが、 樹脂からなる ビーズであればカラムに充填することによりその後の操作を簡便にする。 またガラ スプレートを用いることも好適である。
Aの 「固相担体との結合に用いられる基」 は、 ニトロベンジル基を有するリンカ —部分 （光切断型リンカ一） を固相担体 （Z ) に結合させる為に必要な連結基であ つて、 例えば、 0、 S、 N H、 カルボニル基等の基が挙げられ、 これらの基をアル キレン基等を介して 2つ以上組み合わせたもの （例えば— O— ( C H 2 ) 3 - C O - 等） 、 もしくはポリエチレングリコールのような繰り返し構造 （例えば 一 o—
( C H 2 C H 2 - O) 4 - C H 2 C H 2 - C O - 等） を持っていてもよい。 Aの 「固 相担体との結合に用いられる基」 と固相担体 （Z ) との結合としては、 固相担体上 のァミノ基と Aとのアミ ド結合、 チォアミ ド結合、 力ルバメート結合、 ゥレア結合、 チォカルバメート結合、 チォゥレア結合、 固相担体上のカルボキシル基と Aとのァ ミ ド結合、 エステル結合、 固相担体上のヒ ドロキシル基と Aとのエステル結合、 ェ —テル結合等が挙げられる。 いずれも当分野で公知の材料ならびに反応により形成 される。
本明細書中、 ハロゲン原子としてはフッ素、 塩素、 臭素、 ヨウ素等が挙げられる。 本明細書中、 「置換されていてもよいアルキル基」 とは 1乃至 2以上の置換基を 有していてもよい炭素数 1〜 3の直鎖状または分枝状のアルキル基を意味する。
「炭素数 1〜 3の直鎖状または分枝状のアルキル基」 としては、 具体的にはメチル、 ェチル、 プロピル、 イソプロピル等が挙げられる。 置換基としてはハロゲン原子、
(前述と同義） 、 水酸基、 アルコキシ基 （炭素数 1乃至 6の直鎖状、 分枝状または 環状のアルコキシ基） 等が挙げられ、 置換されたアルキル基としては、 例えばトリ フルォロメチル、 2—ヒドロキシェチル、 2—メ トキシェチル等が挙げられる。 本明細書中、 「置換されていてもよいァリール基」 とは 1乃至 2以上の置換基を 有していてもよい炭素数 6乃至 1 4のァリール基を意味する。 「炭素数 6乃至 1 4 のァリール基」 としては、 具体的にはフエニル、 1—ナフチル、 2—ナフチル、 2 一インデュル、 2—アンスリル等が挙げられる。 置換基としてはニトロ基、 ハロゲ ン原子 （前述と同義） 、 アルキル基 （炭素数 1〜3の直鎖状または分枝状のアルキ ル基） 、 アルコキシ基 （前述と同義） 等が挙げられ、 置換されたァリール基として は、 2—ニ トロフェニ^^、 2—クロ口フエ二ノレ、 2 , 4—ジメ トキシフエ二ノレ等が 挙げられる。
本明細書中、 「置換されていてもよいアルコキシ基」 とは 1乃至 2以上の置換基 を有していてもよい炭素数 1乃至 6の直鎖状、 分枝状または環状のアルコキシ基を 意味する。 「炭素数 1乃至 6の直鎖状、 分枝状または環状のアルコキシ基」 として は、 具体的にはメ トキシ、 エトキシ、 n—プロボキシ、 イソプロボキシ、 ブトキシ、 イソブトキシ、 s e c—ブトキシ、 t e r t—ブトキシ、 ペンチルォキシ、 へキシ ルォキシ、 シクロプロピルォキシ、 シクロブチルォキシ等が挙げられる。 置換基と しては、 ハロゲン原子 （前述と同義） 、 水酸基、 アルコキシ基 （前述と同義） 、 ポ リエチレングリコール基等が挙げられ、 置換されたアルコキシ基としては、 トリフ ルォロメ トキシ、 2—ヒ ドロキシメ トキシ、 2—メ トキシェトキシ、 ポリエチレン ダリコールォキシ等が挙げられる。
本明細書中、 「置換されていてもよいアルキレン基」 とは、 炭素数 1〜3の直鎖 状または分枝状のアルキレン基を意味する。 「炭素数 1〜 3の直鎖状または分枝状 のアルキレン基」 としては、 具体的にはメチレン、 エチレン、 プロピレン、 イソプ ロピレン等が挙げられる。 置換基としてはハロゲン原子 （前述同義） 、 水酸基、 ァ ノレコキシ基 （前述と同義） 等が挙げられる。
