CN112390763B - 光敏性化合物及其制备方法和应用及含有其的光敏性蛋白质固定凝胶 - Google Patents

光敏性化合物及其制备方法和应用及含有其的光敏性蛋白质固定凝胶 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种光敏性化合物及其制备方法和应用及含有其的光敏性蛋白质固定凝胶。光敏性化合物的结构式如式(I)所示，其中，R为吸电子基团。该光敏性化合物的制备方法，包括以下步骤：将N‑(3‑氨基丙基)甲基丙烯酸盐盐酸盐溶解于有机溶剂中，向其中加入含吸电子基团的四氮唑类化合物和三乙胺，搅拌回流反应10～20h后进行纯化处理得到所述光敏性化合物。光敏性化合物是以四氮唑环为光敏基团，光敏性蛋白质固定凝胶包括作为光敏成分的此化合物；将蛋白质分离功能和蛋白质固定功能集合于一体，可实现在凝胶内部原位固定蛋白质，稳定固定蛋白质，更加强力高效，不易被洗脱造成蛋白质损失。

Description

光敏性化合物及其制备方法和应用及含有其的光敏性蛋白质 固定凝胶
技术领域
本发明涉及化学生物技术领域，具体涉及一种光敏性化合物及其制备方法和应用，以及含有其的光敏性蛋白质固定凝胶。
背景技术
在肿瘤研究领域，肿瘤细胞本身具有高度异质性，癌症的靶向治疗需在单细胞分辨率水平上提供定量和高度特异性的靶蛋白检测。对细胞异质性的研究，可以为个体化的治疗提供丰富的，关键的遗传表达信息，为治疗方案的制定和靶向药物的选择和开发打下基础。在干细胞研究领域，研究不同细胞的基因表达差异有助于加深对遗传发育以及不同组织和细胞基因表达调控的规律的理解。蛋白质是生命的物质基础，是有机大分子，是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者；同时，乙酰化、泛素化、磷酸化等表观遗传修饰对蛋白质的功能起着至关重要的调控作用。基因组及转录组的研究并不能满足人类对疾病发生发展中存在的异质性探索的需求，单细胞蛋白质组学应运而生。
目前，微流控芯片技术、荧光流式细胞术、质谱流式细胞术、质谱流式成像技术、单细胞分泌蛋白测定技术、单细胞蛋白质免疫印迹等高通量、高灵敏度、高分辨率的分析手段，为单细胞组学的研究提供了强有力的工具。其中，蛋白质免疫印迹(Western Blot)是细胞与分子生物学和免疫遗传学中常用的一种蛋白测定方法。具体流程是通过使用凝胶电泳分离样品中的蛋白质，随后将蛋白质转移到固相支持物上(如，硝酸纤维素或PVDF)，接着用对靶蛋白质具有特异性的抗体来检测样品中的蛋白质。由于蛋白质是经过电泳分离后再进行抗体结合反应，故较少受到抗体交叉反应性的影响。因此，即使在复杂的样品如细胞裂解物中，也能够清楚地区分靶上和靶外信号。
然而，传统的蛋白印迹方法中所测定的结果是基于大量细胞样品的蛋白平均表达水平，其结果掩盖了单个细胞蛋白的表达量的特殊性和多样性。由于抗原和抗体之间的结合存在着一定程度的特异性，仅仅依赖于抗原抗体的结合识别靶蛋白分子进行检测的蛋白免疫测定方法，如微流控技术、荧光流式细胞术、质谱流式细胞术、质谱流式成像技术、单细胞分泌蛋白isoplex技术等，特异性较低，可能存在较高的假阳性；同时也受到特异性探针的种类的限制而使得上述方法的应用受限。而且，考虑到对细胞表面蛋白、跨膜蛋白、分泌蛋白及胞内甚至核内蛋白的检测，在流式细胞术中，胞内及核内蛋白的直接检测操作难度大；单细胞分泌蛋白检测技术仅可检测分泌蛋白，无法检测细胞表面、跨膜蛋白、胞内及核内蛋白。
单细胞蛋白质免疫印迹结合了十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)的分子筛效应和免疫印迹的特异性，通过蛋白质的分子量和抗原抗体识别双重验证，保证了检测的特异性，同时可检测细胞表面蛋白、跨膜蛋白、胞内及核内的蛋白，可区分经表观遗传修饰蛋白。但基于N-(3-[(4-苯甲酰基苯基)甲酰氨基]丙基)甲基丙烯酰胺的光敏感型凝胶，光敏固定效率较低，检测下限为单细胞27000个蛋白分子，难以应用于低丰度蛋白质的检测，且背景荧光较高，方法灵敏度低。激发波长也较短(UVB，280～320nm)，可能引起蛋白抗原位点失活，造成假阴性。此外，难以应用于稀有细胞类群的单细胞蛋白质分析，例如，循环肿瘤细胞(1-10个细胞/毫升血液)。
发明内容
本发明为克服上述现有技术的不足，提供一种光敏性化合物及其制备方法和应用，以及含有其的光敏性蛋白质固定凝胶。
