JPWO2004040305A1 - 化合物の固相担体への固定化方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、解析対象の分子を当該分子側の結合位置を特定することなく固相担体に結合することによって得られる分子固定化固相担体の混合物を用いて、当該固相上で該分子と特異的に相互作用する分子との間での特異相互作用を解析する方法、特に、当該固定化が、当該分子に、当該分子側の結合位置を特定することなく導入されたスペーサーを介して行われるものである、方法を提供し、当該方法によれば従来必須とされてきた構造活性相関を検討することなく、解析対象の分子に特異的な相互作用を有する分子のみを同定、選別することが可能となり、これらの分子間の相互作用を解析することが可能となる。

Description

本発明は、化合物（対象分子、特に低分子化合物）の固定化技術についての基盤技術に関する。より具体的には、対象となる分子を固相担体に固定し、低分子−高分子、低分子−低分子あるいは高分子−高分子相互作用を測定、あるいは特異的な相互作用をベースとしターゲット分子を精製する際により効率的な対象分子の固相担体への固定化を可能にする技術に関する。

対象分子（特に低分子化合物）を固相担体に固定し、あるいは他の分子と結合し、低分子−高分子、低分子−低分子あるいは高分子−高分子相互作用を測定、あるいは特異的な相互作用をベースとしターゲット分子を精製する方法は様々な領域で活用されている。例えば、新規創薬ターゲット探索を目的としたアフィニティー樹脂を用いたターゲット蛋白研究が著名である。この研究の代表例としては、１９８９年のシュライバー教授によるアフィニティー樹脂を用いた免疫抑制剤ＦＫ５０６の結合蛋白質ＦＫＢＰ（ＦＫ５０６ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）の発見（ＦＫ５０６の細胞内結合蛋白質としてのＦＫＢＰ１２の発見；例えば「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」，（英国），１９８９年１０月２６日，第３４１巻，ｐ．７５８−７６０参照）、および引き続き行われたＦＫ５０６−ＦＫＢＰ複合体によるＦＫ５０６薬効メカニズムにおけるカルシニューリン阻害作用の発見（例えば「セル（Ｃｅｌｌ）」，（米国），１９９１年８月２３日，第６６巻，第４号，ｐ．８０７−８１５参照）や、抗がん剤Ｔｒａｐｏｘｉｎのターゲット蛋白質としてのＨＤＡＣ（例えば「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」，（米国），１９９６年４月１９日，第２７２巻，ｐ．４０８−４１１参照）発見等が有名である。
しかし、これまでは、低分子を固相担体に固定するためには、低分子構造の中で、活性に悪影響を起こさない位置に選択的にスペーサーを導入することが必要とされていた。そのため、ターゲット分子を探索し精製する、あるいは対象分子とそのターゲットとの相互作用を解析するという研究を遂行するには、事前に対象低分子化合物に関する広範な構造活性相関研究を行い、求める活性の消失を引き起こさない構造上の部位を同定することが必須とされてきた。しかし、この検討には膨大な数の化合物をそれぞれ個別に１から合成し、その薬理活性を測定する必要があるため、多大な投資と時間を必要としていた。また、限られた研究期間の範囲において、求める化合物を得ることが出来ない場合も多くみられターゲット探索研究そのものを断念せざるを得ない場合も存在している。すなわち、必須とされる構造活性相関研究が上記研究を遂行するにあたり大きな障害となってきた。
近年、有効な創薬ターゲット探索を目的とし、ゲノム創薬に多大な投資がなされているが、アフィニティー樹脂を用いたターゲット探索研究はゲノム研究に比べ効率的な投資が可能なことから上述の障害を克服する新たな手法が待たれていた。
本発明は、構造活性相関研究を必須とすることなく、固相担体上での分子間相互作用解析ならびに当該解析をもとに対象化合物（リガンド）のターゲット分子を探索し得る方法の提供を目的とする。

本願発明者らは、上記課題を解決すべく、リガンドに関する構造活性相関に関する検討を行うことなく、１）リガンドにもともと存在する官能基（以下、リガンド固有の官能基と称する）を利用し、あるいは２）リガンドに新たに導入した官能基を利用し、この官能基を直接的に固定化反応に利用あるいは適当なスペーサーを介し間接的に固定化反応に利用する方法を考案し、低分子化合物を固定化するための一般的な方法を開発した。
すなわち、１）リガンド自身に活用可能な官能基がもともとある場合：リガンド固有の官能基を利用し、この官能基を直接的に固定化反応に利用あるいは適当なスペーサーを介して間接的に固定化反応に利用することによって、リガンドのターゲット分子を探索する方法、２）リガンドに活用可能な官能基が無い場合：リガンドに化学的あるいは酵素的な官能基付加反応を行った後、直接的に固定化反応に利用あるいは適当なスペーサーを介して間接的に固定化反応に利用することによって、リガンドのターゲット分子を探索する方法を開発した。
即ち本発明は下記の通りである。
〔１〕少なくとも以下の工程を含む、分子Ａと該分子Ａに特異的な相互作用を有する分子Ｂとの相互作用を解析する方法：
（１）分子Ａ側の結合位置を特定することなく固相担体に分子Ａを結合することによって分子Ａを固定化した固相担体の混合物を得る工程、
（２）分子Ｂを含むかまたは含まない試料を上記（１）で得られた固相担体の混合物に接触させる工程、および
（３）分子Ａに特異的な相互作用を示したか、または示さなかった分子を同定し、分子Ａと分子Ｂとの相互作用を解析する工程。
〔２〕分子Ａを固定化した固相担体の混合物を得る工程において、分子Ａと固相担体との間に分子Ａ側の導入位置を特定することなくスペーサーを導入することを特徴とする上記〔１〕記載の方法。
〔３〕分子Ａを固定化した固相担体の混合物を得る工程において、（１）分子Ａに官能基が導入されること、および（２）該官能基の導入が分子Ａ側の導入位置を特定することなく行われることを特徴とする上記〔１〕記載の方法。
〔４〕スペーサーの分子Ａへの導入が、分子Ａ側の導入位置を特定することなく導入された官能基を介して行われるものである上記〔２〕記載の方法。
〔５〕分子Ａ側の導入位置を特定することなく行われる分子Ａへの官能基の導入が、化学反応によるものであるかまたは酵素反応によるものである上記〔３〕又は〔４〕記載の方法。
〔６〕分子Ａ側の導入位置を特定することなく行われる分子Ａへの官能基の導入が、酵素反応によるものである上記〔５〕記載の方法。
〔７〕酵素反応が、代謝酵素により行われることを特徴とする、上記〔６〕記載の方法。
〔８〕少なくとも以下の工程を含む、分子Ａに特異的な相互作用を有する分子Ｂを選別する方法：
（１）分子Ａ側の結合位置を特定することなく固相担体に分子Ａを結合することによって分子Ａを固定化した固相担体の混合物を得る工程、
（２）分子Ｂを含むかまたは含まない試料を上記（１）で得られた固相担体の混合物に接触させる工程、および
（３）分子Ａに特異的な相互作用を示したか、または示さなかった分子を同定し、分子Ｂを選別する工程。
〔９〕分子Ａを固定化した固相担体の混合物を得る工程において、分子Ａと固相担体との間に分子Ａ側の導入位置を特定することなくスペーサーを導入することを特徴とする上記〔８〕記載の方法。
〔１０〕分子Ａを固定化した固相担体の混合物を得る工程において、（１）分子Ａに官能基が導入されること、および（２）該官能基の導入が分子Ａ側の導入位置を特定することなく行われることを特徴とする上記〔８〕記載の方法。
〔１１〕スペーサーの分子Ａへの導入が、分子Ａ側の導入位置を特定することなく導入された官能基を介して行われるものである上記〔９〕記載の方法。
〔１２〕分子Ａ側の導入位置を特定することなく行われる分子Ａへの官能基の導入が、化学反応によるものであるかまたは酵素反応によるものである上記〔１０〕又は〔１１〕記載の方法。
〔１３〕分子Ａ側の導入位置を特定することなく行われる分子Ａへの官能基の導入が、酵素反応によるものである上記〔１２〕記載の方法。
〔１４〕酵素反応が、代謝酵素により行われることを特徴とする、上記〔１３〕記載の方法。
〔１５〕分子Ａ側の結合位置を特定することなく固相担体に分子Ａを結合することによって得られる２種以上の分子Ａ固定化固相担体からなる分子Ａ固定化固相担体混合物であって、該２種以上の分子Ａ固定化固相担体において、分子Ａは分子Ａ上のそれぞれ異なる位置で固相担体に固定化されている、分子Ａ固定化固相担体混合物。
〔１６〕分子Ａの固相担体への結合が、分子Ａと固相担体との間に分子Ａ側の導入位置を特定することなく導入されたスペーサーを介して行われるものである、上記〔１５〕記載の分子Ａ固定化固相担体混合物。
〔１７〕分子Ａの固相担体への結合が、（１）分子Ａに導入された官能基を介して行われること、および（２）該官能基の導入が分子Ａ側の導入位置を特定することなく行われることを特徴とする上記〔１５〕記載の分子Ａ固定化固相担体混合物。
〔１８〕スペーサーの分子Ａへの導入が、分子Ａ側の導入位置を特定することなく導入された官能基を介して行われるものである上記〔１６〕記載の分子Ａ固定化固相担体混合物。
〔１９〕分子Ａ側の導入位置を特定することなく行われる分子Ａへの官能基の導入が、化学反応によるものであるかまたは酵素反応によるものである上記〔１７〕又は〔１８〕記載の分子Ａ固定化固相担体混合物。
〔２０〕分子Ａ側の導入位置を特定することなく行われる分子Ａへの官能基の導入が、酵素反応によるものである上記〔１９〕記載の分子Ａ固定化固相担体混合物。
〔２１〕酵素反応が、代謝酵素により行われることを特徴とする、上記〔２０〕記載の分子Ａ固定化固相担体混合物。
〔２２〕アフィニティークロマトグラフィー用固相担体である、上記〔１５〕〜〔２１〕のいずれか１項に記載の分子Ａ固定化固相担体混合物。
〔２３〕分子Ａ側の結合位置を特定することなく固相担体に分子Ａを結合し、２種以上の分子Ａ固定化固相担体からなる分子Ａ固定化固相担体混合物を得ることを含むアフィニティークロマトグラフィー用固相担体の製造方法であって、該２種以上の分子Ａ固定化固相担体において、分子Ａは分子Ａ上のそれぞれ異なる位置で固相担体に固定化されている、アフィニティークロマトグラフィー用固相担体の製造方法。
〔２４〕分子Ａの固相担体への結合が、分子Ａと固相担体との間に分子Ａ側の導入位置を特定することなく導入されたスペーサーを介して行われるものである、上記〔２３〕記載のアフィニティークロマトグラフィー用固相担体の製造方法。
〔２５〕分子Ａの固相担体への結合が、（１）分子Ａに導入された官能基を介して行われること、および（２）該官能基の導入が分子Ａ側の導入位置を特定することなく行われることを特徴とする上記〔２３〕記載のアフィニティークロマトグラフィー用固相担体の製造方法。
〔２６〕スペーサーの分子Ａへの導入が、分子Ａ側の導入位置を特定することなく導入された官能基を介して行われるものである上記〔２４〕記載のアフィニティークロマトグラフィー用固相担体の製造方法。
〔２７〕分子Ａ側の導入位置を特定することなく行われる分子Ａへの官能基の導入が、化学反応によるものであるかまたは酵素反応によるものである上記〔２５〕又は〔２６〕記載のアフィニティークロマトグラフィー用固相担体の製造方法。
〔２８〕分子Ａ側の導入位置を特定することなく行われる分子Ａへの官能基の導入が、酵素反応によるものである上記〔２７〕記載のアフィニティークロマトグラフィー用固相担体の製造方法。
〔２９〕酵素反応が、代謝酵素によって行われるものである、上記〔２８〕記載のアフィニティークロマトグラフィー用固相担体の製造方法。
〔３０〕少なくとも（１）分子Ｂを含むかまたは含まない試料を上記〔１５〕〜〔２２〕のいずれか１項に記載の分子Ａ固定化固相担体混合物に接触させる工程、および（２）分子Ａに特異的な相互作用を示したか、または示さなかった分子を同定し、分子Ｂを選別する工程を含む、分子Ａに特異的な相互作用を有する分子Ｂのスクリーニング方法。

