CN117050964A - 一种从肿瘤细胞中直接制备fasn的本源光亲和捕获材料的方法 - Google Patents

一种从肿瘤细胞中直接制备fasn的本源光亲和捕获材料的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种从肿瘤细胞中直接制备脂肪酸合酶的本源光亲和捕获材料的方法，属于仿生材料制备领域。本发明以FASN为模式酶，首先利用AfBPP技术设计合成FASN光亲和探针FAP，然后在无需蛋白纯化的情况下可以对肿瘤细胞内的FASN进行亲和捕获，最后将捕获到的FASN通过光亲和探针以“点击”反应固定在预先叠氮化的硅球材料表面，制备具有良好活性的FASN硅球材料。本发明制备的本源光亲和酶捕获材料无需纯化酶且可避免破坏酶活性位点，解决了现有酶固定材料制备技术中酶的来源和酶活性位点易被破坏的难题，为酶固定材料制备提供了新思路、新技术。

Description

一种从肿瘤细胞中直接制备FASN的本源光亲和捕获材料的 方法
技术领域
本发明属于仿生材料制备技术领域，涉及一种从肿瘤细胞中直接制备脂肪酸合酶(FASN)的本源光亲和捕获材料的方法。
背景技术
将靶点固定在载体上，用于筛选靶点的直接作用小分子药物的筛选技术因其高效、快速的优点得到广泛发展及应用。然而，此筛选方法往往需要纯化的靶点蛋白，不仅成本高，在靶点固定化过程中又极易破坏靶点的活性位点。这将对筛选结果的准确性产生一定的影响，因此，构建无需纯化靶点蛋白且能保护靶点活性中心的筛选方法是药物筛选的重要前沿方向。
基于活性的蛋白质组学分析(Activity-based protein profiling,ABPP)是利用基于活性的分子探针在蛋白质组的水平上或活细胞内原位标记、捕获、富集和鉴定具有特定生理活性的靶蛋白质的方法。ABPP技术先将基于活性的探针(activity-based probe,ABP)加入到复杂的蛋白质组进行共孵育，然后分离并富集与小分子探针特异性结合的蛋白质。其中，AfBPP从可逆抑制剂设计而来，并广泛应用于非共价、可逆抑制剂和药物靶点的识别和富集。鉴于其可以特异性地获取目的蛋白，且可逆地与靶蛋白结合的特点，将AfBPP技术与药物筛选的技术相结合，在ABP的保护及特异性的亲和作用下，即可设计出从疾病模型中直接获得的本源活性靶点材料，从而实现候选活性成分，尤其是天然产物中有效成分的精确高效筛选。
发明内容
本发明的目的就是提供一种从肿瘤细胞中直接制备脂肪酸合酶(FASN)的本源光亲和捕获材料的方法。能直接从肿瘤细胞中捕获FASN，解决了现有基于靶点的药物筛选方法中靶点的纯化和靶点活性中心易被破坏的难题。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
本发明公开了一种从肿瘤细胞中直接制备FASN的本源光亲和酶捕获材料的方法，以FASN为模式酶，首先利用基于亲和力的蛋白质组学分析技术(AfBPP技术，affinity-based protein profiling)设计合成FASN的光亲和探针FAP，然后在无需蛋白纯化的情况下对肿瘤细胞内的FASN进行亲和捕获，最后将捕获到的FASN通过光亲和探针以“点击”反应固定在预先叠氮化的硅球材料表面，制备具有良好活性的FASN硅球材料。
具体为：
步骤一、将叠氮-聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯通过氨解反应键合到硅球上。
步骤二、以FASN的特异性抑制剂为基础，设计合成FASN光亲和探针FAP(photo-affinity probe)。
步骤三、将FASN光亲和探针，与肿瘤细胞裂解液共孵育，经过365nm紫外光照射，得到特异性抑制剂保护酶活性中心状态下的FASN光亲和探针-FASN蛋白复合物。
将FASN光亲和探针-FASN复合物，与酯酶孵育，经过酯酶水解，FASN光亲和探针中特异性抑制剂连同连接臂部分被水解离去，得到带有炔基手柄的FASN。