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案实现：
一种光敏性化合物，其特征在于，所述光敏性化合物的结构式如式(I)所示：
其中，R为吸电子基团。
优选地，所述吸电子基团选自取代或未取代的杂环基或者取代或未取代的芳基。
优选地，所述吸电子基团选自如下基团的任意一种：
本发明的另一个目的是，提供一种光敏性化合物的制备方法。
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案实现：
光敏性化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐盐酸盐溶解于有机溶剂中，向其中加入含吸电子基团的四氮唑类化合物和三乙胺，搅拌回流反应10～20h后进行纯化处理得到所述光敏性化合物。
优选地，所述N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐盐酸盐、含吸电子基团的四氮唑类化合物和三乙胺的质量比为1:1:(2～8)。
优选地，所述含吸电子基团的四氮唑类化合物通过以下步骤制备：
A、将环状化合物溶解于有机溶剂中，于–40℃下加入二乙酸碘苯并在氮气保护下搅拌3～5h；将搅拌后的混合物经过浓缩处理后溶解于有机溶剂，再向其中加入5-甲酸乙酯四氮唑、三氟甲烷磺酸铜(II)和三乙胺，于室温且氮气保护下搅拌至少24h后，进行洗涤、干燥、过滤及纯化处理，得到中间产物；
B、将所述中间产物溶解于体积比为1:1的MeOH/H2O溶液中，于0℃下加入氢氧化锂；再于室温且氮气保护下搅拌至少1h；最后将其置于0℃下加入2N HCl，调节pH为7～9，得到混合溶液；
C、萃取出所述混合溶液中的有机相，然后进行洗涤处理、干燥剂干燥和过滤后即得到所述含吸电子基团的四氮唑类化合物。
优选地，所述环状化合物选自未经取代或取代的杂环化合物，或者未经取代或取代的苯环。
优选地，在步骤A中，所述环状化合物、二乙酸碘苯和有机溶剂的摩尔比为1:(10～15):(100～200)；所述5-甲酸乙酯四氮唑、三氟甲烷磺酸铜(II)和三乙胺的摩尔比为(3～8):1:(13～20)。
优选地，在步骤A中，采用硅胶层析进行纯化，其中洗脱剂PE:EA＝4～8:1。
优选地，在步骤B中，所述中间产物和氢氧化锂的质量比为1:1～5。
优选地，在加入所述含吸电子基团的四氮唑类化合物前，还需加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸和1-羟基苯并三唑反应至少30min；其中加入的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸和1-羟基苯并三唑与N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐盐酸盐的质量比为(2～7):(1～3):1。
优选地，所述含吸电子基团的四氮唑类化合物通过琥珀酰亚胺酯和含四氮唑基团的化合物制备得到，其中所述含四氮唑基团的化合物具有吸电子基团。
优选地，所述有机溶剂包括三氟乙醇、二氯甲烷、四氢呋喃或N,N-二甲基甲酰胺中的一种或多种。
本发明的另一个目的是，还提供一种光敏性化合物的应用。
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案实现：
光敏性化合物或前述制备方法得到的光敏性化合物在分离和固定蛋白质中的应用。
本发明的另一个目的是，还提供一种光敏性蛋白质固定凝胶。
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案实现：
一种光敏性蛋白质固定凝胶，包括作为光敏成分的光敏性化合物或前述的制备方法得到的光敏性化合物。
本发明所述的“取代”，表示所给结构中的一个或多个氢原子被取代基所取代。当所给出的结构式中不止一个位置能被取代基所取代时，所述取代基可以相同或不同。
本发明所述的“杂环基”，是指含有1-4个杂原子(例如1、2、3或4个杂原子)作为环成员的非芳香环基团。杂原子是指氮、氧或硫。杂环基可以是具有4-8个环原子的单环杂环基(例如4-7元环、5-7元环、5-6元环)，或者具有7-11个环原子的双环杂环基。杂环基可以是芳香或非芳香的。杂环基的例子有氮杂环丁基、吡咯烷基、吡咯啉基、四氢呋喃基、二氢呋喃基、哌嗪基、哌啶基、吗啉基、硫代吗啉基、四氢吡喃基、四氢噻吩基等。