Yとして好ましくは単結合であり、 Aとして好ましくは一0_ (CH2) 3— CO —であり、 Qとして好ましくは NHであり、 として好ましくは置換されていて もよいアルキル基 （特に好ましくはメチル基） であり、 R2〜R5として好ましくは 水素原子、 置換されていてもよいアルキル基 （特に好ましくはメチル基） または置 換されていてもよいアルコキシ基 （特に好ましくはメ トキシ基） である。
本明細書中、 Piの 「ァミノ基、 水酸 Sもしくはスルフヒ ドリル基の保護基」 な らびに P2の 「ァミノ基、 水酸基、 スルフヒドリル基、 カルボニル基もしくはカル ボキシル基の保護基」 としては通常当分野で用いられるものが利用でき、 「P r o t e c t i v e Gr o u p s i n Or g a n i c Sy n t h e s i s, G r e e n a n d Wu t s著、 J o h n Wi l e y & S o n s, I n c. 1999」 等に記載の一般的に用いられる保護基が利用できる。 具体的には 「ァミノ基の保護基」 としては、 9—フルォレニルメチルォキシカルボニル、 t e r t—ブチルォキシカルボニル等が、 「水酸基の保護基」 としては、 トリチル、 t e r tーブチル、 ベンジル等が、 「スルフヒ ドリル基の保護基」 としては、 ベンジ ノレ、 トリチル、 ァセタミ ドメチル等がそれぞれ挙げられる。 「カルボキシル基の保 護基」 としてはアルキル基 （前述と同義、 好ましくはメチル、 t e r t一プチル） 、 ァラルキル基 （炭素数 7乃至 1 0であり、 具体的には、 ベンジル、 メチルベンジル、 フエネチル等が挙げられ、 好ましくはべンジル基である） 等が挙げられる。 また、 Aの 「固相担体との結合に用いられる基」 がカルボニル基の場合、 P 2はカルボ二 ル基の保護基であり、 Aと一緒になつてカルボニル基の保護基であるジメチルァセ タールを形成する。
特に好ましい固相担体としては式 （I I ) で表されるものであり、 例えば下記式 で表される固相担体が好ましい。
Figure imgf000019_0001
(式中の記号は前記と同義である）
当該固相担体は、 下記式で表される。一ニトロべンジルリンカ一を介してリガン ド （X) を固相担体 （Z ) に固定化することによって調製される。 具体的な手順は 実施例にて後述する。
Figure imgf000019_0002
(式中の記号は前記と同義である）
本発明では、 上記リガンドを固定化した固相担体上で該リガンドとの特異的な相 互作用に基づいてターゲット分子を探索あるいは精製する過程を要する。 従ってタ ーゲット分子は、 リガンドと特異的に相互作用するものであれば特に限定されるも のではなく、 公知化合物である場合もあれば新規物質である場合も予想される。 タ ーゲット分子としては低分子化合物であっても高分子化合物であってもかまわない。 ターゲット分子が低分子化合物の場合には、 低分子化合物であるリガンドとの低分 子化合物と低分子化合物との特異的相互作用に基づき、 あるいは高分子化合物であ るリガンドとの高分子化合物と低分子化合物との特異的相互作用に基づき、 ターグ ット分子が選別され得る。 またターゲット分子が高分子化合物の場合には、 低分子 化合物であるリガンドとの低分子化合物と高分子化合物との特異的相互作用に基づ き、 あるいは高分子化合物であるリガンドとの高分子化合物と高分子化合物との特 異的相互作用に基づき、 ターゲット分子が選別され得る。 好ましいリガンドとター ゲット分子の組み合わせは低分子化合物と高分子化合物、 あるいは高分子化合物と 高分子化合物という組み合わせである。
