CN113358875A - 一种孔径可控的复合型聚丙烯酰胺凝胶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种孔径可控的复合型聚丙烯酰胺凝胶及其制备方法。本发明第一方面提供了一种孔径可控的复合型聚丙烯酰胺凝胶的制备方法，包括如下步骤：将氧化石墨烯、丙烯酸、二氯亚砜、对苯二酚和三乙胺混合，并在保护气体氛围下合成丙烯酸功能化石墨烯；将丙烯酸功能化石墨烯溶于二甲基甲酰胺中，得到功能化石墨烯的二甲基甲酰胺溶液；将功能化石墨烯的二甲基甲酰胺溶液、丙烯酰胺、N‑异丙基丙烯酰胺水溶液、Tris‑HCl、SDS、TritonX‑100、光敏化合物MAP‑mPyTC以及APS和TEMED混合得到复合型聚丙烯酰胺凝胶。根据本发明提供的制备方法制备得到的复合型聚丙烯酰胺凝胶，可根据温度调控其尺寸，并且凝胶尺寸调控可逆，所需变化时间短。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种孔径可控的复合型聚丙烯酰胺凝胶及其制备方法。
背景技术
蛋白质印迹法(Western Blot)是细胞与分子生物学和免疫遗传学中常用的一种蛋白测定方法。具体流程是通过使用凝胶电泳分离样品中的蛋白质，随后将蛋白质转移到膜(例如：硝酸纤维素或PVDF膜)，接着用对靶蛋白质具有特异性的抗体来检测样品中的蛋白质。由于蛋白是经过电泳分离后再进行抗体结合反应，故较少受到抗体交叉反应性的影响。因此，即使在复杂的样品如细胞裂解物中，也能够清楚地区分靶上和靶外信号。然而，传统的蛋白印迹方法中所测定的结果是基于大量细胞样品的蛋白平均表达水平，其结果掩盖了单个细胞蛋白的表达量的特殊性和多样性。UC伯克利大学的Amy Herr教授提出一种单细胞的蛋白质印迹术(Single-cell western blot)，采用基于N-(3-((4-benzoylphenyl)formamido)propyl)methacrylamide(BPMAC)光敏型凝胶原位固定电泳分离后的蛋白进行免疫印迹，在一块微芯片上实现数千个单细胞蛋白质表达水平的测定和细胞异质性的研究。单细胞蛋白质免疫印迹实验的基本流程包括：(1)单细胞捕获和裂解：细胞在分选后，经重力作用沉降进入单细胞捕获单元；(2)凝胶电泳：加入预热至55℃的类RIPA的裂解电泳缓冲液裂解15秒。细胞在裂解后，在芯片两端施加电场，蛋白在电场的作用下进入芯片表面的凝胶涂层中，并开始电泳分离；(3)蛋白固定：凝胶电泳结束后，通过对凝胶表面进行一定波长和强度的紫外光激发照射，使凝胶涂层蛋白条带中蛋白分子和凝胶单体分子原位聚合；(4)免疫印迹蛋白分析：将固定好的蛋白分子用特异性的一抗结合，洗脱，再用带有荧光或发光基团标记的二抗结合，洗脱。最后在激光共聚焦荧光显微镜下，测定目标蛋白分子的荧光信号强度。
传统的聚丙烯酰胺凝胶在电泳时充当分子筛基质，使得蛋白质分离；抗原抗体反应时，凝胶固定住蛋白质充当免疫印迹的支架。然而传统的凝胶支持介质性能单一，凝胶孔径固定，往往只能分离分子量在30-250kDa的蛋白质，极大地限制了单细胞蛋白质免疫印迹技术的应用。当凝胶孔径过大时，小分子量蛋白质的分离分辨率较低，蛋白质固定效率减低，极大的影响了检测结果的准确性；大分子量蛋白在抗体孵育过程，抗体由于分子量过大难以进入凝胶基质结构与凝胶内固定住的蛋白质分子反应结合，极大的影响了检测结果的灵敏度与线性范围。
因此，设计研究合成方法简单、对小分子量蛋白质分离分辨率高，同时在抗体孵育环节可使凝胶孔径变大，使得抗体易于进入凝胶介质内的聚丙烯酰胺凝胶对单细胞蛋白质免疫印迹技术的生物学应用具有重要的理论和现实意义。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种对小分子量蛋白质分离分辨率高，孔径可控的复合型聚丙烯酰胺凝胶。
为实现上述目的，本发明提供了一种孔径可控的复合型聚丙烯酰胺凝胶的制备方法，包括如下步骤：
步骤1、将氧化石墨烯、丙烯酸、二氯亚砜、对苯二酚和三乙胺混合，并在保护气体氛围下合成得到丙烯酸功能化石墨烯；
步骤2、将所述丙烯酸功能化石墨烯溶于二甲基甲酰胺中，得到功能化石墨烯的二甲基甲酰胺溶液；
步骤3、将所述功能化石墨烯的二甲基甲酰胺溶液、丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺水溶液、Tris-HCl、SDS、TritonX-100、光敏化合物MAP-mPyTC以及APS和TEMED混合在无氧条件下得到所述凝胶。