本发明所述的“芳基”,是指含有6-14个(例如6-12个、6-20个)碳原子的单碳环芳香基或稠合或非稠合的多碳环芳香基，在多碳环的情况下，只要一个碳环是芳香的即可。芳基也包括与杂环基稠合的芳基。所述芳基的例子有苯基、联苯基、萘基等。
本发明所述的“MeOH”，是指甲醇。
本发明中，光敏性化合物是以四氮唑环为光敏基团，光敏性蛋白质固定凝胶包括作为光敏成分的此化合物；将蛋白质分离功能和蛋白质固定功能集合于一体，可应用于微流控蛋白免疫印迹、单细胞蛋白免疫印迹、毛细管电泳蛋白免疫印迹等技术。由于基于四氮唑环的化合物为光敏成分，使其可以应用于SDS-PAGE电泳、等电聚焦电泳、非变性PAGE、双向电泳、质荷比分离、亲和相互作用分离等具有分离功能的技术中。并且由于该光敏成分经过紫外光的激发作用下，与蛋白质的功能团发生反应，从而将其交联固定于凝胶内部，可应用于后续在胶内原位针对目标靶向蛋白的特异性定量或半定量检测。
将本发明的光敏性蛋白质固定凝胶应用于免疫印迹测定时，检测用的抗体探针可以是荧光、酶、胶体金、超顺磁性微球等标记抗体；检测反应可以是除抗体外的试剂，例如，适配体、纳米抗体、凝集素等；可用于单细胞或多细胞、或提取出的蛋白质、或纯化的蛋白质溶液等的测定；可用于一种或多种蛋白质分析物的同时检测。
本发明提供的光敏性化合物，其中的四氮唑环为光敏基团，再通过改变其中的吸电子基团来改变所需激发光的波长及能量，在紫外激发作用下四氮唑环断开再与蛋白质交联从而产生固定蛋白质的作用。因此，以光敏性化合物作为光敏成分可制备光敏性蛋白质固定凝胶，应用于单细胞免疫印迹研究。本发明提供的制备光敏性化合物的方法，操作简单、成本低廉。
本发明提供的光敏性蛋白质固定凝胶，具有以下优点：
1、可实现在凝胶内部原位固定蛋白质，稳定固定蛋白质，更加强力高效，不易被洗脱造成蛋白质损失，保证了后续检测的灵敏度。并且，与蛋白质的功能团聚合速度更快，极大提高蛋白固定效率，避免因聚合速度慢，引起的蛋白质扩散导致灵敏度降低。
2、紫外激发时间更短，能够更加快速的固定蛋白质；紫外激发光的波长更长且范围更窄，能量也就更低；降低了紫外引起胶内部背景自发荧光，同时，避免引起蛋白抗原位点失活，节省了检测过程的时间，降低成本。
3、可以非选择性地固定所有蛋白质，即包括不同分子量的蛋白质、不同酸碱性的蛋白质、不同等电点的蛋白质、不同三维结构的蛋白质以及不同位置分布的蛋白(如表面蛋白、跨膜蛋白、胞内及核内蛋白)等，这就避免了由于方法本身造成对某种特定蛋白质的漏检或误检。由于非选择性，使其可应用于其它免疫印迹测定(例如DNA-蛋白质或RNA-蛋白质)。
4、在单细胞免疫印迹技术的实验体系中，不与其它分子反应，如水、SDS、TritonX、脱氧胆酸钠等，避免固定位点被占用引起的蛋白质固定效率降低，同时减少因此产生的背景荧光。而且，也不影响抗原抗体结合、受体配体结合、酶活性、适配体结合等，保证后续检测体系成功有效的搭建。
5、凝胶的使用浓度更低，不影响SDS-PAGE本身的分子筛效应，保留原方法的特异性及分离分辨率。
附图说明
图1为实施例1的光敏性化合物的合成路线图。
图2为实施例1的第一产物的核磁共振氢谱图。
图3为实施例1的最终产物的质谱图。
图4为实施例1的最终产物的核磁共振氢谱图。
图5为实施例1的光敏性化合物的紫外-可见吸收光谱图。
图6为实施例7的浓度为0％、0.75％、1.5％、3％的光敏性蛋白质固定凝胶对牛血清白蛋白的固定效率对比图。
图7为实施例7的不同紫外光照时间下光敏性蛋白质固定凝胶对牛血清白蛋白的固定效率对比图。
图8为实施例7的光敏性蛋白质固定凝胶经紫外光激发与蛋白质之间的作用原理示意图。
图9为实施例7的光敏感型蛋白质固定凝胶不影响抗原抗体结合。
具体实施方式
下面结合附图对本发明进行详细的描述。
实施例1
按照摩尔比1:11:200，称取甲基-1氢-吡咯、二乙酸碘苯和三氟乙醇，先将甲基-1氢-吡咯溶解于三氟乙醇中，再于–40℃下加入二乙酸碘苯，氮气保护搅拌3h。将搅拌后的混合物浓缩成黑色油状后溶解于二氯甲烷中。然后，向其中加入按照摩尔比3:1:13称取的5-甲酸乙酯四氮唑、三氟甲烷磺酸铜(II)和三乙胺；在室温且氮气保护下搅拌24h。得到的物质通过饱和氯化铵和卤水分别洗涤，再采用无水硫酸镁对其干燥，最后过滤、采用硅胶层析(洗脱剂为PE:EA＝8:1)进一步纯化，得到棕色油状中间产物，其结构式为下式(1)所示。