ターゲット分子との相互作用の解析、 ならびにターゲット分子の選別は簡便には 固相上で行う。 ターゲット分子として予め候補物質が予測される場合には、 候補物 質を単独で上記固相担体上に固定化されたリガンドと接触させ両者の相互作用を測 定し、 候補物質がターゲット分子であるか否かを判断すればよいが、 通常、 複数の 物質 （高分子化合物および または低分子化合物） を含む試料をリガンドと接触さ せ、 複数の物質 （高分子化合物および Zまたは低分子化合物） の各々とリガンドと の相互作用の有無ならびにその相互作用の程度を測定することによりターゲット分 子であるか否かを判断し、 選別する。 ここで複数の物質を含む試料としては、 全て 公知化合物から構成されるものであっても、 一部新規な化合物を含むものであって も、 さらには全て新規な化合物から構成されるものであってもよい。 しかしながら、 リガンドのターゲット分子の探索、 あるいは昨今のプロテオーム解析の進歩によれ ば、 全てその構造が公知な化合物の混合物であることが望ましい。 全て公知な化合 物から構成される試料としては、 大腸菌等によって遺伝子工学的に調製されたタン パク質の混合物等であり、 一部新規な化合物を含むものとしては、 細胞や組織の抽 出物 （ライゼート） であり、 また全て新規な化合物から構成されるものとしては、 まだその機能や構造が知られていない新規なタンパク質や新しく合成された化合物 等の混合物が挙げられる。 試料が混合物の場合、 特に公知化合物を含む場合には、 任意にこれらの化合物の試料中の含有量を所望の値に設定しておくこともできる。 リガンドのターゲット分子の探索という見地にたてば、 低分子化合物ならびに高分 子化合物であるのが好ましく、 ヒト等の動物体内でのターゲット分子の探索につい ていえば高分子化合物であることが好ましい。
本明細書中、 リガンドならびにターゲット分子という用語は、 互いに特異的な分 子間相互作用を有する組み合わせを意図するものであって、 当該組み合わせのうち、 片方をリガンドとして固相に固定化すれば他方がターゲット分子となり、 すなわち どちらを固相に固定化するかによつて、 それらの呼称は変更され得る。 リガンドに 特異的な相互作用を有するターゲット分子は 1種類とは限らず、 また同様にターグ ット分子に特異的な相互作用を有するリガンドも 1種類とは限らない。 本明細書で はリガンドならびにターゲット分子という用語は、 ある特定の分子を指すものでは なく特異的な相互作用を有する分子同士の各々を意図するものである。
「特異的な相互作用」 とは、 特定のリガンド （特定のターゲット分子） のみを特 異的に認識して結合するような特性を発揮する作用であり、 ァゴニストあるいはァ ンタゴ二ストに対する特異的受容体、 基質に対する酵素、 そして例えば FK506 (リガンド） に対する FK 506'結合タンパク質 （ターゲット分子） や、 ステロイ ドホルモンに対するステロイ ドホノレモン受容体 （例； d e x ame t h a s o n e と g l u c o c o r t i c o i d r e c e p t o r) 、 抗カ sん斉 t r a p o x i nに対する HD AC等の関係が 「特異的相互作用」 に該当する。 一方、 「非特異的 な相互作用」 とは、 それによる結合の対象が広範にわたり且つ特定分子に限定され ず、 反応条件によって種々変化するような状況を生じる作用をいい、 本発明におい ては、 固相上のリガンドゃ固相担体自体の表面に、 結合 '吸着するような不特定の 分子間の作用を意味する。 「非特異的相互作用」 は、 「特異的相互作用」 に基づく リガンドとターゲット分子の結合の障害となるか、 あるいは混同されることにより 「特異的な相互作用」 による結合を見落としてしまう危険性がある。
本発明において 「特異的相互作用を解析する」 とは、 リガンドとターゲット分子 との間の相互作用の特異性の程度を、 相互作用情報として得ることであって、 例え ば Kd (解離速度定数） 、 K a (結合速度定数） 等の数値として得ることができる。 上記相互作用情報に基づき、 リガンドと特異的な相互作用を有するか否かを判定す ることによってターゲット分子を同定することができる本願発明の固相担体はタ一 ゲット分子探索用であり得、 また、 リガンドとターゲット分子との特異的相互作用 を利用して本願発明の固相担体を用いてターゲット分子を精製することもできる。