図１は、本発明の概念図を模式的に図示したものである。従来法と比較してある。
図２は、本発明のＦＫ５０６結合アフィニティー樹脂（実施例２）を用いてｌｙｓａｔｅ中のＦＫ５０６に結合する蛋白質（ＦＫＢＰ１２）を検出した結果を示す、電気泳動写真である。
レーン１：マーカー
レーン２：結合位置が確定していて既にその有効性がわかっている標準のＦＫ５０６付アフィニティー樹脂（参考製造例３）
レーン３：位置を特定することなくＦＫ５０６を付したアフィニティー樹脂（実施例２）
レーン４：レーン２の実験の前に行った最終洗浄の混合液Ａ
レーン５：レーン３の実験の前に行った最終洗浄の混合液Ａ
レーン６：実施例１（１）で述べたｌｙｓａｔｅ
レーン７：レーン２の実験で樹脂との結合を終えた後のｌｙｓａｔｅ
レーン８：レーン３の実験で樹脂との結合を終えた後のｌｙｓａｔｅ
レーン９：マーカー（レーン１と同じ）
図３は、本発明のＦＫ５０６結合アフィニティー樹脂（実施例３）を用いてｌｙｓａｔｅ中のＦＫ５０６に結合する蛋白質（ＦＫＢＰ１２）を検出した結果を示す、電気泳動写真である。
レーン１：マーカー
レーン２：結合位置が確定していて既にその有効性がわかっている標準のＦＫ５０６付アフィニティー樹脂（参考製造例３）
レーン３：位置を特定することなくスペーサーを介さずにＦＫ５０６を直接樹脂に結合させて作成したＦＫ５０６付アフィニティー樹脂（実施例３）
発明の詳細な説明
本発明の概念図を図１に示す。図１はリガンド（分子Ａ：詳細は後述）を適当なスペーサーを介して固相担体に結合することによって分子Ａ固定化固相担体を得る方法を模式的に示したものである。従来法ならびに本発明法を示す。従来法であれば、分子Ａ側の生物活性に関与する結合部位が無傷で保有されている固相担体のみをあらかじめ構造活性相関を検討することによって製造するか、あるいは選別する必要があったが、本発明では、分子Ａ側の固相担体との結合部位を確認することなく、分子Ａ側の生物活性に関与する結合部位が損なわれている固相担体と、当該結合部位が無傷で保有されている固相担体とが混じった状態での使用が可能である。
本発明は、固相担体に固定化される分子（本明細書中、分子Ａとも定義し、便宜上「リガンド」とも称する）と当該分子に対して特異的な相互作用を有する分子（本明細書中、分子Ｂとも定義し、便宜上「ターゲット分子」とも称する）との相互作用を解析する技術、かかる解析をもとに分子Ｂを同定、選別するという技術を提供する。本明細書中、リガンドならびにターゲット分子という用語は、互いに特異的な分子間相互作用を有する組み合わせを意図するものであって、当該組み合わせのうち、片方をリガンドとして固相に固定化すれば他方がターゲット分子となり、すなわちどちらを固相に固定化するかによって、それらの呼称は変更され得る。分子Ａに特異的な相互作用を有する分子Ｂは１種類とは限らず、また同様に分子Ｂに特異的な相互作用を有する分子Ａも１種類とは限らない。本明細書では分子Ａならびに分子Ｂという用語は、互いに異なる物質であることを明確にすべく、便宜上、ＡあるいはＢとの符号を付したものである。ある特定の分子を指すものではなく特異的な相互作用を有する分子同士の各々を意味するものである。
「特異的な相互作用」とは、特定のリガンド（特定のターゲット分子）のみを特異的に認識して結合するような特性を発揮する作用であり、アゴニストあるいはアンタゴニストに対する特異的受容体、基質に対する酵素、そして例えばＦＫ５０６（リガンド）に対するＦＫ５０６結合蛋白質（ターゲット分子）や、ステロイドホルモンに対するステロイドホルモン受容体（例＝ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎとｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、抗がん剤ｔｒａｐｏｘｉｎに対するＨＤＡＣ等の関係が「特異的な相互作用」に該当する。
本発明において「特異相互作用を解析する」とは、分子Ａと分子Ｂとの間の特異相互作用の程度を、相互作用情報として得ることであって、例えばＫｄ、Ｋａ等の数値として得ることができる。本発明において「選別」とは、上記相互作用情報に基づき、分子Ａと特異的な相互作用を有するか否かを判定し、分子Ｂを同定することを意味する。
本発明において用いられる固相担体は、その上で分子Ａと分子Ｂの特異的な相互作用が生じるものであれば特に限定されず、当分野で通常使用されるものが利用でき、その後に実施する分子Ｂの同定、選別の工程の為に行われる方法に応じて適宜決定される。材質としては、例えば、樹脂（ポリスチレン、メタクリレート系樹脂、ポリアクリルアミド等）、ガラス、金属（金、銀、鉄、シリコン等）等が用いられる。これらの固相は、いかなる形状のものであってもよく、また上記した材質の種類や、その後に実施する分子Ｂとの相互作用の解析、分子Ｂの同定、選別の工程の為に行われる方法に応じて適宜決定される。例えば板状、ビーズ状、薄膜状、糸状、コイル状等が挙げられるが、樹脂からなるビーズであればカラムに充填することによりその後の操作を簡便にし、また金属の薄膜であれば表面プラズモン共鳴によるＢＩＡＣＯＲＥ等の担体として好適に使用できる。またガラスプレートを用いることも好適である。
本発明において使用する固相は、上述の如く、その材質や形状に特に制限はないが、当然のことながら、分子Ａが固定化されないような、あるいは分子Ａが固定化されるものの分子Ｂとの特異的な相互作用を発揮することができないような構造上の障害を有するものは、余分な工程を経る必要があって操作が煩雑になったり、あるいは使用に耐えなかったりする場合があるので、本発明を実施する上で好ましくない。
本発明の「分子Ａと該分子Ａに特異的な相互作用を有する分子Ｂとの相互作用を解析する方法」ならびに「分子Ａに特異的な相互作用を有する分子Ｂを選別する方法」では、分子Ａ側の結合位置を特定することなく固相担体に分子Ａを結合することによって得られる２種以上の分子Ａ固定化固相担体を含む分子Ａ固定化固相担体の混合物を用いることを通常は前提とする（１種のみの場合もありうる）。該２種以上の分子Ａ固定化固相担体において分子Ａは分子Ａ上のそれぞれ異なる位置で固相担体に固定化されているが、それらの位置はあらかじめ特定されているものではない。分子Ａの固相担体への結合は、直接的、あるいはスペーサーを介して間接的に行われる。直接的に結合させる場合には、分子Ａ固有の官能基を利用する場合と、分子Ａに新たに導入された官能基を利用する場合がある。当該新たな官能基の導入もまた、分子Ａ側の導入位置を特定することなく行われる。また、分子Ａへのスペーサーの導入も、分子Ａ側の導入位置を特定することなく行われる。各結合あるいは導入位置の分布は、分子Ａの、固相担体への結合あるいは分子Ａへのスペーサーや官能基の導入に使用する各試薬に対する反応性によって、決定される。当該結合あるいは導入位置は、１箇所であっても２箇所以上であっても構わないが、上述のように、各位置の分布が、各試薬に対する反応性および反応条件によって決定されるものであるため、分子Ａと用いる試薬の組み合わせおよび／または反応条件によっては分子Ａ側の生物活性に関与する結合部位を無傷で保有させることが不可能な場合もある。
例えば、分子Ｂを検出する手段としての固相担体、すなわち分子Ａ側の生物活性に関与する結合部位を無傷で保有している固相担体が混合物中に含まれない場合、例えば上述したように分子Ａ側の生物活性に関与する結合部位が損なわれているような固相担体のみで構成されている混合物の場合が考えられるので、そのような場合には、利用する試薬や反応を変更する等により新たに別の固相担体混合物を調製して用いる。本発明の分子Ａと分子Ｂとの相互作用を解析する方法や分子Ｂを選別する方法、分子Ｂのスクリーニング方法やアフィニティークロマトグラフィー用固相担体の製造方法においては、分子Ｂを検出する手段として用いる固相担体が混合物中に存在するか否かを予め確認する工程を含むことが好ましい。
固相担体との結合、スペーサーの導入、官能基の導入は、分子Ａ側の結合位置あるいは導入位置を特定することなく行われ、どの位置で各工程が行われているかを確認する必要はなく、結果として、分子Ａが、分子Ａ側の、分子Ｂとの結合を阻害しない位置（必要な場合には官能基および／またはスペーサーが導入されて）で固相担体に固定化された分子Ａ固定化固相担体のみが分子Ｂを捕捉し、単離・選別あるいはその分子Ａとの相互作用を解析することができればよい。図１に示すように、本発明においては、分子Ａの固相担体との（分子Ａ側の）結合位置、あるいは分子Ａへの官能基あるいはスペーサーの（分子Ａ側の）導入位置を特定しなくても、得られるいずれかの分子Ａ固定化固相担体が、分子Ａ側の生物活性に関与する結合部位を無傷で保有していることになるので、その部位と分子Ｂとの結合が保証され得る。すなわち、本発明では、種々の分子Ａ固定化固相担体の混合物（さらには原料や分解物を含んでいてもよい）中で、分子Ａの構造活性相関を問題とすることなく、分子Ｂ（ターゲット分子）との結合を阻害しない位置で固相担体に固定化された分子Ａ固定化固相担体と分子Ｂとの相互作用のみを検出できる。
尚、本明細書中、用語「分子Ａ側の結合位置」および「分子Ａ側の導入位置」は、分子Ａに結合、あるいは導入する他の要素に応じて区別して用いたが、分子Ａ側の反応に関与する位置を特定することなく双方（分子Ａと固相担体、分子Ａとスペーサー、分子Ａと官能基）を繋げるという点では同義である。
さらに、「分子Ａと該分子Ａに特異的な相互作用を有する分子Ｂとの相互作用を解析する方法」ならびに「分子Ａに特異的な相互作用を有する分子Ｂを選別する方法」に使用される上記分子Ａ固定化固相担体の混合物は、アフィニティークロマトグラフィー用の固相担体として有用である。したがって、本発明は、分子Ａ側の結合位置を特定することなく固相担体に分子Ａを結合することによって固定化し、２種以上の分子Ａ固定化固相担体からなる分子Ａ固定化固相担体混合物を得ることを含むアフィニティークロマトグラフィー用固相担体の製造方法であって、該２種以上の分子Ａ固定化固相担体において、分子Ａは分子Ａ上のそれぞれ異なる位置で固相担体に固定化されている、アフィニティークロマトグラフィー用固相担体の製造方法を提供する。かかる方法によって得られるアフィニティークロマトグラフィー用固相担体は、２種以上の分子Ａ固定化固相担体からなる分子Ａ固定化固相担体混合物でありながら、さらなる精製や分別を必要とすることなく、十分に分子Ｂとの親和性を発揮することができ、分子Ｂの選別や分子Ｂとの相互作用の解析に使用することができる。
得られる分子Ａ固定化固相担体の混合物には具体的には以下の態様が例示される。
１）分子Ａ固有の官能基を利用する場合
分子Ａ（リガンド）が固有に有する官能基を直接的に固相担体との結合に使用する場合であって、リガンド固有の官能基を利用し、この官能基を直接的に固定化反応に利用あるいは適当なスペーサーを介して固定化反応に利用することによって、リガンドのターゲット分子を探索する。
リガンドの官能基を直接的に固定化反応に付す場合には、リガンドと固相担体を固定化に好適な条件下で反応させる。
具体的にはリガンドを水性または有機性の溶媒あるいはそれらの混合溶媒に溶解し、得られたリガンド溶液と固相（固相についても予め水性または有機性の溶媒あるいはそれらの混合溶媒に懸濁しておくことが好ましい）とを混合することによって、あるいはリガンドと固相担体とのアミド結合や、シッフ塩基形成による結合、Ｃ−Ｃ結合、エステル結合、水素結合、疎水相互作用等の共有結合あるいは非共有結合に付すことによってリガンドを固相に固定化する。リガンドおよび固相を溶解または懸濁しておく水性または有機性の溶媒としては、同じものであっても異なるものであってもよく、例えば水、緩衝液等の水性溶媒、アルコール（メタノール、エタノール等）、ジメチルホルムアミド、ジクロルメタン、アセトニトリル等の有機性溶媒が挙げられる。これらの混合溶媒もまた好適に使用できる。固定化するリガンド上の官能基の種類等に応じてリガンドの固相への固定化に利用する反応が設定され、適宜公知の手法によりリガンドを固相に固定化する。
一連の反応や処理を行う際の温度は、設定した固定化反応に好適で且つリガンドが安定な温度であれば特に限定されないが、通常０℃〜１００℃、好ましくは室温〜７０℃で実施される。また、固相とリガンドとを混合する時間も、固相にリガンドが固定化されれば特に限定されず、設定した固定化反応や固定化を意図するリガンド、使用する固相の種類等に応じて適宜設定される。通常１時間から数日間、好ましくは２時間から一晩程度である。結合反応には、利用する固定化反応に応じて適宜設定される、一般に固相に対して過剰量のリガンドを用いるが、固相上、あるいはリガンドの全ての結合可能部位が反応に供せられる必要はなく、固相にリガンドが部分的に固定化されるものであっても、本願発明の目的を達成することができるので、必ずしも過剰量である必要はない。
アミド結合や、シッフ塩基、Ｃ−Ｃ結合、エステル結合、水素結合、疎水相互作用等のリガンドの固相担体への固定化に利用する反応は当分野では公知の技術であり、反応試薬や反応条件等は従来実施されている方法に準じて行うことができ、また必要に応じて適宜変更してもよい。
一方、リガンド固有の官能基を適当なスペーサーを介して固定化反応に利用する場合には、まずリガンド固有の官能基にスペーサーを導入する。当該スペーサーの導入も、分子Ａ側の導入位置を特定することなく行われ、通常、化合物にスペーサーを導入するのに実施される公知の方法が利用できる。本発明においてはその導入位置を特定する必要がなく混合物としての使用が可能なので、構造活性相関を考慮することなく、リガンドとスペーサーを、スペーサー導入に好適な条件下で反応させる。