进一步地，步骤1之前还包括，将所述氧化石墨烯溶于二甲基甲酰胺溶液中，并在冰浴中进行超声波处理。
进一步地，步骤1中，将合成产物经过洗涤、离心后得到所述丙烯酸功能化石墨烯，所述离心的转速为10000转/分。
进一步地，步骤2中，所述功能化石墨烯的二甲基甲酰胺溶液中功能化石墨烯的质量分数为1％。
进一步地，步骤3中，所述N-异丙基丙烯酰胺水溶液中N-异丙基丙烯酰胺的质量分数为60％。
进一步地，步骤3中，将0.005-0.1％功能化石墨烯的二甲基甲酰胺溶液、14％丙烯酰胺、0.1-3％N-异丙基丙烯酰胺水溶液、75mM Tris-HCl、0.1％SDS、0.1％TritonX-100、0.2％MAP-mPyTC以及0.2％APS和0.2％TEMED混合得到所述凝胶。
本发明还提供了一种孔径可控的复合型聚丙烯酰胺凝胶，根据上述任一所述制备方法制备得到。
进一步地，当温度为33-55℃时，所述复合型聚丙烯酰胺凝胶的收缩率为-4.2％。
进一步地，当温度为0-10℃时，所述复合型聚丙烯酰胺凝胶的膨胀率为10.51％。
进一步地，所述复合型聚丙烯酰胺凝胶的T％为2-16％。
根据本发明提供的制备方法制备得到的复合型聚丙烯酰胺凝胶，具有以下优势：
1、凝胶介质尺寸可调控性：电泳时，凝胶孔径均匀一致且孔径尺寸小，使得低分子量蛋白质分离分辨率提高；抗体孵育时，凝胶孔径增大，使得抗体易于进入凝胶介质机制内，与凝胶内原位固定的蛋白质反应结合，并且凝胶尺寸调控可逆，尺寸所需变化时间短，不过度增加实验时间、成本、人力等负担。
2、光敏固定蛋白质效率较高，不易被洗脱造成蛋白损失，可显著提升蛋白检测的灵敏度，且紫外激发时间短，紫外激发波谱更窄且波长更长，能量更低，有利于避免引起蛋白抗原位点失活，降低紫外引起胶内部背景自发荧光。
3、该凝胶可同时非选择性固定所有蛋白质，包括不同分子量的蛋白质，不同酸碱性的蛋白质，不同等电点的蛋白质，不同三维结构的蛋白质、不同位置分布的蛋白如表面蛋白、跨膜蛋白、胞内及核内蛋白等，避免由于方法本身造成对某特定蛋白质漏检、误检。
4、凝胶成分稳定，不与单细胞免疫印迹技术体系中的其它分子反应，如水，SDS，Triton-X，脱氧胆酸钠等，避免固定位点被占用引起的蛋白固定效率降低，同时减少因此产生的背景荧光；不影响抗原抗体结合或受体配体结合或酶活性或适配体结合等，不影响后续检测体系的搭建，不影响光敏剂与蛋白质交联的结合速度、效率等。
5、制备成本较低，价格更低廉。
以下将结合具体实施例对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1A为氧化石墨烯的紫外-可见吸收光谱；
图1B为本发明一实施例制备的丙烯酸功能化石墨烯的紫外-可见吸收光谱；
图2A为氧化石墨烯的红外光谱；
图2B为本发明一实施例制备的丙烯酸功能化石墨烯的红外光谱；
图3为本发明一实施例制备得到的凝胶膨胀和收缩后的对比图；
图4A为本发明一实施例制备得到的凝胶与牛血清蛋白BSA摇洗前的示意图；
图4B为本发明一实施例制备得到的凝胶与牛血清蛋白BSA摇洗后的示意图；
图5为使用本发明一实施例制备得到的凝胶对抗原抗体结合的影响；
图6A1-A4为纯聚丙烯酰胺凝胶在不同浓度下的免疫印迹信号；
图6B为本发明一实施例制备得到的凝胶在14％T下的免疫印迹信号。
具体实施方式
以下参考说明书附图介绍本发明的实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
实施例1：本实施例提供的复合型聚丙烯酰胺凝胶的制备方法包括如下步骤：
步骤1、制备丙烯酸功能化石墨烯
将干燥的氧化石墨烯粉末溶解在二甲基甲酰胺(DMF)中，并在冰浴中对所得混合物使用JY99-II DN超声波仪(中国宁波科学技术有限公司)进行超声波处理30分钟使其分散均匀，以防止高温破坏氧化石墨烯的结构。然后将20g丙烯酸、30ml二氯亚砜、1mg对苯二酚(阻聚剂)和30mg三乙胺加入到氧化石墨烯溶液中，在冰浴和氮气保护下搅拌两小时，在室温下孵育过夜，将反应产物使用蒸馏水多次漂洗，在10000转/分离心三次除去小分子副产物后，制备得到丙烯酸功能化石墨烯，随后将其冻干后在4℃下保存备用；
步骤2、将丙烯酸功能化石墨烯溶解于二甲基甲酰胺，制备成质量分数为1％的溶液；将N-异丙基丙烯酰胺溶解于水溶液中，制备成质量分数为60％的溶液；