実施例
以下、 実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、 本発明はこれらの実施例 によりなんら限定されるものではない。 また、 用いる各化合物や試薬等は特に言及 しない限り、 商業的に入手可能であるか、 また既知の報告等に基づいて調製するこ とができる。
略語一覧
DMF ： ジメチノレホノレムアミ ド
NMP ： N—メチノレ一 2—ピロリ ドン
EDC ： 1一 [3— (ジメチルァミノ） プロピル] _ 3—ェチルカルボジイミ ド Fmo c ： 9—フルォレニルメチルォキシカノレボニル
Ho B t ： 1—ヒ ドロキシベンゾトリァゾール
2— ME ： 2—メルカプトエタノール
実施例 1 ：光切断型リンカーを介して FK 5 06を固定化した樹脂の合成
光切断型リンカ— （4— {4 - [ 1— (Fmo c—ァミノ） 一ェチル] _ 2—メ トキシ一 5—ニトロフエノキシ } 酪酸， F l u k a ) ( 1 24mg, 0. 24mm o 1 ) N TOYOパール榭脂 （T SKg e l AF— a m i n o, 600 μ 1 , 遊離ァミノ基 (a v a i l a b l e a m i n o g r o u p) fま 0. 0 6 mm o 1 ) 、 EDC (44mg, 0. 2 8 mm o 1 ) 、 HOB t (3 9mg, 0. 2 8m mo 1 ) および DMF (6m l ) の混合物を室温で 1 5時間撹拌した。 反応の終点 はニンヒドリン反応で残存アミノ基が肉眼で観測できなくなることで確認した。 こ の時の反応率を換算すると約 8 8%であった。 反応終了確認後、 DMFで樹脂を 5 回洗浄した。 ここに、 20%ピぺリジン一 DMF溶液 （6m l ) を加え、 2時間室 温で攪拌した。 DMFで樹脂を 5回洗浄後、 200 μ 1をとりわけ、 文献 （B i o c o n j u g a t e Ch em i s t r y, 2003, 14 (6) ， 1 222— 1230) 記載の方法で調製した 17—ァリル一 1, 14—ジ一ヒドロキシ一 12 - {2- [4— (7—カルボキシーヘプタノィル一ォキシ） 一 3—メ トキシ一シク 口へキシル ] — 1—メチルービュル } — 23， 25—ジメ トキシ一 13， 19, 2 1， 27—テトラメチル一 1 1, 28—ジォキサ一4—ァザ一トリシクロ [22. 3. 1. 04' 9] ォクタコス一 18—ェン一 2, 3， 10， 16—テトラオン （F K506 ； 77mg, 0. 08mmo 1 ) 、 EDC (14. 9 m g , 0. 096m mo 1 ) , HOB t (1 2. 8mg, 0. 096mmo 1 ) および DMF ( 1 m 1 ) の混合物を室温で 20時間撹拌した。 反応の終点はニンヒドリン反応で残存ァ ミノ基が肉眼で観測できなくなることで確認した。 この時の反応率を換算すると約 94%であった。 反応終了確認後、 DMFで樹脂を 5回洗浄した。 ここに無水酢酸 (200 μ 1 ) および DMF (800 1 ) を加え 1時間室温で撹拌した。 その 後 DMFで十分洗浄し、 得られた光切断型リンカーを介して FK506を固定化し た樹脂は後述する結合実験に用いた。
実施例 2
(1) ラット脳ライゼートの調製
ラットの脳 （2. 2 g) を混合液 A (0. 25 Mシュクロース， 25mM T r i sバッファー （pH7. 4) , 22m l ) に混ぜ、 ホモジネートを作成後、 95 00 r p mで 10分間遠心分離した。 遠心分離上清を取り、 50000 r pmでさ らに 30分間遠心分離した。 こうして得られた上清をライゼ一トとして使用した。 なお、 実験はすべて 4 °Cあるいは氷上で行った。