具体的には、リガンドを水性または有機性の溶媒あるいはそれらの混合溶媒に溶解し、得られたリガンド溶液とスペーサー（スペーサーも予め水性または有機性の溶媒あるいはそれらの混合溶媒に溶解しておくことが好ましい）を混合し、固定化するリガンドの官能基に応じて当分野で公知の方法を用いてスペーサーとリガンドを結合させる。当該スペーサーは必要に応じて反応性を付与する為に誘導体化してもよい。例えば、官能基として水酸基を有するリガンドであれば、スペーサーとしてカルボン酸またはその誘導体を用い脱水剤の存在下で脱水反応を行うことによって、好適にスペーサーがリガンドに導入される。ここで用いる水性または有機性の溶媒としては、上記したものと同様なものが用いられる。
一連の反応や処理を行う際の温度は、反応が進行し、且つリガンドやスペーサーが安定な温度であれば特に限定されないが、通常０℃〜１００℃、好ましくは室温〜７０℃で実施される。また、反応時間も特に限定されず、実施する化学反応や使用するリガンド、スペーサーの種類等に応じて適宜設定される。通常１時間〜数日間、好ましくは２時間〜一晩である。結合反応には、一般にリガンドに対して過剰量のスペーサーを用いるが、リガンド上あるいはスペーサー上の全ての結合可能部位が反応に供せられる必要はなく、リガンドにスペーサーが部分的に導入されたものであっても、本願発明の目的を達成することができるので、必ずしも過剰量である必要はない。
「スペーサー」とは、リガンドの固相担体への固定化の際に導入されて固相担体とリガンドとの間に介在する基となる物質であって、ここで「スペーサーが介在する」とは、該スペーサーが固相内の官能基からリガンド内の官能基までの間に存在することを意味する。該スペーサーは、その一端を固相内の官能基と結合し、他端をリガンド内の官能基と結合する。当分野で通常、リガンドの固相への固定化の際に使用されているものが利用でき（スペーサーあるいはリンカーとも称される）、結果的に固相担体とリガンドとの間に介在する基として機能し得るものであれば新規に合成されるものであってもよい。該スペーサーとリガンドとの結合はアミド結合や、シッフ塩基、Ｃ−Ｃ結合、エステル結合、水素結合、疎水相互作用等の共有結合あるいは非共有結合である。
スペーサーを導入後、該スペーサーが導入されたリガンドを用いて、上記の「リガンドの官能基を直接的に固定化反応に付す場合」で実施した方法と同様にしてリガンドを分子Ａ側の結合位置を特定することなく固相担体に結合する。
２）リガンドに活用可能な官能基が無い場合
リガンドに化学反応的あるいは酵素反応的な官能基付加反応を行った後、固定化反応に利用あるいは適当なスペーサーを介して固定化反応（上記１）参照）に利用することによって、リガンドのターゲット分子を探索する。
当該官能基の付加もまた、分子Ａ側の導入位置を特定することなく実施されるものである。
化学的に官能基を付加する方法としては、ニトロ化、ハロゲン化およびそれに続く各種反応等が挙げられる。例えばニトロ化を行った後、還元反応を行うことによりアミノ基を付加することができ、さらに各種置換基（アミド、Ｎ−アルキル、スルフォンアミド等）へと変換できる。またハロゲン化を行った後、酸化的付加反応を行うことによりカルボキシル基、エステル基、アリール基等を付加することができる。
酵素反応的に官能基を付加する方法としては、例えば、酸化酵素、還元酵素、加水分解酵素等の代謝酵素、特に薬物代謝酵素（Ｓ−９Ｍｉｘ等）を利用する方法が挙げられる。用いる酵素の由来は特に限定されず、細菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ ｎｏｎａｓ属等）、放線菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属等）、カビ由来（Ａｓ ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属等）等の微生物由来、哺乳動物の細胞や組織由来であってもよいし、そのような代謝酵素を発現するように遺伝子組換え技術により調製された形質転換体由来のものであってもよい。大量に入手できるという利点から微生物由来あるいは形質転換体由来の酵素が好ましい。
例えば肝組織の細胞破砕液（ｃｅｌｌ ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅ）を９，０００×ｇで遠心して得られる上清（Ｓ−９画分：Ｓ−９Ｍｉｘとして商業的に入手可能）が用いられる。この酵素とリガンドを反応させることによってリガンドに各種官能基が導入されることが知られている。例えば芳香環あるいはアルキル鎖の水酸化による水酸基の導入、２重結合のエポキシ化によるエポキシ基の導入、Ｎ−アルキルアミノ基の脱アルキル化に伴うアミノ基の生成、酸化的脱アミノ化によるカルボニル基の生成、エステルあるいはアミド結合の加水分解によるカルボキシル基、アミノ基あるいは水酸基の生成等が知られている（新版薬物代謝、Ｇ．Ｇ．ギブソン等著、村田敏郎監訳、講談社ＩＳＢＮ ４−０６−１３９７７５−３）。
さらに官能基は固相担体との結合、あるいはスペーサーとの結合に先立って活性化されていてもよい。具体的には各種官能基（例えば水酸基、アミノ基、カルボキシル基等）を例えばフォスゲン等の反応性の高い試薬で活性化することができる。
分子Ａが固相担体に固定化されたか否かは、分子Ａ、あるいは分子Ａに予め結合・導入されたスペーサー、あるいは官能基に含まれるある特定の構造乃至置換基等に基づく呈色反応等を利用して確認することができる。例えばアミノ基を認識するニンヒドリン反応等が利用できる。
本発明において固相担体に固定化する分子Ａ（リガンド）は特に限定されず、公知の化合物であっても今後開発される新規な化合物であってもよい。また、低分子化合物であっても高分子化合物であってもかまわない。ここで低分子化合物とは分子量１０００未満程度の化合物であって、例えば医薬品として通常使用し得る有機化合物およびその誘導体や無機化合物が挙げられ、有機合成法等を駆使して製造される化合物やその誘導体、天然由来の化合物やその誘導体、プロモーター等の小さな核酸分子や各種の金属等であり、望ましくは医薬品として使用し得る有機化合物およびその誘導体、核酸分子をいう。また、高分子化合物としては分子量１０００以上程度の化合物であって、蛋白質、ポリ核酸類、多糖類、およびこれらを組み合わせたものなどが挙げられる。これらの低分子化合物あるいは高分子化合物は、公知のものであれば商業的に入手可能であるか、各報告文献に従って採取、製造、精製等の工程を経て得ることができる。これらは、天然由来であっても、また遺伝子工学的に調製されるものであってもよく、また半合成等によっても得ることができる。
本発明では、上記分子Ａを固定化した固相上で該分子Ａとの特異的相互作用に基づいて分子Ｂを選別する過程を要する。従って分子Ｂは、分子Ａと特異的に相互作用するものであれば特に限定されるものではなく、公知化合物である場合もあれば新規物質である場合も予想される。分子Ｂとしては低分子化合物であっても高分子化合物であってもかまわない。分子Ｂが低分子化合物の場合には低分子化合物である分子Ａとの低分子化合物と低分子化合物との特異的相互作用に基づき、あるいは高分子化合物である分子Ａとの高分子化合物と低分子化合物との特異的相互作用に基づき、分子Ｂが選別され得る。また分子Ｂが高分子化合物の場合には低分子化合物である分子Ａとの低分子化合物と高分子化合物との特異的相互作用に基づき、あるいは高分子化合物である分子Ａとの高分子化合物と高分子化合物との特異的相互作用に基づき、分子Ｂが選別され得る。好ましい分子Ａと分子Ｂの組み合わせは低分子化合物と高分子化合物、あるいは高分子化合物と高分子化合物という組み合わせである。
分子Ｂとの相互作用の解析、ならびに分子Ｂの選別は簡便には固相上で行う。分子Ｂとして予め候補物質が予測される場合には、候補物質を単独で上記固相に固定化された分子Ａと接触させ両者の相互作用を測定し、候補物質が分子Ｂであるか否か、すなわち分子Ａのターゲット分子であるか否かを判断すればよいが、通常、複数の物質（高分子化合物および／または低分子化合物）を含む試料を分子Ａと接触させ、複数の物質（高分子化合物および／または低分子化合物）の各々と分子Ａとの相互作用の有無ならびにその相互作用の程度を測定することにより分子Ｂであるか否かを判断し、選別する。ここで複数の物質を含む試料としては、全て公知化合物から構成されるものであっても、一部新規な化合物を含むものであっても、さらには全て新規な化合物から構成されるものであってもよい。しかしながら、リガンドのターゲット分子の探索、あるいは昨今のプロテオーム解析の進歩によれば、全てその構造が公知な化合物の混合物であることが望ましい。全て公知な化合物から構成される試料としては、大腸菌等によって遺伝子工学的に調製された精製蛋白質の混合物等であり、一部新規な化合物を含むものとしては、細胞や組織の抽出物（ｌｙｓａｔｅ）であり、また全て新規な化合物から構成されるものとしては、まだその機能や構造が知られていない新規な蛋白質や新しく合成された化合物等の混合物が挙げられる。試料が混合物の場合、特に公知化合物を含む場合には、任意にこれらの化合物の試料中の含有量を所望の値に設定しておくこともできる。リガンドのターゲット分子の探索という見地にたてば、選別すべき分子Ｂは、低分子化合物ならびに高分子化合物であるのが好ましく、ヒト等の動物体内でのターゲット分子の探索についていえば高分子化合物であることが好ましい。
また、あらかじめリガンドに対して生理活性を有する試料であることが特に好ましく、固定化を所望するリガンドに応じて、用いる試料は適宜変更され、最適なものが選択される。これら試料の選択は、本発明の分子Ａと分子Ｂとの相互作用を解析する方法や分子Ｂを選別する方法、分子Ｂのスクリーニング方法やアフィニティークロマトグラフィー用固相担体の製造方法を実施する前に行うことが好ましい。
本発明は、上記固相に固定化された分子Ａを用いて、当該分子Ａに特異的な相互作用を有する分子Ｂをスクリーニングする方法を提供する。該スクリーニング方法は以下の工程を少なくとも含む。
（１）分子Ｂを含むかまたは含まない試料を上述の分子Ａ固定化固相担体混合物に接触させる工程。
本工程において用いる試料は、上記同様、複数の物質を含むものである。その態様は特に限定されず、使用する固相担体や後の工程にどのような原理や手段、方法を用いるかによって適宜変更し得る。例えば分子Ａが固定化されたビーズ樹脂を充填したカラムを用いる場合には液状とするのが好ましい。分子Ｂを含まない試料であれば、工程（２）で分子Ａに特異的な相互作用を示さなかった分子（複数種存在する場合あり）の同定ならびに解析を行う。分子Ｂを含む試料であれば、工程（２）で分子Ａに特異的な相互作用を示した分子Ｂ（複数種存在する場合あり）を同定、解析する。試料と固相担体とを接触させる方法は、試料内の分子Ｂが固相担体に固定化された分子Ａと結合することができれば特に限定されず、使用する固相担体や後の工程の同定方法あるいは解析方法にどのような原理や手段、方法を用いるかによって適宜変更し得る。例えば分子Ａが固定化されたビーズ樹脂を充填したカラムを用いる場合には、液状にした試料をカラムに添加しカラム内を通すことにより簡便に実施される。
（２）分子Ａに特異的な相互作用を示したか、または示さなかった分子を同定し、分子Ｂを選別する工程を含む、分子Ａに特異的な相互作用を有する分子Ｂのスクリーニング方法。
かかる工程は、使用する固相担体や固定化した分子Ａの種類等によって適宜変更し得るが、通常当分野で実施されている低分子化合物あるいは高分子化合物を同定する為の各種方法により行う。また、今後開発されるであろう方法によっても実施可能であろう。例えば分子Ａ固定化固相担体として分子Ａ固定化ビーズ樹脂を充填してなるカラムを用いた場合、続く試料の添加により、分子Ａに分子Ｂを結合させる。結合した分子Ｂを緩衝液の極性を変える、あるいは過剰の分子Ａをさらに加える等の処理によって分子Ａから解離させ、その後同定したり、あるいは固相上の分子Ａと結合した状態でそのまま界面活性剤等によって抽出して同定したりすることもできる。同定方法としては具体的には電気泳動法、免疫学的反応を用いたイムノブロッティングや免疫沈降法、クロマトグラフィー、マススペクトラム、アミノ酸シーケンス、ＮＭＲ（低分子のときに特に）等の公知の手法により、またこれらの方法を組み合わせて実施する。分子Ａに結合しない分子を同定する工程も上記分子Ａに結合する分子を同定する方法に準じて行うことができるが、カラムの素通り画分に含まれる分子を同定の対象とするので、同定工程に入る前に予め濃縮や粗精製等の処理を行うことが好ましい。得られたデータならびに既存の報告をもとに各分子を同定し、分子Ａのターゲット分子であるか否かを判断する。
また、本工程は自動化されていてもよい。例えば２次元電気泳動で得られた種々の分子のデータを直接読み取り、既存のデータベースに基づいて分子の同定を行うことも可能である。
かかる結合が、特異的なものであるか否かは拮抗試験を行うことによって確認できる。具体的には以下の方法が挙げられる。まずターゲット分子であると判断された分子を含む試料をフリーの分子Ａと混合し、十分に反応させる。ついで得られた混合液を分子Ａ固定化固相担体混合物に接触させる。固相担体にトラップされた分子の種類を、フリーの分子Ａと混合しなかった場合（対照）と比較する。さきにターゲット分子であると判断された分子が事実ターゲット分子であるなら、対照で認められた分子Ｂのバンドが消失、あるいは減弱しているはずである。