其中，上述制备方法的产率为9.6％。如图2所示，中间产物的核磁共振氢谱数据如下：1H NMR(400MH,DMSO)：δ7.13-7.00(m,1H),6.65(dd,J＝3.9,1.9Hz,1H),6.24(dd,J＝3.9,3.0Hz,1H),4.47(q,J＝7.1Hz,2H),3.65(s,3H),1.37(t,J＝7.1Hz,3H)。对此进行质谱分析，结果为[M+H]+222.0。
按照质量比1:1.8称取中间产物和氢氧化锂，将中间产物溶解于20ml体积比为1:1的MeOH/H2O溶液中，于0℃下再向其中加入氢氧化锂；再将其置于室温且氮气保护下搅拌反应1h；最后将温度调节为0℃后向其中加入2N HCl，调节pH为7，得到混合溶液；用乙酸乙酯溶液萃取出混合溶液中的有机相，用卤水洗涤有机相后采用无水硫酸钠干燥，通过过滤浓缩为棕色固体，即含吸电子基团的四氮唑类化合物1，其结构式为下式(2)所示，通过此方法得到370mg，产率为94％。对该化合物进行质谱分析，结果为[M+H]+194.1。
按照质量比2:1:1称取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑和N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐盐酸盐，先将N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐盐酸盐溶解于50mL四氢呋喃中，再在0℃下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑，反应1h；再按照N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐盐酸盐、含吸电子基团的四氮唑类化合物1和三乙胺的质量比为1:1:2.5，称取并加入含吸电子基团的四氮唑类化合物1和三乙胺，混合搅拌、回流反应12h。反应结束后，用制备型HPLC纯化产物，得到白色粉末41mg(产率6.7％)即为最终产物，光敏性化合物，其结构如式(3)。
如图3-4所示，最终产物的核磁共振氢谱数据如下：1H NMR(400MHz,MeOD)δ6.97-6.82(m,1H),6.60(dd,J＝4.0,1.9Hz,1H),6.23(dd,J＝3.9,3.0Hz,1H),5.78-5.64(m,1H),5.50-5.23(m,1H),3.71(s,3H),3.50(t,J＝6.8Hz,2H),3.36(t,J＝6.7Hz,2H),2.03-1.92(m,3H),1.87(p,J＝6.7Hz,2H)。对该光敏性化合物进行质谱分析，结果为[M+H]+318.1。
本实施例的光敏性化合物的合成路线图如图1所示。图5为本实施例的化合物的紫外-可见吸收光谱图，通过安捷伦科技(中国)有限公司生产的紫外-可见分光光度计，仪器型号为Evolution 220UV-Vis，光谱扫描范围从300nm到800nm；测量了该化合物的光吸收特性。紫外激发的波谱更窄且波长更长，则能量更低，这就避免紫外引起蛋白抗原位点失活，也降低紫外引起胶内部背景自发荧光。
实施例2
制备结构式如下式(4)所示的光敏性化合物。
按照摩尔比1:10:170称取吡咯、二乙酸碘苯和三氟乙醇，先将吡咯溶解于三氟乙醇中，再于–40℃下加入二乙酸碘苯，氮气保护搅拌3h。将搅拌后的混合物浓缩成黑色油状后溶解于二氯甲烷中。然后，向其中加入按照摩尔比4:1:15称取的5-甲酸乙酯四氮唑、三氟甲烷磺酸铜(II)和三乙胺；在室温且氮气保护下搅拌24h。得到的物质通过饱和氯化铵和卤水分别洗涤，再采用无水硫酸镁对其干燥，最后过滤、采用硅胶层析(洗脱剂为PE:EA＝7:1)进一步纯化，得到棕色油状中间产物。
按照质量比1:1称取中间产物和氢氧化锂，先将中间产物溶解于20ml体积比为1:1的MeOH/H2O溶液中，于0℃下向其中加入氢氧化锂；再将其置于室温且氮气保护下搅拌反应2h；最后将温度调节为0℃后向其中加入2N HCl，调节pH为7.5，得到混合溶液；用乙酸乙酯溶液萃取出该混合溶液的有机相，用卤水洗涤有机相后采用无水硫酸钠干燥，通过过滤浓缩为棕色固体，即含吸电子基团的四氮唑类化合物2。