(2) 結合実験及び標的タンパク質の精製
実施例 1で調製した、 FK506を、 光切断型リンカ一 （4— {4- [1— (F mo c—ァミノ） 一ェチル ] —2—メ トキシ一5—ニトロフエノキシ } 酪酸， F 1 u k a) を介して固定化した榭脂 （TOYOPEARL AF) を、 上記 （1) で 調製したラット脳ライゼートと混合し、 付着物をバッファー B (25mM トリス バッファー （pH7. 4) , 0. 25Mシュクロース， 500mMヒ ドラジン， 5 0 OmM 2— ME) で洗浄し、 その後溶出のためバッファー B中にて、 1時間大 型 UV照射ランプ （365 n m, Mo d e l B 100AP, Lo n g Wa v e U l t r a v i o l e t L amp, 1 1 5V— 2. 5 A, U V P, U l a n d, CA) での光照射を行った。 照射後、 バッファー溶液をサンプルとして回収し、 榭 脂上に残った残存タンパク質を、 溶出試薬 （S amp 1 e Bu f f e r S o l u t i o n w i t h 2ME (x 2) f o r SDS— p a g e, c o d e 30566-22, Na k a l a i t e s q u e) にて溶出した。 樹脂上 に残った残存タンパク質を溶出して得られたサンプルと光照射にて溶出したサンプ ルとを電気泳動によって比較した （図 2) 。
光照射による溶出では、 光切断型リンカ一を介して FK506を固定化した樹脂 から FK506の結合タンパク質である FKB P 12が高純度で溶出されることが 確認された （図 2レーン 3) 。 光照射後の樹脂上のタンパク質を、 溶出試薬を用い て溶出すると、 FKBP 12以外の非選択的結合タンパク質を含むタンパク質が溶 出した （図 2レーン 2) 。 一方、 光照射を行わず当初の FK 506固定化樹脂に結 合したタンパク質を全溶出した結果を図 2レーン 1に示す。
これらの結果から本発明により特異的結合タンパク質のみが高純度で精製される ことが明らかである。
実施例 3 ：光切断型リンカ一を介してクロモグリク酸を固定化した樹脂の合成 実施例 1に記載の方法にしたがって作製した、 光切断型リンカ一を結合した樹脂 (500 μ 1 ) と、 クロモグリク酸 （93mg, 0. 2mmo 1 ) 、 EDC (37 mg, 0. 24mmo 1 ) 、 HOB t (32 m g , 0. 24mm o 1 ) および NM P (5m l ) の混合物を室温で 20時間撹拌した。 反応の終点はニンヒ ドリン反応 で残存ァミノ基が肉眼で観測できなくなることで確認した。 この時の反応率を換算 すると約 76%であった。 反応終了確認後、 NMPで樹脂を 5回洗浄した。 ここに 無水酢酸 （1m l) および NMP (4m l ) を加え 1時間室温で撹拌した。 その後 NMPで十分洗浄し、 得られた光切断型リンカ一を介してクロモグリク酸を固定化 した樹脂を後述する結合実験に用いた。
実施例 4
( 1 ) E. c o l iライゼ一トの調製
定法にしたがってクロモグリク酸結合タンパクを発現した E. c o 1 i (0. 5 2 g) を混合液 C (0. 25 Mシュクロース， 25mM T r i sバッファー （p H7. 4) , 1% Ch a p s, 4m l ) に混ぜ、 ホモジネートを作成後、 1000 0 r pmで 60分間遠心分離した。 こうして得られた上清をライゼ一トとして使用 した。 なお、 実験はすべて 4 °Cあるいは氷上で行った。
(2) 結合実験および標的タンパク質の精製