将带有炔基手柄的FASN蛋白加入到预先叠氮化的硅球材料中，经过生物正交的“点击”反应，得到具有良好活性的FASN硅球材料。
优选地，所述硅球为氨基化硅球ASG，叠氮基团通过氨解反应键合到氨基化硅球ASG上，制得PFASG；反应式为：
进一步的，步骤二中所述的特异性抑制剂为GSK2194069。
将GSK2194069与1.2当量的1,6-二溴己烷在无水碳酸钾的存在下，60℃搅拌反应20min，得到化合物2，反应式为：
将化合物2与1.2当量3-(3-(丁基-3-炔-1-基)-3H-偶氮基-3-基)丙酸在无水碳酸钾的存在下，60℃搅拌反应1h，得到FASN光亲和探针；反应式为：
进一步的，所述的“点击”反应为铜(I)-催化叠氮化物-炔环加成反应。
本发明通过FAP探针头部的FASN的特异性抑制剂与FASN的可逆结合先将FASN的活性位点进行保护，借助光亲和基团实现共价交联后再借鉴前药的理论将FASN的特异性抑制剂水解脱去，从而暴露出FASN的活性位点。进一步通过点击反应将本源FASN固定于硅球材料表面，制备FASN/PFASG材料。制备的本源光亲和酶捕获材料无需纯化酶且可避免破坏酶活性位点，解决了现有酶固定材料制备技术中酶的来源和酶活性位点易被破坏的难题，为酶固定材料制备提供了新思路、新技术。
附图说明
图1为本发明实施例的整体过程流程图。
图2为本发明实施例中FASN光亲和探针(FAP)的质谱图及核磁图谱。
图3为本发明实施例中ASG、PFASG和FASN/PFASG材料的红外光谱图。
图4为本发明实施例中ASG、PFASG和FASN/PFASG材料的X射线光电子能谱(XPS)图。
图5为本发明实施例中ASG、PFASG和FASN/PFASG材料的C1s、N1s和O1s的高分辨XPS图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
下面结合附图对本发明做进一步详细描述：
一种从肿瘤细胞中直接制备FASN的本源光亲和捕获材料的方法，具体为：首先，如图1所示，将叠氮-聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯通过氨解反应键合到硅球(本实施例中选用ASG)上，制备PFASG，备用。然后，以FASN的特异性抑制剂(本实施例中选用GSK2194069)为基础，合成FASN的光亲和探针FAP。接着对肿瘤细胞内的FASN进行亲和捕获，最后将捕获到的FASN通过光亲和探针以点击反应固定在预先叠氮化的硅球材料表面，制备FASN/PFASG材料。
具体包括以下步骤：
步骤一、制备PFASG：
取500mg ASG(5μm，)，用乙腈洗涤2次；取50mg叠氮-聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯，溶于5mL乙腈中；随后，将ASG充分混悬在叠氮-聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯的乙腈溶液中，室温下翻转过夜，以高效液相色谱检测其底物消耗程度；待反应完成后，离心，弃上清，用乙腈洗涤2次以消除非特异性吸附成分，得PFASG材料，将其保存在超纯水中置于4℃条件下，备用。
反应式为：
步骤二、合成FASN的光亲和探针FAP：
首先，取特异性抑制剂(GSK2194069，化学式见反应式中化合物1)(30.0mg、70μmoL、1.0当量)、1,6-二溴己烷(17.0mg、70μmoL、1.0当量)、研磨碎的无水K2CO3(14.5mg、105μmoL、1.5当量)，量取7.5mL DMF(二甲基甲酰胺，作为溶剂)，依次放入15mL耐压管中，60℃、600rpm条件下搅拌反应20min。待反应液冷却后于真空离心浓缩仪中挥干，并用70％MeOH复溶后通过半制备高效液相色谱进行分离纯化，得到化合物2。
反应式为：