按照质量比3:1:1称取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑和N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐盐酸盐，先将N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐盐酸盐溶解于50mL四氢呋喃中，于0℃下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑，反应30min；再按照N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐盐酸盐、含吸电子基团的四氮唑类化合物2和三乙胺的质量比为1:1:2，称取并加入含吸电子基团的四氮唑类化合物2和三乙胺混合搅拌、回流反应10h。反应结束后，用制备型HPLC纯化产物，得到白色粉末状的最终产物，其结构如式(4)。
实施例3
制备结构式如下式(5)所示的光敏性化合物。
按照摩尔比为1:12:150称取噻吩、二乙酸碘苯和三氟乙醇，先将噻吩溶解于三氟乙醇中，再于–40℃下加入二乙酸碘苯，氮气保护搅拌4h。将搅拌后的混合物浓缩成黑色油状后，溶解于二氯甲烷中。然后，向其中加入按照摩尔比5:1:16称取的5-甲酸乙酯四氮唑、三氟甲烷磺酸铜(II)和三乙胺；在室温且氮气保护下搅拌27h。得到的物质通过饱和氯化铵洗涤，采用无水硫酸镁对其干燥，最后过滤、采用硅胶层析(洗脱剂为PE:EA＝6:1)进一步纯化，得到棕色油状中间产物。
按照质量比1:2称取中间产物和氢氧化锂，先将中间产物溶解于20ml体积比为1:1的MeOH/H2O溶液中，于0℃下向其中加入氢氧化锂；再将其置于室温且氮气保护下搅拌反应1.5h；最后将温度调节为0℃后向其中加入2N HCl，调节pH为8，得到混合溶液；用乙酸乙酯溶液萃取出该混合溶液中的有机相，用卤水洗涤有机相后采用无水硫酸钠干燥，通过过滤浓缩为棕色固体，即含吸电子基团的四氮唑类化合物3。
按照质量比5:2:1称取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑和N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐盐酸盐，先将N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐盐酸盐溶解于50mL四氢呋喃中，于0℃下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑，反应2h；再按照N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐盐酸盐、含吸电子基团的四氮唑类化合物3和三乙胺的质量比为1:1:4，称取并加入含吸电子基团的四氮唑类化合物3和三乙胺，混合搅拌、回流反应15h。反应结束后，用制备型HPLC纯化产物，得到白色粉末状的最终产物，其结构如式(5)。
实施例4
制备结构式如下式(6)所示的光敏性化合物。
按照摩尔比1:13:130称取呋喃、二乙酸碘苯和三氟乙醇，先将呋喃溶解于三氟乙醇中，再于–40℃下加入二乙酸碘苯，氮气保护搅拌4h。将搅拌后的混合物浓缩成黑色油状后溶解于二氯甲烷中。然后，向其中加入按照摩尔比7:1:18称取的5-甲酸乙酯四氮唑、三氟甲烷磺酸铜(II)和三乙胺，在室温且氮气保护下搅拌30h。得到的物质通过饱和氯化铵和卤水分别洗涤，再采用无水硫酸钠对其干燥，最后过滤、采用硅胶层析(洗脱剂为PE:EA＝5:1)进一步纯化，得到棕色油状中间产物。
按照质量比1:3称取中间产物和氢氧化锂，先将中间产物溶解于20ml体积比为1:1的MeOH/H2O溶液中，于0℃下向其中加入氢氧化锂；再将其置于室温且氮气保护下搅拌反应2.5h；最后将温度调节为0℃后向其中加入2N HCl，调节pH为8.5，得到混合溶液；用乙酸乙酯溶液萃取出该混合溶液中的有机相，用饱和氯化铵和卤水分别洗涤有机相后采用无水硫酸钠干燥，通过过滤浓缩为棕色固体，即含吸电子基团的四氮唑类化合物4。