実施例 3で調製した、 クロモグリク酸を、 光切断型リンカ一 （4— {4- [1- (Fmo c—ァミノ） 一ェチル] _ 2—メ トキシ一 5—二トロフエノキシ } 酪酸， F 1 u k a ) を介して固定化した樹脂 （TOYOP EAR L AF) を、 上記 (1) で調製したクロモグリク酸結合タンパク発現 E. c o l iライゼートと混合 し、 付着物をバッファー D (25mM トリスバッファー （pH7. 4) , 0. 2 5 Mシュクロース， l%Ch a p s, 500 mMイミダゾ一ノレ， 500 mM 2— ME) で洗浄し、 その後溶出のためバッファー D中にて、 1時間大型 UV照射ラン プ （365 n m, Mo d e l B 100AP, Lo n g Wa v e U 1 t r a v i o l e t L amp, 1 15V—2. 5 A, UVP, Up l a n d, CA) での 光照射を行った。 照射後、 バッファー溶液をサンプルとして回収することにより、 高純度のクロモグリク酸結合タンパク （分子量：約 80K) 溶液を得ることができ た。
産業上の利用可能性
本発明の方法によれば、 従来、 特異的結合能を有するリガンドを固定化したァフ ィニティー樹脂によるタンパク質の精製過程で問題となっていた、 高濃度リガンド あるいは塩によるタンパク質の変性や、 非選択的タンパク質の混入等を排除するこ とができる。 本出願は、 日本で出願された特願 2004— 224634を基礎としておりその 内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims

請求の範囲
1 . 光照射により切断されるリンカ一を介してリガンドが固定化されている、 リガ ンドとターゲット分子との特異的相互作用を解析する為の固相担体。
2 . ターゲット分子探索用である、 請求項 1記載の固相担体。
3 . ターゲット分子精製用である、 請求項 1記載の固相担体。
4 . 下記式 （I ) または （I I ) で示される、 請求項 1〜3のいずれか 1項に記載 の固相担体。
Figure imgf000027_0001
(式中、 Xはリガンドであり、 光照射により切断され； Yは単結合あるいは置換さ れていてもよいアルキレン基であり ； Aは固相担体との結合に用いられる基であ り ； Zは固相担体であり ； Qは、 N H、 Oまたは Sであり ； は水素原子、 置換 されていてもよいアルキル基または置換されていてもよいァリール基； R 2は水素 原子、 置換されていてもよいアルキル基、 置換されていてもよいァリール基、 置換 されていてもよいアルコキシ基、 ハロゲン原子またはシァノ基であり ； R 3は水素 原子、 置換されていてもよいアルキル基、 置換されていてもよいァリール基、 置換 されていてもよいアルコキシ基、 ハロゲン原子またはシァノ基であり ； R 4は水素 原子、 置換されていてもよいアルキル基、 置換されていてもよいァリール基、 置換 されていてもよいアルコキシ基、 ハロゲン原子またはシァノ基であり ； R 5は水素 原子、 置換されていてもよいアルキル基、 置換されていてもよいァリール基、 置換 されていてもよいアルコキシ基、 ハロゲン原子またはシァノ基である）
5 . R 2が、 水素原子、 置換されていてもよいアルキル基または置換されていても よいアルコキシ基であり ； R 3が水素原子、 置換されていてもよいアルキル基また は置換されていてもよいアルコキシ基であり ； R 4が水素原子、 置換されていても よいアルキル基または置換されていてもよいアルコキシ基であり ； R 5が水素原子、 置換されていてもよいアルキル基または置換されていてもよいアルコキシ基である、 請求項 4記載の固相担体。
6 . 下記式で表される、 請求項 4記載の固相担体。
Figure imgf000028_0001
(式中、 Xはリガンドであり、 光照射により切断され； Zは固相担体である)
7 . 下記式 （ ) または （I ) で示される化合物。
Figure imgf000028_0002