然后，取化合物2(12.0mg、20μmoL、1.0当量)、3-(3-(丁基-3-炔-1-基)-3H-偶氮基-3-基)丙酸(4.0mg、24μmoL、1.2当量)、研磨碎的无水K2CO3(4.2mg、30μmoL、1.5当量)，量取2mL DMF(二甲基甲酰胺，作为溶剂)，依次放入15mL耐压管中，80℃、600rpm搅拌反应1h。待反应液冷却后于真空离心浓缩仪中挥干，并用70％MeOH复溶后通过半制备高效液相色谱进行分离纯化，合成FASN的光亲和探针FAP。
反应式为：
步骤三、制备FASN/PFASG材料：
取处于生长对数期且状态良好的人胰腺癌细胞PANC1，用4℃预冷的PBS缓冲液清洗3次，然后加入预冷的含有磷酸酶和蛋白酶抑制剂的M-PER细胞裂解缓冲液，裂解液用量约为200μL/皿；于冰上用细胞刮铲将细胞轻轻刮下，置于预冷的2mL离心管内上下颠倒几次，短暂涡旋充分混匀后于冰上静置裂解20min；将裂解完的细胞悬液于12,000rpm，4℃条件下离心20min，离心完成后将上清转移至新的2mL离心管中，按照试剂盒说明书用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。
为减少所制备材料表面的非特异性吸附，将蛋白浓度调整至1mg/mL；分别取10μL50mM FAP探针与500μL 1mg/mL细胞裂解液置于混匀仪中4℃，600rpm孵育60min；
孵育完成后得到复合物4(GSK2194069与FASN亲和结合的复合物)，使用365nm紫外灯于冰上照射样品，为减少对蛋白活性的损伤每照射5min间隔2min，总计照射时间20min；得到复合物5(GSK2194069保护酶活性中心状态下的FASN光亲和探针-FASN共价复合物)。
反应式为：
称取20mg酯酶溶于500μL PBS缓冲液中，与500μL上述复合物5反应液混匀后于混匀仪中，600rpm、37℃水解90min；
FASN光亲和探针中GSK2194069连同连接臂部分被水解离去，得到带有炔基手柄的FASN(化合物6)；反应式为：
配制100mM THPTA配体(点击化学铜离子配体3-羟丙基三唑基甲胺)、20mMCuSO4·5H2O、300mM抗坏血酸钠溶液，取5mg PFASG材料混悬在500μL PBS缓冲液中，与1mL上述化合物6反应液混匀后继续加入100μL PBS缓冲液、100μL 100mM THPTA、100μL 20mMCuSO4·5H2O、100μL 300mM抗坏血酸钠，涡旋，待充分混匀后，避光条件下，冰浴翻转孵育2h；孵育完成后，离心弃掉上清并用PBS缓冲液洗涤2次以去掉非特异性吸附成分，得到FASN/PFASG材料(化合物7)。
反应式为：
进行如下实验对FAP的结构进行验证：
本实施例中制备的FAP为淡黄色固体，产率为82.43％，图2中a为化合物FAP的高分辨质谱图，分子式为C39H44N6O5，分子量为676.33732。在ESI﹢电离源下检测到准分子离子峰[M+H]+。
图2中b为化合物FAP(3)的1H-NMR谱图，HPLC检测纯度为98.08％，溶剂为氘代甲醇(Methanol-d4)，化学位移在3.31ppm处为氘代甲醇中氢的峰，4.87ppm处为残余的水峰。1HNMR(500MHz,Methanol-d4)δ7.94(t,J＝1.3Hz,2H),7.90–7.84(m,4H),7.83(dd,J＝2.3,1.0Hz,2H),7.67–7.59(m,4H),7.50(t,J＝8.2Hz,4H),6.94(d,J＝2.2Hz,2H),4.12(td,J＝6.6,1.1Hz,4H),3.95–3.83(m,5H),3.81–3.61(m,3H),3.55(ddd,J＝12.0,8.2,3.8Hz,1H),3.06(dd,J＝12.0,7.8Hz,1H),2.77–2.62(m,5H),2.60–2.50(m,1H),2.32–2.22(m,2H),2.21–2.09(m,5H),2.09–1.96(m,7H),1.85(pd,J＝6.9,3.5Hz,4H),1.78(q,J＝8.3,7.9Hz,5H),1.71(dtd,J＝16.9,7.5,6.6,4.8Hz,6H),1.63(t,J＝7.4Hz,5H),1.51–1.39(m,8H),0.93–0.77(m,8H)。