步骤3、将14％丙烯酰胺，0.01％功能化石墨烯的二甲基甲酰胺溶液，1％N-异丙基丙烯酰胺水溶液，75mM Tris-HCl，0.1％SDS，0.1％TritonX-100、0.2％MAP-mPyTC、0.2％APS和0.2％TEMED混合在无氧条件下得到该凝胶。
本发明进一步对实施例1制备得到的凝胶进行测试，具体地：
(一)使用紫外-可见分光光度计(购自安捷伦科技(中国)有限公司，型号为Evolution 220UV-Vis)测量氧化石墨烯和实施例1步骤1制备得到的丙烯酸功能化石墨烯的紫外-可见吸收光谱，光谱扫描范围为300-800nm，测试结果如图1A-1B所示。
采用傅立叶变换红外光谱仪(FT-IR)对氧化石墨烯和实施例1步骤1制备得到的丙烯酸功能化石墨烯上的官能团进行了研究，测试波长为400-4000nm，测试结果如图2A-2B所示，可以看出氧化石墨烯被成功修饰上了丙烯酸的官能团。
(二)对凝胶称重记为WO，随后将干燥的凝胶在4℃下浸泡至蒸馏水中4h，浸泡结束后称重记为WS，称重后再在55℃下浸泡至蒸馏水中，取出后称重记为WC，图3为凝胶膨胀和收缩后的对比图，根据QS＝(WS-W0)/W0、QC＝(WC-W0)/W0计算得到凝胶的膨胀率(QS)和收缩率(QC)，计算显示，QS为10.51％，QC为-4.2％。
(三)按照下述方法测试凝胶对牛血清蛋白BSA的固定效率
1、按照0.5％SDS，0.1％v/vTriton X-100，0.25％脱氧胆酸钠，12.5mM Tris，96mMglycine配置得到RIPA-like裂解液(Radio immune-precipitation assay lysisbuffer)，pH为8.3，取RIPA-like裂解液水浴加热至50-55℃，提前开启紫外，使光源稳定。
2、将芯片置于新的皿中，胶面朝上，滴加200μl BSA溶液(5.12mg/mL)，轻摇玻片，使BSA溶液分布均匀，静置3min。
3、将凝胶置于电泳槽内，从电泳槽一角轻柔尽快倒入水浴55℃预热的10ml RIPA-like裂解液。
4、立即开启电压电源，200V电压(E＝40v/cm2)，蛋白电泳分离30s，随后终止电压，紫外曝光，曝光时间设置为45s。
5、曝光结束，取出凝胶，置于考马斯亮蓝染液(0.1g考马斯亮蓝粉末溶于20mL甲醇+16mL水+4mL乙酸)中染色5min。
6、拍摄照片，记录蛋白固定情况。
7、TBST摇洗，每15min换液一次，持续2h，后摇洗过夜。
8、拍摄照片，记录蛋白固定情况。
如图4A-4B所示，凝胶在经较短时间(30s以内)的紫外激发后对蛋白质具有较高的固定效率。
(四)按照下述方法测试凝胶对抗原抗体的结合的影响
1、按照0.5％SDS，0.1％v/v Triton X-100，0.25％脱氧胆酸钠，12.5mM Tris，96mM glycine配置得到RIPA-like裂解液(Radio immune-precipitation assay lysisbuffer)，pH 8.3，取RIPA-like裂解液水浴加热至50-55℃，提前开启紫外，使光源稳定。
2、将芯片置于新的皿中，胶面朝上，滴加200μl BSA溶液(5.12mg/mL)，轻摇玻片，使BSA溶液分布均匀，静置3min。
3、将胶置于电泳槽内，从电泳槽一角轻柔尽快倒入水浴55℃预热的10ml RIPA-like裂解液。
4、立即开启电压电源，200V电压(E＝40v/cm2)，蛋白电泳分离30s。
5、立即终止电压，紫外曝光。曝光时间分别设置为45s。
6、曝光结束，取出胶。
7、将胶置于TBST里摇洗30min，10min换液一次。
8、加一抗，4℃过夜孵育。
9、将胶置于TBST里摇洗30min，10min换液一次。
10、加二抗，室温孵育1h。
11、将胶置于TBST里摇洗30min，10min换液一次。
将凝胶置于confocal下观察，如图5所示，该凝胶对抗原抗体的结合无影响。
(五)按照下述方法测试常规聚丙烯酰胺凝胶和实施例1制备得到的复合型聚丙烯酰胺凝胶在不同浓度下与牛血清白蛋白的免疫印迹信号：
1、按照0.5％SDS，0.1％v/v Triton X-100，0.25％脱氧胆酸钠，12.5mM Tris，96mM glycine配置得到RIPA-like裂解液(Radio immune-precipitation assay lysisbuffer)，pH 8.3，取RIPA-like裂解液水浴加热至50-55℃，提前开启紫外，使光源稳定。