以下、製造例ならびに実施例、実験例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例、実験例によりなんら限定されるものではない。尚、各構造式中の略語は以下の通りである。
Ｍｅ：メチル基
ＴＢＤＰＳ：ｔ−ブチルジフェニルシリル基
ＴＢＳ：ｔ−ブチルジメチルシリル基
実施例１：ＦＫ−５０６へのスペーサー導入（位置を特定しないで導入する）
１７−アリル−１，１４−ジ−ヒドロキシ−１２−｛２−［４−（７−カルボキシ−ヘプタノイル−オキシ）−３−メトキシ−シクロヘキシル］−１−メチル−ビニル｝−２３，２５−ジメトキシ−１３，１９，２１，２７−テトラメチル−１１，２８−ジオキサ−４−アザ−トリシクロ［２２．３．１．０^４，９］オクタコス−１８−エン−２，３，１０，１６−テトラオン（混合物Ａ）の合成

１７−アリル−１，１４−ジ−ヒドロキシ−１２−［２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシ−シクロヘキシル）−１−メチル−ビニル］−２３，２５−ジメトキシ−１３，１９，２１，２７−テトラメチル−１１，２８−ジオキサ−４−アザ−トリシクロ［２２．３．１．０^４，９］オクタコス−１８−エン−２，３，１０，１６−テトラオン（ＦＫ−５０６、１、３．３ｍｇ、４．１０μｍｏｌ）をベンゼンで２回共沸した後、ジクロロメタン（３９μｌ）に溶解し、Ｏ−モノ（ｔｅｒｔ−ブチル−ジフェニル−シラニル）オクタン二酸／ジクロロメタン溶液（１００ｍｇ／ｍｌ）を１６．２μｌ（４．０９μｍｏｌ）加えた。これに１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ／ＨＣｌ，０．９４ｍｇ，４．９０μｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン／ジクロロメタン溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を２３μｌ（１．８８μｍｏｌ）、室温で加えて溶解した後、１．５時間静置した。これにジクロロメタン（１５０μｌ）及び飽和炭酸ナトリウム水（１５０μｌ）を加えて抽出した。集めた有機相に窒素気流を吹きかけ濃縮した。得られたシラップにアセトニトリル（２８μｌ）を加えて溶解した後、４６−４８％フッ化水素水（６．５μｌ）を室温で加え、１．５時間静置した。これに酢酸エチル（１００μｌ）及び飽和炭酸ナトリウム水（１００μｌ）を加えて抽出し、有機相に窒素気流を吹きかけて濃縮し、混合物Ａのシラップを得た。混合物Ａは精製等を行うことなくこのまま次のステップに使用した。混合物Ａ中に、ＦＫＢＰ１２との結合を阻害しない位置のみにスペーサーが導入された化合物、例えば参考製造例２で示す１７−アリル−１，１４−ジ−ヒドロキシ−１２−｛２−［４−（７−カルボキシ−ヘプタノイル−オキシ）−３−メトキシ−シクロヘキシル］−１−メチル−ビニル｝−２３，２５−ジメトキシ−１３，１９，２１，２７−テトラメチル−１１，２８−ジオキサ−４−アザ−トリシクロ［２２．３．１．０^４，９］オクタコス−１８−エン−２，３，１０，１６−テトラオンが含まれているか、またはＦＫＢＰ１２との結合に寄与する位置にスペーサーが導入されたＦＫ５０６、あるいは複数のスペーサーが導入されたＦＫ５０６が含まれるか等の構造情報は不明のまま使用した。
実施例２：スペーサー付ＦＫ−５０６の混合物のトヨパール樹脂への固定化
実施例１で得られたシラップをベンゼンで遠心減圧濃縮した後、塩化メチレン／Ｎ−メチル−２−ピロリドン（４／１）の混合溶媒（０．３ｍｌ）に溶解し、ＷＳＣ（１．４４ｍｇ、７．５μｍｏｌ）及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１．０１ｍｇ、７．５μｍｏｌ）を加えた。この溶液をトヨパール樹脂（ＴＳＫｇｅｌ ＡＦ−ａｍｉｎｏ；１００μｌ中に０．０１ｍｍｏｌのアミンが存在）１０μｌに加えて終夜室温で振とうした。反応終了後、樹脂を塩化メチレン／Ｎ−メチル−２−ピロリドン（４／１）の混合溶媒、及びＤＭＦで十分に洗浄した後、ニンヒドリンテストにより縮合収率を測定した（約２９％）。得られた樹脂に無水酢酸／ＤＭＦ（１／４）の混合溶液（０．３ｍｌ）を加えて室温で３０分間振とうした。反応終了後、樹脂を塩化メチレン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及び２０％エタノール水で十分に洗浄し、後の実験で使用するアフィニティー樹脂とした。
参考製造例１：１７−アリル−１４−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ）−１−ヒドロキシ−１２−｛２−［４−（７−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ−カルボニル）ヘプタノイル−オキシ）−３−メトキシ−シクロヘキシル］−１−メチル−ビニル｝−２３，２５−ジメトキシ−１３，１９，２１，２７−テトラメチル−１１，２８−ジオキサ−４−アザ−トリシクロ［２２．３．１．０^４，９］オクタコス−１８−エン−２，３，１０，１６−テトラオンの合成