(式中、 P iは水素原子、 又はアミノ基、 水酸基もしくはスルフヒ ドリル基の保護 基であり ； Yは単結合あるいは置換されていてもよいアルキレン基であり ； Aは固 相担体との結合に用いられる基であり ； P 2は水素原子、 又はアミノ基、 水酸基、 スルフヒ ドリノレ基、 カルボニル基もしくはカルボキシル基の保護基であり ； Qは、 N H、 Oまたは Sであり は水素原子、 置換されていてもよいアルキル基また は置換されていてもよいァリール基； R 2は水素原子、 置換されていてもよいアル キル基、 置換されていてもよいァリール基、 置換されていてもよいアルコキシ基、 ハロゲン原子またはシァノ基であり ； R 3は水素原子、 置換されていてもよいアル キル基、 置換されていてもよいァリール基、 置換されていてもよいアルコキシ基、 ハロゲン原子またはシァノ基であり ； R 4は水素原子、 置換されていてもよいアル キル基、 置換されていてもよいァリール基、 置換されていてもよいアルコキシ基、 ハロゲン原子またはシァノ基であり ； R 5は水素原子、 置換されていてもよいアル キル基、 置換されていてもよいァリール基、 置換されていてもよいアルコキシ基、 ハロゲン原子またはシァノ基である）
8 . 下記式 （1 ' ) または （I ) で示される、 リガンドを固相担体に固定化す る際に用いられるリンカ一。
Figure imgf000029_0001
(式中、 P iは水素原子、 又はアミノ基、 水酸基もしくはスルフヒドリル基の保護 基であり ； Yは単結合あるいは置換されていてもよいアルキレン基であり ； Aは固 相担体との結合に用いられる基であり ； P 2は水素原子、 又はアミノ基、 水酸基、 スルフヒドリル基、 カルボニル基もしくはカルボキシル基の保護基であり ； Qは、 N H、 Oまたは Sであり ； 1^は水素原子、 置換されていてもよいアルキル基また は置換されていてもよいァリール基； R 2は水素原子、 置換されていてもよいアル キル基、 置換されていてもよいァリール基、 置換されていてもよいアルコキシ基、 ハロゲン原子またはシァノ基であり ； R 3は水素原子、 置換されていてもよいアル キル基、 置換されていてもよいァリール基、 置換されていてもよいアルコキシ基、 ハロゲン原子またはシァノ基であり ； R 4は水素原子、 置換されていてもよいアル キル基、 置換されていてもよいァリール基、 置換されていてもよいアルコキシ基、 ハロゲン原子またはシァノ基であり ； R 5は水素原子、 置換されていてもよいアル キル基、 置換されていてもよいァリール基、 置換されていてもよいアルコキシ基、 ハロゲン原子またはシァノ基である）
9 . 光照射により切断されることを特徴とする請求項 8記載のリンカー。
1 0 . 請求項 9記載のリンカ一を介してリガンドが固定化されている、 リガンドと ターゲット分子との特異的相互作用を解析する為の固相担体。
1 1 . ( 1 ) 光照射により切断されるリンカ一を介してリガンドを固相担体上に固 定化する工程、 （2 ) 上記 （1 ) で得られたリガンドが固定化された固相担体と、 該リガンドのターゲット分子を含む力、含まない試料とを混合する工程、 （3 ) 光を 照射してリガンドを固相担体から切断する工程、 および （4 ) リガンドにターゲッ ト分子が結合しているかどう力確認する工程を含む、 ターゲット分子の探索方法。
1 2 . リガンドが固定化された固相担体が、 下記式 （I ) または （I I ) で示され る、 請求項 1 1記載の方法。
Figure imgf000031_0001