2、配置交联度分别为6％、8％、10％、12％的微芯片凝胶，以及12％T含有1％N-异丙基丙烯酰胺和0.01％丙烯酸化的氧化石墨烯的微芯片凝胶。
3、将芯片置于新的皿中，胶面朝上，滴加200μl BSA溶液(5.12mg/mL)，轻摇玻片，使BSA溶液分布均匀，静置3min。
4、将胶置于电泳槽内，从电泳槽一角轻柔尽快倒入水浴55℃预热的10ml RIPA-like裂解液。
5、立即开启电压电源，200V电压(E＝40v/cm2)，蛋白电泳分离30s。
6、立即终止电压，紫外曝光。曝光时间分别设置为45s。
7、曝光结束，取出胶。
8、将胶置于TBST里摇洗30min，10min换液一次。
9、加一抗，4℃过夜孵育。
10、将胶置于TBST里摇洗30min，10min换液一次。
11、加二抗，室温孵育1h。
12、将胶置于TBST里摇洗30min，10min换液一次。
将凝胶置于confocal下观察，如图6所示，由A1-A4可以看出随着交联度的增大抗体逐渐难以进入凝胶，印记难以分辨，而复合型聚丙烯酰胺凝胶由于孔径可调，在低温条件下孔径扩大，在较高的交联度下也能有较为明显的免疫印迹。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种孔径可控的复合型聚丙烯酰胺凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、将氧化石墨烯、丙烯酸、二氯亚砜、对苯二酚和三乙胺混合，并在保护气体氛围下合成得到丙烯酸功能化石墨烯；
步骤2、将所述丙烯酸功能化石墨烯溶于二甲基甲酰胺中，得到功能化石墨烯的二甲基甲酰胺溶液；
步骤3、将所述功能化石墨烯的二甲基甲酰胺溶液、丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺水溶液、Tris-HCl、SDS、TritonX-100、光敏化合物MAP-mPyTC以及APS和TEMED混合在无氧条件下得到所述凝胶。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1之前还包括，将所述氧化石墨烯溶于二甲基甲酰胺溶液中，并在冰浴中进行超声波处理。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中，将合成产物经过洗涤、离心后得到所述丙烯酸功能化石墨烯，所述离心的转速为10000转/分。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2中，所述功能化石墨烯的二甲基甲酰胺溶液中功能化石墨烯的质量分数为1％。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3中，所述N-异丙基丙烯酰胺水溶液中N-异丙基丙烯酰胺的质量分数为60％。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3中，将0.005-0.1％功能化石墨烯的二甲基甲酰胺溶液、14％丙烯酰胺、0.1-3％N-异丙基丙烯酰胺水溶液、75mMTris-HCl、0.1％SDS、0.1％TritonX-100、0.2％MAP-mPyTC、0.2％APS和0.2％TEMED混合得到所述凝胶。
7.一种孔径可控的复合型聚丙烯酰胺凝胶，其特征在于，根据权利要求1-6任一项所述制备方法制备得到。
8.如权利要求7所述的复合型聚丙烯酰胺凝胶，其特征在于，当温度为33-55℃时，所述复合型聚丙烯酰胺凝胶的收缩率为-4.2％。
9.如权利要求7所述的复合型聚丙烯酰胺凝胶，其特征在于，当温度为0-10℃时，所述复合型聚丙烯酰胺凝胶的膨胀率为10.51％。
10.如权利要求7所述的复合型聚丙烯酰胺凝胶，其特征在于，所述复合型聚丙烯酰胺凝胶的交联度T％为2-16％。
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| CN113866425A (zh) * | 2021-09-24 | 2021-12-31 | 上海交通大学 | 一种单细胞蛋白数字化成像检测方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113358875B (zh) | 2024-06-18 |
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