１７−アリル−１４−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ）−１−ヒドロキシ−１２−［２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシ−シクロヘキシル）−１−メチル−ビニル］−２３，２５−ジメトキシ−１３，１９，２１，２７−テトラメチル−１１，２８−ジオキサ−４−アザ−トリシクロ［２２．３．１．０^４，９］オクタコス−１８−エン−２，３，１０，１６−テトラオン（１３８ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ）、Ｏ−モノ（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニル）オクタン二酸（８６．７ｍｇ，０．２１８ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ；１６．５ｍｇ，０．０９８ｍｍｏｌ）、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ／ＨＣｌ；６９．１ｍｇ，０．２６１ｍｍｏｌ）および塩化メチレン（ＣＨ_２Ｃｌ_２；１ｍｌ）の混合物を室温で１．５時間撹拌した。反応物を酢酸エチル−水混合液に注ぎ、抽出した。得られた有機相を水、食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）で乾燥した。ＭｇＳＯ_４を濾別後、減圧下濃縮した。こうして得られた残渣をシリカゲルカラムで精製し（２０％ＡｃＯＥｔ（ｎ−ヘキサン中）で溶出）、目的とする１７−アリル−１４−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ）−１−ヒドロキシ−１２−｛２−［４−（７−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ−カルボニル）ヘプタノイル−オキシ）−３−メトキシ−シクロヘキシル］−１−メチル−ビニル｝−２３，２５−ジメトキシ−１３，１９，２１，２７−テトラメチル−１１，２８−ジオキサ−４−アザ−トリシクロ［２２．３．１．０^４，９］オクタコス−１８−エン−２，３，１０，１６−テトラオン（４４ｍｇ，２４．６％）を得た。
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ：−０．１−０．１（１２Ｈ，ｍ），０．７−２．６（４７Ｈ，ｍ），０．８５ ａｎｄ ０．８６（１８Ｈ，ｓ），１．５０（３Ｈ，ｓ），１．６３（３Ｈ，ｓ），２．７５（１Ｈ，ｍ），３．３１（３Ｈ，ｓ），３．３５（３Ｈ，ｓ），３．３９（３Ｈ，ｓ），４．０５（１Ｈ，ｍ），３．０−４．４（６Ｈ），４．５−５．８（９Ｈ，ｍ）．
参考製造例２：１７−アリル−１，１４−ジ−ヒドロキシ−１２−｛２−［４−（７−カルボキシ−ヘプタノイル−オキシ）−３−メトキシ−シクロヘキシル］−１−メチル−ビニル｝−２３，２５−ジメトキシ−１３，１９，２１，２７−テトラメチル−１１，２８−ジオキサ−４−アザ−トリシクロ［２２．３．１．０^４，９］オクタコス−１８−エン−２，３，１０，１６−テトラオンの合成