图2中c为化合物FAP(3)的13C-NMR谱图，HPLC检测纯度为98.08％，溶剂为氘代甲醇(Methanol-d4)，化学位移在48.8ppm处为氘代甲醇中碳的峰。13C NMR(126MHz,Methanol-d4)δ174.61,174.52,174.10,174.08,156.40,155.08,147.48,147.46,146.66,146.64,144.22,144.20,136.25,132.78,129.72,129.09,129.08,124.95,124.94,120.95,112.64,107.93,83.66,70.44,65.71,65.67,52.86,52.19,47.15,46.54,46.27,37.43,35.74,33.41,32.48,31.07,30.12,29.56,29.52,29.34,29.10,28.77,27.15,26.49,13.86,13.31,13.06,8.07,8.00,7.93,7.90。
以上表征均证明已成功合成FAP探针。
对FASN/PFASG材料进行表征：
采用傅立叶变换红外光谱仪，使用波长范围为400-4000cm-1的红外光分别对ASG材料、PFASG材料和FASN/PFASG材料进行扫描分析。
如图3中a所示，在ASG材料的红外光谱中，808cm-1附近是Si-O-Si对称伸缩振动峰，1400cm-1附近是C-H弯曲振动峰，2876cm-1和2967cm-1附近是C-H伸缩振动峰，氨基吸收峰在3500-3300cm-1；
如图3中b所示，在PFASG材料的红外光谱中，1400cm-1附近是C-N伸缩振动及C-H弯曲振动峰，1653cm-1附近与酰胺键的C＝O吸收有关，新出现的2100cm-1附近的吸收峰是叠氮基团不对称伸缩振动峰，表明叠氮基团成功修饰到ASG材料表面；
如图3中c所示，在FASN/PFASG材料的红外光谱中，1660cm-1附近与酰胺键及羧酸的C＝O和三唑环中的C＝C吸收有关，1567cm-1附近是三唑环中N-H的弯曲振动峰，并且可明显观察到2100cm-1叠氮基团不对称伸缩振动峰明显减小，1531cm-1附近酰胺Ⅱ带的吸收峰增强，表明成功合成FASN/PFASG材料。
傅立叶变换红外光谱仪特征显示的官能团信息与本实验设计的合成路径相一致，表明本实验成功制备FASN/PFASG材料。但是，由于本实验中PFASG材料本身就存在酰胺键，导致FASN/PFASG材料的FT-IR结果中蛋白的特征谱带并不显著。XPS是能够分析材料表面化学性质的一项技术，可以分析材料中元素组成、元素化学价态与电子态。因此，通过XPS对FASN/PFASG材料表面的元素的化学态进行分析。
如图4所示是三种材料的XPS谱图(a为ASG材料的XPS谱图，b为PFASG材料的XPS谱图，c为FASN/PFASG材料的XPS谱图)，三种材料中都含有C、O、N、Si元素。表1展示了三种材料中各元素的比例，其中N元素呈现出“从少到多”的明显趋势，初步表明叠氮基团被成功键合到ASG材料表面并进一步通过点击反应将FASN固定于硅球材料表面；而S元素本身在蛋白中所占比例较小，故在FASN/PFASG材料中含量较低，导致其变化不够显著。
表1
如图5所示，展示了C1s、N1s和O1s的高分辨XPS谱图以显示结合能的差异。
ASG材料C1s的结合能出现在288.24、286.89和284.80eV处，分别归属于C-N、C-O/C-Si和C-C；
PFASG材料C1s的结合能出现在288.33、286.35和284.80eV处，分别归属于C-N/C＝O、C-O/C-Si和C-C；