(式中、 Xはリガンドであり、 光照射により切断され； Yは単結合あるいは置換さ れていてもよいアルキレン基であり ； Aは固相担体との結合に用いられる基であ り ； Zは固相担体であり ； Qは、 N H、 Oまたは Sであり ； は水素原子、 置換 されていてもよいアルキル基または置換されていてもよいァリール基； R 2は水素 原子、 置換されていてもよいアルキル基、 置換されていてもよいァリール基、 置換 されていてもよいアルコキシ基、 ハロゲン原子またはシァノ基であり ； R 3は水素 原子、 置換されていてもよいアルキル基、 置換されていてもよいァリール基、 置換 されていてもよいアルコキシ基、 ハロゲン原子またはシァノ基であり ； R 4は水素 原子、 置換されていてもよいアルキル基、 置換されていてもよいァリール基、 置換 されていてもよいアルコキシ基、 ハロゲン原子またはシァノ基であり ； R 5は水素 原子、 置換されていてもよいアルキル基、 置換されていてもよいァリール基、 置換 されていてもよいアルコキシ基、 ハロゲン原子またはシァノ基である）
1 3 . R 2が、 水素原子、 置換されていてもよいアルキル基または置換されていて もよいアルコキシ基であり ； R 3が水素原子、 置換されていてもよいアルキル基ま たは置換されていてもよいアルコキシ基であり ； R 4が水素原子、 置換されていて もよいアルキル基または置換されていてもよいアルコキシ基であり ； R 5が水素原 子、 置換されていてもよいアルキル基または置換されていてもよいアルコキシ基で ある、 請求項 1 2記載の方法。
1 4 . 該固相担体が下記式で表される、 請求項 1 2記載の方法。 X一
Figure imgf000032_0001
(式中、 xはリガンドであり、 光照射により切断され； zは固相担体である）
15. (1) 光照射により切断されるリンカ一を介してリガンドを固相担体上に固 定化する工程、 (2) 上記 （1) で得られたリガンドが固定化された固相担体と、 該リガンドのターゲット分子を含む試料とを混合 る工程、 （3) 光を照射してリ ガンドを固相担体から切断する工程、 および （4) リガンドに結合したターゲット 分子を回収する工程を含む、 ターゲット分子の精製方法。
16. リガンドが固定化された固相担体が、 下記式 （I) または （I I) で示され る、 請求項 1 5記載の方法。
Figure imgf000032_0002
(式中、 Xはリガンドであり、 光照射により切断され； Yは単結合あるいは置換さ れていてもよいアルキレン基であり ； Aは固相担体との結合に用いられる基であ り ； Zは固相担体であり ； Qは、 NH、 Oまたは Sであり ； 1^は水素原子、 置換 されていてもよいアルキル基または置換されていてもよいァリール基； R2は水素 原子、 置換されていてもよいアルキル基、 置換されていてもよいァリール基、 置換 されていてもよいアルコキシ基、 ハロゲン原子またはシァノ基であり ； R 3は水素 原子、 置換されていてもよいアルキル基、 置換されていてもよいァリール基、 置換 されていてもよいアルコキシ基、 ハロゲン原子またはシァノ基であり ； R 4は水素 原子、 置換されていてもよいアルキル基、 置換されていてもよいァリール基、 置換 されていてもよいアルコキシ基、 ハロゲン原子またはシァノ基であり ； R 5は水素 原子、 置換されていてもよいアルキル基、 置換されていてもよいァリール基、 置換 されていてもよいアルコキシ基、 ハロゲン原子またはシァノ基である）
1 7 . R 2が、 水素原子、 置換されていてもよいアルキル基または置換されていて もよいアルコキシ基であり ； R 3が水素原子、 置換されていてもよいアルキル基ま たは置換されていてもよいアルコキシ基であり ； R 4が水素原子、 置換されていて もよいアルキル基または置換されていてもよいアルコキシ基であり ； R 5が水素原 子、 置換されていてもよいアルキル基または置換されていてもよいアルコキシ基で ある、 請求項 1 6記載の方法。
1 8 . 該固相担体が下記式で表される、 請求項 1 6記載の方法。
Figure imgf000033_0001
(式中、 Xはリガンドであり、 光照射により切断され； Zは固相担体である)
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