按照质量比6:2:1称取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑和N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐盐酸盐，先将N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐盐酸盐溶解于50mL四氢呋喃中，于0℃下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑，反应1.5h；再按照N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐盐酸盐、含吸电子基团的四氮唑类化合物4和三乙胺的质量比为1:1:6，称取并加入含吸电子基团的四氮唑类化合物4和三乙胺，混合搅拌、回流反应17h。反应结束后，用制备型HPLC纯化产物，得到白色粉末状的最终产物，其结构如式(6)。
实施例5
制备结构式如下式(7)所示的光敏性化合物。
按照摩尔比1:15:100称取甲苯、二乙酸碘苯和三氟乙醇，先将甲苯溶解于三氟乙醇中，再于–40℃下加入二乙酸碘苯，氮气保护搅拌5h。将搅拌后的混合物浓缩成黑色油状后溶解于二氯甲烷中。然后，向其中加入按照摩尔比8:1:20称取的5-甲酸乙酯四氮唑、三氟甲烷磺酸铜(II)和三乙胺；在室温且氮气保护下搅拌30h。得到的物质通过饱和氯化铵、卤水分别洗涤，再采用无水硫酸镁对其干燥，最后过滤、采用硅胶层析(洗脱剂为PE:EA＝4:1)进一步纯化，得到棕色油状中间产物。
按照质量比1:5称取中间产物和氢氧化锂，先将中间产物溶解于20ml体积比为1:1的MeOH/H2O溶液中，于0℃下向其中加入氢氧化锂；再将其置于室温且氮气保护下搅拌反应2h；最后将温度调节为0℃后向其中加入2N HCl，调节pH为9，得到混合溶液；用乙酸乙酯溶液萃取出该混合溶液中的有机相，用卤水洗涤有机相后采用无水硫酸镁干燥，通过过滤浓缩为棕色固体，即含吸电子基团的四氮唑类化合物5。
按照质量比7:3:1称取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑和N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐盐酸盐，先将N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐盐酸盐溶解于50mL四氢呋喃中，室温下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑，反应1h；再按照N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐盐酸盐、含吸电子基团的四氮唑类化合物5和三乙胺的质量比为1:1:8，称取并加入含吸电子基团的四氮唑类化合物5和三乙胺，混合搅拌、回流反应20h。反应结束后，用制备型HPLC纯化产物，得到白色粉末状的最终产物，其结构如式(7)。
实施例6
制备结构式如下式(8)所示的光敏性化合物。
按照质量比1:1:2称取N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐盐酸盐、含吸电子基团的四氮唑类化合物6和三乙胺；先将N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐盐酸盐溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，于0℃下将含吸电子基团的四氮唑类化合物6和三乙胺加入其中，混合搅拌、回流反应12h。反应结束后，用制备型HPLC纯化产物，得到白色粉末状的最终产物，其结构如式(8)。其中，含吸电子基团的四氮唑类化合物6通过市售的琥珀酰亚胺酯和含四氮唑基团的化合物合成得到，其中含四氮唑基团的化合物具有吸电子基团，本实施例中，吸电子基团为具有取代基甲基的苯基。
实施例7
以实施例1中制备的光敏性化合物为光敏成分制备光敏性蛋白质固定凝胶。
将光敏性化合物溶解于二甲基亚砜中，配置成浓度为100mM的储存溶液；在四支1.5mL Ep管内，分别加入25uL 1.5M的Tris-HCl缓冲液(pH为8.8)，166.7uL 30％丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺(29:1)溶液，265.3uL ddH2O，再向四支Ep管内分别加入15uL、7.5uL、3.75uL和0uL的储存溶液，配制成浓度分别为3％、1.5％、0.75％和0％的胶前体溶液。接着，分别向每支Ep管内加入10uL 5％SDS、10uL 5％Triton X-100、4uL过硫酸铵(APS)和4uL四甲基乙二胺(TEMED)，轻轻将其摇匀。然后，将上述溶液滴加于多孔微阵列模具上，并将载玻片轻缓盖上，避免气泡产生，静置20min，待胶凝固后，剥离模具，制成至少四组不同浓度的多孔微阵列凝胶。