参考製造例１で調製した１７−アリル−１４−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ）−１−ヒドロキシ−１２−｛２−［４−（７−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ−カルボニル）ヘプタノイル−オキシ）−３−メトキシ−シクロヘキシル］−１−メチル−ビニル｝−２３，２５−ジメトキシ−１３，１９，２１，２７−テトラメチル−１１，２８−ジオキサ−４−アザ−トリシクロ［２２．３．１．０^４，９］オクタコス−１８−エン−２，３，１０，１６−テトラオン（４４ｍｇ，０．０３７ｍｍｏｌ）とアセトニトリル（０．８８ｍｌ）の混合物に４６−４８％のフッ化水素（ＨＦ）水（０．１２ｍｌ）を静かに加え室温にて終夜撹拌した。反応物を酢酸エチル−水混合液に注ぎ、抽出した。得られた有機相を水、食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）で乾燥した。ＭｇＳＯ_４を濾別後、減圧下濃縮した。こうして得られた残渣をシリカゲルカラムで精製し（５％メタノール（クロロホルム中））、目的とする１７−アリル−１，１４−ジ−ヒドロキシ−１２−｛２−［４−（７−カルボキシ−ヘプタノイル−オキシ）−３−メトキシ−シクロヘキシル］−１−メチル−ビニル｝−２３，２５−ジメトキシ−１３，１９，２１，２７−テトラメチル−１１，２８−ジオキサ−４−アザ−トリシクロ［２２．３．１．０^４，９］オクタコス−１８−エン−２，３，１０，１６−テトラオン（１４．２ｍｇ，４０％）。
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ：０．７−２．６（４７Ｈ，ｍ），１．５０（３Ｈ，ｓ），１．６３（３Ｈ，ｓ），２．７５（１Ｈ，ｍ），３．３１（３Ｈ，ｓ），３．３５（３Ｈ，ｓ），３．３９（３Ｈ，ｓ），４．０５（１Ｈ，ｍ），３．０−４．４（６Ｈ），４．５−５．８（１１Ｈ，ｍ）．
ＭＳ（ｍ／ｚ）：９６０（Ｍ＋）
参考製造例３：ＦＫ５０６付ＴＯＹＯパール樹脂（ＴＳＫｇｅｌ ＡＦ−ａｍｉｎｏ）の合成

参考製造例２で調製した１７−アリル−１，１４−ジ−ヒドロキシ−１２−｛２−［４−（７−カルボキシ−ヘプタノイル−オキシ）−３−メトキシ−シクロヘキシル］−１−メチル−ビニル｝−２３，２５−ジメトキシ−１３，１９，２１，２７−テトラメチル−１１，２８−ジオキサ−４−アザ−トリシクロ［２２．３．１．０^４，９］オクタコス−１８−エン−２，３，１０，１６−テトラオン（３８．４ｍｇ，０．０４ｍｍｏｌ）、ＴＯＹＯパール樹脂（ＴＳＫｇｅｌ ＡＦ−ａｍｉｎｏ，１００μｌ，遊離アミノ基（ａｖａｉｌａｂｌｅ ａｍｉｎｏ ｇｒｏｕｐ）は０．０１ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ／ＨＣｌ（９．２ｍｇ，０．０４８ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ；６．５ｍｇ，０．０４８ｍｍｏｌ）およびＤＭＦ（１ｍｌ）の混合物を室温で６時間撹拌した。反応の終点はニンヒドリン反応で残存アミノ基が肉眼で観測できなくなることで確認した。この時の反応率を換算すると約８２％であった。反応終了確認後、ＤＭＦで樹脂を５回洗浄した。ここに無水酢酸（１００μｌ）およびＤＭＦ（４００μｌ）を加え１時間室温で撹拌した。その後ＤＭＦで十分洗浄し、得られたＦＫ５０６付ＴＯＹＯパール樹脂は後述する結合実験において対照用アフィニティー樹脂として用いた。
実施例３：ＦＫ５０６のトヨパール樹脂への直接的な固定化
ＦＫ−５０６（３．３ｍｇ、４．１μｍｏｌ）をベンゼンで遠心減圧濃縮した後、ＤＭＦ（０．６ｍｌ）に溶解し、ＷＳＣ（１．００ｍｇ、５．２μｍｏｌ）及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（０．７ｍｇ、５．２μｍｏｌ）を加えた。この溶液をトヨパール樹脂（ＴＳＫｇｅｌ ＡＦ−ａｍｉｎｏ；１００μｌ中に０．０１ｍｍｏｌのアミンが存在）１０μｌに加えて終夜室温で振とうした。反応終了後、樹脂をＤＭＦで十分に洗浄した。得られた樹脂に無水酢酸／ＤＭＦ（１／４）の混合溶液（０．３ｍｌ）を加えて室温で３０分間振とうした。反応終了後、樹脂をＤＭＦ及び２０％エタノール水で十分に洗浄し、ＦＫ５０６を結合したアフィニティー樹脂を得た。
実施例４：結合実験１
（１）ｌｙｓａｔｅの調製
ラットの脳（２．２ｇ）を混合液１（０．２５Ｍシュクロース，２５ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ７．４），２２ｍｌ）に混ぜ、ホモジネートを作成後、９５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。遠心分離上清を取り、５００００ｒｐｍでさらに３０分間遠心分離した。こうして得られた上清をｌｙｓａｔｅとして使用した。なお、実験はすべて４℃あるいは氷上で行った。
（２）結合実験
実施例２で作成したＦＫ５０６結合アフィニティー樹脂、ならびに参考製造例３で作成した既にその有効性が分っている従来のＦＫ５０６結合アフィニティー樹脂を用いて以下の手順でｌｙｓａｔｅとの結合実験を行った。なお、ｌｙｓａｔｅは混合液１で１／２に希釈して使用した。ＦＫ５０６を結合した各種アフィニティー樹脂をそれぞれ１０μｌずつ使用した。
ＦＫ５０６結合アフィニティー樹脂とｌｙｓａｔｅ（１ｍｌ）を４℃で終夜、静かに振とうした。その後、上清を除き、残ったＦＫ５０６結合アフィニティー樹脂を混合液１で４回十分に洗浄してＦＫ５０６結合アフィニティー樹脂表面を十分に洗浄した。
こうして得られたＦＫ５０６結合アフィニティー樹脂に２０μｌのＳＤＳ用泳動バッファー（ｎａｋａｌａｉ ｃａｔ．ＮＯ＝３０５６６−２２、電気泳動用ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ２−ＭＥ（２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）（２ｘ）ＳＤＳ ＰＡＧＥ用）を加え、２５℃で１０分間加熱した。こうして得られたサンプル液を市販のＳＤＳゲル（Ｂｉｏ Ｒａｄ ｒｅａｄｙＧｅｌ Ｊ，１５％ＳＤＳ，ｃａｔ．ＮＯ＝１６１−Ｊ３４１）で分離し、そのＳＤＳゲルを解析した。比較として、参考製造例３で示したＦＫＢＰ１２との結合を妨げないことが知られている位置にスペーサーを選択的に結合させたＦＫ５０６を保持するアフィニティー樹脂を使用した（図２）。参考製造例３で示したアフィニティー樹脂はＦＫＢＰ１２と効率的に結合することを確認している（特願２００２−２２２２２６）。
ＦＫＢＰ１２との結合について着目した結果を図２に示す。
図２からもわかるように、実施例２でＦＫ５０６上の結合位置を特定することなく作成した本発明のＦＫ５０６結合アフィニティー樹脂（レーン３）は、参考製造例３で作成した標準的なアフィニティー樹脂（あらかじめＦＫＢＰ１２との結合を妨げないことが知られている位置にスペーサーを結合させてある）同様ＦＫＢＰ１２との結合が確認された。ＦＫ５０６と結合する他の蛋白質との結合についても、実施例２で作成した本発明のＦＫ５０６結合アフィニティー樹脂と、参考製造例３で作成した標準的なアフィニティー樹脂とでは酷似した結果が得られた。
これらの結果より、本発明の方法が効果的で、有用であることが示された。
実施例５：結合実験２
実施例３で作成したＦＫ５０６結合アフィニティー樹脂、ならびに参考製造例３で作成した既にその有効性が分っている従来のＦＫ５０６結合アフィニティー樹脂を用いて実施例４で行ったのと同様にして結合実験を行った。結果を図３に示す。
図３からもわかるように、実施例３で結合位置を特定することなくＦＫ５０６を固相に結合させて作成した本発明のＦＫ５０６結合アフィニティー樹脂は、参考製造例３で作成した標準的なアフィニティー樹脂と同様のＦＫＢＰ１２との結合が確認された。ＦＫ５０６と結合する他の蛋白質との結合についても、実施例３で作成した本発明のＦＫ５０６結合アフィニティー樹脂と、参考製造例３で作成した標準的なアフィニティー樹脂とでは酷似した結果が得られた。
これらの結果より、本発明の方法が効果的で、有用であることが示された。
実施例６：ＦＫ５０６固定化固相担体（官能基の活性化処理）
１７−アリル−１，１４−ジ−ヒドロキシ−１２−［２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシ−シクロヘキシル）−１−メチル−ビニル］−２３，２５−ジメトキシ−１３，１９，２１，２７−テトラメチル−１１，２８−ジオキサ−４−アザ−トリシクロ［２２．３．１．０^４，９］オクタコス−１８−エン−２，３，１０，１６−テトラオン（ＦＫ５０６；８．０４ｍｇ，０．０１ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（ＣＨ_３ＣＮ；１００μｌ）に溶解し、室温にてフォスゲン（ＣＯＣｌ_２）−トルエン（Ｔｏｌｕｅｎｅ）溶液（１．２４ｍｍｏｌ／ｍｌ；８μｌ、０．０１ｍｍｏｌ）を加え、１．５時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮した後、ＴＯＹＯパール樹脂（ＴＳＫｇｅｌ ＡＦ−ａｍｉｎｏ，１００μｌ，遊離アミノ基（ａｖａｉｌａｂｌｅ ａｍｉｎｏ ｇｒｏｕｐ）は０．０１ｍｍｏｌ；東ソー株式会社製）およびアセトニトリル（ＣＨ_３ＣＮ；５００μｌ）を加え、室温にて１．５時間撹拌した。反応終了後、樹脂をＤＭＦで２回、水で２回洗浄し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１ｍｌ）を加えて、１分間撹拌した。樹脂を水で２回、ＤＭＦで２回洗浄した後、無水酢酸（１００μｌ）およびＤＭＦ（４００μｌ）を加え５分間室温で撹拌した。その後ＤＭＦで３回、２０％エタノール水で２回洗浄し、得られたＦＫ５０６付ＴＯＹＯパール樹脂は後述する結合実験に用いた。
実施例７：結合実験３
（１）ｌｙｓａｔｅの調製
ラット脳（２．０ｇ）をバッファーＡ（０．５％Ｔｗｅｅｎ２０と３００μＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌｄｉｔｈｉｏｃａｒｂａｍａｔｅ ｔｒｉｈｙｄｒａｔｅを含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，２０ｍｌ）に混ぜ、ホモジネートを作成後、超音波破砕法により、１０分間処理した。９０００ｒｐｍにて１０分遠心分離した。遠心分離上清を取り、５００００ｒｐｍでさらに３０分間遠心分離した。こうして得られた上清をｌｙｓａｔｅとして使用した。なお、実験はすべて４℃あるいは氷上にて行った。
（２）実施例６で調製したＦＫ５０６を結合したアフィニティー樹脂（１０μｌ）をバッファーＡにて充分洗浄した後、上記（１）で調製したラット脳ｌｙｓａｔｅ（１ｍｌ）と混合し、４℃で約０．５時間、静かに振とうした。遠心分離操作を行い、上澄み液を除去した。得られたＦＫ５０６結合樹脂をバッファーＡにて充分洗浄し、２５μｌのＳＤＳ用ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（ｎａｋａｌａｉ ｃａｔ．ＮＯ＝３０５６６−２２、電気泳動用ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ２−ＭＥ（２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）（２ｘ）ＳＤＳ ＰＡＧＥ用）を加え、２５℃で１０分間撹拌した。こうして得られたサンプル液を市販のＳＤＳゲル（ＢｉｏＲａｄ ＲｅａｄｙＧｅｌ Ｊ，１５％ＳＤＳ，ｃａｔ．ＮＯ＝１６１−Ｊ３４１）で分離した結果、樹脂上に特異的に結合すると考えられているＦＫＢＰ１２のバンドが観察された。
実施例８：官能基の導入（Ｓ−９Ｍｉｘの利用）
Ｓ−９Ｍｉｘ；エームス試験用凍結Ｓ−９Ｍｉｘ（キッコーマン株式会社）を使用した。
［Ｓ−９Ｍｉｘを用いた代謝１］