FASN/PFASG材料C1s的结合能出现在288.06、286.12和284.80eV处，分别归属于C-N/C＝O、C-O/C-Si和C-C。
ASG材料N1s的结合能出现在402.77和400.33eV处，分别归属于C-N和N-H；PFASG材料N1s的结合能出现在402.69、401.16、400.06和399.20eV处，分别归属于叠氮基团的N＝*N+＝N-、*N＝N+＝N-、N＝N+＝*N-和N-H；
FASN/PFASG材料N1s的结合能出现在402.60、400.93、399.82和398.40eV处，分别归属于C-N、三唑环的N＝*N-N、N＝N+＝*N-和N-H。ASG材料O1s的结合能出现在534.79、533.69和532.66eV处，分别归属于末端-OH、O-Si和C-O；
PFASG材料O1s的结合能出现在532.73、532.53和531.83eV处，分别归属于O-Si、C-O和O＝C-N；
FASN/PFASG材料O1s的结合能出现在533.60、532.60、531.58和530.66eV处，分别归属于O＝C-*O、O-Si、C-O和O＝C-N/*O＝C-O。
综上所述，XPS表征结果与傅立叶变换红外光谱仪(FT-IR)表征结果一致，充分说明本实验将叠氮基团键合于硅球材料表面，并通过点击反应成功完成FASN/PFASG材料的构建。

Claims (7)

1.一种从肿瘤细胞中直接制备FASN的本源光亲和酶捕获材料的方法，其特征在于：以FASN为模式酶，首先利用AfBPP技术设计合成FASN的光亲和探针FAP，然后在无需蛋白纯化的情况下对肿瘤细胞内的FASN进行亲和捕获，最后将捕获到的FASN通过光亲和探针以“点击”反应固定在预先叠氮化的硅球材料表面，制备具有良好酶活的FASN硅球材料。
2.如权利要求1所述的从肿瘤细胞中直接制备FASN的本源光亲和酶捕获材料的方法，其特征在于：具体为：
步骤一、将叠氮-聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯通过氨解反应键合到硅球上；
步骤二、以FASN的特异性抑制剂为基础，设计合成FASN光亲和探针FAP；
步骤三、将FASN光亲和探针，与肿瘤细胞裂解液共孵育，经过365nm紫外光照射，得到特异性抑制剂保护酶活性中心状态下的FASN光亲和探针-FASN蛋白复合物；
将FASN光亲和探针-FASN复合物，与酯酶孵育，经过酯酶水解，FASN光亲和探针中特异性抑制剂连同连接臂部分被水解离去，得到带有炔基手柄的FASN；
将带有炔基手柄的FASN蛋白加入到预先叠氮化的硅球材料中，经过生物正交的“点击”反应，得到具有良好酶活的FASN硅球材料。
3.如权利要求1或2所述的从肿瘤细胞中直接制备FASN的本源光亲和酶捕获材料的方法，其特征在于：所述硅球为氨基化硅球ASG。
4.如权利要求3所述的从肿瘤细胞中直接制备FASN的本源光亲和酶捕获材料的方法，其特征在于：叠氮基团通过氨解反应键合到所述氨基化硅球ASG上，制得PFASG；反应式为：
5.如权利要求2所述的从肿瘤细胞中直接制备FASN的本源光亲和酶捕获材料的方法，其特征在于：步骤二中所述的特异性抑制剂为GSK2194069。
6.如权利要求5所述的从肿瘤细胞中直接制备FASN的本源光亲和酶捕获材料的方法，其特征在于：将所述GSK2194069与1.2当量的1,6-二溴己烷在无水碳酸钾的存在下，60℃搅拌反应20min，得到化合物2，反应式为：
将化合物2与1.2当量3-(3-(丁基-3-炔-1-基)-3H-偶氮基-3-基)丙酸在无水碳酸钾的存在下，60℃搅拌反应1h，得到FASN光亲和探针；反应式为：
7.如权利要求1或2所述的从肿瘤细胞中直接制备FASN的本源光亲和酶捕获材料的方法，其特征在于：所述的“点击”反应为铜(I)-催化叠氮化物-炔环加成反应。
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