称取500mg的0.5％SDS、100uL的0.1％v/v Triton X-100、250mg的0.25％脱氧胆酸钠、1.514g Tris以及7.2g甘氨酸混合，调节pH为8.3，配制成1L电泳缓冲液，保存于4℃。将此电泳缓冲液水浴加热至55℃，并提前开启紫外光，以使光源稳定。
将附着上述凝胶的载玻片置于干净的器皿中，使胶面朝上放置，滴加200uL5.12mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)溶液，轻摇载玻片使BSA溶液在胶面上分布均匀，然后静置3min。将凝胶置于电泳槽内，从电泳槽一角轻柔且快速地倒入预热的10mL电泳缓冲液。立即开启电源，200V电压(E＝40v/cm2)，蛋白电泳分离30s后，立即关闭电源，进行紫外曝光10min。曝光结束，取出凝胶，置于考马斯亮蓝染液(0.1g考马斯亮蓝粉末溶解于20mL甲醇、16mL水和4mL乙酸组成的混合溶液中)中染色5min；此时拍摄照片，记录四组凝胶上的蛋白固定情况(图6中左侧一列所示)。采用TBST缓冲液(用盐酸滴定到pH 7.5的100mM tris、150mM NaCl、0.1％Tween 20、9480,EMD Millipore)摇洗，每15min换缓冲液一次、持续2h，然后浸于TBST缓冲液中摇洗12h；再次拍摄照片，记录四组凝胶上的蛋白固定情况(图6中右侧一列所示)，如图6所示。从该图中可以看出，未加入光敏性蛋白质固定凝胶在经过12h后蛋白质基本被全部洗去，然而较低浓度光敏性蛋白质固定凝胶，即0.75％的光敏性蛋白质固定凝胶，在经过紫外光的激发后就显示出对胶内蛋白质较高的固定效率。
本实施例中，在不同紫外光照时间0s、15s、30s、1min、2min、4min、6min、10min的激发下，采用相同浓度的光敏性蛋白质固定凝胶按照上述方法对相同浓度的牛血清白蛋白进行摇洗，结果如图7所示。图中左侧一列为电泳后的蛋白固定情况，右侧一列为不同紫外光照时间下的蛋白质固定情况；15s的紫外激发就可对蛋白质产生固定作用，30s开始固定作用加强，这显示出本发明的光敏性蛋白质固定凝胶所需紫外激发时间更短，避免引起蛋白质抗原位点失活，也降低了紫外引起凝胶内部背景自发荧光的影响。
图8为本实施例的光敏性蛋白质固定凝胶在紫外光的激发下与蛋白质之间的作用原理示意图，从此图中可看出，光敏性蛋白质固定凝胶经过紫外光的激发，紫外光照射波长在300～400nm之间，光敏性化合物中的四氮唑环断开，与蛋白质中的羧基发生亲核加成反应，在吸电子基团的作用下，1,4-酰基转移，最终凝胶与蛋白质之间形成稳定的结构，从而固定住蛋白质。因此，本发明的光敏性蛋白质固定凝胶所需紫外曝光激发时间短，一般30s以内，即与蛋白质分子的功能团聚合速度更快，这可避免由于聚合速度慢而导致的蛋白质扩散，引起灵敏度降低，这就极大的提高了蛋白质固定效率。并且，由于光敏性蛋白质固定凝胶是与蛋白质中的羧基反应，这就可使光敏性蛋白质固定凝胶对蛋白质具有非选择性，可固定所有蛋白质。本发明的光敏性蛋白质固定凝胶不影响电泳中SDS-PAGE本身的分子筛效应，保留了原方法的特异性及分离分辨率，同时又能非选择性地固定所有蛋白质，可与电泳分离更好地配合，以便于后期的蛋白质检测。图9为单细胞条带图，单细胞入孔裂解后进行电泳，电泳结束后，使用紫外激发光敏性蛋白质固定凝胶与蛋白质发生反应，将蛋白质原位固定在胶内。使用可以识别特定蛋白的一抗进行孵育，随后用带有荧光的二抗识别一抗，最后检测荧光条带。图中所检测蛋白质为内参蛋白Tubulin，从左图中可看出，有明显的荧光条带，表示已固定蛋白不影响抗原抗体的结合；通过使用Matlab进行数据分析，得到的信号峰明显，该曲线(峰)下面积代表检测到的抗原的量。从该图中可知，经过本发明光敏性蛋白质固定凝胶对蛋白质的固定，在后续检测过程中，不影响抗原抗体结合、或受体配体结合、或酶活性、或适配体结合等；不影响后续检测体系的搭建。