実験操作；Ｓ−９Ｍｉｘ２０ｍｌを５０ｍｌファルコンチューブに加え、化合物Ａ（１．５ｍｇ、５μＭ）をメタノール７５μｌに溶かしＳ−９Ｍｉｘ中に加えた。恒温槽にて３７℃、２１時間攪拌した。反応液に酢酸エチル３ｍｌを加え、激しく攪拌後、６，０００Ｇにて１５分遠心し、有機相を分離した。酢酸エチルの抽出操作を３回行った。得られた酢酸エチル相を飽和食塩水にて洗浄し、有機相を別のファルコンチューブ（１５ｍｌ容器）に移し、窒素ガスを噴きかけ乾燥した。
［樹脂上への固定化］
Ｓ−９ｍｉｘを用いて得られた代謝物（Ａ代謝混合物（Ｂ））をＣＨ_２Ｃｌ_２３００μｌおよびＤＭＦ３０μｌの混合溶媒に溶かし、０．５ｍｌエッペンチューブに加えた。無水こはく酸（０．９８ｍｇ，９．８×１０^−３ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（Ｅｔ_３Ｎ；０．９８ｍｇ，９．８×１０^−３ｍｍｏｌ）、触媒量のＤＭＡＰを加え室温にて３．５時間攪拌した。１Ｎ−ＨＣｌ（５００μｌ）を加え、酢酸エチル１ｍｌ×３にて抽出した。得られた酢酸エチル相を５００μｌ飽和食塩水にて洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した。酢酸エチル相を１５ｍｌコニカルチューブに移し、窒素ガスを噴きかけ乾燥した。ＴＯＹＯパール（ＡＦ−Ａｍｉｎｏ−６５０Ｍ）（８０μｌ，８μｍｏｌ）に先ほど得られた化合物をＣＨ_２Ｃｌ_２（１ｍｌ）に溶かし加えた。ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリピロリジノホスホニウム（ＰｙＢＯＰ；５ｍｇ、９．６μｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（２．５μｌ，１９．２μｍｏｌ）を加え、１７時間室温にて攪拌した。
ＤＭＦで５回、ＣＨ_２Ｃｌ_２で５回それぞれ洗浄後、２０％無水酢酸ＣＨ_２Ｃｌ_２溶液１ｍｌを加え３０分間攪拌し、樹脂上に残っているアミノ基をアセチルキャッピングした。再びＤＭＦで５回、ＣＨ_２Ｃｌ_２で５回洗浄後、２０％アルコール溶液で５回さらに洗浄して、目的物の樹脂（Ｃ）を得た。
［Ｓ−９Ｍｉｘを用いた代謝２］

実験操作；Ｓ−９Ｍｉｘ１０ｍｌを５０ｍｌファルコンチューブに加え、化合物Ｄ（３．０ｍｇ）をメタノール７５μｌおよび水７５μｌに溶かしＳ−９Ｍｉｘ中に加えた。恒温槽にて３７℃、終夜攪拌した。反応液に酢酸エチル３ｍｌを加え、有機相を分離し、さらに抽出操作を行った。酢酸エチルによる抽出操作は３回行った。得られた酢酸エチル相を飽和食塩水にて洗浄し、有機相を別のファルコンチューブ（１５ｍｌ容器）に移し、窒素ガスを噴きかけ乾燥した。これに、アセトニトリル（５００μｌ）を加え、さらに別に調製したフォスゲンのトルエン溶液（１．２４ｍｍｏｌ）を５３μｌ加えた。この混合物を室温にて約３時間攪拌し、数分間減圧濃縮し、未反応フォスゲンを除いた後、ここにＴＯＹＯパール（ＡＦ−Ａｍｉｎｏ−６５０Ｍ）（６５μｌ，６．５μｍｏｌ）を加えた。この混合物を数時間攪拌し、アセトニトリル、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液、水で十分に洗浄して、目的物の樹脂（Ｅ）を得た。