在本发明中，洗涤采用的试剂包括饱和氯化铵和卤水，干燥剂包括无水硫酸镁和无水硫酸钠，纯化处理操作包括采用硅胶层析(洗脱剂为PE:EA＝4～8:1)和制备型HPLC；并且，有机溶剂包括三氟乙醇、二氯甲烷、四氢呋喃或N,N-二甲基甲酰胺中的一种或多种。在各实施例的相应操作中以上技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对各实施例中的以上技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
本发明中的实施例仅用于对本发明进行说明，并不构成对权利要求范围的限制，本领域内技术人员可以想到的其他实质上等同的替代，均在本发明保护范围内。

Claims (12)

1.一种光敏性化合物，其特征在于，所述光敏性化合物的结构式如式(I)所示：
；
其中，R选自如下基团的任意一种：
。
2.权利要求1所述的光敏性化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐盐酸盐溶解于有机溶剂中，向其中加入含R基团的四氮唑类化合物和三乙胺，搅拌回流反应10～20h后进行纯化处理得到所述光敏性化合物。
3.根据权利要求2所述的光敏性化合物的制备方法，其特征在于，所述N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐盐酸盐、含R基团的四氮唑类化合物和三乙胺的质量比为1:1:(2～8)。
4.根据权利要求2所述的光敏性化合物的制备方法，其特征在于，所述含R基团的四氮唑类化合物通过以下步骤制备：
A、将环状化合物溶解于有机溶剂中，于-40℃下加入二乙酸碘苯并在氮气保护下搅拌3～5h；将搅拌后的混合物经过浓缩处理后溶解于有机溶剂，再向其中加入5-甲酸乙酯四氮唑、三氟甲烷磺酸铜(II)和三乙胺，于室温且氮气保护下搅拌至少24h后，进行洗涤、干燥、过滤及纯化处理，得到中间产物；
B、将所述中间产物溶解于体积比为1:1的MeOH/H2O溶液中，于0℃下加入氢氧化锂；再于室温且氮气保护下搅拌至少1h；最后将其置于0℃下加入2N HCl，调节pH为7～9，得到混合溶液；
C、萃取出所述混合溶液中的有机相，然后进行洗涤处理、干燥剂干燥和过滤后即得到所述含R基团的四氮唑类化合物。
5.根据权利要求4所述的光敏性化合物的制备方法，其特征在于，在步骤A中，所述环状化合物、二乙酸碘苯和有机溶剂的摩尔比为1:(10～15):(100～200)；所述5-甲酸乙酯四氮唑、三氟甲烷磺酸铜(II)和三乙胺的摩尔比为(3～8):1:(13～20)。
6.根据权利要求4所述的光敏性化合物的制备方法，其特征在于，在步骤A中，采用硅胶层析进行纯化，其中洗脱剂PE:EA＝4～8:1。
7.根据权利要求4所述的光敏性化合物的制备方法，其特征在于，在步骤B中，所述中间产物和氢氧化锂的质量比为1:1～5。
8.根据权利要求4～7任一项所述的光敏性化合物的制备方法，其特征在于，在加入所述含R的四氮唑类化合物前，还需加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸和1-羟基苯并三唑反应至少30min；其中加入的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸和1-羟基苯并三唑与N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐盐酸盐的质量比为(2～7):(1～3):1。
9.根据权利要求2所述的光敏性化合物的制备方法，其特征在于，所述含R基团的四氮唑类化合物通过琥珀酰亚胺酯和含四氮唑基团的化合物制备得到，其中所述含四氮唑基团的化合物具有R基团。
10.根据权利要求2、4或5所述的光敏性化合物的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂包括三氟乙醇、二氯甲烷、四氢呋喃或N ,N-二甲基甲酰胺中的一种或多种。
11.权利要求1所述的光敏性化合物或权利要求2～10任一项所述的制备方法得到的光敏性化合物在分离和固定蛋白质中的应用。
12.一种光敏性蛋白质固定凝胶，包括作为光敏成分的权利要求1所述的光敏性化合物或权利要求2～10任一项所述的制备方法得到的光敏性化合物。
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