［結合実験］
（１）ｌｙｓａｔｅの調製
大腸菌株ＤＨ５αを用い前培養を行い、ＳＢ培地で本培養を開始し、３７℃、１３０ｒｐｍで一晩培養した。培養終了後、集菌し、バッファーＡを１０ｍｌ加え、超音波でホモジネート処理をし、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌｙｓａｔｅ（１．５ｍｇ／ｍｌ）を得た。
Ｅ．ｃｏｌｉ ｌｙｓａｔｅ（１．５ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌにＣＯＸ１（ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ １；ｏｖｉｎｅ，ｃａｙｍａｎ ｃａｔ ｎｏ．６０１００）１０μｇを加え調製した。
（２）結合実験
上記で得られたＳ−９Ｍｉｘ代謝物を固定化したアフィニティー樹脂を用いて、以下の手順でｌｙｓａｔｅとの結合実験を行った。ｌｙｓａｔｅは上記調製したｌｙｓａｔｅ １ｍｌ（ＣＯＸ１含有）を使用した。Ｓ−９Ｍｉｘ代謝物固定化樹脂（Ｃ）は１０μｌ（１μｍｏｌ相当分）を用いた。
Ｓ−９Ｍｉｘ代謝物固定化樹脂（Ｃ）とｌｙｓａｔｅ １ｍｌを４℃で終夜、静かに振とうした。樹脂を１２，０００Ｇにて遠心分離により沈殿させ、上清を取り除いた。樹脂をバッファーＡにて５回洗浄した。こうして得られたＳ−９Ｍｉｘ代謝物固定化樹脂（Ｃ）に２０μｌのＳＤＳ用ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（ｎａｋａｌａｉ ｃａｔ．ＮＯ；３０５６６−２２，電気泳動用ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ２−ＭＥ（２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）（２ｘ）ＳＤＳ ＰＡＧＥ用）を加え、２５℃で１０分間攪拌した。こうして得られたサンプル液および標品としてのＣＯＸ１（ｃａｙｍａｎ ｃａｔ ｎｏ．６０１００）を市販のＳＤＳゲル（ＰＡＧ Ｍｉｎｉ“ＤＡＩＩＣＨＩ”１０（１３Ｗ），ｃａｔ．Ｎｏ．３０１６１）で分離し、そのＳＤＳゲルを解析した。結果、サンプル液中にＣＯＸ１に相当するバンドが検出され、Ｓ−９Ｍｉｘ代謝物固定化樹脂にＣＯＸ１が結合していることが確認された。かくして目的のＣＯＸ１を混合ｌｙｓａｔｅから抽出することができた。

本発明の方法によれば、従来必須とされてきた構造活性相関に関する事前の検討を必要とすることなく、リガンドを固相担体に固定化することが可能となり、多大な労力や経費を低減化することができる。従って、従来に比し短時間で多数のリガンドのターゲット分子を得ることが可能となる。
本出願は、日本で出願された特願２００２−３１９０９９を基礎としておりそれらの内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (30)

1. 少なくとも以下の工程を含む、分子Ａと該分子Ａに特異的な相互作用を有する分子Ｂとの相互作用を解析する方法：
   （１）分子Ａ側の結合位置を特定することなく固相担体に分子Ａを結合することによって分子Ａを固定化した固相担体の混合物を得る工程、
   （２）分子Ｂを含むかまたは含まない試料を上記（１）で得られた固相担体の混合物に接触させる工程、および
   （３）分子Ａに特異的な相互作用を示したか、または示さなかった分子を同定し、分子Ａと分子Ｂとの相互作用を解析する工程。
2. 分子Ａを固定化した固相担体の混合物を得る工程において、分子Ａと固相担体との間に分子Ａ側の導入位置を特定することなくスペーサーを導入することを特徴とする請求の範囲１記載の方法。
3. 分子Ａを固定化した固相担体の混合物を得る工程において、（１）分子Ａに官能基が導入されること、および（２）該官能基の導入が分子Ａ側の導入位置を特定することなく行われることを特徴とする請求の範囲１記載の方法。
4. スペーサーの分子Ａへの導入が、分子Ａ側の導入位置を特定することなく導入された官能基を介して行われるものである請求の範囲２記載の方法。
5. 分子Ａ側の導入位置を特定することなく行われる分子Ａへの官能基の導入が、化学反応によるものであるかまたは酵素反応によるものである請求の範囲３又は４記載の方法。
6. 分子Ａ側の導入位置を特定することなく行われる分子Ａへの官能基の導入が、酵素反応によるものである請求の範囲５記載の方法。
7. 酵素反応が、代謝酵素により行われることを特徴とする、請求の範囲６記載の方法。
8. 少なくとも以下の工程を含む、分子Ａに特異的な相互作用を有する分子Ｂを選別する方法：
   （１）分子Ａ側の結合位置を特定することなく固相担体に分子Ａを結合することによって分子Ａを固定化した固相担体の混合物を得る工程、
   （２）分子Ｂを含むかまたは含まない試料を上記（１）で得られた固相担体の混合物に接触させる工程、および
   （３）分子Ａに特異的な相互作用を示したか、または示さなかった分子を同定し、分子Ｂを選別する工程。
9. 分子Ａを固定化した固相担体の混合物を得る工程において、分子Ａと固相担体との間に分子Ａ側の導入位置を特定することなくスペーサーを導入することを特徴とする請求の範囲８記載の方法。
10. 分子Ａを固定化した固相担体の混合物を得る工程において、（１）分子Ａに官能基が導入されること、および（２）該官能基の導入が分子Ａ側の導入位置を特定することなく行われることを特徴とする請求の範囲８記載の方法。
11. スペーサーの分子Ａへの導入が、分子Ａ側の導入位置を特定することなく導入された官能基を介して行われるものである請求の範囲９記載の方法。
12. 分子Ａ側の導入位置を特定することなく行われる分子Ａへの官能基の導入が、化学反応によるものであるかまたは酵素反応によるものである請求の範囲１０又は１１記載の方法。
13. 分子Ａ側の導入位置を特定することなく行われる分子Ａへの官能基の導入が、酵素反応によるものである請求の範囲１２記載の方法。
14. 酵素反応が、代謝酵素により行われることを特徴とする、請求の範囲１３記載の方法。
15. 分子Ａ側の結合位置を特定することなく固相担体に分子Ａを結合することによって得られる２種以上の分子Ａ固定化固相担体からなる分子Ａ固定化固相担体混合物であって、該２種以上の分子Ａ固定化固相担体において、分子Ａは分子Ａ上のそれぞれ異なる位置で固相担体に固定化されている、分子Ａ固定化固相担体混合物。
16. 分子Ａの固相担体への結合が、分子Ａと固相担体との間に分子Ａ側の導入位置を特定することなく導入されたスペーサーを介して行われるものである、請求の範囲１５記載の分子Ａ固定化固相担体混合物。
17. 分子Ａの固相担体への結合が、（１）分子Ａに導入された官能基を介して行われること、および（２）該官能基の導入が分子Ａ側の導入位置を特定することなく行われることを特徴とする請求の範囲１５記載の分子Ａ固定化固相担体混合物。
18. スペーサーの分子Ａへの導入が、分子Ａ側の導入位置を特定することなく導入された官能基を介して行われるものである請求の範囲１６記載の分子Ａ固定化固相担体混合物。
19. 分子Ａ側の導入位置を特定することなく行われる分子Ａへの官能基の導入が、化学反応によるものであるかまたは酵素反応によるものである請求の範囲１７又は１８記載の分子Ａ固定化固相担体混合物。
20. 分子Ａ側の導入位置を特定することなく行われる分子Ａへの官能基の導入が、酵素反応によるものである請求の範囲１９記載の分子Ａ固定化固相担体混合物。
21. 酵素反応が、代謝酵素により行われることを特徴とする、請求の範囲２０記載の分子Ａ固定化固相担体混合物。
22. アフィニティークロマトグラフィー用固相担体である、請求の範囲１５〜２１のいずれか１項に記載の分子Ａ固定化固相担体混合物。
23. 分子Ａ側の結合位置を特定することなく固相担体に分子Ａを結合し、２種以上の分子Ａ固定化固相担体からなる分子Ａ固定化固相担体混合物を得ることを含むアフィニティークロマトグラフィー用固相担体の製造方法であって、該２種以上の分子Ａ固定化固相担体において、分子Ａは分子Ａ上のそれぞれ異なる位置で固相担体に固定化されている、アフィニティークロマトグラフィー用固相担体の製造方法。
24. 分子Ａの固相担体への結合が、分子Ａと固相担体との間に分子Ａ側の導入位置を特定することなく導入されたスペーサーを介して行われるものである、請求の範囲２３記載のアフィニティークロマトグラフィー用固相担体の製造方法。
25. 分子Ａの固相担体への結合が、（１）分子Ａに導入された官能基を介して行われること、および（２）該官能基の導入が分子Ａ側の導入位置を特定することなく行われることを特徴とする請求の範囲２３記載のアフィニティークロマトグラフィー用固相担体の製造方法。
26. スペーサーの分子Ａへの導入が、分子Ａ側の導入位置を特定することなく導入された官能基を介して行われるものである請求の範囲２４記載のアフィニティークロマトグラフィー用固相担体の製造方法。
27. 分子Ａ側の導入位置を特定することなく行われる分子Ａへの官能基の導入が、化学反応によるものであるかまたは酵素反応によるものである請求の範囲２５又は２６記載のアフィニティークロマトグラフィー用固相担体の製造方法。
28. 分子Ａ側の導入位置を特定することなく行われる分子Ａへの官能基の導入が、酵素反応によるものである請求の範囲２７記載のアフィニティークロマトグラフィー用固相担体の製造方法。
29. 酵素反応が、代謝酵素によって行われるものである、請求の範囲２８記載のアフィニティークロマトグラフィー用固相担体の製造方法。
30. 少なくとも（１）分子Ｂを含むかまたは含まない試料を請求の範囲１５〜２２のいずれか１項に記載の分子Ａ固定化固相担体混合物に接触させる工程、および（２）分子Ａに特異的な相互作用を示したか、または示さなかった分子を同定し、分子Ｂを選別する工程を含む、分子Ａに特異的な相互作用を有する分子Ｂのスクリーニング方法。

Images